NGHIÊN CỨU CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUI TRÌNH TĂNG SINH Bacillus subtilis Rd2.11 VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC ĐỘNG CỦA SẢN PHẨM B. subtilis Rd2.11 LỎNG LÊN SỰ PHÁT TRIỂN CỦA CÂY DƯA LEO

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
….WUX….

TRẦN THỊ NGỌC HIỀN

NGHIÊN CỨU CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUI TRÌNH
TĂNG SINH Bacillus subtilis Rd2.11 VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC ĐỘNG
CỦA SẢN PHẨM B. subtilis Rd2.11 LỎNG
LÊN SỰ PHÁT TRIỂN CỦA CÂY
DƯA LEO (Cucumis sativus L.)

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Thành Phố Hồ Chí Minh
Tháng 4/2011


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
….WUX….

TRẦN THỊ NGỌC HIỀN

NGHIÊN CỨU CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUI

TRÌNH TĂNG SINH Bacillus subtilis Rd2.11 VÀ ĐÁNH GIÁ
TÁC ĐỘNG CỦA SẢN PHẨM B. subtilis Rd2.11 LỎNG
LÊN SỰ PHÁT TRIỂN CỦA CÂY
DƯA LEO (Cucumis sativus L.)

Chuyên ngành

: Công nghệ Sinh học

Mã số

: 60.42.80

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Hướng dẫn Khoa học:
1. TS. LÊ ĐÌNH ĐÔN
2. TS. NGUYỄN VĂN HÙNG

Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 4/2011


NGHIÊN CỨU CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUI TRÌNH TĂNG SINH

Bacillus subtilis Rd2.11 VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC ĐỘNG CỦA SẢN PHẨM
B. subtilis Rd2.11 LỎNG LÊN SỰ PHÁT TRIỂN CỦA
CÂY DƯA LEO (Cucumis sativus L.)

TRẦN THỊ NGỌC HIỀN

Hội đồng chấm luận văn:
1. Chủ tịch:

TS. BÙI MINH TRÍ
Đại học Nông Lâm TP. HCM

2. Thư ký:

TS. TRẦN THỊ LỆ MINH
Đại học Nông Lâm TP. HCM

3. Phản biện 1:

TS. HOÀNG QUỐC KHÁNH
Viện Sinh học Nhiệt đới TP. HCM

4. Phản biện 2:

TS. TỪ THỊ MỸ THUẬN
Đại học Nông Lâm TP. HCM

5. Ủy viên:

TS. LÊ ĐÌNH ĐÔN
Đại học Nông Lâm TP. HCM

ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
HIỆU TRƯỞNG

i

LÝ LỊCH CÁ NHÂN
Tôi tên là Trần Thị Ngọc Hiền sinh ngày 19 tháng 01 năm 1983 tại huyện
Cần Giuộc - tỉnh Long An. Con Ông Trần Văn Dèo và Bà Trương Thị Nhứt.
Tốt nghiệp tú tài tại Trường Trung học phổ thông huyện Cần Giuộc, tỉnh
Long An năm 2001.
Tốt nghiệp Đại học ngành Công nghệ Sinh học hệ chính quy tại Đại học Cần
Thơ, tỉnh Cần Thơ năm 2006.
Tháng 09 năm 2007 theo học Cao học ngành Công nghệ Sinh học tại Đại học
Nông Lâm, Thủ Đức, thành phố Hồ Chí Minh.
Tình trạng gia đình: chưa lập gia đình.

Địa chỉ liên lạc: 129/A1, ấp 2/5, xã Long Hậu – Cần Giuộc – Long An.
Điện thoại: 0838903167, 0988415536
Email ( Fax):

ii


LỜI CAM ĐOAN
Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi.
Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa
từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác.

Tác giả luận văn

Trần Thị Ngọc Hiền

iii


LỜI CẢM TẠ
Chân thành bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến,
Quý thầy cô đã tận tâm truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt thời gian học.
TS. Lê Đình Đôn, Viện trưởng - Trưởng Bộ môn Công nghệ Sinh học và TS.
Nguyễn Văn Hùng, Trưởng Bộ môn Cơ điện tử, trường Đại học Nông Lâm TP.

HCM đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và động viên tôi hoàn thành tốt luận văn.
PGS.TS. Nguyễn Ngọc Tuân và tập thể cán bộ Phòng Đào tạo Sau Đại học
trường Đại học Nông Lâm TP. HCM đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện
thuận lợi trong thời gian học tập và hoàn thành luận văn tốt nghiệp.
Cô Phạm Thị Minh Kiều, Bộ môn Bảo vệ Thực vật – Khoa Nông học –
Trường Đại học Nông Lâm TP. HCM đã nhiệt tình giúp đỡ và hỗ trợ tôi thực hiện
tốt luận văn.
TS. Trần Thị Lệ Minh, Bộ môn Công nghệ Sinh học, Đại học Nông Lâm TP.
HCM đã dìu dắt lớp tôi trong suốt thời gian học.
Rất cảm ơn,
Tất cả các bạn lớp cao học Công nghệ Sinh học 2007 luôn ủng hộ và động viên
tôi trong suốt thời gian học.

