slide kiểm nghiệm thuốc 56

LOGO

Bộ môn
Hóa phân tích – Kiểm nghiệm

SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

(HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY –HPLC)


Giới thiệu chung
 Sắc ký lỏng hiệu năng cao - sắc ký lỏng áp suất cao
 Kỹ thuật phân tích dựa trên cơ sở của sự phân tách các chất trên một pha

tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di chuyển của pha động lỏng dưới áp suất
cao. Sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay loại cỡ
là tuỳ thuộc vào loại pha tĩnh sử dụng.
 Khi phân tích các chất được hòa tan trong dung môi thích hợp và tách ở

nhiệt độ thường.
 Sắc ký thường được hoàn thành trong một thời gian ngắn (khoảng 30 phút).

Chỉ những thành phần có hệ số chọn lọc khác nhau mới có thể phân tích
được bằng HPLC.


Giới thiệu chung
 Ngày nay HPLC đã và đang được sử dụng nhiều trong
lĩnh vực phân tích hoá học nói chung cũng như trong
kiểm tra chất lượng thuốc và phân tích sinh dược học
nói riêng.

 Trong phân tích thuốc bằng phương pháp sắc ký,
phần lớn các dược điển đều sử dụng sắc ký phân bố.


Giới thiệu chung
Ứng dụng

(1)
Định tính

(2)
Thử tạp
chất

(3)
Định lượng


Giới thiệu chung
Định tính

Mẫu thử
So sánh thời gian
lưu của chất phân
tích trong dung
dịch thử
với thời gian lưu
của
chất
chuẩn

trong dung dịch
chuẩn chạy cùng
Đk sắc ký

Mẫu
chuẩn


Giới thiệu chung

Định lượng

Phương
pháp
chuẩn
ngoại

Phương
pháp
thêm
chuẩn

Phương
pháp
chuẩn
nội

Phương
pháp
chuẩn

hóa
diện
tích.


Nội dung


1. Thông số đặc trưng
Hệ số dung lượng k’
Hệ số chọn lọc α
Hệ số đối xứng F
Số đĩa lý thuyết và hiệu lực cột N
Độ phân giải Rs


1. Thông số đặc trưng
Hệ số dung lượng k’

Tối ưu: 1 < k’ < 8

K : hệ số phân bố
Vs : thể tích pha tĩnh
Vm: thể tích pha động
Qs: lượng chất trong pha tĩnh
Qm: lượng chất trong pha
động
tR : thời gian lưu
t’R : thời gian lưu hiệu chỉnh
t0: thời gian chết

1. Thông số đặc trưng
Hệ số chọn lọc α

1,05 ≤ α ≤ 2,0

Hệ số đối xứng F

W: Chiều rộng pic đo ở 1/20 chiều cao pic
a: Khoảng cách từ đường vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép đường cong
phía trước tại vị trí 1/20 chiều cao pic.


1. Thông số đặc trưng
Số đĩa lý thuyết và hiệu lực cột N
W: Chiều rộng đo ở đáy pic
W1/2: Chiều rộng pic đo ở nửa chiều cao pic

Độ phân giải Rs

Rs >1. Tối ưu Rs = 1,5

tRB, tRA: Thời gian lưu của 2 pic liền kề nhau (B và A),
WB , WA: Độ rộng pic đo ở các đáy pic,
W1/2B, W1/2A: Độ rộng pic đo ở nửa chiều cao pic.
Các giá trị: tRB, tRA, WB, WA , W1/2B , W1/2A phải tính theo cùng một đơn vị.


Bài 1: Dữ kiện sau thu được bằng sắc ký trên cột dài 40cm.

Hãy tính :
a/ Số đĩa lý thuyết trung bình của cột ?
b/ Chiều cao của đĩa ? H = L/N
c/ Độ phân giải cho:
+ B và A
+ B và C
+ A và C


Bài 2. Khi chạy sắc ký một hỗn hợp 2 chất A và B thu được thời gian lưu lần
lượt là: 10,0 và 10,9 trên cột dài 40cm. Một chất không lưu giữ qua cột ở 1,9
phút.
Cho biết thể tích pha tĩnh VS = 19,6ml và thể tích pha động VM = 62,6ml.
Hãy tính :
a/. Hệ số dung lượng k’ cho mỗi chất ?
b/. Hệ số phân bố cho mỗi chất ?
c/. Hệ số chọn lọc cho A và B ?


