Nghiên cứu thiết kế vector Tet– OFF điều khiển tính trạng giới tính trên muỗi Aedes aegypti (Khóa luận tốt nghiệp)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

NGUYỄN ĐÌNH DUY KHANH
Tên đề tài:
“NGHIÊN CỨU THIẾT KẾ VECTOR TET-OFF MANG GENE ĐIỀU
KHIỂN TÍNH TRẠNG GIỚI TÍNH TRÊN MUỖI AEDES AEGYPT”

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo

: Chính quy

Chuyên ngành

: Công nghệ sinh học

Khoa

: CNSH-CNTP

Khóa học

: 2011-2016

Thái Nguyên, năm 2016


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

NGUYỄN ĐÌNH DUY KHANH
Tên đề tài:
“NGHIÊN CỨU THIẾT KẾ VECTOR TET-OFF MANG GENE ĐIỀU
KHIỂN TÍNH TRẠNG GIỚI TÍNH TRÊN MUỖI AEDES AEGYPT”

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Hệ đào tạo

: Chính quy

Chuyên ngành

: Công nghệ sinh học

Lớp

: K44 CNSH

Khoa

: CNSH-CNTP

Khóa học

: 2011-2016

Giảng viên hƣớng dẫn:
1. TS. Nguyễn Văn Hạnh
Phòng Công nghệ phôi – Viện Công nghệ Sinh học –

Viện Hàm lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
2. ThS. Vi Đại Lâm
Khoa Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm,
ĐH Nông Lâm Thái Nguyên
Thái Nguyên, năm 2016


i
LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình học tập và nghiên cứu để hoàn thành được khóa luận tốt
nghiệp này với sự nỗ lực của cá nhân, tôi đã nhận được sự hướng dẫn, giúp đỡ, chỉ
bảo và động viên của thầy cô, bạn bè và gia đình.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Thầy giáo: TS. Nguyễn Văn Hạnh,
Th.S. Vi Đại Lâm, Th.S. Đỗ Trung Kiên và Th.S. Lê Bắc Việt, người đã trực tiếp
giúp đỡ và hướng dẫn tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài cũng như trong quá
trình hoàn chỉnh luận văn tốt nghiệp.
Tôi xin chân thành cảm ơn các Thầy cô trong khoa Công nghệ Sinh học và
Công nghệ Thực phẩm đã dạy dỗ và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua.
Tôi xin chân thành cảm ơn các cán bộ, các anh chị làm việc tại phòng Công
nghệ phôi - Viện Công nghệ Sinh học – Viện Hàm lâm Khoa học và Công nghệ
Việt Nam đã giúp đỡ, tạo mọi điều kiện để tôi học tập và nghiên cứu.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, người thân và bạn
bè đã luôn động viên, chia sẻ giúp đỡ tôi vượt qua mọi khó khăn trong quá trình học
tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn.
Xin chân thành cảm ơn!
Thái Nguyên,20 tháng 05 năm 2016
Sinh viên

Nguyễn Đình Duy Khanh

ii
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 3.1: Danh mục các thiết bị sử dụng trong đề tài .............................................. 15
Bảng 3.2: Tỉ lệ thành phần PCR tạo đoạn gene P1-2 ................................................ 18
Bảng 3.3: Chu trình nhiệt PCR sử dụng mồi P1 và P2 tạo đoạn gene P1-2 ............. 18
Bảng 3.4: Tỉ lệ thành phần PCR tạo đoạn gene P5-6 ................................................ 20
Bảng 3.5:Chu trình nhiệt PCR sử dụng mồi P5 và P6 để tạo đoạn gene P5-6 ......... 21
Bảng 3.6: Tỉ lệ thành phần phản ứng cắt đối với sản phẩm tinh sạch PCR của đoạn
gene P1-2 và P5-6 ..................................................................................................... 21
Bảng 3.7: Tỉ lệ thành phần PCR tạo đoạn gene P1-6 ................................................ 22
Bảng 3.8: Chu trình nhiệt PCR sử dụng mồi P1 và P6 để tạo đoạn P1-6 ................. 23
Bảng 3.9: Tỉ lệ thành phần PCR tạo đoạn gene P3-4 ................................................ 23
Bảng 3.10: Chu trình nhiệt PCR sử dụng mồi P3 và P4 để tạo đoạn P3-4 ............... 24
Bảng 3.11: Tỉ lệ thành phần phản ứng cắt đối với sản phẩm tinh sạch PCR của đoạn
gene P1-6 và P3-4 ..................................................................................................... 24
Bảng 3.12: Tỉ lệ thành phần phản ứng cắt của vector pTet-Dual OFF bằng hai
enzyme BamHI và HindIII ........................................................................................ 25
Bảng 3.13: Tỉ lệ thành phần phản ứng cắt của P16-34 và pTRE-Tight-BI bằng hai
enzyme BamHI và HindIII ........................................................................................ 26
Bảng 3.14: Tỉ lệ thành phần PCR tạo đầu nối cho pTRE-Tight-BI-P16-34 ............. 27
Bảng 3.15: Chu trình nhiệt PCR tạo đầu nối cho pTRE-Tight-BI-P16-34 ............... 27
Bảng 3.16: Tỉ lệ thành phần phản ứng cắt của DNA plasmid pTet-Dual OFF và sản
phẩm PCR pTRE-Tight-BI bằng hai enzyme PspXI và XhoI .................................. 28
Bảng 3.17: Tỉ lệ thành phần PCR khuẩn lạc E.coli biến nạp .................................... 30
Bảng 3.18: Tỉ lệ thành phần phản ứng nối sau khi cắt bằng enzyme cắt .................. 32


