ĐIỀU CHẾ KHÁNG HUYẾT THANH THỎ KHÁNG VI KHUẨN EDWARDSIELLA ICTALURI - ỨNG DỤNG TRONG CHẨN ĐOÁN NHANH BỆNH GAN THẬN MỦ TRÊN CÁ TRA NUÔI CÔNG NGHIỆP

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
*********

TRẦN THỊ HUYỀN

ĐIỀU CHẾ KHÁNG HUYẾT THANH THỎ KHÁNG
VI KHUẨN EDWARDSIELLA ICTALURI - ỨNG DỤNG
TRONG CHẨN ĐOÁN NHANH BỆNH GAN THẬN MỦ
TRÊN CÁ TRA NUÔI CÔNG NGHIỆP

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP
(NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC)

Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 08/2010
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO


ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
*********

TRẦN THỊ HUYỀN

ĐIỀU CHẾ KHÁNG HUYẾT THANH THỎ KHÁNG
VI KHUẨN EDWARSIELLA ICTALURI - ỨNG DỤNG
TRONG CHẨN ĐOÁN NHANH BỆNH GAN THẬN MỦ
TRÊN CÁ NUÔI CÔNG NGHIỆP
Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
Mã số:
LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP

Hướng dẫn khoa học
1. TS Nguyễn Hữu Thịnh

Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 08/2010


LÝ LỊCH CÁ NHÂN

Tôi tên là Trần Thị Huyền, sinh ngày 28 tháng 10 năm 1981 tại huyện Hưng
Hà, tỉnh Thái Bình. Con ông Trần Đình Hùng và bà Trần Thi Hải
Tốt nghiệp phổ thông tại trường Trung học phổ thông Nguyễn Trung Trực,
thành phố Hồ Chí Minh, năm 1998.
Tốt nghiệp Đại Học ngành Thủy Sản, hệ Chính Quy tại Đại Học Nông Lâm
thành phố Hồ Chí Minh, Thủ Đức, thành phố Hồ Chí Minh.
Sau đó làm việc tại trường Đại Học Công Nghiệp thành phố Hồ Chí Minh,
chức vụ Giảng Viên
Tháng 09 năm 2006 theo học cao học ngành Công Nghệ Sinh Học tại Đại
Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, Thủ Đức, thành phố Hồ Chí Minh.
Đã lập gia đình : Chồng Đỗ Ngọc Vinh, năm kết hôn 2007
Địa chỉ liên lạc: 40/458 A Lê Đức Thọ, phường 17, quận Gò Vấp, thành phố
Hồ Chí Minh.
Điện thoại: 0937594879
Email:


LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu,

kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố
trong bất cứ công trình nào

Ngày

tháng

năm 2010

Trần Thị Huyền


LỜI CẢM ƠN
Con xin gửi đến Bố Mẹ lòng biết ơn vô vàn. Bố Mẹ luôn giúp đỡ và cho con
thêm niềm tin và nghị lực phấn đấu không ngừng trong cuộc sống.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy Nguyễn Hữu Thịnh đã tận tình
hướng dẫn, giúp đỡ và tạo điều kiện cho em trong suốt thời gian thực hiện đề tài.
Xin chân thành cảm ơn các Thầy Cô trong bộ môn Công Nghệ Sinh Học
trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh đã giúp đỡ em hoàn thành luận
văn này.
Em cũng gửi lời cảm ơn đến các đồng nghiệp trường Đại Học Công Nghiệp
Thành Phố Hồ Chí Minh đã luôn động viên, giúp đỡ và tạo điều kiện cho em hoàn
thành tốt đề tài nghiên cứu.
Cám ơn tất cả các bạn, anh chị và các em lớp cao học Công Nghệ Sinh Học
đã giúp đỡ, cùng tôi làm việc trong quá trình học tập và nghiên cứu.
Cuối cùng em xin cảm ơn chồng Đỗ Ngọc Vinh đã luôn động viên tinh thần,
an ủi và chia sẻ cuộc sống cho em có thêm thời gian để hoàn thành trong suốt thời
gian 4 năm học tập và thực hiện thành công luân văn tốt nghiệp thạc sĩ.