Anh Hồ Hoài Bảo và anh Đào Duy Vinh, Bộ môn Cơ điện tử – Khoa Cơ khí
Công nghệ – Trường Đại học Nông Lâm TP. HCM đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong
quá trình sửa chữa và vận hành hệ thống thiết bị lên men.
Cuối cùng,
Xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, những người đã sinh
thành, nuôi dưỡng và giáo dục tôi để tôi có được ngày hôm nay.
Tác giả luận văn,
Trần Thị Ngọc Hiền

iv

TÓM TẮT
Đề tài “Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến qui trình tăng sinh Bacillus
subtilis Rd2.11 và đánh giá tác động của sản phẩm B. subtilis Rd2.11 lỏng lên sự
phát triển của cây dưa leo (Cucumis sativus L.)” được tiến hành tại Trại thực
nghiệm – Bộ môn Công nghệ Sinh học, phòng thí nghiệm – Bộ môn Bảo vệ Thực
vật – Khoa Nông học – Trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh, thời gian từ
tháng 4 năm 2009 đến tháng 4 năm 2010.
B. subtilis có khả năng đối kháng với nhiều loài nấm gây bệnh trên cây trồng,
đã được nhiều nước trên thế giới nghiên cứu và chế tạo chế phẩm phòng trừ sinh
học đối với các loại bệnh trên cây trồng. Trong đề tài này tập trung nghiên cứu dòng
B. subtilis Rd2.11 với thí nghiệm xác định các thông số tối ưu của các yếu tố ảnh
hưởng đến qui trình tăng sinh B. subtilis Rd2.11, tính ổn định của qui trình và thí

nghiệm sinh học đánh giá tác động của sản phẩm B. subtilis Rd2.11 lỏng lên sự phát
triển của cây dưa leo trồng ngoài đồng.
Kết quả qui hoạch thực nghiệm mức độ ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm
(mật số B. subtilis) của 3 yếu tố môi trường, tốc độ khuấy và thời gian lên men đã
tìm được qui trình tăng sinh đạt mật số cao với môi trường có thành phần gồm: 2%
bột đậu nành, 0,05% mật rỉ và 0,3% KH2PO4; tốc độ khuấy 200 vòng/phút và thời
gian nuôi cấy B. subtilis Rd2.11 ở 48 giờ là thích hợp nhất. Mật số B. subtilis
Rd2.11 chưa ổn định giữa các lần tăng sinh khác nhau vì có sự suy giảm rất mạnh
về mật số trong dung dịch sau thời gian tồn trữ 3 tháng. B. subtilis Rd2.11 vẫn lưu
giữ được đặc tính trong quá trình nuôi cấy và có tác động kích thích sự phát triển
của cây dưa leo trồng ngoài đồng.

v


ABSTRACT
The thesis “Studying the effects of the fermented process of Bacillus subtilis
Rd2.11 and assessing the effects of the finished product of liquid B. subtilis Rd2.11
on the growth of cucumber (Cucumis sativus L.)” was conducted at the Department
of Biotechnology, Laboratory of the Plant Protection Department, the Faculty of
Argonomy, Nong Lam University in Ho Chi Minh city from April 2009 through
April 2010.
B. subtilis was abled to antagonize different kinds of plant fungus, has been
studied and used to make preventive products for plant diseases. This thesis focuses

on studing B. subtilis Rd2.11 with the experiment defining optimal data of the
effects of the fermentation of B. subtilis Rd2.11, the stability of fermentation and
biological experiments assessing the effects of the liquid B. subtilis Rd2.11 on the
growth of the cucumber in the field.
The experiment of the effects of 3 factors including the fermented medium,
stirring velocity and fermented time on the product quality (density of B. subtilis)
showed that the fermented process of B. subtilis Rd2.11 reached high density in the
fermented medium of including 2% soy-bean flour, 0.05% molasses and 0.3%
KH2PO4, with the stirring velocity of 200 rpm and the most appropriate fermented
condition of 48 hours. With the ratios for monitoring the density of B. subtilis
Rd2.11 in the liquid B. subtilis Rd2.11, after a period of 3 months, it indicates that
there is a drastic decrease in the density of the B. subtilis Rd2.11. Thus, B. subtilis

Rd2.11 does not show high stability because the fermentation equipment is
defective. For biological experiment assessing the effects of the liquid B. subtilis
Rd2.11 on the growth of cucumber in the field, all the results showed that B. subtilis
Rd2.11 had useful effects of stimulating the growth of cucumber. This showed the
stable activity of B. subtilis Rd2.11 in the culture processing.

vi


MỤC LỤC
CHƯƠNG

TRANG

Trang tựa
Trang chuẩn y ........................................................................................... i
Lý lịch cá nhân ........................................................................................ ii
Lời can đoan ........................................................................................... iii
Cảm tạ ..................................................................................................... iv
Tóm tắt..................................................................................................... v
Abstract................................................................................................... vi
Mục lục .................................................................................................. vii
Danh sách hình ....................................................................................... xi
Danh sách bảng..................................................................................... xiii

1. MỞ ĐẦU .................................................................................................. 1
1.1. Đặt vấn đề .............................................................................................. 1
1.2. Mục tiêu nghiên cứu .............................................................................. 3
1.3. Yêu cầu .................................................................................................. 3
2. TỔNG QUAN VÀ LÝ THUYẾT ........................................................... 4
2.1. Bacillus subtilis ...................................................................................... 4
2.1.1. Lịch sử phát hiện ................................................................................. 4
2.1.2. Phân loại Bacillus subtilis ................................................................... 4
2.1.3. Đặc điểm hình thái của Bacillus subtilis ............................................. 5
2.1.4. Sự phân bố, sinh trưởng và phát triển của Bacillus subtilis ................ 5
2.1.4.1. Sự phân bố của B. subtilis ................................................................ 5
2.1.4.2. Sự sinh trưởng và phát triển của B. subtilis .................................... 6

2.1.5. Bào tử và khả năng tạo bào tử của Bacillus subtilis ........................... 6
2.1.6. Tính đối kháng của Bacillus subtilis ................................................... 8

vii


2.1.7. Những ứng dụng từ Bacillus subtilis ............................................... 10
2.1.8. Tình hình nghiên cứu Bacillus subtilis trong và ngoài nước ............ 14
2.1.8.1. Tình hình nghiên cứu B. subtilis ngoài nước ................................. 14
2.1.8.2. Tình hình nghiên cứu B. subtilis trong nước.................................. 15
2.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của Bacillus
subtilis trong quá trình nhân sinh khối ................................................ 17

