Công nghệ sinh học động vật:

Công nghệ sinh học động vật:
1.

2.

các bước cơ bản trong công nghệ chuyển gen động vật:
Công nghệ tạo động vật chuyển gen là một quá trình phức tạp và ở
những loài khác nhau có thể khác nhau ít nhiều nhưng nội dung cơ bản
gồm các bước chính sau:
- Tách chiết, phân lập gen mong muốn và tạo tổ hợp gen biểu hiện
trong tế bào động vật; tạo cơ sở vật liệu biến nạp gen;
- Biến nạp gen vào phôi động vật; nuôi cấy phôi và cấy truyền hợp tử
(đối với động vật bậc cao);
- Phân tích đánh giá tính ổn định và sự biểu hiện của gen lạ và tạo ra
dòng động vật chuyển gen gốc một cách liên tục, sản xuất động vật
chuyển gen.
Ứng dụng động vật chuyển gen trong đời sống thực tiễn và y học :
- Tạo ra những động vật có tốc độ lớn nhanh, hiệu quả sử dụng thức ăn
cao
Đưa tổ hợp bao gồm gen cấu trúc của hormone sinh trưởng và promoter
methallothionein vào động vật. Cho đến nay người ta đã đưa thành
công gen này vào thỏ, lợn và cừu.
Lợn chuyển gen hormone sinh trưởng lượng mỡ giảm đi đáng kể (giảm
từ 28,55mm xuống 0,7mm) và hiệu quả sử dụng thức ăn cao hơn.
Tuy nhiên động vật nuôi chuyển gen hormone sinh trưởng có biểu hiện
bệnh lý lớn quá cỡ và chưa có ý nghĩa lớn trong thực tiễn.
- Tạo ra động vật chống chịu được bệnh tật và sự thay đổi của điều kiện
môi trường
Biết được một số gen có khả năng kháng bệnh và chống chịu được sự
thay đổi điều kiện môi trường của vật nuôi
Tiêm gen Mx vào lợn để tạo ra được giống lợn miễn dịch với bệnh

cúm.
Chuyển gen chống lạnh AFP (antifreeze protein) và đã tạo ra được các
giống cá có khả năng bảo vệ cơ thể chống lại sự lạnh giá (cá hồi, cá
vàng...).
- Nâng cao năng suất, chất lượng động vật bằng cách thay đổi các con
đường chuyển hóa trong cơ thể động vật
nghiên cứu nâng cao chất lượng sữa bò, sữa cừu bằng cách chuyển gen
lactose vào các đối tượng quan tâm. Sự biểu hiện của gen này được


3.

1.

điều khiển bởi promoter của tuyến sữa. Trong sữa của những động vật
chuyển gen này, đường lactose bị thủy phân thành đường galactose và
đường glucose.
- Tạo ra động vật chuyển gen làm mô hình nghiên cứu bệnh ở người
Nhiều dòng chuột chuyển gen đã được tạo ra như các mô hình nghiên
cứu bệnh tâm thần, tim mạch, phổi, ung thư, viêm nhiễm và miễn dịch
cũng như để nghiên cứu cơ chế và sự rối loạn của chuyển hoá, sự sinh
sản và sự phát triển sớm ở người
- Thử nghiệm các chất gây ung thư
Ba dòng chuột chuyển gen khác nhau đã được tạo ra cho việc thử
nghiệm các chất gây ung thư:
Chuột chuyển gen Eμ-pim-1 mang gen ung thư đã hoạt hoá pim-1 (gen
này có tốc độ gây ra khối u tự phát thấp và xuất hiện rất nhạy với chất
gây ung thư).
Chuột chuyển gen mang một gen ung thư đã hoạt hoá (v-H-ras, c-Hras) hoặc một gen ức chế khối u bất hoạt (p53).
Chuột chuyển gen với gen sửa đổi DNA đã bất hoạt (XPA).