TÓM TẮT
Đề tài “ Điều chế kháng huyết thanh thỏ kháng Edwardrsiella ictaluri - Ứng
dụng trong chẩn đoán nhanh sự hiện diện của edwardsiellosis trên cá tra
(Pangasianodon hypophthalmus)” được nghiên cứu tại trường Đại Học Công
Nghiệp Thành Phố Hồ Chí Minh từ tháng 9 năm 2008 đến tháng 8 năm 2010.
Mục đích nghiên cứu là phát triển kỹ thuật Dot-ELISA để phát hiện E. ictaluri
trên cá tra phơi nhiễm edwardsiellosis bằng kháng huyết thanh thỏ.
Kháng huyết thanh được sản xuất bằng cách tạo miễn dịch trên thỏ bằng hỗn
hợp vi khuẩn E. ictaluri đã bị bất hoạt bằng formalin và tá chất Freund’s Complete.
Kháng huyết thanh chuyên biệt cho E. ictaluri và hiệu giá ngưng kết thu được đạt
đến 1/512. Kỹ thuật Dot-ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) được ứng
dụng để phát hiện E. ictaluri trên cá tra được gây nhiễm bệnh thực nghiệm. Kết quả
cho thấy kỹ thuật này có thể phát hiện E. ictaluri với giới hạn phát hiện là 2.9 x 105
tế bào/ml. Độ nhạy, độ chuyên biệt, giá trị âm tính, dương tính giả lần lượt là 100%,
100%, 0%, 0%. Đối với mẫu cá có triệu chứng bệnh “gan thận mủ” thu tại An
Giang, phương pháp Dot-Elisa có tỉ lệ phát hiện E.ictaluri cao nhất là 93,3%. Trong
khi phương pháp ngưng kết nhanh trên phiến kính và kit sinh hóa 14GNR cho kết
quả thấp hơn và chỉ đạt 81,7 và 90%. Tóm lại, kháng huyết thanh thỏ có có đáp ứng
miễn dịch tốt và việc sử dụng kháng huyết thanh này trong phương pháp Dot-Elisa
có thể đáp ứng được yêu cầu của một công cụ hiệu quả cho chẩn đoán phát hiện
nhanh E. ictaluri trên cá tra bị lây nhiễm vi khuẩn này.


ABSTRACT
Study entitled as “Producing rabbit antiserum against Edwardrsiella ictaluri
– Application in quick diagnosis of edwardsiellosis in tra catfish (Pangasianodon
hypophthalmus)” was conducted at HoChiMinh City University of Industry from
September, 2008 to August, 2010. This study was aimed to develop Dot-ELISA
technique to detect E. ictaluri in edwardsiellosis suffered catfish by using rabbit
antiserum.

Rabbit antiserum was produced by immunizing rabbit with a mixture of
formalin killed cell of E. ictaluri and Freund’s Complete Adjuvant. The collected
serum was specific for E. ictaluri and its agglutination titer was up to 512. DotELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) technique was developed to detect
E. ictaluri in experimentally infected catfish. Results showed that this technique
could detect E. ictaluri at the detection limit of 2.9 x 105 cell/ml. Its sensitivity and
specification, false negative/positive results and detection level was 100, 0, and
100%, respectively. Edwardsiellosis suffered catfish from An Giang Province were
sampled for detection of the bacterium by Dot-ELISA, slide agglutination
techniques and IDS 14GNR biochemical kit. The highest detection level was 93.3%
for Dot-ELISA. Meanwhile, those of slide agglutination and IDS 14GNR kit were
lower and only reached 81.7 and 90.0 %, respectively. In conclusions, rabbit
antiserum was successfully produced and its application in Dot-ELISA technique
could considered as an effective method for quick detection of E. ictaluri in
edwardsiellosis suffered catfish.


MỤC LỤC

CHƯƠNG

TRANG

MỤC LỤC ...........................................................................................................i
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT................................................................ iv
DANH SÁCH CÁC BẢNG ................................................................................ v
DANH SÁCH CÁC HÌNH................................................................................. vi
Chương 1 ............................................................................................................ 1
GIỚI THIỆU ....................................................................................................... 1
1.1

Đặt vấn đề ................................................................................................ 1

1.2
Mục tiêu và yêu cầu.................................................................................. 3
1.2.1 Mục tiêu ................................................................................................... 3
1.2.2 Yêu cầu .................................................................................................... 3
Chương 2 ............................................................................................................ 4
TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................................... 4
2.1
Bệnh do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri trên cá nuôi ................................ 4
2.1.1 Trên thế giới ............................................................................................. 4
2.1.2 Việt Nam .................................................................................................. 5
2.2
2.2.1
2.2.2
2.2.3

Vi Khuẩn Edwardsiella ictaluri ................................................................ 6
Khái quát .................................................................................................. 6
Hình thái vi khuẩn Edwardsiella ictaluri .................................................. 8
Đặc điểm sinh hóa .................................................................................... 8

2.3

Đặc điểm kháng nguyên vi khuẩn Edwardsiella ictaluri ......................... 10

2.4
2.4.1
2.4.2
2.4.3

Một Số Phương Pháp Phát Hiện Edwardsiella ictaluri ........................... 11
Phương pháp phân lập – định danh ......................................................... 11
Phương pháp huyết thanh học................................................................. 12
Phương pháp PCR .................................................................................. 14

2.5

Phương pháp Dot-ELISA ....................................................................... 14
i