2.3. Sơ lược về hệ thống lên men tạo chế phẩm sinh học ........................... 18
2.3.1. Kỹ thuật lên men ............................................................................... 18
2.3.2. Các phương pháp lên men................................................................. 18
2.3.3. Hệ thống lên men .............................................................................. 19
2.3.3.1. Thiết bị lên men ngoài nước ....................................................... 19
2.3.3.2. Hệ thống thiết bị lên men trong nước ............................................ 25
3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................... 28
3.1. Thời gian thực hiện .............................................................................. 28
3.2. Địa điểm ............................................................................................... 28
3.3. Nội dung nghiên cứu ............................................................................ 28
3.4. Vật liệu nghiên cứu .............................................................................. 28
3.4.1. Nguyên vật liệu ................................................................................ 28

3.4.2. Môi trường - Hóa chất....................................................................... 29
3.4.3. Dụng cụ và trang thiết bị thí nghiệm ................................................ 29
3.5. Phương pháp nghiên cứu...................................................................... 29
3.5.1. Phương pháp nuôi cấy Bacillus subtilis Rd2.11 ............................... 29
3.5.2. Phương pháp bố trí các thí nghiệm ................................................... 30
3.5.2.1. Cơ sở chọn các yếu tố đầu vào (X) và đầu ra (Y) .......................... 30
3.5.2.2. Giả định bài toán hộp đen .............................................................. 30
3.5.2.3. Phương pháp bố trí thí nghiệm .............................................................. 32
3.5.3. Phương pháp đánh giá chất lượng sản phẩm B. subtilis
Rd2.11 lỏng ........................................................................................ 35
3.5.3.1. Phương pháp xác định mật số B. subtilis Rd2.11 .......................... 35

viii


3.5.3.2. Phương pháp đánh giá tác động của sản phẩm B. subtilis Rd2.11
lỏng lên sự phát triển của cây dưa leo trồng ngoài đồng ............... 36
3.5.3.3. Phương pháp xác định chỉ tiêu theo dõi diễn biến mật số B. subtilis
Rd2.11 trong 3 tháng ở nhiệt độ phòng ......................................... 36
3.5.4. Phương pháp xử lý số liệu ............................................................... 37
3.5.4.1. Xử lý thống kê................................................................................ 37
3.5.4.2. Tính toán tối ưu hóa ....................................................................... 37
4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .............................................................. 39
4.1. Kết quả qui hoạch thực nghiệm xác định các thông số tối ưu của thiết

bị lên men Bacillus subtilis Rd2.11 ..................................................... 39
4.1.1. Kết quả khử trùng đường ống dẫn khí, dẫn hơi và thiết bị
lên men ........................................................................................... 39
4.1.2. Kết quả khử trùng môi trường .......................................................... 39
4.2. Kết quả xác định các thông số tối ưu cho các yếu tố tác động lên qui
trình nhân sinh khối Bacillus subtilis Rd2.11 ...................................... 41
4.2.1. Kết quả xác định mật số Bacillus subtilis Rd2.11 ............................ 41
4.2.2. Kết quả so sánh sự khác biệt về mật số B. subtilis Rd2.11 ............... 43
4.2.3. Xác định các thông số tối ưu cho các yếu tố tác động lên qui trình
tăng sinh B. subtilis Rd2.11 ............................................................. 50
4.2.4. Kết quả theo dõi chỉ tiêu diễn biến mật số B. subtilis Rd2.11
trong 3 tháng ở nhiệt độ phòng ........................................................ 53

4.3. Kết quả đánh giá tác động của sản phẩm Bacillus subtilis Rd2.11 lỏng
lên sự phát triển của cây dưa leo trồng ngoài đồng ............................. 57
4.4. Thảo luận chung ................................................................................... 60
5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................... 64
5.1. Kết luận ................................................................................................ 64
5.2. Đề nghị ................................................................................................. 65
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................ 66
PHỤ LỤC ................................................................................................... 70

ix

Phụ lục 1: . Kết quả khảo nghiệm chạy khử trùng hệ thống lên men năng
suất 50 lít/mẽ ........................................................................... 70
Phụ lục 2: Bảng kết quả phân tích thống kê xác định các thông số tối ưu
cho các yếu tố tác động lên qui trình nhân sinh khối
Bacillus subtilis Rd2.11 .............................................................. 73
Phụ lục 3: Bảng kết quả phân tích thống kê đánh giá tác động của sản
phẩm Bacillus subtilis Rd2.11 lỏng lên sự phát triển của
cây dưa leo trồng ngoài đồng ..................................................... 78
Phụ lục 4: Kết quả phân tích thống kê kiểm tra mật số Bacillus subtilis
Rd2.11 trong 3 tháng .................................................................. 86
Phụ lục 5: Một số hình ảnh về thiết bị lên men và kiểm tra mật số
B. subtilis Rd2.11 ....................................................................... 88

x


DANH SÁCH HÌNH
HÌNH

TRANG

Hình 2.1. Hình dạng Bacillus subtilis...................................................................... 5
Hình 2.2. Bacillus subtilis tạo bào tử. ................................................................... 8
Hình 2.3. B. subtilis tạo lớp màng bảo vệ rễ cây Arabidopsis thaliana. ................. 9