- Tạo ra động vật chuyển gen làm mô hình nghiên cứu trong chất độc
học
- Thử nghiệm các chất gây đột biến, các chất gây ung thư
- Tạo ra vật nuôi chuyển gen cung cấp nội quan cấy ghép cho người
Các điều kiện lý hóa ảnh hưởng đến kỹ thuật nuôi cấy mô – tế bào
động vật :
Nhiệt độ

Tế bào của các loài động vật khác nhau có nhiệt độ nuôi cấy thích hợp khác
nhau. VD: tế bào của động vật có vú và của người phát triển tốt ở 37 ± 1°C,
nhiệt độ tế bào của các loài chim phát triển tốt ở 38,5°C, còn tế bào của các
loài côn trùng phát triển tốt ở nhiệt độ 25 ± 2°C.
Một số dòng tế bào phát triển ở nhiệt độ thấp hơn thân nhiệt bình thường của
cơ thể, VD: tế bào biểu mô, tế bào tinh trùng...
Trong nuôi cấy in vitro, tế bào động vật không chịu được nhiệt độ cao hơn
2°C so với nhiệt độ phát triển thích hợp của chúng, nhưng tế bào lại có khả
năng chịu đựng được nhiệt độ thấp hơnnhiệt độ phát triển tối ưu của chúng
mà rất ít ảnh hưởng đến sự phát triển của chúng sau này.


2. pH
pH không chỉ quan trọng trong việc duy trì sự cân bằng ion thích hợp mà còn
duy trì chức năng tối ưu của các enzyme nội bào, cũng như sự gắn kết của
các hormone và nhân tố tăng trưởnglên các receptor bề mặt.
Sự biến đổi pH có thể làm thay đổi chuyển hóa tế bào, dẫn tới sự cảm ứng
sản xuất protein shock nhiệt, một quá trình dẫn đến sự chết tế bào
(apoptosis). Do vậy, kiểm soát pH là cần thiết để tối ưu hóa điều kiện nuôi
cấy.
pH tối ưu cho sự phát triển của tế bào nuôi cấy khác nhau tùy theo loài và tùy
theo dòng tế bào.

Hầu hết các tế bào sống trong môi trường có ngưỡng pH 6,5 – 7,8 nên môi
trường nuôi cấy thường được điều chỉnh pH ở 7,0 – 7,4 (trung bình là 7,2).
Một số dòng tế bào thích hợp với pH caohơn (VD: tế bào fibroblast người
thích hợp với pH 7,4 – 7,7) hay thấp hơn (VD: tế bào côn trùng phát triển tốt
ở pH 6,2±0,1).
Môi trường có pH ổn định ít thay đổi có thể giúp tế bào sống tốt hơn. Hầu hết
các môi trường thương mại chứa phenol red như là một chất chỉ thị pH. Môi
trường chuyển màu vàng cho biết pH giảm (acid) và màu hồng nếu pH tăng
(kiềm).
3. Áp suất thẩm thấu
Áp suất thẩm thấu của môi trường được xác định bởi chính công thức môi
trường. Muối và glucose là hai tác nhân chính hình thành nên áp suất thẩm
thấu, mặc dù các amino acid cũng quan trọng.
Thay đổi áp suất thẩm thấu của tế bào hầu như luôn tác động lên sự tăng
trưởng và chức năng tế bào. Nếu tế bào nằm trong môi trường có áp suất
không thích hợp, chúng sẽ biến dạng: tế bào co lại trong môi trường có áp
suất thẩm thấu quá cao, còn trong môi trường có áp suất quá thấp,chúng sẽ
căng phồng lên.
Để kiểm tra áp suất thẩm thấu của môi trường, thường sử dụng Osmom kế
(Osmometer).


Các môi trường thương mại được thiết kế để áp suất thẩm thấu là 300 mOsm
(tế bào phát triểntrong khoảng 290 - 310 mOsm).
Có thể điều chỉnh áp suất thẩm thấu bằng cách thêm NaCl, cứ 0,0292 g/lít
NaCl sẽ làm tăng1 mOsm (sử dụng 5M NaCl với 1ml/lít sẽ làm tăng áp suất
thẩm thấu lên 10 mM).
Chú ý là trong môi trường còn có các thành phần đường, ion, các amino
acid…chúng cũng đóng góp vào sự tạo áp suất thẩm thấu.
4. Các loại khí

