chủng Lactococcus lactis subsp. cremoris VNC53

LỜI CẢM ƠN
Trước hết, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS. Nguyễn La
Anh – Chủ nhiệm Bộ môn Công nghệ Sinh học Vi sinh, Viện Công nghiệp
Thực phẩm đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập,
nghiên cứu và hoàn thiện khóa luận tốt nghiệp.
Em xin chân thành cảm Ban giám hiệu, Ban lãnh đạo, các thầy giáo,
cô giáo Viện Đại học Mở Hà Nội đã giảng dạy em trong suốt thời gian học tập
tại trường và tạo điều kiện thuận lợi, giúp đỡ em hoàn thành khóa luận này.
Khóa luận này là bước đầu tập dượt nghiên cứu khoa học mặc dù đã cố
gắng nhưng không thể tránh khỏi những hạn chế, thiếu sót. Em rất mong nhận
được những ý kiến đóng góp của các thầy, cô giáo, các bạn để khóa luận được
hoàn thiện hơn.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội,ngày 22 tháng 05 năm 2016
Người viết

Nguyễn Thị Thu

1


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi và được sự
hướng dẫn khoa học của PGS.TS. Nguyễn La Anh. Các nội dung nghiên cứu,
kết quả trong đề tài này là trung thực và chưa công bố dưới bất kì hình thức
nào trước đây.
Hà Nội,ngày 22 tháng 05 năm 2016
Người viết

Nguyễn Thị Thu

2


MỤC LỤC

3


DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 1.1: Các hợp chất hương hình thành từ quá trình chuyển hóa axit amin
qua axit α – keto theo con đường chuyển hóa transaminase………………….7
Bảng 1.2: Sự khác nhau điều kiện sinh trưởng của 2 loài Lactococcus lactis
ssp. cremoris và Lactococcus lactis ssp. lactis ………………………………9
Bảng 1.3: Ứng dụng Lactococcus lactis ssp. cremoris trong sản xuất
phomat……………………………………………………………………….10

4


DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1: Các con đường lên men hexose (glucose) chính ở vi khuẩn lactic...5
Hình 2.1: Chủng Lactococcus lactis subsp. cremoris VNC53………………17
Hình 3.1: Khảo sát nguồn đường chủng VNC53……………………………27
Hình 3.2: Nồng độ đường chủng VNC53…………………………………..27
Hình 3.3: Khảo sát nguồn đạm chủng VNC53................................................28
Hình 3.4: Nồng độ đạm chủng VNC53...........................................................29
Hình 3.5: Ảnh hưởng của pH đến chủng VNC53…………………………..30
Hình 3.6: Ảnh hưởng nhiệt độ tới chủng VNC53…………………………..31
Hình 3.7: Ảnh hưởng tỷ lệ tiếp giống đến chủng VNC53………………......32
Hình 3.8: Động học quá trình lên men chủng VNC53……………………..33

Hình 3.9: Ảnh hưởng chất bảo vệ màng tế bào đến chủng VNC53………..35
Hình 3.10: Ảnh hưởng của nhiệt độ bảo quản tới chủng VNC53.................36
Hình 3.11: Ảnh hưởng của thí nghiệm sốc thẩm thấu đến chủng VNC53...37

5


CÁC TỪ VIẾT TẮT
BSA
ARN
CO2
FAA
FAO
CFU
LAB
MRS
OD
WHO
ATP

Bovine serum albumin
Axit ribonucleic
Carbon dioxide
Free amino acid
Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc
Colony Forming Unit
Lactic acid bacteria
de Man, Rogosa and Sharpe (Medium for LAB)
Optical Density
Tổ chức Y tế Thế giới

Adenozin triphotphat

6


MỞ ĐẦU

Ngày nay, cùng với đà tăng trưởng kinh tế, nhu cầu về các sản phẩm có
giá trị dinh dưỡng cao từ nói chung, các sản phẩm từ sữa nói riêng ngày càng
cao. Phomat là sản phẩm của quá trình lên men sữa, đã được tiêu thụ rộng rãi
trên thế giới. Mặc dù mức tiêu thụ phomat ở nước ta chưa cao, nhưng vẫn
tăng đều qua các năm, đặc biệt ở là các thành phố lớn.
Trong sản xuất phomat, giống khởi động là yếu tố quan trọng quyết định
chất lượng của sản phẩm. Các vi khuẩn lactic: Lactococcus lactis subsp.
cremoris, Lactococcus lactis subsp. latis, và các loài thuộc chi Leuconostoc…
là những giống khởi động đã được thương mại hóa cho nhiều loại phomat:
Cheddar, Gouda… Ở Việt Nam, nguồn giống này đều là nhập khẩu. Do đó,
nhu cầu về nghiên cứu, tạo giống khởi động để chủ động nguồn cung, giảm
giá thành sản phẩm là cần thiết.
Các nghiên cứu tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic phù hợp cho lên
men phomat đã và đang được tiến nghiên cứu tại Bộ môn Công nghệ sinh học
vi sinh, Viện Công nghiệp thực phẩm (thuộc chương trình KC07). Chủng
Lactococcus lactis subsp. cremoris VNC53 đã được tuyển chọn là một trong
các chủng khởi phù hợp cho lên men phomat.
Do đó đề tài nghiên cứu của em thuộc lĩnh vực nghiên cứu tiếp theo
trong công nghệ sản xuất giống khởi động, với tiêu đề “ Nghiên cứu công
nghệ lên men sinh khối và thu hồi chủng Lactococcus lactis subsp.
cremoris VNC53 có ứng dụng trong sản xuất phomat”.
1. Mục tiêu nghiên cứu: Xác định được các điều kiện thích hợp để lên
men và bảo quản sinh khối từ chủng Lactococcus lactis subsp.