2.5.1 Khái niệm Dot-ELISA ............................................................................ 15
2.5.2 Một số nghiên cứu ứng dụng của phương pháp Dot-ELISA .................... 15
Chương 3 ......................................................................................................... 18
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................... 18
3.1
Thời gian và địa điểm nghiên cứu ........................................................... 18
3.1.1. Thời gian ................................................................................................ 18
3.1.2. Địa điểm .................................................................................................18
3.2
Vật liệu nghiên cứu ................................................................................. 18
3.2.1 Dụng cụ - Thiết bị.................................................................................. 18
3.2.2.1 Hóa chất cho nuôi cấy vi khuẩn ............................................................. 23
3.2.2.2 Hóa chất dùng cho phản ứng ngưng kết giữa kháng nguyên - kháng thể 23
3.2.2.3 Hóa chất dùng cho Dot-Elisa .................................................................23
3.3

Nội dung nghiên cứu............................................................................... 20

3.4
Các phương pháp nghiên cứu. .................................................................21
3.4.1 Phương pháp nuôi cấy và thu sinh khối vi khuẩn Edwardsiella ictaluri
dạng FKC (Formalin Killed Cell) ......................................................................21
3.4.1.1 Phương pháp nuôi cấy tăng sinh vi khuẩn .............................................. 21
3.4.1.2 Phương pháp tạo FKC............................................................................ 21
3.4.2 Phương pháp tạo miễn dịch trên thỏ. ....................................................... 22
3.4.3 Phương pháp lấy máu - thu huyết thanh thỏ ............................................ 23
3.4.4 Phương pháp thực hiện phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kính,........ 24
3.4.5 Phương pháp xác định hiệu vi giá ngưng kết của huyết thanh thỏ. .......... 24
3.4.6 Phương pháp xác định vi khuẩn Edwardsiella ictaluri dạng FKC bằng
Dot-Elisa ........................................................................................................... 25
3.4.7 Phương pháp xác định giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng .......... 27
3.4.8 Phương pháp gây bệnh nhiễm bệnh thực nghiệm cho cá tra giống với vi
khuẩn Edwardsiella ictalri ................................................................................ 27
3.4.9 Phương pháp phân phân lập – phát hiện Edwardsiella ictalri. ................. 28
3.5
Bố trí thí nghiệm và phương pháp thực hiện ........................................... 29
3.5.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát độ pha loãng kháng huyết thanh thỏ cho phản ứng
ngưng kết với KFC E. ictaluri và vi khuẩn E. ictaluri........................................29
3.5.2 Thí nghiệm 2: Xác định hiệu giá ngưng kết nhanh của kháng huyết thanh
thỏ với FKC E. ictaluri và vi khuẩn E. ictaluri trên phiến kính ......................... 30
3.5.3 Thí nghiệm 3: Thực hiện phương pháp Dot-ELISA cho phát hiện vi khuẩn
E. ictaluri dạng FKC ......................................................................................... 30
ii


3.5.4 Thí nghiệm 4 : Thực hiện kỹ thuật Dot-ELISA cho phát hiện vi khuẩn E.
ictaluri .............................................................................................................. 31
3.5.5 Thí nghiệm 5: Khảo sát mật độ vi khuẩn E. ictaluri cho thí nghiệm phát

hiện bằng phương pháp Dot-ELISA .................................................................. 31
3.5.6 Thí nghiệm 6: Thử nghiệm phương pháp Dot-ELISA phát hiện vi khuẩn
E. ictaluri hiện diện trên cá tra giống gây bệnh “gan thận mủ” thực nghiệm...... 32
3.5.7 Thí nghiệm 7: Ứng dụng chẩn đoán phát hiện sự hiện diện của vi khuẩn
Edwarsiella ictaluri có trong mẫu bệnh cá tra ................................................... 36
Chương 4 .......................................................................................................... 37
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................................... 37
4.1
Xác định hiệu giá vi ngưng kết giữa kháng huyết thanh thỏ và vi khuẩn vi
khuẩn Edwardsiella ictaluri dạng FKC vi khuẩn Edwardsiella ictaluri ............. 37
4.1.1 Kết quả hiệu giá ngưng kết sau 7 ngày.................................................... 37
4.1.2 Kết quả hiệu giá ngưng kết sau 14 ngày.................................................. 40
4.2
Xác định hiệu giá ngưng kết nhanh trên phiến kính giữa kháng huyết
thanh thỏ với FKC E. ictaluri và E. ictaluri sống............................................. 42
4.3

Thử nghiệm Dot- ELISA phát hiện FKC E. ictaluri................................ 44

4.4

Thử nghiệm phương pháp Dot-ELISA cho phát hiện E. ictaluri sống ..... 47

4.5

Khảo sát mật độ vi khuẩn E. ictaluri cho thí nghiệm phát hiện ............... 49

4.6
Kiểm chứng phương pháp Dot-ELISA trên mẫu cá tra giống được gây
bệnh thực nghiệm .............................................................................................. 52