Hình 2.4. Bacillus subtilis đối kháng với đồng loại. ............................................. 10
Hình 2.5. Sản phẩm Natto – lên men đậu nành từ Bacillus subtilis. ..................... 11
Hình 2.6. Sơ đồ qui trình chế biến đậu hũ lên men bởi B. subtilis. ....................... 12
Hình 2.7. Chế phẩm B. subtilis dùng trong thủy sản. ............................................ 13
Hình 2.8. Sơ đồ quá trình lên men tạo chế phẩm sinh học. ................................... 20
Hình 2.9. Thiết bị lên men với bộ đảo trộn cơ học dạng sủi bọt có thể tích
là 63m3. ................................................................................................. 21
Hình 2.10. Thiết bị lên men dạng xilanh có đảo trộn bằng khí động học và
thổi khí môi trường. ............................................................................. 23
Hình 2.11. Sơ đồ dây chuyền công nghệ nuôi cấy vi sinh vật bằng phương
pháp nuôi cấy chìm. ............................................................................. 24
Hình 2.12. Sơ đồ dây chuyền công nghệ nuôi cấy vi sinh vật bằng phương

pháp bề mặt. ......................................................................................... 25
Hình 2.13. Sơ đồ hệ thống lên men tạo chế phẩm sinh học. ................................. 26
Hình 2.14. Sơ đồ cấu tạo máy khuấy lên men ...................................................... 27
Hình 3.1. Mô hình bài toán hộp đen quá trình lên men. ........................................ 31
Hình 3.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm của phương pháp Box – Behnken với
3 yếu tố. ................................................................................................. 32
Hình 3.3. Sơ đồ cụm thiết bị lên men 50 lít/mẻ. ................................................... 34
Hình 4.1. Biểu đồ diễn biến nhiệt độ trong nồi lên men theo thời gian ở chế độ
khử trùng không tải................................................................................ 40
Hình 4.2. Biểu đồ diễn biến nhiệt độ trong nồi lên men theo thời gian ở chế độ
khử trùng có tải. ..................................................................................... 41

xi


Hình 4.3. Biểu đồ biểu diễn sự khác biệt về mật số B. subtilis Rd2.11 theo môi
trường với 3 mức thời gian tương ứng 24, 48 và 72 giờ. ...................... 44
Hình 4.4. Biểu đồ biểu diễn sự khác biệt về mật số B. subtilis Rd2.11 theo tốc độ
khuấy với 3 mức thời gian tương ứng 24, 48 và 72 giờ. ....................... 47
Hình 4.5. Biểu đồ biểu diễn sự khác biệt về mật số B. subtilis Rd2.11 theo
thời gian ................................................................................................. 48
Hình 4.6. Khuẩn lạc B. subtilis Rd2.11 trên môi trường PGA (ủ trong 24 giờ). .. 48
Hình 4.7. Khuẩn lạc B. subtilis Rd2.11 trên môi trường PGA (ủ trong 24 giờ). .. 49
Hình 4.8. Khuẩn lạc B. subtilis Rd2.11 trên môi trường PGA (ủ trong 24 giờ). .. 49

Hình 4.9. Biểu đồ biểu diễn sự ảnh hưởng của môi trường và tốc độ khuấy lên
mật số B. subtilis Rd2.11 trong quá trình nhân sinh khối. .................... 51
Hình 4.10. Biểu đồ biểu diễn sự ảnh hưởng của tốc độ khuấy và thời gian lên
mật số B. subtilis Rd2.11 trong quá trình nhân sinh khối. .................... 52
Hình 4.11. Biểu đồ biểu diễn sự ảnh hưởng của môi trường và thời gian lên
mật số B. subtilis Rd2.11 trong quá trình nhân sinh khối. .................... 53
Hình 4.12. Dung dịch B. subtilis Rd2.11 lỏng sau 72 giờ tăng sinh được lưu trữ
trong phòng thí nghiệm. ........................................................................ 54
Hình 4.13. Biểu đồ biểu diễn sự khác biệt mật số B. subtilis Rd2.11 sau 3 tháng
và sau 72 giờ tăng sinh. ....................................................................... 54
Hình 4.14. Mật số B. subtilis Rd2.11, nồng độ pha loảng 10-4. ............................ 56
Hình 4.15. Cây dưa leo 5 ngày sau trồng. ............................................................. 58

Hình 4.16. Cây dưa leo 10 ngày sau trồng. ........................................................... 58
Hình 4.17. Cây dưa leo 15 ngày sau trồng.............................................................. 58

xii


DANH SÁCH BẢNG
BẢNG

TRANG

Bảng 3.1. Miền thực nghiệm theo phương pháp Box – Behnken qui hoạch các

yếu tố ảnh hưởng đến qui trình nhân sinh khối B. subtilis Rd2.11 ....... 33
Bảng 3.2. Ma trận thí nghiệm qui hoạch thực nghiệm các yếu tố ảnh hưởng đến
qui trình nhân sinh khối B. subtilis Rd2.11 ........................................... 33
Bảng 4.1. Mật số B. subtilis Rd2.11 đạt được trong qui trình nhân sinh khối ...... 42
Bảng 4.2. Kết quả so sánh sự khác biệt mật số B. subtilis Rd2.11 theo
môi trường ............................................................................................. 43
Bảng 4.3. Kết quả so sánh sự khác biệt mật số B. subtilis Rd2.11 theo tốc
độ khuấy ................................................................................................ 44
Bảng 4.4. Kết quả so sánh sự khác biệt mật số B. subtilis Rd2.11 theo
thời gian ................................................................................................. 45
Bảng 4.5. Sự khác biệt về mật số B. subtilis Rd2.11 theo thời gian ..................... 46
Bảng 4.6. Sự khác biệt về mật số B. subtilis Rd2.11 theo môi trường ................. 46