[Type text]

Page 7


cremoris VNC53 với mật độ và tỷ lệ sống sót cao nhất, nhằm tạo giống
khởi động phù hợp cho sản xuất phomat.
2. Nội dung nghiên cứu:
- Nghiên cứu các điều kiện tối ưu để lên men chủng Lactococcus
lactis subsp. cremoris VNC53: xác định thời gian, môi trường, nhiệt
độ, pH và tỷ lệ tiếp giống thích hợp để lên men thu sinh khối.
- Nghiên cứu phương pháp bảo vệ tế bào chủng Lactococcus lactis
subsp. cremoris VNC53.

[Type text]

Page 8


PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.Giới thiệu chung về phomat
Phomat có đến hàng nghìn loại khác nhau, tùy theo đặc điểm mùi vị,
hình dáng, hàm lượng chất béo.
Phomat được coi là sản phẩm sữa bổ nhất. Phomat chứa một lượng
protein, chất béo tương đối cao nên độ sinh năng lượng tương đương với thịt
lợn (2.500 – 4.500 kcal). Các protein, chất béo trong phomat đều ở dạng cơ
thể dễ hấp thu, có đầy đủ các axit amin không thay thế, các vitamin, các chất
khoáng [2].
Theo định nghĩa của FAO/WHO, pho mát là sản phẩm rắn hoặc bán rắn,
ở dạng tươi hoặc đã qua ủ chín, thu được bằng cách làm đông tụ sữa hoặc các

nguyên liệu từ sữa: sữa gầy, sữa tách béo, cream, whey cream, nhờ hoạt động
của enzym rennet hoặc các tác nhân đông tụ thích hợp khác và làm tách một
phần nước khỏi quện sữa đông [15].
1. Phân loại theo tác nhân đông tụ casein là renin hay là axit. Có một số
loại, vừa là kết quả của sự đông tụ casein bằng axit và bằng cả renin. Ví
dụ, loại cottage.
2. Phân loại theo hàm lượng nước: pho mát rất cứng ( Độ ẩm < 47%),
phomat cứng (độ ẩm < 56%), phomat cứng vừa ( độ ẩm = 54 – 63%) và
phomat mềm (độ ẩm= 78 – 87%), hàm lượng nước thấp. Phomat cứng
như Cheddar, Emmental; loại Camembert, Brie là phomat mềm.
3. Phân loại dựa vào loại vi khuẩn dùng khi ủ chín phomat. Đa số các loại
phomat đều “chín” nhờ tác động của vi khuẩn lactic. Một số loại như
Camembert quá trình chín nhờ mốc trắng (white moulds); hoặc
Roquefort và Gorgonzola do tác động của mốc xanh (blue moulds) [2].

[Type text]

Page 9


1.2. Vi khuẩn lactic trong sản xuất phomat
Vào năm 1873 J. Liter lần đầu tiên phát hiện được một loài vi khuẩn đặt
tên là “vi khuẩn lactic”.
Vi khuẩn lactic là những vi khuẩn Gram dương, bất động và không sinh
bào tử, catalase âm tính, là loài vi khuẩn kị khí tùy nghi, có khả năng lên men
kị khí cũng như hiếu khí, có khả năng lên men đường để tạo axit lactic, khả
năng chịu đựng cao với môi trường axit. Một số vi khuẩn lactic có hoạt tính
protease giúp thủy phân protein của sữa thành peptit và axit amin, hoạt tính
này ở các loài là khác nhau, thông thường trực khuẩn là cao nhất. Đặc biệt
một số chủng lactic có khả năng ức chế vi sinh vật gây bệnh [12].