4.7
Kiểm chứng phương pháp Dot-ELISA trên mẫu cá tra giống mắc bệnh
gan thận mủ tại ao nuôi. .................................................................................... 56
Chương 5 .......................................................................................................... 59
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................................... 59
5.1

Kết Luận ................................................................................................ 59

5.2

Đề nghị................................................................................................... 59

TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................. 61

iii


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
BHIB Brain Heart Infusion Broth
Bộ NN&PTNT Bộ Nông Nghiệp và Phát triển Nông Thôn
BSA Bovine Serum Albumine
Dot-ELISA Dot-Enzyme-linked immunosorbent assay
FA Freund’s adjuvant
FATs Fluorescent Antibody Tests
FITC Flourescent isothiocyanate
FKC Formalin Killed Cell
HRP horseradish peroxidase
IgG Immunoglobulin G
NTB nitroblue tetrazolium

OD Optical Density
OIE World Organisation for Animal Health
PBS Phosphate buffer saline
PVDF Polyvinylidene fluoride
SDS Sodium Dodecyl Sulfate
SRAC Southern Regional Aquaculture Center
PCR Polymerase Chain Reaction
RT-PCR Real-Time Polymerase Chain Reaction
TBS Tris-buffered saline
TBST Tris-buffered saline + Tween 20

iv


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng 2.1

Sự khác nhau giữa các loài thuộc giống Edwardsiella .................... 7

Bảng 2.2

Bảng phân tích đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn E. ictaluri .......... 10

Bảng 3.1

Các lần tiêm và lấy máu thỏ kiểm tra kháng thể ........................... 23

Bảng 3.2

Quy trình thực hiện phản ứng ngưng kết huyết thanh thỏ - FKC .. 25

Bảng 4.1
Kết quả khảo sát hiệu giá kháng thể cho phản ứng ngưng kết với
các vi khuẩn dạng FKC và vi khuẩn sống E. ictaluri sau 7 ngày ............ 37
Bảng 4.2
Kết quả khảo sát độ pha loãng huyết thanh thỏ cho phản ứng ngưng
kết với các vi khuẩn dạng FKC và vi khuẩn sống E. ictaluri sau 14 ngày40
Bảng 4.3

Kết quả hiệu giá ngưng kết nhanh trên phiến kính........................ 42

Bảng 4.4
Kết quả khảo sát độ pha loãng kháng huyết thanh cho thí nghiệm
Dot-Elisa xác định FKC E. ictaluri ......................................................... 46
Bảng 4.5
Kết quả khảo sát độ pha loãng kháng huyết thanh cho thí nghiệm
Dot-ELISA xác định E. ictaluri sống ...................................................... 47
Bảng 4.6

Khảo sát mật độ E. ictaluri cho thí nghiệm phát hiện ................... 51

Bảng 4.7
Kết quả kiểm tra sự hiện diện E. ictaluri trên mẫu cá bệnh thực
nghiệm và mẫu đối chứng....................................................................... 53
Bảng 4.8
Kết quả xác định sự hiện diện của vi khuẩn E. ictaluri có trong mẫu
cá bệnh thu tại An Giang ................................................................................... 56
Sơ đồ 3.1

Sơ đồ nội dung nghiên cứu ......................................................... 20

v


DANH SÁCH CÁC HÌNH
HÌNH

TRANG

Hình 2.1

Đốm trắng trên gan cá tra

4

Hình 2.2

U nhọt trắng, đỏ trên thân cá

4

Hình 2.3

Cá tra bị bệnh đốm trắng trên gan (G), thận (Th), tỳ tạng (Tt)

7

Hình 2.4

Khuẩn lạc E. ictaluri trên môi trường BHIA sau khi ủ 24 giờ

9

Hình 2.5

Vi khuẩn E. ictaluri

9

Hình 2.6

Phương pháp Dot-ELISA

15

Hình 3.1

Thỏ thí nghiệm

21

Hình 3.2

Phương pháp ngưng kết nhanh trên phiến kính

23

Hình 3.3

Cá tra giống thí nghiệm

27

Hình 4.1

Kết quả khảo sát độ pha loãng huyết thanh thỏ cho phản ứng ngưng

kết với các vi khuẩn dạng FKC và vi khuẩn sống E. ictaluri sau 7 ngày
Hình 4.2

37

Kết quả khảo sát độ pha loãng huyết thanh thỏ cho phản ứng ngưng

kết với các vi khuẩn dạng FKC và vi khuẩn sống E. ictaluri sau 14 ngày

41

Hình 4.3a

Kết quả phản ứng ngưng kết nhanh âm tính trên phiến kính

42

Hình 4.3b

Kết quả phản ứng ngưng kết nhanh âm tính trên phiến

42

Hình 4.4
Kết quả khảo sát độ pha loãng kháng huyết thanh cho thí nghiệm
Dot-ELISA xác định FKC E. ictaluri
45
Hình 4.5
Kết quả khảo sát độ pha loãng kháng huyết thanh cho thí nghiệm
Dot-ELISA xác định E. ictaluri sống
47
Hình 4.6

Kết quả khảo sát mật độ vi khuẩn E. ictaluri

50

Hình 4.7

Mẫu mô gan thận cá chết do gây bệnh thực nghiệm

53

Hình 4.8

Kết quả kiểm tra E. ictaluri cho thí nghiệm Dot-Elisa

54

Hình 4.9

Kết quả kiểm tra E. Ictaluri cho thí nghiệm IDS 14 GNR.