2. Hệ thống máy HPLC
1. Bình chứa dung
môi pha động
2. Bộ phận đuổi khí
3. Bơm cao áp
4. Bộ phận tiêm mẫu
5. Cột sắc ký
6. Detector
7. Máy tính –
phần mềm

8. Máy in


2. Hệ thống máy HPLC


3. Các kỹ thuật HPLC

Phân bố
1

2

Hấp phụ

Phân loại

Rây phân tử

4

3

Trao đổi ion


3. Các kỹ thuật HPLC
Sắc ký phân bố hiệu năng cao

Sắc ký

ký lỏnglỏng- lỏng
lỏng (LLC):
(LLC): lớp
lớp
Sắc
mỏng pha
pha lỏng
lỏng hữu
hữu cơ
cơ bao
bao trên
trên
mỏng
bề mặt
mặt của
của các
các tiểu
tiểu phân
phân chất
chất
bề
mang
mang
Nhược điểm:
điểm: bị
bị rửa
rửa trôi
trôi dần
dần
Nhược

theo dòng
dòng pha
pha động
động 
 hiệu
hiệu lực
lực
theo
cột bị
bị giảm
giảm dần
dần trong
trong quá
quá trình
trình
cột
sửdụng.
dụng.
sử

Pha tĩnh
Sắc ký
ký pha
pha liên
liên kết
kết (BPC):
(BPC):
Sắc
được liên
liên kết

kết hóa
hóa học
học với
với
được
chất mang.
mang. Các
Các nhóm
nhóm chức
chức
chất
hữu cơ
cơ liên
liên kết
kết với
với bề
bề mặt
mặt
hữu
của các
các tiểu
tiểu phân
phân silica
silica qua
qua
của
cácnhóm
nhómsilanol
silanol
các

3. Các kỹ thuật HPLC
Sắc ký phân bố hiệu năng cao

Pha tĩnh

Một số pha liên kết thường dùng


3. Các kỹ thuật HPLC
Pha tĩnh
- Khi sử dụng silica, nhôm oxyd hoặc polyme xốp thì
các chất được phân tách theo cơ chế hấp phụ nên
được gọi là sắc ký hấp phụ.
- Nếu pha tĩnh là nhựa trao đổi ion thì gọi là sắc ký
trao đổi ion.
- Nếu pha tĩnh là polyme xốp như dextran..., ta có
sắc ký rây phân tử.


3. Các kỹ thuật HPLC
Sắc ký phân bố hiệu năng cao
Tuỳ thuộc vào việc sử dụng pha động và pha tĩnh
người ta chia sắc ký phân bố thành 2 loại (sắc ký pha
thuận và sắc ký pha đảo)


3. Các kỹ thuật HPLC
Pha động

Pha động có thể là dung môi đơn hay hỗn hợp
của 2, 3 hay 4 thành phần. Người ta có thể thay đổi độ
phân cực của pha động bằng cách thay đổi tỷ lệ của
các thành phần dung môi trong hỗn hợp.
Kỹ thuật thay đổi liên tục thành phần dung môi
trong thời gian chạy sắc ký được gọi là rửa giải
gradient hoặc chương trình hóa dung môi.


3. Các kỹ thuật HPLC
Sắc ký phân bố hiệu năng cao
Sắc ký pha thuận

Pha tĩnh phân cực hơn
pha động.
Pha động: không phân
cực (hỗn hợp pentan,
hexan, heptan, isootan)

Các chất không
phân cực sẽ được
rửa giải sớm.
Thứ tự rửa giải sẽ
chậm dần
theo
chiều tăng của độ
phân cực


3. Các kỹ thuật HPLC

Sắc ký phân bố hiệu năng cao

Phổ biến nhất

Sắc ký pha đảo

Pha động phân cực hơn
pha tĩnh.
Pha tĩnh: không phân cực
(C18, C8, C6H5). Pha
động: phân cực (H20,
MeOH, acetonitril).

Thứ tự rửa giải:
chất phân cực ra
trước, các chất ít
và không phân cực
ra sau.


3. Các kỹ thuật HPLC
Sắc ký phân bố hiệu năng cao

Một số chú ý

Sắc ký pha đảo
 Để điều chỉnh độ phân cực của pha động
có thể hòa lẫn thêm những dung môi như
methanol, ethanol (EtOH), acetonitril, dioxan,
tetrahydrofuran (THF) và dimethylformamid.

 Một số thành phần khác cũng có thể được
thêm vào pha động như: các acid, base,
đệm , chất diện hoạt.


3. Các kỹ thuật HPLC
Sắc ký phân bố hiệu năng cao

Sắc ký pha đảo
 Khi pha động có thêm các
muối vô cơ hoặc các chất hoạt
động bề mặt, nên lọc nó trước
khi dùng vì có thể có cặn
không tan trong nước gây bẩn
cột.
 Việc đuổi khí rất quan trọng
với pha động pha đảo

Một số chú ý