Quá trình sản xuất phomat đòi hỏi phải có vi khuẩn lactic. Chúng có thể
được chủ động bổ sung vào sữa hoặc sử dụng ngay những vi khuẩn có mặt
trong sữa tươi. Vi khuẩn lactic đã được sử dụng trên toàn thế giới, đóng vai
trò quan trọng trong lên men thực phẩm ở quy mô công nghiệp. Vi khuẩn
lactic giúp chuyển hóa đường hexose thành axit lactic. Các vi khuẩn này có
chức năng tạo axit lactic trong quá trình lên men sữa góp phần gây đông tụ
casein làm nguyên liệu cho sản xuất pho mát. Ngoài ra, chúng còn tham gia
vào quá trình chuyển hóa để tạo nên đặc điểm cảm quan và các chỉ tiêu hóa lý
đặc trưng cho phomat thành phẩm.
Có thể tóm tắt các quá trình chính như sau:
- Quá trình chuyển hóa lactose
Lên men lactose thành L – axit lactic là chức năng cơ bản của chủng
giống khởi động trong sản xuất phomat. Sự axit hóa này không chỉ tới ảnh
hưởng đến cấu trúc ban đầu của quện sữa mà còn ảnh hưởng tới chất lượng
pho mát do pH quyết định khả năng hòa tan của casein [17]. Tùy theo chủng
giống mà lactose có thể được chuyển hóa theo con đường Embden-Meyerhof
[Type text]

Page 10


(EM) hoặc con đường phosphoketolase (hình 1.1). Theo con đường EM, từ một
phân tử glucose tạo ra hai phân tử axit lactic. Theo con đường phosphoketolase
thì một phân tử glucose tạo ra một phân tử axit lactic, ethanol và CO2.

Hình 1.1: Các con đường lên men hexose (glucose) chính ở vi khuẩn lactic
[13]
- Quá trình chuyển hóa axit lactic
Lactate là một chất thơm của phomat. Ngoài ra, lactate có thể bị oxy hóa
theo các con đường khác nhau, tổng hợp nên các hợp chất thơm khác như

acetate, ethanol, formate ở giai đoạn ủ chín và mức độ oxy hóa này phụ thuộc
vào hệ vi sinh vật và sự sẵn có oxy trong phomat [17].
- Quá trình chuyển hóa citrate
Hàm lượng citrate trong sữa tươi khoảng 8 mmol/ lít sữa, nhưng 94%
trong số này bị mất trong quá trình sản xuất phomat do hòa tan vào huyết
tương sữa [16]. Tuy nhiên, một lượng ít citrate còn lại trong quện sữa (10
mmol/kg quện sữa) lại đóng vai trò quan trọng trong quá trình thành các hợp
chất thơm bay hơi.
Sản phẩm của quá trình chuyển hóa là CO2, diacetyl, acetate, acetoin và
có thể có 2,3 – butanediol [14].
[Type text]

Page 11


- Quá trình phân giải lipit và chuyển hóa axit béo
Quá trình phân giải lipit diễn ra trong giai đoạn ủ chín phomat. Lipase
tồn tại trong pho mát do nhiều nguồn khác nhau. Bản thân sữa tươi cũng chứa
enzym lipoprotein lipase, tuy nhiên hoạt tính của enzym bị mất ở sữa đã thanh
trùng. Các loài Lactococcus có hoạt tính phân giải lipit yếu nhưng có thể đã
giải phóng một lượng lớn axit béo tự do khi mật độ tế bào ở mức cao sau giai
đoạn đông tụ sữa [1].
Quá trình phân giải triglyceride tạo ra các axit béo, glycerol, mono –
hoặc diglyceride. Chất béo trong sữa của các động vật nhai lại chứa lượng lớn
các chuỗi axit béo ngắn và trung bình, khi bị thủy phân chúng đóng góp đáng
kể vào việc tạo hương của nhiều loại phomat. Các axit béo tự do có thể phản
ứng với ethanol hoặc các nhóm chứa gốc lưu huỳnh tạo ra các ester hoặc
thioester [14].
- Quá trình phân giải protein
Phân giải protein là quá trình phức tạp nhất và quan trọng nhất trong số

các sự kiện sinh hóa diễn ra ở giai đoạn ủ chín phomat. Quá trình này ảnh
hưởng đến sự hình thành hương vị của phomat theo nhiều hướng khác nhau.
Một vài chuỗi peptit ngắn, axit amin tạo hương vị và có thể là cả vị không
mong muốn (như vị đắng) cho phomat. Sự phân giải casein làm thay đổi cấu
trúc phomat (làm mềm) tạo điều kiện để giải phóng các hợp chất có vị trong
khi nhai. Ngoài ra, quá trình này còn là nguồn cung cấp cơ chất (axit amin) cho
một loạt các quá trình dị hóa diễn ra sau đó như: sự khử amin, khử cacboxyl,
chuyển amin, khử lưu huỳnh [14].
Sản phẩm cuối cùng của quá trình phân giải protein là các axit amin tự
do (FAA). Nồng độ FAA phụ thuộc vào từng loại phomat và được dùng như
là một chỉ số của sự chín [10]. Nồng độ của FAA trong phomat ở bất kì giai
đoạn của quá trình chín là kết quả của sự giải phóng các axit amin từ casein
và sự chuyển hóa các axit amin thành các sản phẩm khác qua quá trình dị hóa.
[Type text]

Page 12


Bảng 1.1: Các hợp chất hương hình thành từ quá trình chuyển hóa axit amin
qua axit α – keto theo con đường chuyển hóa transaminase [16]
Axit
amin

Axit keto

Andehit

Axit hữu cơ

Alcohol

(thiol)