54

vi


Hình 4.10 Kết quả xác định sự hiện diện vi khuẩn E. ictaluri có trong mẫu cá
bệnh tại An Giang
56

vii


viii


Chương 1
GIỚI THIỆU
1.1

Đặt vấn đề
Trong mười năm qua, cá tra (Pangasianodon hypopthalmus) từ một loài

cá bản địa với thế mạnh và hiệu quả kinh tế có được đã trở thành sản phẩm chiến
lược của quốc gia, là một trong những mặt hàng thủy sản xuất khẩu ưu thế ở Việt
Nam. Theo Bộ NN & PTNT, năm 2008 lượng cá tra xuất khẩu trên 550.000 tấn,
đạt kim nghạch hơn 1,4 tỉ đô la, chiếm 32,4 % tổng kim nghạch xuất khẩu thủy
sản của cả nước. Thị trường tiêu thụ cá tra đã và đang được mở rộng và có uy tín
ở 130 nước và vùng lãnh thổ, khu vực nhập khẩu lớn là Ucraina, Nga, Bắc Phi,
Trung Đông, Mỹ.
Từ những lợi thế trên, đầu năm 2010, Bộ NN&PTNT chính thức công bố

quy hoạch vùng nuôi cá tra dự kiến vào năm 2010, và trong bản “Quy hoạch phát
triển sản xuất và tiêu thụ cá tra vùng ĐBSCL năm 2010, định hướng đến năm
2020” đã xác định cá tra là đối tượng nuôi chủ lực, việc sản xuất và hoạt động
tiêu thụ cá tra là một hoạt động kinh tế quan trọng phục vụ tiêu dùng trong nước
và xuất khẩu của đất nước. Song cùng sự phát triển nghề nuôi, mở rộng quy mô
sản xuất để đạt những mục tiêu trên, trong nhiều năm qua, người nuôi cá bị thiệt
hại khá lớn do nhiều dịch bệnh xảy ra. Trong đó, bệnh gan thận mủ đã gây thiệt
hại nghiêm trọng cho nghề nuôi cá. Năm 2002, qua nghiên cứu của Crumlish và
cộng tác viên, tác nhân gây bệnh này trên cá tra được xác định là vi khuẩn
Edwardsiella ictaluri. Vì thế, hiện nay đối với từng hộ nuôi, việc áp dụng nhiều
mô hình nuôi tiên tiến, tìm ra phương pháp phòng trừ bệnh hiệu quả áp dụng cho
nghề nuôi cá tra nói riêng và nghề nuôi nuôi trồng thuỷ sản nói chung đã trở
thành một vấn đề mang tính cấp thiết.

1


Tuy nhiên để phòng bệnh cho cá tra nuôi cần phải xác định sự hiện diện
của tác nhân gây bệnh – vi khuẩn E. ictaluri. Từ trước đến nay, đã có nhiều
phương pháp phát hiện E. ictaluri khác nhau đã được nghiên cứu và ứng dụng
như: RT-PCR (Lenania và ctv, 2003), PCR, ELISA (John và Dean, 1996; Karen
và ctv, 2000; Eric và ctv, 2007; OIE, 2009) Western blot (OIE, 2009), phân lập
truyền thống (Craig và ctv, 1993; Hawke và ctv, 1998; Ferguson và ctv, 2001;
Nguyễn Hữu Thịnh và Trương Thị Thanh Loan, 2007),…nhưng hầu hết các
phương pháp trên đều đòi hỏi trang thiết bị đắt tiền, kỹ thuật viên được huấn
luyện thuần thục hay thời gian phân lập – phát hiện kéo dài kéo theo việc ứng
dụng vào thực tiễn phục vụ cho nhu cầu chẩn đoán bệnh cho cá nuôi có phần hạn
chế. Chính vì thế, sự cần thiết của một phương pháp phát hiện sớm vi khuẩn hiện
diện trong cơ thể cá là điều quan trọng, sẽ hạn chế các thiệt hại về kinh tế, nâng
cao tỷ lệ sống cho cá nuôi.