iii
DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 2.1: Cấu trúc của vector pTet-Dual-OFF (Catalog No. 631113) ....................... 7
Hình 2.2: Cơ chế hoạt động của pTet-Dual-OFF ........................................................ 8
Hình 2.3: Cấu tạo vector pTRE-Tight-BI (Catalog No. 631068) ............................... 9
Hình 4.1: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm tách chiết và tinh sạch DN muỗi Aedes
aegypti ....................................................................................................................... 33
Hình 4.2a: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR đoạn gene P1-2 ....................... 34
Hình 4.2b: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm tinh sạch sau khi PCR của đoạn gene P1-234
Hình 4.3a: Kết quả giải trình tự của đoạn gene P1-2 ................................................ 35
Hình 4.3b: Kết quả so sánh giải trình tự đoạn gene P1-2 với đoạn gene Tra-2 RNAi35
Hình 4.4a: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR đoạn gene P3-4 ....................... 36
Hình 4.4b: Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR của đoạn gene P3-4 ........................... 36
Hình 4.5a: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR đoạn gene P5-6 ....................... 37
Hình 4.5b: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm tinh sạch sau khi PCR của đoạn gene
P5-6 ........................................................................................................................... 37
Hình 4.6a: Kết quả điện di sản phẩm cắt của P1-2 và P5-6 bằng enzyme SalI ........ 38
Hình 4.6b: Kết quả điện di sản phẩm tinh sạch của P1-2 và P5-6 sau khi cắt bằng
enzyme SalI ............................................................................................................... 38
Hình 4.7: Kết quả điện di sản phẩm cắt P3-4 và P5-6 bằng Acc65I ......................... 39
Hình 4.8a: Kết quả điện di sản phẩm nối của đoạn P1-2 và P5-6............................. 40
Hình 4.8b: Kết quả điện di sản phẩm nối của đoạn P3-4 và P5-6 ............................ 40
Hình 4.9a: Kết quả điện di sản phẩm cắt pJET P1-6 bằng enzyme HindIII và Acc65I41
Hình 4.9b: Kết quả điện di sản phẩm cắt pJET P3-4 bằng enzyme HindIII và
Acc65I ....................................................................................................................... 41
Hình 4.10a: Kết quả tinh sạch sản phẩm cắt vector pJET P1-6 và pJET P3-4 bằng
enzyme HindIII và Acc65I ........................................................................................ 42
Hình ảnh 4.10b: Kết quả tinh sach DNA plasmid pJET P16-34 sau khi biến nạp ... 42