Este

1.2.1. Các nhóm vi khuẩn lactic khởi động trong sản xuất phomat
Giống khởi động cho sản xuất từ sữa là vi sinh vật được chủ động bổ
sung vào nguyên liệu để tạo ra sản phẩm cuối cùng với các đặc điểm mong
muốn, thông qua sự phát triển và quá trình lên men của chúng [18].
Trong công nghệ lên men các sản phẩm từ sữa, nhiệm vụ chính của giống
khởi động vi sinh vật là: (1) – bảo quản sản phẩm về mặt sinh học, kéo dài
thời hạn sử dụng so với nguyên liệu không lên men; (2) - tạo các đặc điểm
cảm quan đặc trưng như vị, hương; (3) – tạo cấu trúc đặc trưng cho sản phẩm
về độ nhớt, độ cứng, độ thoáng… cũng như màu sắc; (4) – tạo lập các đặc
điểm về dinh dưỡng đặc trưng. Giống khởi động trong sản xuất phomat có thể
được chia thành các nhóm sau:
1.2.1.1. Các chủng vi khuẩn lactic ưa ấm
Nhóm LAB ưa ấm có nhiệt độ sinh trưởng tối ưu ở 30 oC, bao gồm các
loài thuộc hai chi, Lactococcus và Leuconostoc. Trong đó, Lactococcus lactis
subsp. lactis, Lactococcus lactis subsp. cremoris đóng vai trò chính là sinh
axit, các loài Lactococcus lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis,
Leuconostoc lactis, Leuconostoc cremoris tạo hương thơm cho phomat [6].

[Type text]

Page 13


Trong sản xuất phomat, có thể sử dụng chủng đơn lẻ hoặc kết hợp các
chủng với nhau tạo giống khởi động. Trong hỗn hợp giống khởi động thì các
chủng sinh axit chiếm ưu thế 90 – 99%, còn các chủng tổng hợp chất hương

chỉ chiếm 1 – 10% [4].
Các chủng lactic ưa ấm đã được sử dụng trong sản xuất nhiều loại
phomat khác nhau. Người ta ước tính rằng hai phần ba quá trình lên men sữa
là sử dụng các chủng ưa ấm. Trong ngành công nghiệp sữa liên quan tới quá
trình lên men, thì các chủng nào càng lên men nhanh thì càng tốt. Đây dường
như là một đặc tính ưu thế của các loài Lactococcus. Các loài khác cũng làm
giảm độ pH của sữa nhưng với tốc độ chậm hơn nhiều [7].
1.2.1.2. Các chủng vi khuẩn lactic ưa nhiệt
Các chủng lactic ưa nhiệt được sử dụng trong sản xuất các loại phomat
cần nhiệt độ nấu cao ( Emmental, Gruyere, Grana, Comte). Các LAB ưa nhiệt
thuộc hai chi là Lactobacillus và Streptococcus. Mặc dù Lactobacillus là một
nhóm lớn gồm 64 loài nhưng chỉ một vài trong số chúng có khả năng lên men
sữa. Các loài Lactobacillus đã được thương mại hóa chủ yếu là: Lactobacillus
delbrueckii subsp. bulgaricus, Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis và
Lactobacillus helveticus. Ở chi Streptococcus, trong số 27 loài thì chỉ có duy
nhất Streptococcus thermophilus được sử dụng làm giống khởi động trong sản
xuất thực phẩm và các sản phẩm từ sữa [1].
1.2.1.3. Các chủng khởi động “thủ công”
Giống khởi động “thủ công” (hay tự nhiên), bắt đầu từ việc sử dụng một
phần sản phẩm của mẻ lên men trước để cấy sang mẻ mới. Một số loại
phomat Ý và Thụy Sĩ, nước sữa ( whey) tách ra từ sữa đông của lô sản xuất
trước được ủ trong điều kiện chọn lọc như nhiệt độ cao và độ pH thấp để thu
nhận whey “ khởi động”. Thành phần hệ vi sinh vật của giống khởi động tự
nhiên này rất phức tạp, tương đối biến đổi và thường không xác định. Mặc dù
[Type text]

Page 14


hiệu suất không ổn định, trái ngược với xu hướng hiện nay trong công nghệ

tạo chủng khởi động (hiệu suất phải ổn định), việc thay thế bằng những chủng
khởi động xác định đôi khi tạo ra sản phẩm ít hương thơm hơn [6].
1.2.2. Lactococcus lactis subsp. cremoris và ứng dụng trong sản xuất
phomat
Lactococcus lactis subsp. cremoris là cầu khuẩn, có đường kính 0,6 – 1,0
µm, tồn tại ở dạng song cầu khuẩn hoặc chuỗi dài, sinh trưởng ở dải nhiệt độ
từ 10oC – 40oC. Không phát triển được trong môi trường chứa NaCl 4%; pH
9,2. Loài này có ý nghĩa rất lớn trong nền công nghiệp sản xuất phomat và các
sản phẩm lên men từ sữa. Theo cách phân loại của W.H. Holzapfel và B.J.B.
Wood (1995), đa số các chủng Lactococcus lactis subsp. cremoris khác với
Lactococcus lactis subsp. lactis ở một số đặc điểm sinh lý, sinh hóa sau:
Bảng 1.2: Một số đặc điểm khác nhau giữa Lactococcus lactis subsp.
cremoris và Lactococcus lactis subsp. lactis [11].
Đặc điểm khác nhau
Loài
Lactococcus
lactis subsp.
cremoris
Lactococcus
lactis subsp.
lactis