Trong những phương pháp phát hiện nhanh mầm bệnh dựa trên kỹ thuật
miễn dịch, Dot-ELISA với lợi thế có độ nhạy, độ đặc hiệu tương đối cao, tốn ít
thời gian sàng lọc mẫu với số lượng lớn và quy trình thực hiện không quá phức
tạp và cho kết quả trong khoảng thời gian ngắn đã đáp ứng được yêu cầu trên.
Do đó hiện nay phương pháp này đã và đang được quan tâm nghiên cứu.
Trước tình hình đó, được sự đồng ý của Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học
trường Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, dưới sự hướng dẫn của TS.
Nguyễn Hữu Thịnh, tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Điều chế huyết thanh thỏ
kháng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri - Ứng dụng trong chẩn đoán nhanh bệnh
gan thận mủ trên cá tra” nhằm phát hiện nhanh loài vi khuẩn này trên cá tra nuôi
ở Việt Nam trước.

2


1.2

Mục tiêu và yêu cầu

1.2.1 Mục tiêu
 Điều chế huyết thanh thỏ kháng vi khuẩn Edwadrsiella ictaluri.
 Ứng dụng kỹ thuật Dot-ELISA trong phát hiện nhanh E. ictaluri gây
bệnh trên cá tra (Pansianodon hypopthalmus).
1.2.2 Yêu cầu
 Thu được kháng huyết thanh thỏ kháng vi khuẩn E. ictaluri.
 Xác định hiệu giá vi ngưng kết giữa vi khuẩn E. ictaluri dạng KFC với
kháng huyết thanh thỏ.
 Thực hiện thành công kỹ thuật Dot-ELISA cho phát hiện vi khuẩn E.
ictaluri
 So sánh các phương pháp phát hiện vi khuẩn với phương pháp Dot-ELISA

3


Chương 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1

Bệnh do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri trên cá nuôi

2.1.1 Trên thế giới
Bệnh nhiễm khuẩn huyết trên cá da trơn xuất hiện đầu tiên vào năm 1976
ở miền đông nam Hoa Kỳ, đặc biệt là các bang Mississipi, Alabama, Arkansas,
Louisiana, Georgia, và Florida. Dịch bệnh này suốt một thập kỉ qua đã gây thất
thu hàng tỉ đô la cho ngành nuôi cá da trơn (James và ctv, 1990; Hawke và ctv,
1998).
Cá bị bệnh nổi đầu lên trên mặt nước và để lộ những đường bơi xoắn ốc
trên lớp bùn ao, sau đó cá chết. Cá có thể trương bụng, lồi mắt và mang cá nhợt
nhạt, nhiều đốm đỏ trên lưng, cuống đuôi. Gốc vây ngực chuyển sang màu trắng
nhạt, da vùng bụng, và mang cá chuyển từ màu đỏ thành màu nâu (Hawke và ctv,
1998).

Hình 2.1 Đốm trắng trên gan cá da trơn

Hình 2.2 U nhọt trắng, đỏ trên thân cá

( Nguồn trích từ SRAC Publication No. 477, 2006)

4

Đến năm 1979, Hawke và ctv dựa vào các dấu hiệu bệnh này đã phát hiện
tác nhân gây bệnh Edwardsiella ictaluri. Vi khuẩn này chỉ sống sót trong nước
khoảng tám ngày, nhưng nó đã được chứng minh có khả năng sống đến 95 ngày
ở nhiệt độ từ 18 – 250C khi được ủ bên trong ao bùn.
Bệnh nhiễm khuẩn huyết của cá da trơn là một bệnh theo mùa rõ rệt, dịch
bệnh xảy ra khi nhiệt độ nước dao động trong khoảng từ 240C đến 280C (750F –
820F). Đây là điều kiện nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của vi khuẩn. Do đó,
dịch bệnh thường thấy vào tháng năm, tháng sáu và tháng chín, tháng mười trong
ao nuôi ở miền tây nước Mỹ. Bên ngoài khoảng nhiệt độ này, tỉ lệ chết có thể
xuất hiện nhưng thấp và bệnh thường ở thể mãn tính (John và Craig, 1995; Oktay
và ctv, 2008).
Nghiên cứu Hawke và cộng tác viên vào năm 1998 cho thấy vi khuẩn E.
ictaluri còn là tác nhân gây bệnh trắng gan, và được phân lập đầu tiên trên cá
nheo (Ictalurus punctatus). Tuy nhiên, những biểu hiện bệnh lý trên cá nheo
hoàn toàn khác so với cá tra bị nhiễm bệnh (Oktay và ctv, 2008).
2.1.2 Việt Nam
Bệnh này xuất hiện lần đầu tiên trên cá tra ở đồng bằng sông Cửu Long
vào cuối năm 1998. Trên gan, thận và lách cá xuất hiện nhiều đốm trắng có
đường kính 1 – 3 mm, bên trong chứa dịch màu trắng đục. Tuy nhiên, nguyên
nhân gây bệnh chỉ được xác định là do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri ba năm
sau đó (Ferguson và ctv, 2001; Từ Thanh Dung và ctv, 2003).
Tại Việt Nam cao điểm của dịch bệnh thường xảy ra từ tháng 09 đến
tháng 12 hằng năm vào thời kì thời tiết chuyển mát. Thiệt hại do bệnh cũng rất
lớn, tỉ lệ chết có thể đến 90% trên cá tra giống và 50% trên cá tra nuôi thương
phẩm. Bệnh xuất hiện nhiều nhất vào mùa xuân, mùa thu trong ao nuôi mật độ
cao, chất lượng nước kém và trong nuôi cá lồng bè (Từ Thanh Dung và ctv,
2003; Đỗ Thị Hòa và ctv, 2004)..

