slide kiểm nghiệm thuốc 41

Kiểm nghiệm thuốc bằng phương
pháp sinh học


Mục tiêu bài học

4
3

Nêu được vai trò của PP sinh học
trong KN chất kháng sinh, và TB được thử
nghiệm ĐL chất KS bằng PP khuếch tán.
TB được mục đích, nguyên tắc, PP thử
vô khuẩn và đếm SL VSV trong 1 g(1ml) DP

Biết KT làm một môi trường nuôi
cấy VSV và nêu được các PP tiệt
2
trùng.
Nắm được những đđ cơ bản về hình thái,
1
tính chất nuôi cấy của VK, vi nấm để áp dụng trong
thử nghiệm VSV.

2


Nội dung bài học
I

Mở đầu

II

Kiểm nghiệm thuốc bằng phương pháp thử trên động vật

III

Kiểm nghiệm thuốc bằng phương pháp thử vi sinh vật
1. Đại cương về vi sinh vật
2. Môi trường nuôi cấy vi sinh vật
3. Thử vô khuẩn
4. Thử giới hạn vi sinh vật
5. Xác định hoạt lực kháng sinh bằng phương pháp thử vi
sinh vật
3


I. Mở đầu
1. Nguyên tắc của phương pháp sinh học:
- So sánh hiệu lực tác dụng hoặc các đặc tính riêng của chất
thử với chất chuẩn tương ứng trong cùng một điều kiện và
thời gian thí nghiệm.
- Trong KN thuốc:
+ KN thuốc bằng các phương pháp thử trên động vật.
+ KN thuốc bằng các thử nghiệm vi sinh vật.

4


I. Mở đầu

2. Chất chuẩn:
-Chất chuẩn gốc
-Chất chuẩn thứ cấp
3. Đánh giá kết quả:
- Đánh giá bằng toán thống kê.
- Độ chính xác của phép thử được thể hiện bằng giới hạn
tin cậy.

5


II. Kiểm nghiệm thuốc bằng phương pháp thử trên động vật
1. Nguyên tắc:
- Dựa trên sự đáp ứng của động vật thí nghiệm đối với các chế
phẩm được đưa vào cơ thể (liều lượng theo quy định của từng
thí nghiệm) để đánh giá chất lượng của chế phẩm cần thử.
2. Động vật thí nghiệm:
- Phải đồng đều, thuần khiết về nòi giống
- Khoẻ mạnh, không nhiễm bệnh
- Không có thai
- Được nuôi dưỡng đầy đủ.

6


II. Kiểm nghiệm thuốc bằng phương pháp thử trên động vật
3. Thử in vivo và in vitro:
- Thử in vitro: tiến hành trên các cơ quan cô lập của động vật,
như tim, tử cung, ruột, máu…
- Thử in vivo: thực hiện trên cơ thể động vật sống, dựa vào kết

quả các thông số để đánh giá tác dụng và chất lượng của
thuốc.
4. Liều:
- Là lượng chế phẩm thử đưa vào cơ thể động vật một lần cho
từng mục đích thí nghiệm.
7


II. Kiểm nghiệm thuốc bằng phương pháp thử trên động vật
5. Các thử nghiệm trên ĐV được áp dụng trong KNT:
- Thử độc tính bất thường
- Thử chất hạ huyết áp
- Thử chất gây sốt
- Định lượng các hormon: gonadorelin, corticotrophin,insulin,
oxytocin, menotrophin
- Kiểm tra tính an toàn của vaccin và sinh phẩm.
- Xác định hiệu lực của các vaccin và antitoxin.
 

8


III. Kiểm nghiệm thuốc bằng phương pháp thử
vi sinh vật

9


1. Đại cương về vi sinh vật

Vi sinh
vật

10


1. Đại cương về vi sinh vật

11


1. Đại cương về vi sinh vật
 Sự ảnh hưởng của các yếu tố ngoại cảnh đối với quá trình
phát triển của vi sinh vật (VSV):
 Nhiệt độ: phát triển ở 15 – 45 oC
- Tế bào sinh dưỡng: chết ở 60 oC /20 - 30 phút
- Bào tử: chỉ bị tiêu diệt ở 120 oC / 30 – 40 phút → tiệt trùng.
 Độ ẩm:
- Thiếu nước → loại nước → trao đổi chất giảm → chết.
 Ánh sáng:
- UV → vi sinh vật bị chết/đột biến tuỳ liều lượng → vận dụng.