o

40 C

pH
9,6

NaCl

4%

Giải phóng NH3
từ agrinine

Sử dụng
đường
Maltose

-

-

-

-

Hiếm khi

+

+

+

+

+

Ghi chú: (-): không phát triển (+): Sinh trưởng được

Lc. lactis subsp. cremoris là một trong những loài vi khuẩn lactic ưa ấm
được sử dụng rộng rãi trong lên men nhiều loại phomat: Cheddar, Gouda,
Edam, Cottage, Cream. Trong chế phẩm giống khởi động thương mại, Lc.
lactis ssp. cremoris thường được kết hợp với các loài ưa ấm như Lc. lactis
subsp. lactis; Lc. lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis và các loài thuộc
chi Leuconostoc; hoặc kết hợp với các loài ưa nhiệt Lactobacillus delbrueckii
[Type text]

Page 15


spp. bulgaricus, Streptococcus thermophilus (phomat Brick, Limburger).
Bảng 1.3: Một số chế phẩm giống khởi động phomat chứa Lactococcus lactis
subsp. cremoris
Chế phẩm

Giống khởi động
Lactococcus. lactis subsp.
lactis
Mesophilic(Sacco
) MO 030
Lactococcus. lactis subsp.
cremoris
Lactococcus lactis subsp. lactis
Lactococcus lactis subsp.
cremoris
Mesophilic(Sacco
Lactococcus lactis subsp. lactis
) MO 030R

biovar. diacetylactis
Leuconostoc mesenteroides
subsp. cremoris
Lactococcus lactis subsp.
Mesophilic Starter
cremoris
( mother)
Lactococcus lactis subsp. lactis

Nhà cung cấp
Glengarry
cheesemaking &
Dairy Supply

Glengarry
cheesemaking &
Dairy Supply

New England
Cheesemaking
Supply Co

1.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men tăng sinh khối
1.3.1. Ảnh hưởng của môi trường tới khả năng sinh trưởng
Vi khuẩn lactic thuộc loại vi sinh vật dị dưỡng. Nguồn năng lượng cần
thiết cho hoạt động sống và phát triển của chúng do trao đổi chất với môi
trường bên ngoài. Để duy trì sự sống, điều hòa các quá trình chuyển hóa trong
tế bào, chúng cần sử dụng nguồn gluxit có trong môi trường dinh dưỡng làm
nguồn carbon (chủ yếu là đường glucose), nguồn nitơ (peptone, cao thịt, cao
nấm men), vitamin, muối khoáng và các nguyên tố vi lượng.

Ngoài ra nhu cầu về các muối vô cơ và hữu cơ cũng rất cần thiết. Trong
đó Tween 80 là một dẫn xuất của acid oleic, là một loại acid hữu cơ quan
trọng có ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của hầu hết các loài vi khuẩn lactic.

[Type text]

Page 16


Để đảm bảo cho sự sinh trưởng và phát triển, vi khuẩn lactic cần nhiều hợp
chất vô cơ. Phosphate là loại muối quan trọng nhất đối với vi khuẩn lactic.
1.3.2. Ảnh hưởng của pH môi trường tới khả năng sinh trưởng
Mỗi loài vi sinh vật thích hợp với một giới hạn pH nhất định của môi
trường nuôi cấy. pH của môi trường có ảnh hưởng trực tiếp đến sự phát triển
và khả năng sinh tổng hợp enzyme của vi sinh vật. Đó là bởi vì ion H + và OHtrong môi trường tác động trực tiếp lên màng nguyên sinh chất làm thay đổi
sự vận chuyển của cơ chất cảm ứng vào tế bào và vận chuyển enzyme ra
ngoài môi trường. Mặt khác ion H+ và OH- cũng ảnh hưởng đến hệ enzyme
của vi sinh vật, tham gia vào hoạt động sống, sinh tổng hợp của vi sinh vật.
Axit mới tạo thành phải được trung hòa liên tục. Để lên men nhanh và
trọn vẹn, phạm vi pH tối ưu phải nằm giữa 4,5 và 6,5. Nhưng cũng có một số
chủng phát triển ở pH=9,6 và một số hoạt động ở pH=3,2. Ví dụ như loài
Lactococcus lactis subsp. lactis có thể phát triển ở pH 9,6. Khi axit lactic
được hình thành và nồng độ tăng dần trong quá trình lên men thì pH sẽ giảm
và nồng độ axit lactic đạt khoảng 2,2% sẽ ức chế vi khuẩn lactic (Trần Minh
Tâm, 2000).
1.3.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới khả năng sinh trưởng
Nhiệt độ cũng là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng tởi sự
sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật. Khi nhiệt độ tăng, các hóa chất và
các phản ứng của enzyme trong tế bào tăng nhanh, do đó sự sinh trưởng của
vi sinh vật cũng tăng theo. Tuy nhiên, nhiệt độ quá cao sẽ khiến protein, axit

nucleic trong tế bào trở nên nhạy cảm với nhiệt độ và có thể bị bất hoạt. Các
loài Lactococcus có dải nhiệt độ sinh trưởng 10 – 42oC, tối ưu là từ 20 – 35oC.
Lactococcus lactis subsp. cremoris nhạy cảm với nhiệt độ (40oC) hơn so với
Lactococcus lactis subsp. lactis.