Bảng 4.7. Sự khác biệt về mật số B. subtilis Rd2.11 theo tốc độ khuấy ............... 46
Bảng 4.8. Kết quả kiểm tra mật số Bacillus subtilis Rd2.11 trong 3 tháng .......... 55
Bảng 4.9. Kết quả so sánh sự khác biệt mật số B. subtilis Rd2.11 ban đầu và sau
lưu trữ .................................................................................................. 55
Bảng 4.10. Kết quả chiều cao trung bình của 10 cây dưa leo có xử lý và không
xử lý sản phẩm Bacillus subtilis Rd2.11 lỏng ....................................... 57
Bảng 4.11. Kết quả so sánh chiều cao cây dưa leo có xử lý và không xử lý
sản phẩm Bacillus subtilis Rd2.11 lỏng 5 ngày sau trồng ..................... 59
Bảng 4.12. Kết quả so sánh chiều cao cây dưa leo có xử lý và không xử lý
sản phẩm Bacillus subtilis Rd2.11 lỏng 10 ngày sau trồng ................... 59
Bảng 4.13. Kết quả so sánh chiều cao cây dưa leo có xử lý và không xử lý
sản phẩm Bacillus subtilis Rd2.11 lỏng 15 ngày sau trồng ................... 59

xiii


Chương 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Trong nền sản xuất nông nghiệp, bên cạnh các yếu tố về “nước, phân, giống”
sinh vật gây hại cây trồng là một vấn đề lớn mà con người phải đối mặt. Có rất
nhiều loại sinh vật khác nhau sử dụng cây trồng làm thức ăn, hoặc sống ký sinh trên
cây trồng. Đây là một trong những nguyên nhân gây thiệt hại nặng nề cho năng suất
cây trồng. Hằng năm, sản lượng lương thực, rau quả trên thế giới bị mất do sâu

bệnh vào khoảng 20% - 35%, trong đó các nước Châu Âu mất trung bình khoảng
20%, các nước Châu Á mất khoảng 35%. Từ năm 1960 đến nay, nhiều nước trên
thế giới đã sử dụng ồ ạt các chất hóa học để diệt trừ sâu bệnh. Việc sử dụng các loại
thuốc hóa học ở thời kỳ đầu đem lại lợi ích rất lớn, là khả năng tiêu diệt sâu bệnh rất
nhanh và rất có hiệu quả. Sau 40 năm thế giới sử dụng thuốc trừ sâu hóa học đã cho
thấy những nhược điểm khó chấp nhận được như: gây hiện tượng ô nhiễm nước và
ô nhiễm đất, việc sử dụng thuốc hóa học không theo chỉ dẫn cụ thể tạo ra sự dư thừa
không chỉ tồn tại trong đất, trong nước mà còn bám vào rau, quả và nông sản gây ra
hiện tượng ngộ độc, thậm chí dẫn đến tử vong ngày càng nhiều (Lương Đức Phẩm,
2000). Do đó, Việt Nam cũng như nhiều quốc gia trên thế giới đã cảnh báo và cấm
sử dụng nhiều loại thuốc hóa học, thúc đẩy xu hướng sử dụng đấu tranh sinh học
ngày càng được chú ý.

Tiến bộ của ngành Công nghệ Sinh học là đã tạo ra được những chế phẩm
sinh học có nguồn gốc từ vi sinh vật. Sản xuất những chế phẩm sinh học này dựa
trên nền tảng khoa học là sự đấu tranh sinh tồn giữa các loài trong giới sinh vật. Các

1


vi sinh vật muốn tồn tại phải tạo ra những vũ khí, ngoài khả năng thích nghi và khả
năng sinh sản phát triển mạnh. Vũ khí đó chính là những độc tố hoặc kháng sinh
được tổng hợp bởi vi sinh vật trong suốt quá trình phát triển trong môi trường sống
có nhiều yếu tố cạnh tranh.
Các loại chế phẩm sinh học từ vi sinh vật đã và đang được sử dụng ngày

càng phổ biến. Trong đó, Bacillus subtilis từ lâu được xem như là một tác nhân
phòng trừ sinh học đối với các loài nấm và vi khuẩn gây bệnh trên cây trồng. Một
số kháng sinh có tác dụng ức chế sự phát triển của các tác nhân gây bệnh được sản
sinh từ B. subtilis như polymyxin, difficidin, subtilin, mycobacillin. Trong các loại
kháng sinh trên thì mycobacillin có tác dụng kháng nấm mạnh nhất. Dựa vào đặc
tính đó, nhiều nhà khoa học trên thế giới đã nghiên cứu ứng dụng B. subtilis để
phòng trị tác nhân gây bệnh trong đất phổ biến như Rhizoctonia, Fusarium, Pythium
và Phytophthora. Nghiên cứu của Saman (2007) chất ethyl acetate ly trích từ B.
subtilis CA32r có khả năng ức chế sự phát triển của nấm Sclerotium ngay khi hạch
nấm bắt đầu nảy mầm. Hiện nay, trên thế giới cũng như ở Việt Nam đã xuất hiện
nhiều sản phẩm bảo vệ thực vật có nguồn gốc từ B. subtilis như sản phẩm Subtilex
của công ty Becker Underwood (Mỹ) dùng để phòng trị nấm Fusarium spp.,