Ba loại khí cần quan tâm: CO2, O2 và N2. Tỷ lệ của chúng được phối trộn
thích hợp theo các chương trình thiết kế sẵn của tủ nuôi, nhờ đó các phân áp
khí được tạo ra thích ứng với đặc điểm sinh lý của tế bào và mô sống.
O2 có vai trò quan trọng trong sinh trưởng, tăng sinh và biệt hóa tế bào. Nồng
độ O2 phổ biến dùng trong tủ nuôi tế bào thường từ 16 – 20%.
Tác động của CO2 lên nuôi cấy tế bào khó được xác định một cách chính xác,
bởi nó liên quan đến hàm lượng CO2 hòa tan, pH, nồng độ HCO3.
4.

Thành phần cơ bản trong môi trường nuôi cấy mô – tế bào động
vật:

Thành phần môi trường
a. Muối vô cơ
Các muối vô cơ trong môi trường giữ vai trò quan trọng đối với sự phát triển
tế bào in vitro, như: cân bằng áp suất thẩm thấu, duy trì cơ chế vận chuyển
chất qua màng, giúp điều hòa điện thế màng, bám gắn tế bào, hoạt động như
các cofactor...
b. Hệ đệm
Hệ đệm có vai trò điều hòa pH của môi trường nuôi cấy. Hầu hết các môi
trường sử dụng hệ đệm bicarbonate với CO2 là thành phần chính. Ngoài ra,
còn có hệ thống đệm phosphat và các đệm hữu cơ phức tạp khác. Cũng có thể
sử dụng hệ đệm hữu cơ hay huyết thanh trong môi trường cơ bản.


Sử dụng hệ đệm bicarbonate/CO2 cần duy trì không khí với 5–10% CO2
trong tủ. Bicarbonate, CO2 rẻ, không độc đối với tế bào nên được dùng phổ
biến.
Hệ đệm hữu cơ được sử dụng nhiều nhất là HEPES (N-2hydroxyethylpiperazine-N-2ethane sulfonic acid).
Các hệ đệm hữu cơ không nhạy cảm với CO2, chúng cung cấp một hệ thống

tốt để các tế bào chuyển hóa mạnh (sản xuất nhiều CO2) có thể ổn định pH.
Một số dung dịch đệm như Tris [Tris (hydroxymethyl) aminomethane]
thường sử dụng trong sinh hóa có thể gây độc đối với tế bào in vitro.
c. Carbohydrate
Đường trong môi trường là nguồn cung cấp C và năng lượng cho sự phát
triển tế bào invitro. Các đường chính được sử dụng là glucose và galactose,
một số môi trường còn sử dụng maltose hay fructose. Nồng độ đường khác
nhau giữa các môi trường cơ bản từ 1g/l– 4,5g/l. Môi trường chứa nồng độ
đường cao sẽ giúp phát triển nhiều kiểu tế bào.
d. Vitamine
Vitamine là cơ chất cho nhiều cofactor, chúng có nhiều trong thành phần
huyết thanh. Tuynhiên, nhiều loại môi trường cần được bổ sung vitamine
thích hợp như vitamine nhóm B cần thiết cho sự phát triển tế bào. Thông
thường vitamine được sử dụng trong môi trường là riboflavin, thiamine và
biotin.
e. Các protein và peptide
Các thành phần này giữ vai trò quan trọng trong nuôi cấy hầu hết các tế bào,
đặc biệt khi nuôi cấy với môi trường không huyết thanh. Một số protein,
peptide rất cần thiết như albumin, transferring, fibronectin và fetuin thường
có sẵn trong huyết thanh.
f. Acid béo và lipid
Giống với protein và peptide, các chất này rất cần thiết trong môi trường nuôi
không huyết thanh và cho một số tế bào đặc biệt. Chúng hiện diện trong
huyết thanh với các dạng như cholesterol và steroid.


g. Yếu tố vi lượng
Bao gồm kẽm, đồng, selenium… và các tricarboxylic acid trung gian, trong
đó selenium là chất giúp tách các gốc oxy tự do.
h. Huyết thanh