[Type text]

Page 17


1.3.4. Ảnh hưởng của tỉ lệ tiếp giống đến khả năng sinh trưởng
Tỷ lệ tiếp giống có ảnh hưởng không nhỏ tới sự phát triển của vi khuẩn.
Tỷ lệ tiếp giống quá thấp dẫn tới thời gian lên men kéo dài, dễ tạp nhiễm, sinh
khối thu được thấp. Ngược lại, tỷ lệ tiếp giống quá cao rút ngắn được quá
trình lên men nhưng sinh khối không cao do nguồn thức ăn nhanh chóng bị
cạn kiệt và sinh ra các sản phẩm gây ức chế quá trình sinh trưởng. Do đó cần
phải có tỷ lệ tiếp giống phù hợp để tiết kiệm được môi trường lên men, rút
ngắn thời gian lên men và đảm bảo quá trình lên men đạt hiệu quả.
1.4. Các yếu tố ảnh hưởng tới tạo chế phẩm
Các phương pháp tạo chế phẩm giống khởi động vi khuẩn lactic hiện nay
thường được sử dụng là sấy đông khô và sấy chân không. Sấy là khâu quan
trọng, nó quyết định tỷ lệ tế bào sống sót trong chế phẩm cũng như bảo quản
sau này. Qua các khâu làm tăng độ khô của sinh khối (bằng cách trộn với chất
bảo vệ, chất mang), sấy khô, bảo quản trong điều kiện khô, tế bào vi sinh vật
đều phải chịu sự thay đổi của điều kiện môi trường bên ngoài hay còn gọi là
sốc (nhiệt độ, độ ẩm, áp suất ưu trương). Những sự thay đổi điều kiện môi
trường gây ra những bất lợi cho các tế bào, do vậy chỉ một số tế bào có khả
năng thích ứng và sống sót. Trong quá trình sấy khô chế phẩm, luôn xảy ra sự
chết của các tế bào vi sinh vật.
Tỷ lệ sống của các tế bào vi sinh vật phụ thuộc vào đặc điểm cấu tạo,

sinh hoá, sinh lý của chính tế bào vi sinh vật, thời gian, nhiệt độ sấy và độ ẩm.
Để thu nhận được chế phẩm có thành phần là các tế bào vi sinh vật sống,
nhiệm vụ đặt ra làm sao để tỷ lệ sống của các tế bào vi sinh vật ở mức cao
nhất. Có nhiều nghiên cứu về việc làm tăng khả năng sống sót của tế bào
trong quá trình sấy bằng các yếu tố: (i)- tác động vào giữa quá trình lên men
(chất hoà tan tương tích); (ii)- tác động vào cuối quá trình lên men (yếu tố

[Type text]

Page 18


tăng sức đề kháng), (iii)- môi trường sấy; (iv)- điều kiện sấy (nhiệt độ, thời
gian, áp suất, độ ẩm...).
1.4.1. Môi trường sấy
Việc lựa chọn môi trường sấy là rất quan trong đối với vi khuẩn lactic để
làm tăng tỷ lệ sống sót của chúng trong quá trình làm khô và bảo quản.
Đối với hầu hết các giống khởi động lactic đã được thương mại hóa
trong công nghiệp chế biến sữa, bột sữa gầy được cho là môi trường đông khô
lý tưởng bởi nó có tác dụng ngăn chặn tổn thương tế bào bằng cách ổn định
các thành phần của màng tế bào [8, 19]; tạo ra một cấu trúc xốp trong sản
phẩm đông khô, giúp cho việc tái huyền phù dễ dàng; có chứa các protein,
tạo nên lớp bảo vệ xung quanh tế bào [3].
Đối với phương pháp sấy chân không, vật liệu sấy thường sử dụng chất
độn là: lactose, tinh bột, tinh bột biến tính, chất xơ... .Độ ẩm vật liệu sấy càng
cao thì quá trình sấy càng kéo dài. Do vậy thông thường đối với vật liệu sấy
dạng rắn, thường độ ẩm nằm trong khoảng 25- 45%, tỷ trọng vật liệu sấy
trong khoảng 0,25- 0,55 g/cm3 tuỳ thuộc vào tỷ lệ chất độn, sinh khối và các
chất phụ gia khác.
1.4.1.1. Chất bảo vệ tế bào