Rhizoctonia spp. và Pythium spp. gây bệnh trên hạt và thối rễ. Bên cạnh những ứng
dụng trong trồng trọt thì các chế phẩm từ B.subtilis cũng đã đóng góp rất lớn vào
chăn nuôi như năm 1993, Nguyễn Văn Đông đã nghiên cứu sản xuất thử nghiệm
chế phẩm Biosubtyl dùng trong phòng và điều trị bệnh tiêu chảy heo con, giúp heo
tăng trọng tốt.
Tuy nhiên, để tạo ra được các chế phẩm sinh học từ B. subtilis ứng dụng vào
thực tế thì nghiên cứu về qui trình nhân sinh khối B. subtilis là rất cần thiết. Trong
đó, nghiên cứu các yếu tố tác động lên sinh khối B. subtilis là vấn đề tiên quyết cho
xây dựng qui trình công nghệ sản xuất chế phẩm sinh học.
Từ thực tế trên, để xác định chính xác các thông số tối ưu cho quá trình tăng
sinh B. subtilis, tên đề tài được đề nghị thực hiện là “Nghiên cứu các yếu tố ảnh
hưởng đến qui trình tăng sinh Bacillus subtilis Rd2.11 và đánh giá tác động của

2


sản phẩm B. subtilis Rd2.11 lỏng lên sự phát triển của cây dưa leo (Cucumis
sativus L.)”.
1.2. Mục tiêu nghiên cứu
Xác định các điều kiện tối ưu của các yếu tố tác động đến sinh khối B.
subtilis Rd2.11. Từ đó, làm tiền đề xây dựng qui trình nhân sinh khối B. subtilis
Rd2.11 đạt mật số cao, để sản xuất thử nghiệm các chế phẩm thuốc trừ bệnh sinh
học ở qui mô công nghiệp, giúp phòng trừ bệnh hại cây trồng, nâng cao năng suất
cây trồng và đem lại lợi nhuận cao cho người dân.

1.3. Yêu cầu
Xác định qui trình nhân sinh khối B. subtilis Rd2.11 đạt mật số cao.
Đánh giá tính ổn định của qui trình tăng sinh B. subtilis Rd2.11.
Đánh giá hoạt tính của B. subtilis Rd2.11.

3


Chương 2
TỔNG QUAN
2.1. Tổng quan về Bacillus subtilis
2.1.1. Lịch sử phát hiện

Bacillus subtilis được phát hiện đầu tiên trong phân ngựa vào năm 1941 bởi
tổ chức Nazi của Đức. Lúc đầu B. subtilis được sử dụng chủ yếu để phòng trị bệnh
lị cho các binh sĩ Đức chiến đấu ở Bắc Phi.
Năm 1949-1957 Henry và các cộng sự đã tách được các chủng thuần khiết
của B. subtilis. Từ “subtilis therapy” có nghĩa là “thuốc subtilis” ra đời trị các chứng
viêm ruột, viêm đại tràng, chống tiêu chảy và rối loạn tiêu hóa. Ngày nay, B. subtilis
đã được nghiên cứu và sử dụng rộng rãi trên thế giới (Vũ Văn Ngữ, 1979).
2.1.2. Phân loại Bacillus subtilis
Từ bacillus nhằm miêu tả hình dáng của một nhóm vi khuẩn khi được quan
sát dưới kính hiển vi. Bacillus xuất phát từ tiếng Latin có nghĩa là hình que. Do đó,
một số nơi gọi là khuẩn que hoặc trực khuẩn.
Tuy nhiên, Bacillus là tên của một chi gồm các vi khuẩn hình que, Gram

dương, hiếu khí thuộc về họ Bacillaceae trong ngành Firmicutes.
Phân loại khoa học theo Cohn (1872), Bacillus subtilis thuộc:
Giới (Kingdom)

Bacteria

Ngành (Phylum)

Firmicutes

Lớp (class)

Bacilli

Bộ (order)

Bacillales

Họ (family)

Bacillaceae

Chi (genus)

Bacillus

Loài (species)
B. subtilis
( />
4


2.1.3. Đặc điểm hình thái của Bacillus subtilis
B. subtilis là trực khuẩn nhỏ, hình que, hai đầu tròn, bắt màu Gram +, kích
thước 2-3 x 0,7-0,8 µm, đứng đơn lẽ hoặc hình chuổi ngắn, có khả năng di động
(Hình 2.1). Sinh bào tử hình bầu dục, kích thước 1,5-1,8 x 0,8µm. Ở điều kiện

1000C, bào tử của B. subtilis chịu được 180 phút, có tính ổn định cao với nhiệt độ
thấp và sự khô cạn, với tác động của hóa chất và tia bức xạ (Holt, 1997).

Hình 2.1. Hình dạng Bacillus subtilis
( />2.1.4. Sự phân bố, sinh trưởng và phát triển của Bacillus subtilis
2.1.4.1. Sự phân bố của B. subtilis
B. subtilis thuộc nhóm vi sinh vật hiếu khí hay kỵ khí tùy nghi. Phân bố hầu
hết trong tự nhiên, phần lớn B. subtilis cư trú trong đất và rơm cỏ nên còn được gọi
là “trực khuẩn rơm cỏ”. Thông thường đất trồng trọt có khoảng 106 - 107 cfu/g. Ảnh
hưởng có ích của nhóm vi khuẩn này là do sự sản sinh ra các chất kích thích tăng
trưởng cây, chất ức chế hoặc làm suy yếu các tác nhân gây bệnh cây trồng.
Trong nước và đất bùn ở cửa sông cũng như ở nước biển đều có mặt bào tử

và tế bào B. subtilis. Đất nghèo dinh dưỡng như ở những vùng đất hoang, đất sa
mạc thì sự hiện diện của B. subtilis rất hiếm. Ngoài ra, B. subtilis còn có mặt trong
các thực phẩm như mắm, tương, chao; trong các nguyên liệu sản xuất bột mì, bột
gạo (Nguyễn Đức Lượng, 2000).