12


2. Môi trường nuôi cấy vi sinh vật
 Phân loại:
- Môi trường tự nhiên: động vật hay thực vật
- Môi trường tổng hợp: hoá chất thuần khiết,hòa tan trong nước
- Môi trường bán tổng hợp: nguyên liệu tự nhiên và tổng hợp

→ Đáp ứng các điều kiện: - Đầy đủ chất dinh dưỡng
- pH trong khoảng quy định
- Vô trùng

13


2.1. Kĩ thuật pha chế môi trường
1. Chuẩn bị dụng cụ hoá chất

- Dụng cụ: men/thủy tinh
- Nguyên liệu, hóa chất: chất lượng, tinh khiết

2. Cân đong nguyên liệu

- Chính xác (nhất là nguyên tố vi lượng gây
ức chế vi khuẩn)

3. Hoà tan nguyên liệu

- Nước cất / nước khử khoáng
- Thạch: đun cho tan

4. Điều chỉnh pH

- NaOH 1N, HCl 1N

5. Làm trong môi trường

- Lọc qua vải gạc/giấy

6. Đóng ống tiệt trùng

- Thông thường: 110oC/30phút,120oC/20phút
- Các chất phân hủy bởi nhiệt → nhiệt độ thấp

 Pha chế môi trường từ hỗn - Pha: nước cất/nước khử khoáng
- Kiểm tra pH
hợp bột môi trường chế sẵn
14


2.2. Bảo quản môi trường
- Môi trường bột khô: được giữ ở 10 - 12 oC trong điều kiện khô,
tránh ánh sáng.
- Môi trường đã pha chế được bảo quản ở 4 – 10 oC trong 1 – 2
tháng tuỳ theo thành phần môi trường.
 

15


2.3. Các phương pháp tiệt trùng

16


2.3. Các phương pháp tiệt trùng
1.Tiệt trùng bằng nhiệt khô

- Tiệt trùng dụng cụ thí nghiệm bền với nhiệt như bông,
băng, vải, gạc…
- 180oC/ 30 phút, 170oC/ 1 giờ, 160oC/2 giờ

2.Tiệt trùng bằng hơi nước

- Tiệt trùng môi trường nuôi cấy và các dụng cụ phẫu
thuật.
- Nồi hấp: 121oC/ 15 phút

- Tiệt trùng môi trường dễ bị hỏng bởi nhiệt
Tiệt
trùng
gián
đoạn
- Hấp 3 - 4 lần/100oC trong 30 – 40 phút, ủ ở
(phương pháp Tyndall)
24 giờ ,cách 24 giờ hấp lần tiếp theo

28 - 32oC/

- Tiệt trùng môi trường dễ bị hỏng bởi nhiệt
Khử trùng nhiệt độ thấp
- Đun cách thuỷ 60oC/ 30 phút, hoặc 73oC/ 15 phút →
(phương pháp Pasteur)
làm lạnh đột ngột <10oC
3.Phương pháp lọc

- Tiệt trùng các chất dễ bị phá huỷ bởi nhiệt
- Màng lọc có kích thước lỗ lọc ≤ 0,22µm

- Tia UV được dùng để tiệt trùng các buồng pha chế, tủ
4.Phương pháp dùng tia bức
cấy vi sinh vật.
xạ
- Phối hợp dùng hoá chất để khử nấm.
17


3. Thử vô khuẩn
 Mục đích:
→

Phát hiện sự có mặt của vi khuẩn, vi nấm trong: thuốc tiêm,

dịch tiêm truyền, thuốc tra mắt, các dụng cụ y tế mà phải vô
trùng.
 Nguyên tắc:
- Vi khuẩn/nấm cấy vào môi trường có chất dinh dưỡng và
nước, ở nhiệt độ thích hợp → phát triển → biến đổi môi
trường.