Chất bảo vệ tế bào là những hợp chất được bổ sung vào cùng với môi
trường sấy. Tùy theo khả năng xâm nhập vào tế bào của các chất này mà
chúng có những cơ chế bảo vệ tế bào khác nhau. Có thể phân ra làm 3 nhóm:
(i) Chất xâm nhập qua được cả thành tế bào và cả màng tế bào (Glycerol); (ii)
Chất chỉ đi qua được thành tế bào (các oligosacarit, các acid amin và các
polyme có phân tử lượng thấp); (iii) Chất không đi qua thành tế bào hoặc
không có liên kết trực tiếp với thành tế bào hay màng tế bào (polyme có khối
lượng phân tử cao).
[Type text]

Page 19


Đường và các dẫn xuất của đường
Các loại đường khác nhau trong chế phẩm có ảnh hưởng hay phụ thuộc
vào loại đường từng được bổ sung vào môi trường nuôi cấy trước đó. Có
nghĩa là sự khác nhau trong khả năng bảo vệ của các loại đường đối với tế
bào khi sấy và bảo quản chế phẩm là do sự thâm nhập có hiệu quả hay không
hiệu quả của từng loại đường và điều đó liên quan đến loại đường được hấp
thụ.
Một số nghiên cứu của Carvalho và cộng sự (2003) [9] cho thấy sorbitol
có tác dụng tích cực tới sự sống sót của Lactobacillus rhamnosus, Lb.
bulgaricus, Lb. plantarum trong giai đoạn bảo quản khô, mặc dù không thể
hiện khả năng bảo vệ trong quá trình đông khô.
Crowe và cộng sự (1996) [5] cho rằng trehalose bảo vệ các vật liệu sinh
học hiệu quả hơn các loại đường khác, trong khi đó Leslie và cs (1995) thấy
rằng trehalose có thể bảo vệ liposome làm từ lipit màng tế bào và cả tế bào
nguyên vẹn trong quá trình lạnh đông và sấy.
Tuy nhiên giá thành của hợp chất độn rất được quan tâm khi sử dụng
chất độn trong quy mô công nghiệp. Vì thế trong thực tế sucrose, glucose có

đặc tính sinh học tương tự trehalose thường được sử dụng bổ sung vào chất
độn trong quá trình bảo quản tế bào khô, điều đó cũng đưa lại hiệu quả nhưng
khả năng bảo vệ đó còn phụ thuộc vào loại đường sử dụng trong môi trường
nuôi cấy.
Chất bổ trợ
Glycerol là chất bổ trợ cho việc bảo vệ tế bào bởi đó là một chất có khả
năng xâm nhập vào màng tế bào, khiến màng tế bào có khả năng dẻo, dai hơn
và kết hợp được với nước để chống lại sự thoát hơi nước quá nhiều. Đồng
thời ngăn chặn sự hình thành các tinh thể đá bên trong tế bào khi làm lạnh.
[Type text]

Page 20


1.4.2. Điều kiện sấy
1.4.2.1. Ảnh hưởng của hàm ẩm
Hầu hết các quá trình sống của vi khuẩn có liên quan đến nước do đó độ
ẩm là một yếu tố quan trọng của môi trường. Tế bào vi khuẩn khi thiếu nước
sẽ xảy ra hiện tượng loại nước khỏi tế bào vi khuẩn, trao đổi chất bị giảm.
Khả năng chịu hạn của các tế bào khác nhau. So với tế bào dinh dưỡng, các
bào tử chịu được sự khô hạn hơn rất nhiều. Nếu làm lạnh tế bào đồng thời làm
khô trong chân không ta có thể bảo quản được tế bào (tuy còn sống nhưng ở
trạng thái nghỉ) trong một thời gian dài (Nguyễn Lân Dũng và cs, 2002). Tuy
nhiên chế phẩm ở trạng thái càng khô, khi không tiếp xúc với không khí, lại
càng bảo quản tế bào (ở trạng thái nghỉ) tốt hơn. Những tế bào này khi được
hoạt hoá trong môi trường dinh dưỡng, tại nhiệt độ thích hợp lại quay trở lại
trạng thái hoạt động, sinh sôi và phát triển.
1.4.2.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ sấy
Đa số vi sinh vật có khả năng sinh trưởng trong khoảng 20oC đến 40oC.
Chỉ một số ít có khả năng sinh trưởng thấp hơn 20 oC và cao 40 – 55oC; một số

vi khuẩn ưa nóng có thể sống 75oC và 80oC. Ở nhiệt độ cao, protein bị biến
tính, một hoặc hàng loạt enzym bị bất hoạt (Nguyễn Lân Dũng và cs, 2002) –
các enzym hô hấp, đặc biệt là các enzym trong chu trình Kreps rất mẫn cảm
với nhiệt độ; xảy ra sự bất hoạt ARN và sự phá huỷ màng tế bào chất.
Do vậy người ta thường tiến hành quá trình sấy chế phẩm sinh khối vi
sinh vật ở nhiệt độ thấp hoặc bằng hơn nhiệt độ sinh trưởng của chúng.
Vi khuẩn thường chịu được nhiệt độ thấp. Ở nhiệt độ dưới điểm đóng
băng hoặc thấp hơn chúng không thể hiện hoạt động trao đổi chất rõ rệt. Điều
kiện nhiệt độ thấp (dưới -2oC) lại có thể bất hoạt quá trình vận chuyển các
chất hoà tan qua màng tế bào do thay đổi cấu trúc không gian của một số
[Type text]