iv

Hình 4.10c: Kết quả điện di sản phẩm pJET P16-34 sau khi cắt bằng enzyme
HindIII và BamHI ..................................................................................................... 43
Hình 4.10d: Kết quả tinh sạch đoạn P16-34 (Tra-2 RNAi) sau khi cắt bằng HindIII
và BamHI từ DNA plasmid pJET P16-34................................................................. 43
Hình 4.11a: Kết quả kiểm tra sản phẩm cắt của vector pTRE-Tight-BI và pJET p1634 bằng enzyme BamHI và HindIII .......................................................................... 44
Hình 4.11b: Kết quả tinh sạch sản phẩm cắt của vector pTRE-Tight-BI và P16-34
bằng enzyme BamHI và HindIII ............................................................................... 44
Hình 4.12a: Kết quả biến nạp vector pTRE-Tight-BI và P16-34 tạo vector pTRETight-BI-P16-34 vào tế bào khả biến E.coli DH5α .................................................. 45
Hình 4.12b: Kết quả PCR kiểm tra từng khuẩn lạc biến nạp tạo vector pTRE-TightBI-P16-34 .................................................................................................................. 45
Hình 4.13: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm tinh sạch DNA plasmid pTRE-TightBI-P16-34 và sản phẩm cắt DNA plasmid pTRE-Tight-BI-P16-34 bằng enzyme
BamHI và HindIII để kiểm tra đoạn chèn P16-34 .................................................... 46
Hình 4.14a: Khuẩn lạc E.coli mang vector pTet-Dual OFF ..................................... 47
Hình 4.14b: Kết quả điện di tinh sạch DNA plasmid pTet-Dual OFF ..................... 47
Hình 4.15: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm cắt của vector pTet-Dual OFF bằng
BamHI và XhoI ......................................................................................................... 47


v
DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT

Ampr

Kháng kháng sinh Ampicillin

Bp

Base pair – Cặp bazơ nitơ

cDNA

Complementary Deoxyribonucleic Acid

DNA

Deoxyribonucleic Acid

Dox

Doxycyline

E.coli

Escherichia coli

Kb

Kilo base – Kilo bazơ nitơ

LB

Lauria Broth

miRNA

Micro Ribonucleic Acid

mRNA

Messenger Ribonucleic Acid– RNA thông tin

MSC I

Multiple cloning site I

MSC II

Multiple cloning site II

PCR

Polymerase chain reaction – phản ứng chuỗi trùng hợp

RIDL

Release of Insects carrying a Dominant Lethal

RNA

Ribonucleic Acid

RNAi

Interference Ribonucleic Acid– RNA can thiệp

SIRM

Sterile Insect Release Method

SiRNA

Smal interfering Riboncleic Acid

SIT

Sterile Insect Techmique – Kĩ thuật vô trùng côn trùng

TAE

Tris-acetate-EDTA

Tet

Tetracyline

Tet-OFF

pTet-Dual OFF

tTA

Tetracycline-repressible transactivato

Tra-2 RNAi Transformer-2 Interference Ribonucleic Acid
X-gal

5-bromo-4-chloro-3indoly-β-D-galactoside


vi
MỤC LỤC

PHẦN 1: MỞ ĐẦU.......................................................................................... 1
1.1. Đặt vấn đề: ................................................................................................. 1
1.2. Mục tiêu nghiên cứu: ................................................................................. 2
1.3. Mục đích nghiên cứu:................................................................................. 2
1.4. Ý nghĩa khoa học và thực tiến của đề tài: .................................................. 2
1.4.1. Ý nghĩa khoa học .................................................................................... 2
1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn ..................................................................................... 2
PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU............................................................... 3
2.1. Cơ sở khoa học ........................................................................................... 3
2.1.1. Bối cảnh thực hiện ý tưởng đề tài. .......................................................... 3
2.1.2. Genee biểu hiện tính trạng giới tính trên muỗi Aedes aegypti (
Transformer-2 RNAi)........................................................................................ 5
2.1.3. Vector Tet-OFF (pTet-Dual OFF) .......................................................... 6
2.1.4. Vector pTRE-Tight-BI ............................................................................ 9
2.2. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước .............................................. 11
2.2.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ........................................................ 11
2.2.2. Tình hình nghiên cứu trong nước.......................................................... 12
PHẦN 3: ĐỐI TƢỢNG, VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU ............................................................................................... 13
3.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu............................................................ 13
3.1.1. Đối tượng nghiên cứu............................................................................ 13
3.1.2. Phạm vi nghiên cứu ............................................................................... 13
3.2. Vật liệu nghiên cứu .................................................................................. 13
3.2.1. Hóa chất................................................................................................. 13
3.2.2. Thiết bị .................................................................................................. 15
3.2.3. Vật liệu .................................................................................................. 15