5


2.1.4.2. Sự sinh trưởng và phát triển của B. subtilis
Sinh trưởng là sự gia tăng kích thước và khối lượng của tế bào, phát triển
(hoặc sinh sản) là sự gia tăng số lượng tế bào. Các tế bào vi khuẩn thường sinh sản
bằng cách nhân đôi. Vi khuẩn có tốc độ sinh trưởng rất cao, tốc độ này tùy thuộc

vào điều kiện dinh dưỡng, mức độ hiếu khí. Nếu giảm nhiệt độ 100C thì tốc độ sinh
sản của vi khuẩn giảm từ 2 đến 3 lần (Lương Đức Phẩm, 2000).
Sự sinh trưởng của vi khuẩn có thể tạo ra sự trao đổi chất, nhưng để sản xuất
một chất trao đổi như mong muốn thì cơ thể của vi khuẩn phải được sinh trưởng
dưới những điều kiện nuôi cấy đặc biệt với tốc độ sinh trưởng đặc trưng. Sự sinh
trưởng và trao đổi chất của vi khuẩn liên quan chặt chẽ với các điều kiện của môi
trường bên ngoài bao gồm hàng loạt các yếu tố khác nhau, tác động qua lại với
nhau. Đa số các yếu tố đó đều có một đặc tính tác dụng chung biểu hiện ở ba điểm
hoạt động là tối thiểu, tối thích và cực đại.
B. subtilis có nhiệt độ sinh trưởng tối thích là 370C, phát triển bằng cách nẩy
mầm do sự nứt bào tử, không kháng acid. B. subtilis không có không bào khi nuôi
trên môi trường thạch có glucose, chủ yếu gồm các loài sống hiếu khí.

B. subtilis phát triển trong điều kiện hiếu khí, nhưng trong môi trường thiếu
oxy B. subtilis vẫn phát triển được, pH thích hợp từ 7,0 - 7,4. B. subtilis phát triển
trên hầu hết các môi trường cơ bản (như môi trường TSA (Trypticase Soya Agar),
môi trường TSB (Trypticase Soya Broth), môi trường giá đậu-peptone (Nguyễn
Duy Khánh, 2006).
2.1.5. Bào tử và khả năng tạo bào tử của Bacillus subtilis
Bào tử là một hình thức tiềm sinh của vi khuẩn giúp cho vi khuẩn vượt qua
những điều kiện bất lợi của môi trường. Bào tử của B. subtilis có chứa các thành
phần hóa học cơ bản như ở tế bào sinh dưỡng nhưng có một vài điểm khác về tỉ lệ
giữa các thành phần và có thêm một số thành phần mới. Bào tử B. subtilis có dạng
elip đến hình cầu, kích thước chiều rộng từ 0,6 - 0,9 µm, chiều dài từ 1,0 - 1,5 µm,
nằm giữa hoặc trong khoảng trung tâm đến gần cuối tế bào.

6


Mỗi cá thể chỉ tạo một bào tử (Hình 2.2) có khả năng chịu nhiệt, nhờ khả
năng tạo bào tử mà B. subtilis có thể tồn tại được trong các điều kiện bất lợi (như
dinh dưỡng môi trường cạn kiệt, môi trường tích lủy sản phẩm trao đổi chất có hại,
nhiệt độ cao). Quá trình hình thành bào tử gồm các bước sau:
1. tế bào chất và nhân tập trung tại một vị trí nhất định trong tế bào,
2. tế bào chất tiếp tục cô đặc và tạo tiền bào tử (prospore),
3. tiền bào tử hình thành hai lớp màng, tăng cao tính kháng bức xạ,
4. tổng hợp các lớp vỏ bào tử,

5. giải phóng bào tử.
Theo Cappuccino (1992), khi môi trường sống thuận lợi thì bào tử B. subtilis
sẽ hút nước và trương ra, vỏ sẽ bị phá hủy và bào tử sẽ nẩy mầm phát triển thành tế
bào sinh dưỡng mới, quá trình nhân đôi xảy ra liên tục đạt được mật số tối đa. Khi
môi trường cạn kiệt dinh dưỡng và điều kiện sống không thuận lợi thì tế bào sinh
dưỡng sẽ xuất hiện nội bào tử bên trong.
Bào tử B. subtilis có sức đề kháng cao đối với các yếu tố vật lý và hóa học
như nhiệt độ, tia cực tím, áp suất, chất sát trùng và chất hút ẩm. Bào tử có khả năng
chịu đựng được điều kiện khắc nghiệt của môi trường là do cấu tạo trạng thái sinh
học của bào tử đã thay đổi nhiều so với thể sinh dưỡng. Vỏ bào tử chứa nhiều lipid
và dày làm hạn chế rất nhiều sự xâm nhập của các chất hóa học, đồng thời cấu trúc
xốp của màng lại là vật cách nhiệt khá tốt.

Lượng nước trong bào tử rất ít, phần lớn ở trạng thái liên kết làm cho sức
chịu đựng của bào tử với môi trường nhất là với nhiệt độ tăng lên rất nhiều. Trong
bào tử có chứa một lượng lớn ion Ca++ và dipicolinic acid nên có giả thuyết cho
rằng việc tạo phức hợp bền vững của Ca++- DPA sẽ dẫn đến sự ngưng kết các
polymer sinh học trong bào tử và do đó làm tăng khả năng chịu nhiệt của bào tử do
làm giảm sự biến tính của protein.
Hơn nữa, các hệ enzyme trong bào tử ở trạng thái gần như không hoạt động,
các phản ứng sinh hóa gần như không xảy ra và điều này đã giúp cho bào tử B.

7

subtilis có thể tồn tại ở trong trạng thái nghỉ trong thời gian dài hàng ngàn năm
(Cappuccino, 1992).