Trong hầu hết các loại môi trường nuôi cấy tế bào động vật đều có mặt huyết
thanh bởi nó có những vai trò quan trọng như sau:
- Cung cấp chất dinh dưỡng quan trọng cho tế bào như các amino acid thiết
yếu, tiền chấtcủa nucleic acid, các nguyên tố vi lượng…
- Cung cấp các nhân tố tăng trưởng, kích thích cho tế bào tăng trưởng và
phân chia.
- Kích thích sự phục hồi các tổn thương của tế bào khi cấy chuyền, và các
protein trong huyết thanh làm bất hoạt trypsin, tránh các enzym gây tổn
thương tế bào.
- Cải thiện tính tan của các chất dinh dưỡng.
- Chống oxy hóa: huyết thanh kháng oxy hóa mạnh, và ức chế độc tính của
oxy.
- Cải thiện tính dính của tế bào lên bề mặt bình nuôi nhờ các yếu tố làm tăng
độ dính của tếbào lên giá đỡ.
Huyết thanh rất cần cho việc nuôi cấy tế bào động vật. Tuy nhiên, bên cạnh
những tác động tốt nêu trên, huyết thanh cũng có những tác động không tốt:
- Nuôi cấy tế bào với môi trường bổ sung huyết thanh chi phí cao.
- Huyết thanh dễ bị nhiễm virus, mycoplasm và khó ổn định chất lượng của
những lô môi trường khác nhau.- Huyết thanh còn chứa những thành phần
gây ức chế sự phân bào và cảm ứng sự phân hóa.
- Nhiều chất trong huyết thanh (vitamin C, các lipoprotein...) thường không
ổn định khi đông lạnh hay bảo quản lâu.
- Huyết thanh không pha loãng sẽ độc với nhiều loại tế bào.


- Khi mất nồng độ hormone thích hợp, huyết thanh cũng có thể chứa cơ chất
ức chế sự phát triển, biệt hóa hay chức năng.
5. Ưu điểm và hạn chế của kỹ thuật nuôi cấy mô – tế bào động vật:
Ưu điểm
- Hệ thống tế bào động vật là các “nhà máy tế bào” thích hợp cho việc sản

xuất các phân tử phức tạp và các kháng thể dùng làm thuốc phòng bệnh, điều
trị hoặc chẩn đoán: như các enzyme, hormone, vaccine, kháng thể đơn dòng,
thuốc trừ sâu sinh học, interferon và interleukin, các tế bào nguyên vẹn để thử
nghiệm chất độc hóa học…
- Các tế bào động vật có quá trình biến đổi hậu dịch mã chính xác (post
translational modifications) đối với các sản phẩm protein sinh-dược
(biopharmaceutical protein) như phân giải protein, liên kết tiểu đơn vị
(subunit), hoặc nhiều phản ứng kết hợp khác như glycosylation, methylation,
carboxylation, amidation, hình thành các cầu nối disulfide hoặc
phoshorylation các gốc amino acid.
- Sản xuất các viral vector dùng trong liệu pháp gen nhằm chữa trị nhiều bệnh
như ung thư,HIV, viêm khớp, các bệnh tim mạch và xơ hóa u nang.
- Sản xuất các tế bào động vật để dùng như một cơ chất in vitro trong nghiên
cứu chất độc học và dược học.
- Phát triển công nghệ mô hoặc phát sinh cơ quan để sản xuất các cơ quan
thay thế nhân tạo sinh học hay các dụng cụ trợ giúp, như: da nhân tạo để chữa
bỏng, mô gan để chữa viêm gan, …
Hạn chế
- Tế bào động vật có kích thước lớn hơn và cấu trúc phức tạp hơn tế bào vi
sinh vật.
- Tốc độ sinh trưởng của tế bào động vật rất chậm so với tế bào vi sinh vật.
- Các tế bào động vật được bao bọc bởi màng huyết tương, mỏng hơn nhiều
so với thành tế bào dày chắc thường thấy ở vi sinh vật hoặc tế bào thực vật,
và kết quả là chúng rất dễ bị vỡ.