5

Giống như những bệnh khác, cá bệnh do nhiễm vi khuẩn E. ictaluri
thường biểu hiện lờ đờ, kém ăn hoặc bỏ ăn, gầy yếu, bụng chướng tỏ, mắt lồi,
xuất huyết điểm xung quanh vùng miệng. Cá bệnh không có hiện tượng xuất
huyết trên da và hậu môn (Ferguson và ctv, 2001, Eric và ctv, 2007).
Năm 2007, theo nghiên cứu của Nguyễn Hữu Thịnh, khi giải phẫu bên
trong cá bệnh, một số cơ quan nội tạng như gan, lá lách, thận bị hoại tử, tạo thành
những đốm màu trắng đục đường kính 0,5 – 2,5 mm. Thận và tỳ tạng sưng to,
đặc biệt thận bị sưng và nhũn. Bệnh này còn gọi là bệnh “bệnh đốm trắng” hay
“bệnh hoại tử nội tạng”. Đây là bệnh tích điển hình của cá tra. Vì vậy, nông dân
nuôi cá tra thường gọi là “bệnh gan thận mủ”.

Hình 2.3: Cá Tra bị bệnh đốm trắng trên gan(G), thận (Th), tỳ tạng (Tt)
(Nguồn trích Từ Thanh Dung và ctv, 2003)
2.2

Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri

2.2.1 Khái quát
Edwardsiella một giống thuộc họ Enterobacteriaceae, có dạng hình que
mảnh, Gram âm, kích thước 1 x 3 µm, không sinh bào tử, chuyển động nhờ vành
tiêm mao (Đỗ Thị Hòa và ctv, 2004; Don và James và ctv, 2005). Giống
Edwardsiella thuộc nhóm vi khuẩn yếm khí tùy ý gồm có ba loài: E. tarda, E.
ictaluri và E. hoshinae. Trong đó, Việt Nam thường gặp hai loài: E. tarda và E.

6


ictaluri gây bệnh nhiễm khuẩn trên các loài cá vùng nhiệt đới (Ferguson và ctv,

2001; Đỗ Thị Hòa và ctv, 2004).
Edwardsiella ictaluri có dạng que thẳng nhỏ với kích thước 1 µm x 2 -3
µm. Tuy nhiên, vi khuẩn E. ictaluri phân lập từ cá tra có một số đặc điểm khác
với mô tả của Plumb (1993) như có dạng que và kích thước biến đổi. So với E.
tarda phát triển tốt ở nhiệt độ 37 0C, ngược lại E. ictaluri phát triển tốt ở nhiệt độ
280C và yếu ở nhiệt độ 370C. Sự khác nhau về loài của giống vi khuẩn này được
mô tả chi cụ thể theo Don và James (2005).
Bảng 2.1: Sự khác nhau giữa các loài thuộc giống Edwardsiella
Đặc điểm

E. tarda

E. hoshine

E .ictaluri

Sinh indole

+

d

−

Sinh H2S

+

(+)d

−

Di động

+

+

−

Biến dưỡng malonate

−

+

−

Lên men L-arabinose

−

d

−

Lên men sucrose

−

+

−

Lên mentrehalose

−

+

−

Lên men D-mannitol

−

+

−

Trong đó: d: dương tính yếu nhưng âm tính trong môi trường TSI
Nguồn trích dẫn :* Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 2005

7


2.2.2 Hình thái vi khuẩn Edwardsiella ictaluri
Edwardsiella ictaluri có kích cỡ 0,75 x 2,5 µm. Trên môi trường brain
heart infusion agar (BHIA), khuẩn lạc E. ictaluri sau hai mươi bốn giờ ủ trong
suốt và nhỏ li ti. Sau bốn mươi tám giờ ủ, khuẩn lạc phát triển rõ hơn, có nhân,

có màu trắng hơi trong, lồi, tròn với đường kính từ 0,5 – 2 mm. Kết quả nhuộm
Gram cho thấy đa số trực khuẩn ngắn đứng riêng lẻ, một số tạo thành chuỗi 2 – 3
tế bào và bắt màu hồng nhạt (Nguyễn Hữu Thịnh và ctv, 2007).