18


3.Thử vô khuẩn
 Môi trường:
- Môi trường Thioglycolat (phát hiện VK hiếu khí và kỵ khí)
- Môi trường Soybean - casein (phát hiện VK hiếu khí và nấm)
→ Có thể dùng các môi trường

khác:

• MT canh thang cao thịt - pepton → vi khuẩn hiếu khí
• MT Wilson - Blair → vi khuẩn kị khí
• MT Sabouraud lỏng → vi nấm.

19


Ví dụ: Môi trường thioglycolat không có thạch
L-Cystin
Natri clorid
Dextrose (C6H12O6.H2O)
Cao nấm men(có khả năng tan trong nước)
Casein thủy phân bởi pancreatin
Natri thioglycolat
(hoặc acid thioglycolic 0,3 ml)
Resazurin (dung dịch 0,1% mới pha)
Nước
pH sau khi tiệt khuẩn:

0,50 g
2,50 g
5,50 g
5,00 g
15,0 g
0,50 g
1 ml
1000 ml

7,1 ± 0,2

20


Ví dụ: Môi trường thioglycolat có thạch
L – Cystin
Natri clorid
Dextrose (C6H12O6.H2O)
Thạch bột (có độ ẩm nhỏ hơn 15%)
Cao nấm men (có khả năng tan trong nước)
Casein thủy phân bởi pancreatin
Natri thioglycolat
(hoặc acid thioglycolic 0,3 ml)
Resazurin (dung dịch 0,1% mới pha)
Nước

0,50 g
2,50 g
5,50 g
0,75 g
5,00 g
15,00 g
0,50 g
1,0 ml
1000 ml

pH sau khi tiệt khuẩn

7,1 ± 0,2

21


Ví dụ: Môi trường Soybean - casein
Casein thủy phân bởi pancreatin

17,0 g

Bột đậu tương thủy phân bởi papain

3,0 g

Natri clorid

5,0 g

Dikali hydrophosphat

2,5 g

Dextrose monohydrat

2,5 g

Nước

1000 ml

pH sau khi tiệt khuẩn:

7,3 ± 0,2

22


3. Thử vô khuẩn
 Kiểm tra chất lượng môi trường:
 Độ vô trùng

- Lấy 1-2 ống/bình môi trường mới làm → ủ ở 30 - 35 oC ít nhất
trong 4 ngày đối với môi trường phát hiện vi khuẩn, và 25 - 28
o

C ít nhất trong 7 ngày với môi trường phát hiện vi nấm. Sau

thời gian nuôi cấy, các ống môi trường không được có vi sinh
vật mọc.

23


3. Thử vô khuẩn
 Kiểm tra chất lượng môi trường:
 Khả năng dinh dưỡng

- Cấy vào mỗi ống môi trường khoảng 100 tế bào các VSV sau:
+ Vi khuẩn hiếu khí: Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis,
Pseudomonas aeruginosa
+ Vi khuẩn kỵ khí: Clostridium sporogenes

+ Vi nấm: Candida albicans, Aspergillus niger
- Nuôi cấy 30 - 35oC / 3 ngày (vi khuẩn), 25 - 28oC / 5 ngày (vi
nấm)
→

Vi sinh vật phải phát triển tốt trên các môi trường.
24


3. Thử vô khuẩn
 Lấy mẫu thử:
- Toàn bộ số ống/lọ thuốc được khử trùng hoặc được phân bố
vô trùng trong cùng một điều kiện → lô thuốc.
- Lô <100 đơn vị, lấy 3 đơn vị.
- Nếu nhiều hơn thì cứ 50 đơn vị lấy thêm 1 đơn vị nhưng ≤ 10.
Dựa vào tiêu chuẩn ngành hoặc tiêu chuẩn cơ sở của từng
sản phẩm để lấy mẫu cho thích hợp.

25