- Nhu cầu dinh dưỡng của tế bào động vật chưa được xác định một cách đầy
đủ, và môi trường nuôi cấy thường đòi hỏi bổ sung huyết thanh máu rất đắt
tiền.
- Tế bào động vật là một phần của mô đã được tổ chức (phân hóa) hơn là một

cơ thể đơn vào riêng biệt như vi sinh vật.
- Hầu hết các tế bào động vật chỉ sinh trưởng khi được gắn trên một bề mặt.
6. Tế bào gốc là gì? Nguồn gốc, phân loại tế bào gốc
Tế bào gốc là tế bào có khả năng biệt hoá thành nhiều loại tế bào khác để
thay thế cho các tế bào bị mất đi do già và chết tự nhiên hay do chấn thương
vì nhiều nguyên nhân khác nhau.
Nguồn gốc:
– Tế bào gốc phôi lấy trực tiếp từ phôi thai trong giai đoạn phôi bào tức là
hợp tử sau 6-7 ngày thụ tinh.
– Tế bào gốc thai lấy từ tế bào gốc đa năng của mô bào thai bị hủy do phá
thai.
– Tế bào gốc dây rốn lấy từ màng dây rốn và máu dây rốn của thai nhi sau
khi sinh ra.
– Tế bào gốc từ người trưởng thành lấy từ các mô của người trưởng thành
(tủy xương, máu ngoại vi…)
Phân loại tế bào gốc
Theo đặc tính hay mức độ biệt hóa
- Toàn năng (hay thuỷ tổ). Tế bào gốc toàn năng hay tế bào gốc thủy tổ
(totipotent stem cells)
Là những tế bào có khả năng biệt hóa thành tất cả các loại tế bào cơ thể từ
một tế bào ban đầu.
Trứng đã thụ tinh và các tế bào được sinh ra từ những lần phân chia đầu tiên
của tế bào trứng đã thụ tinh (giai đoạn 2 - 4 tế bào – các blastosomer).


- Vạn năng. Tế bào gốc vạn năng (pluripotent stem cells).
Là những tế bào có khả năng biệt hóa thành tất cả các tế bào của cơ thể có
nguồn gốc từ ba lá mầm phôi – lá trong, lá giữa và lá ngoài.
Các tế bào gốc vạn năng không thể phát triển thành thai, không tạo nên
được một cơ thể sinh vật hoàn chỉnh mà chỉ có thể tạo nên được các tế bào,

mô nhất định.
- Đa năng. Tế bào gốc đa năng (multipotent stem cells).
Là những tế bào có khả năng biệt hóa thành nhiều loại tế bào của cơ thể từ
một tế bào ban đầu.
Các tế bào gốc trưởng thành như tế bào gốc tạo máu, tế bào gốc thần kinh
chỉ có tính đa năng; nhưng trong những điều kiện nhất định, chúng vẫn có
thể chuyển biệt hóa và trở nên có tính vạn năng.
- Đơn năng. Tế bào gốc đơn năng (mono/unipotential progenitor cells).
Tế bào gốc đơn năng là những tế bào gốc chỉ có khả năng biệt hóa theo một
dòng.
Khả năng biệt hóa theo dòng cho phép duy trì trạng thái sẵn sàng tự tái tạo
mô, thay thế các tế bào mô chết vì già cỗi bằng các tế bào mô mới.
7. Vẽ sơ đồ tạo động vật chuyển gen và giải thích


Công nghệ tạo động vật chuyển gen là một quá trình phức tạp và ở những
loài khác nhau có thể khác nhau ít nhiều nhưng nội dung cơ bản gồm các
bước chính sau:
- Tách chiết, phân lập gen mong muốn và tạo tổ hợp gen biểu hiện trong tế
bào động vật; tạo cơ sở vật liệu biến nạp gen
+ Tách chiết, phân lập gen mong muốn
Các công cụ sử dụng để tạo dòng bao gồm:


Các enzyme đặc biệt có hoạt tính cắt và nối DNA (enzyme hạn chế và
ligase),



Các mẫu dò (probe), vector



Tế bào vật chủ.