Page 21


permeaza chứa trong màng hoặc ảnh hưởng đến việc hình thành và tiêu thụ
ATP cần cho quá trình vận chuyển chủ động các chất dinh dưỡng. Tuy nhiên,
việc làm lạnh quá nhanh có thể coi là yếu tố ức chế vi khuẩn. Trong trường
hợp làm lạnh dần xuống dưới điểm đóng băng cấu trúc của tế bào ít bị tổn hại
do các tinh thể băng được tạo thành nhưng kích thước nhỏ, do đó tế bào
không bị phá huỷ. Nếu làm lạnh trong chân không các tinh thể băng sẽ thăng
hoa. Tuy nhiên ngay cả trong quá trình sấy đông khô ở nhiệt độ thấp hơn
trạng thái ba thể, tế bào vi sinh vật cũng chết với tỷ lệ thấp.

[Type text]

Page 22


PHẦN THỨ HAI - NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị
2.1.1. Chủng giống
Chủng Lactococcus lactis subsp. cremoris VNC53 từ bộ sưu tập giống
của Viện công nghiệp Thực Phẩm, đã được khảo sát các đặc tính cần thiết của
một chủng khởi động cho sản xuất phomat như: khả năng chuyển hóa citrate,
hoạt tính peptidase, hoạt tính X – prolyl – dipeptidyl aminopeptidase, tổng
hợp exopolysaccharide, hoạt tính enzym nội bào, khả năng hương thơm... Về
khả năng sử dụng nguồn cacbon, chủng VNC53 có lên men tốt 4 loại đường:
Lactose, fructose, galactose, glucose.

Hình 2.1: Chủng Lactococcus lactis subsp. cremoris VNC53
2.1.2. Nguyên liệu và hóa chất
Pepton

: Trung Quốc.

(NH4)2SO4

: Trung Quốc.

[Type text]

Page 23


KH2PO4

: Trung Quốc.

K2HPO4

: Trung Quốc.

MgSO4.7H2O

: Trung Quốc.

NaCl

: Trung Quốc.

KCl

: Trung Quốc.

CaCl2

: Trung Quốc.

Agar

: Việt Nam.

Cao nấm men

: Việt Nam

Glucose

: Việt Nam.

Lactose

: Mỹ.

Và 1 số hóa chất khác.
2.1.3. Thiết bị
Nồi hấp tiệt trùng

: SA – 300VF ( Đài Loan)

Máy ly tâm to

: SORVALL RC 6, Đức.

Máy ly tâm eppendoft

: Mikro 22R, Hettich Zentrifugen, Đức.

Máy so màu quang phổ : UV-1650PC, Shimadzu, Nhật Bản.
Tủ cấy vô trùng

: Bassaire, Anh.

Máy đo pH

: Orion 410A (Mỹ)

Tủ sấy dụng cụ

: Sanyo, Nhật Bản.

Tủ nuôi vi sinh vật

: Sanyo, Nhật Bản.

Lò vi sóng

: Sanyo, Nhật Bản.

Kính hiển vi

: Leica BM500 (Đức)

Một số thiết bị khác.
[Type text]

Page 24


2.1.4. Môi trường
2.1.4.1. Môi trường giữ giống
 Môi trường bảo quản lạnh sâu
Giống được cấy sạch trên đĩa MRS agar 3 lần liên tục, sau đó lấy sinh
khối trên đĩa đưa vào các ống eppendorf chứa glycerol 40%, giữ trong môi
trường này bảo quản ở nhiệt độ -20oC, trong 6 tháng.
 Môi trường thạch đứng
Môi trường MRS có bổ sung agar 20g/l + CaCO 3 3g /l chứa trong các
ống nghiệm nút bông, được hấp thanh trùng ở 121oC/15 phút. Giống được giữ
trong môi trường này bảo quản ở 4oC, 1 tháng cấy chuyển một lần.

2.1.4.2. Môi trường lên men
Môi trường MRS: peptone (10g/l), cao nấm men (15g/l), glucose (20g/l),
tween 80 (1g/l), K2HPO4.3H2O (2,62g/l), CH3COONa (5g/l), (NH4)3citrat
(2,15g/l), MgSO4.7H2O (2g/l), MnSO4.H2O (0.5g/l), pH (6,5-6,8).
Môi trường được thanh trùng ở 121oC/15 phút.
2.2 Phương pháp nghiên cứu
2.2.1 Phương pháp vi sinh
 Hoạt hóa giống
Giống có thể được hoạt hóa từ ống bảo quản đông khô, bảo quản lạnh
sâu hay ống bảo quản trong thạch đứng sang ống nghiệm nút xoáy môi trường
MRS ở nhiệt độ 300C/24h.
 Nhân giống

[Type text]

Page 25