vii

3.3. Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu ............................................ 16
3.4. Nội dung nghiên cứu ................................................................................ 16
3.5. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................... 16
3.5.1. Tách chiết và tinh sạch DNA muỗi Aedes aegypti ............................... 16
3.5.2. PCR phân lập đoạn gene quy định tính trạng giới tính trên muỗi Aedes
aegypti ............................................................................................................. 17
3.5.3. Thiết kế vector pTet-Dual-OFF mang gene quy định tính trạng giới tính
trên muỗi Aedes aegypti (Tra-2 RNAi kẹp tóc).............................................. 25
3.5.4. Phương pháp biến nạp vào tế bào E.coli khả biến để chọn dòng, nuôi
sinh khối và tách DNA plasmid. ..................................................................... 28
3.5.5. Phương pháp nối bằng bộ Kit Ligation (M0202) ................................. 32
PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................... 33
4.1. Kết quả tách chiết và tinh sạch DNA muỗi Aedes aegypti ...................... 33
4.2. Kết quả PCR phân lập đoạn gene quy định tính trạng giới tính trên muỗi
Aedes aegypti. ................................................................................................. 33
4.3. Kết quả thiết kế vector pTET-Dual-OFF, lai ghép chèn đoạn DNA quy
định tính trạng giới tính trên muỗi Aedes aegypti vào vector. ....................... 43
PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................... 48
5.1. Kết luận .................................................................................................... 48
5.2. Kiến nghị .................................................................................................. 48
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 55
I. Tài liệu Tiếng Việt ....................................................................................... 49
II. Tài liệu Tiếng Anh...................................................................................... 50
III. Tài liệu Internet ......................................................................................... 50


1
PHẦN 1
MỞ ĐẦU

1.1. Đặt vấn đề:
Trên thế giới, theo Tổ chức Y tế thế giới (WHO), ước tình hằng năm có
khoảng 2,5 – 3 tỷ người có nguy cơ mắc bệnh do muỗi truyền nhiễm như sốt rét, sốt
vàng da, sốt nhiệt đới (sốt dengue), đặc biệt cuối năm 2015 và đầu 2016 đến nay
suất hiện bệnh virus Zika. Trong 50- 100 triệu người mắc bệnh do muỗi Aedes
aegypti, khoảng 500.000 trường hợp mắc bệnh do muỗi Aedes aegypti phải điều trị,
trong đó 90% là trẻ em dưới 15 tuổi, tỉ lệ tử vong do muỗi Aedes aegypti là 5%.
Bệnh lưu hành nhiều nhất ở vùng Đông Nam Á và Thái Bình Dương trên 100 nước
thuộc khu vực khí hậu nhiệt đới, cận nhiệt đới [8], [1].
Hiện nay Việt Nam là một trong những nước có bệnh dịch lưu hành, bệnh
chiếm tỉ lệ cao trong các bệnh truyền nhiễm ở Việt Nam, là một trong những
nguyên nhân hàng đầu gây tử vong cho trẻ và tình trạng quá tải cho các bệnh viện
trong mùa dịch. Từ năm 1960 đến nay dịch có xu hướng lan rộng và phát triển. Ở
Tây Nguyên những năm có dịch lớn 1983, 1987,1988, 1991, 1995 và 2004 với số
mắc từ 54,80 đến 553,38/100.000 dân số và chết từ 0,08 – 1,34/100.000 dân [6], [4],
[5],[3]. Năm 2008, các tỉnh phía Nam, 78.414 trường hợp mắc, 85 trường hợp chết,
tỉnh Cà Mau có số bệnh nhân là 8.284, tử vong 8 trường hợp [20]. Năm 2009 cả
nước có số bệnh nhân chết là 105.370/87 [21]. Để giải quyết vấn đề trên, nhiều
hướng nghiên cứu đã được thử nghiệm và áp dụng. Các nhà khoa học trên thế giới
đã thành công trong việc tạo ra muỗi biến đổi gene bằng kĩ thuật DNA tái tổ hợp.
Những con muỗi đực biến đổi gene sẽ được thả ra ngoài môi trường và giao phối
với muỗi cái tự nhiên tạo ra thế hệ muỗi con bị khiếm khuyết và chết trước khi
trưởng thành [19], [20]. Các nhà khoa học Mỹ tại Đại học Rocckefeller đã nghiên
cứu tạo muỗi biến đổi gene không phát hiện được mùi của người, hạn chế quá trình
lây truyền bệnh tật qua loài trung gian này [19].
Ở Việt Nam hiện nay, ứng dụng công nghệ DNA tái tổ hợp không còn là
một vấn mới mẻ, đã có rất nhiều công trình nghiên cứu áp dụng Công nghệ Sinh
học để tạo sinh vật biến đổi gene nhằm tạo ra những sản phẩm ứng dụng vào thực
tiễn. Xuất phát từ tính cấp thiết của các căn bệnh nguy hiểm lây truyền qua muỗi

Khóa luận đầy đủ ở file: Khóa luận full