Tế bào vật chủ thường được sử dụng là tế bào vi khuẩn E.coli và vector
thường được sử dụng là plasmid.


Gen chuyển có nguồn gốc từ genome



Từ mRNA



Từ sản phẩm protein có thể thiết kế cặp mồi (primer) để dò tìm
đoạn gen mong muốn


+ Tạo tổ hợp gen chuyển biểu hiện trong tế bào động vật
Ðể tạo tổ hợp gen chuyển biểu hiện trong tế bào động vật, các vùng chức
năng khác nhau của gen có nguồn gốc từ các loài khác nhau có thể được kết
hợp lại với nhau trong ống nghiệm bằng cách sử dụng enzyme hạn chế và
ligase. Tất cả các thành phần của gen có thể được tách chiết và tái tổ hợp để
tạo thành một cấu trúc gen chuyển biểu hiện
Promoter: là yếu tố điều hoà ở gần đầu 5’ của gen, có vai trò quyết định
trong việc điều hoà sự biểu hiện của gen.
Promoter ở tế bào động vật có nguồn gốc hoặc từ động vật như

methallothionein (MT), thymidine kinase, ßactin, amylase, insulin, ßlactoglobulin, adiposite P2 ... hoặc từ virus động vật như Simian virus
(SV40), Rous sarcoma virus (RSV)...
Một yếu tố điều hoà khác là yếu tố tăng cường (enhancer), có chức năng
tăng cường sự biểu hiện của gen, không phụ thuộc vào vị trí và sự định
hướng đối với gen.
Ðầu 3’ của gen cũng phải mang một trình tự poly-A để đảm bảo thích hợp
cho quá trình phiên mã và dịch mã.
+ Tạo cơ sở vật liệu biến nạp gen


Giai đoạn biến nạp gen thích hợp nhất là trứng ở giai đoạn tiền nhân
(pronucleus), giai đoạn mà nhân của tinh trùng và trứng chưa dung hợp
(fusion) với nhau.
Ở giai đoạn này tổ hợp gen lạ có cơ hội xâm nhập vào genome của động vật
nhờ sự tái tổ hợp DNA của tinh trùng và của trứng.
Tế bào phôi chưa phân chia và phân hoá nên tổ hợp gen lạ được biến nạp vào
giai đoạn này sẽ có mặt ở tất cả các tế bào kể cả tế bào sinh sản của động vật.
Trứng chín được thu nhận bằng phương pháp sử dụng kích dục tố theo
chương trình.
Sau đó thụ tinh nhân tạo để tạo ra trứng tiền nhân.
- Biến nạp gen vào phôi động vật; nuôi cấy phôi và cấy truyền hợp tử (đối với
động vật bậc cao).

- Phân tích đánh giá tính ổn định và sự biểu hiện của gen lạ và tạo ra dòng
động vật chuyển gen gốc một cách liên tục, sản xuất động vật chuyển gen.
Kiểm tra kết quả chuyển gen


Để kiểm tra xem gen lạ có xâm nhập được vào bộ máy di truyền của
động vật trưởng thành hay không → Sử dụng phương pháp lai phân tử

trên pha rắn (Southern blot, Northern blot...) hoặc PCR



Để kiểm tra xem sản phẩm của gen lạ có được tổng hợp ra hay không
→ đánh giá ở hai mức độ: phiên mã và dịch mã



Sản phẩm phiên mã được đánh giá bằng phương pháp RT-PCR



Sản phẩm dịch mã được đánh giá bằng phương pháp Western blot,
ELISA hoặc kỹ thuật miễn dịch phóng xạ (RIA) để phát hiện protein lạ
trong động vật.




Theo dõi các thế hệ sau của động vật chuyển gen (F1, F2, F3...) để xác
định gen lạ có di truyền hay không.

Tạo dòng động vật chuyển gen
Sau khi kiểm tra thấy gen ngoại lai đã được di truyền ổn định, tiến hành
lai tạo và chọn lọc để tạo dòng động vật chuyển gen.