Nội bào tử
Tế bào sinh
dưỡng

Hình 2.2. Bacillus subtilis tạo bào tử
()
2.1.6. Tính đối kháng của Bacillus subtilis
B. subtilis có khả năng tổng hợp hơn 20 loại kháng sinh khác nhau như:
subtilin, subtilisin A, sublancin, bacilisocin, polymyxin, difficidin, mycobacillin, có

tác dụng ức chế sự phát triển của các tác nhân gây bệnh, kháng khuẩn và nấm rất
hữu ích. Trong các loại kháng sinh trên, mycobacillin có tác dụng kháng nấm mạnh
nhất. Cơ chế đối kháng của B. subtilis chủ yếu dựa vào khả năng tổng hợp các loại
kháng sinh trên, đa số là các acid amin dạng chuỗi và dạng vòng; khả năng tạo ra
các chất dể chuyển hóa bên ngoài thành tế bào có thể ức chế hoạt động của nhiều
loại nấm gây hại (Loeffler, 1986). Bên cạnh đó, B. subtilis còn có khả năng tạo ra
các enzyme: cellulase, chitinase, và β-1,3-glucanase. Các enzyme này có thể phân
giải màng tế bào của nhiều loại nấm gây hại cây trồng (Marten, 2000).
Loeffler và ctv (1986) đã nghiên cứu khả năng tạo phức chất dipeptide
bacilysin của vài loài thuộc chi Bacillus bao gồm: B. subtilis, B. pumilus, B.
coagulans và B. licheniformic. Thành phần của lipopeptid do Bacillus tiết ra bao

8


gồm: fengymycin, bacilysin và fencimycin có khả năng kháng nấm. Bacilysin đã
kìm hãm các men, fencimycin kìm hãm vi khuẩn và khuẩn ty. Fencimycin ít độc đối
với cây trồng thử nghiệm và chống lại Rhizotonia solani tốt hơn các chất kháng sinh
khác. Công trình nghiên cứu của Tschen (1987) về phòng trừ Rhizotonia solani bởi
B. subtilis đã kết luận rằng fengymycin được sản xuất bởi B. subtilis F-29-3 có khả
năng bảo vệ cây trồng, hạn chế sự xâm nhiễm của Rhizotonia solani. Một nghiên
cứu khác trên B. subtilis được phân lập từ vùng rể lúa là một loại vi khuẩn đối
kháng với Rhizotonia solani và kích thích sự hình thành của rể lúa. Thí nghiệm
đánh giá khả năng phòng trừ bệnh trên nhiều ruộng khác nhau cho thấy chỉ số bệnh

giảm gần 66% và tăng năng suất từ 7,7% đến 26,5% (Tang và ctv, 1996).
Theo Harsh Bais, chuyên gia về thực vật và đất của Đại học Delaware (Mỹ)
đã theo dõi Arabidopsis thaliana - một loài hoa nhỏ, khi bị vi khuẩn Pseudomonas
syringae tấn công, rễ của Arabidopsis thaliana sẽ tiết ra axit malic để thu hút B.
subtilis. B. subtilis có khả năng tạo ra một màng có các đặc tính chống vi khuẩn
quanh rễ cây (Hình 2.3).

Ghi chú:
Rễ cây Arabidopsis thaliana
phóng to với lớp màng bảo vệ
do B. subtilis tạo ra được đánh
dấu bằng màu xanh lục.

Hình 2.3. B. subtilis tạo lớp màng bảo vệ rễ cây Arabidopsis thaliana
( />Ngoài khả năng tổng hợp kháng sinh, B. subtilis còn có khả năng cạnh tranh
dinh dưỡng nên B. subtilis có tính đối kháng trên cả đồng loại (Hình 2.4) và vi sinh
vật gây bệnh khác. Khi môi trường dinh dưỡng cạn kiệt, B. subtilis sẽ tiêu diệt

9


những tế bào xung quanh để hút chất dinh dưỡng cho đến khi phải chuyển sang
sống tiềm sinh. Ở giai đoạn rất sớm của sự hình thành bào tử, một vài tế bào B.
subtilis đã tạo ra kháng sinh để giết chết những tế bào vi khuẩn xung quanh, hay

những vi khuẩn đồng loại ở bên cạnh chưa bắt đầu quá trình này. Chất kháng sinh
sẽ phá vỡ màng tế bào của những vi khuẩn bị tấn công, giải phóng chất dinh dưỡng
và được tế bào đang hình thành bào tử tiêu thụ.

Ghi chú:
Những vi khuẩn còn sống (màu
xanh) đang tiêu diệt những vi
khuẩn chết (màu đỏ) để tránh rơi
vào trạng thái tiềm sinh.

Hình 2.4. B. subtilis đối kháng với đồng loại
( />2.1.7. Những ứng dụng từ Bacillus subtilis

Ứng dụng trong y học: một số chế phẩm được sản xuất từ B. subtilis thành
ống dạng lỏng như ống subtilis 10ml, hoặc thành gói dạng bột có tác dụng chữa trị
tiêu chảy do Coliform và một số bệnh đường ruột khác, hoặc dùng để đắp vết
thương ngoài da. Trong kháng chiến chống Pháp, B. subtilis được giáo sư Đặng
Đức Trạch, Hoàng Thủy Nguyên (bác sĩ quân y) đã nghiên cứu sản xuất chế phẩm
B. subtilis để đưa ra chiến trường nhằm giải quyết dịch tiêu chảy. Ngoài ra, một số
chế phẩm được sản xuất từ B. subtilis còn được dùng trong điều trị giảm viêm
đường hô hấp. Năm 1949, Pháp đã lưu hành thuốc uống dạng ống chứa B. subtilis
chủng IB 5832, đến năm 1955 có thêm thuốc dạng bột đóng gói và viên nang
(Nguyễn Văn Bá và ctv, 2001).

10