Hình 2.4: Khuẩn lạc E. ictaluri trên đĩa

Hình 2.5: Vi khuẩn E. ictaluri

0

môi trường BHIA ủ ở 28 C sau 48 giờ
(Nguồn trích Tạp chí KHKT Nông Lâm Nghiệp số 1 & 2/2007)
2.2.3 Đặc điểm sinh hóa
Đặc điểm sinh hóa của tác nhân gây bệnh viêm ruột nhiễm khuẩn huyết,
Edwardsiella ictaluri được mô tả đầu tiên bởi Hawke (1979), và chi tiết hơn bởi
Waltman (1986) và Plumb (1989). Nhiệt độ tối ưu cho vi khuẩn phát triển từ 25 –
30 0C. Khoảng nhiệt độ thích hợp cho loài vi khuẩn này ở Việt Nam là từ 22 – 28
0

C (trích dẫn bởi Ildiko và ctv, 2007).
Mặc dù đặc điểm sinh hóa, tiến trình phát bệnh của nhiễm khuẩn huyết và

những vùng thương tổn bệnh lý liên quan đã được xác định nhưng cơ chế xâm
nhập vào trong vật chủ nhạy cảm vẫn chưa được hiểu rõ. Miyazaki (1985) cho
8


rằng E. ictaluri xuất hiện đầu tiên ở khoang mũi và sau đó lây nhiễm sang não
thông qua ống mũi, sau đó lây lan toàn bộ hệ thống tuần hoàn và kết thúc bằng sự
nhiễm trùng máu (trích dẫn bởi Ildiko và ctv, 2007; Oktay và ctv, 2008).

Vi khuẩn E. ictaluri có thể tăng trưởng trên môi trường BHI có bổ sung
thêm 1,5 % NaCl, tăng trưởng tốt trong khoảng pH từ 7-7,5. Ở pH 6 tỉ lệ tăng
trưởng giảm 60%, và ở pH 5 hay pH 8, tăng trưởng giảm 23% và 33%. E.
ictaluri không tăng trường ở pH 4 và pH 9 (John và Dean, 1996).
Vi khuẩn này không có enzyme cytochrome oxidase, khử nitrate thành
nitrite, có các enzyme như lysine và orthinine decarbonxylase và lên men
glucose, maltose, không sinh indole và biến dưỡng citrate và các nguồn carbon
khác, không sản sinh sắc tố và không có các enzyme protease, esterase,
pectinase, chitinase, lipase, alginase, collagenase, hyaluronidase (Waltman và
ctv, 1986; Hawke và ctv, 1998; Ferguson và ctv, 2001; Don và ctv, 2005). Tại
Việt Nam, E. ictaluri phân lập đầu tiên từ cá tra là vi khuẩn Gram âm, không di
động, lên men không oxy hóa. Cho phản ứng catalase dương tính, oxidase âm
tính (Từ ThanhDung và ctv, 2003).
Năm 2007 theo kết quả của Nguyễn Hữu Thịnh định danh vi khuẩn bằng
kit IDS 14GNR. Kết quả khảo sát phản ứng sinh hóa bằng kit IDS 14GNS hoàn
toàn đồng nhất với kết quả định danh bằng kit API 20E đối với E.ictaluri được
phân lập từ cá tra (P. hypophthalmus) và trên cá hồi (Oncorhynchusmykis).

9


Bảng 2.2: Bảng phân tích đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn E. ictaluri
Phản ứng sinh
hóa
Catalase
Oxidase
Lên men
Glucose
Khử nitrate
ONPG

Urease
PAD
Citrate
Thủy giải
esculin
Sinh H2S
Indol
Voges-Poskauer
Malonate
LDC
Di động

2.3

E. ictaluri
Kết
quả
+
-

Quan sát
sủi bọt
không đổi màu

+
+
-

vàng
đỏ cánh sen

không màu
đỏ nhạt
vàng lợt
vàng

+
-

khôngđen
không đen
vòng vàng
vàng nhạt
vàng
khuẩn lạc mọc, môi trường có màu tím
khuẩn lạc mọc không nhòe đường cấy

Đặc điểm kháng nguyên vi khuẩn Edwardsiella ictaluri
Những nghiên cứu trước đây về tác nhân gây bệnh xuất huyết ruột trên cá

da trơn cho thấy có mối quan hệ huyết thanh học của ba mươi hai chủng E.
ictaluri với nhau, đặc biệt các chủng gây bệnh này có sự tương đồng về protein
và lipopolysaccharide khi được phân tích bằng kỹ thuật điện di SDS. Trong đó,
chỉ có một sự thay đổi nhỏ trong phần cấu trúc kháng nguyên O trên 3 chủng
được phân lập. Tuy nhiên, một vài biến đổi đã không loại bỏ sự nhận biết kháng
nguyên bằng kháng huyết thanh E. ictaluri trên thí nghiệm miễn dịch siêu kết
dính hay Western blot (Michelle và ctv, 2002; Mark và ctv, 2003, Victor và ctv,
2009).

10