8. quy trình đông lạnh tế bào (môi trường, chất bảo quản, các bước bảo
quản lạnh, phương pháp đông lạnh.
Kỹ thuật bảo quản phôi hay giao tử là bảo quản lạnh phôi hay giao tử

trong thời gian dài ở thấp nhiệt độ -196°C với nitơ lỏng, ngăn chặn các
quá trình trao đổi chất trong tế bào.
Môi trường đông lạnh
• Hepes
• Huyết thanh
• Kháng sinh
• Muối
• Đường
• Chất bảo quản lạnh
Chất bảo quản đông lạnh
Chất bảo quản ngoại bào: BSA, FBS, saccharide, disaccharide (trehalose,
lac, suc), trisaccharide (raffinose), polymer (PVP, polyethylenglycol)
Chất bảo quản nội bào: methanol, ethanol, ethylen glycol, 1,2isopropandiol, glycerol, dimethyl sulfoxide (DMSO)
Nguyên tắc chung: ở nhiệt độ cục thấp (-196°C) trong nitơ lỏng sẽ làm
ngưng hoàn toàn các phản ứng enzyme nội bào, hô hấp tế bào, chuyển hóa,
phát triển … giúp lưu giữ chúng trong thời gian rất dài. Các phân tử nước tồn
tại dưới dạng kết hợp, tinh thể hoặc dạng kính.


Các bước đông lạnh tế bào:
• Tế bào và mô tiếp xúc với chất bảo quản (bước cân bằng)
• Làm lạnh mẫu xuống nhiệt độ âm
• Trữ ở nhiệt độ dưới -196°C
• Làm ấm và giải đông
• Pha loãng và loại bỏ các chất bảo quản lạnh trước khi tái nuôi cấy
Phương pháp đông lạnh
• Đông lạnh chậm
• Đông lạnh nhanh
• Phối hợp đông lạnh nhanh và chậm
• Đông lạnh cực nhanh (thủy tinh hóa)

9. Giải đông lạnh-quy trình và đánh giá tế bào sau khi giải đông)
•

Rã đông nhanh
- 37°C trong bể ổn nhiệt
- Giảm thiểu sự hình thành tinh thể

•

Pha loãng từ từ để ngăn sốc áp suất thẩm thấu

•

Quá trình bù nước của tế bào

•

Loại chất bảo quản lạnh:
- Thay, ủ trong môi trường mới
- Ly tâm nhẹ

Quy trình giải đông
•

Lấy các ống đông lạnh tế bào ra khỏi bình nitơ lỏng.

•

Kiểm tra cẩn thận các nhãn và nắp.

•

Giữ ống đông lạnh ngoài không khí khoảng 30 giây.

•

Đặt toàn bộ ống đông lạnh nhúng vào bình ổn nhiệt 37°C và lắc nhẹ
cho đến khi tan hết.

•

Rửa tế bào bằng ly tâm dịch tế bào đã giải đông trong môi trường nuôi
mới.

•

Tái huyền phù tế bào trong môi trường mới.

•

Trải các tế bào vào đĩa nuôi cấy với môi trường bình thường. Nồng độ
tế bào ban đầu phải cao từ 2-3x104 tế bào/cm2.

Đánh giá chất lượng
Nhuộm xác định số lượng tế bào sống, chết
•

Nuôi cấy sau giải đông

•

Sức sống tế bào sau giải đông: tăng sinh

10. các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình đông lạnh tế bào, giải thích
Các vấn đề khi đông lạnh tế bào động vật thường gặp
1. Trong quá trình thu nhận và thao tác tế bào
+ Sự tiếp xúc giữa tế bào và chất bảo quản lạnh
+ Sự duy trì lượng lớn tế bào ở nhiệt độ phòng và pH
2. Trong quá trình làm lạnh
+ Làm lạnh quá nhanh, quá chậm hay bị gián đoạn
+ Sử dụng chất bảo quản lạnh không phù hợp hay sử dụng nồng độ không
thích hợp
3. Trong quá trình trữ lạnh
+ Quá trình chuyển tế bào vào bình trữ lạnh
+ Nhiệt độ đông lạnh không được duy trì ổn định
4. Trong quá trình giải đông
+ Giải đông chậm


+ Phương pháp loại chất bảo quản lạnh không phù hợp