Ứng dụng kỹ thuật reverse dot blot để xác định genotype HPV trong dịch cổ tử cung

LỜI CẢM ƠN

Để có thể hoàn thành khóa luận này, em đã nhận được sự giúp đỡ hết
sức tận tình của các thầy, các cô, các anh chị kĩ thuật viên trong bộ môn Y
sinh học - Di truyền và các bệnh nhân đến khám tại Bộ môn.
Trước hết, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Lương Thị Lan
Anh, Phó chủ nhiệm bộ môn Y sinh học - Di truyền, trường Đại học Y Hà
Nội. Cô đã giao đề tài, tận tình giúp đỡ, hướng dẫn, động viên, tạo điều kiện
thuận lợi cho em trong suốt quá trình em thực hiện và hoàn thành khóa luận.
Em xin chân thành cảm ơn các thầy, cô, anh, chị trong bộ môn Y sinh
học - Di truyền, trường Đại học Y Hà Nội đã giúp đỡ, quan tâm, đóng góp ý
kiến, chia sẻ kinh nghiệm, tạo điều kiện giúp em hoàn thành khóa luận.
Em xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu, Phòng đào tạo Đại học
trường Đại học Y Hà Nội đã quan tâm, giúp đỡ em trong suốt quá trình học
tập và hoàn thành khóa luận.
Mặc dù, em đã cố gắng để hoàn thiện đề tài một cách hoàn chỉnh nhất,
song do buổi đầu mới làm quen với công tác nghiên cứu khoa học cùng với
nhiều hạn chế về kiến thức cũng như kinh nghiệm nên không thể tránh khỏi
những thiếu sót nhất định mà bản thân chưa nhìn thấy được. Vì vậy, em rất
mong nhận được sự góp ý của quý thầy, cô để khóa luận được hoàn chỉnh
hơn.
Sau cùng, em muốn cảm ơn gia đình, các anh chị em, bạn bè đã giúp
đỡ, động viên em trong suốt quá trình học tập và hoàn thành khóa luận.
Hà Nội, ngày

tháng 6 năm 2015

Sinh viên
Trần Thị Thanh Thanh

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số
liệu, kết quả trong khóa luận là trung thực và chưa từng được ai công bố trong
bất kì một công trình nào khác.

Hà Nội, ngày tháng 6 năm 2015
Sinh viên
Trần Thị Thanh Thanh


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
LỜI CAM ĐOAN
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC BẢNG
DANH MỤC HÌNH
ĐẶT VẤN ĐỀ ....................................................................................................... 1
Chương 1. TỔNG QUAN ..................................................................................... 3
1.1. Đặc điểm chung của HPV .............................................................................. 3
1.2. Cơ chế gây bệnh ............................................................................................. 6
1.3. Tình hình nhiễm HPV ở Việt Nam và trên thế giới ....................................... 9
1.4. Các phương pháp chẩn đoán và xác định genotype HPV............................ 10
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................... 16
2.1. Đối tượng nghiên cứu.................................................................................... 16
2.2. Phương pháp nghiên cứu............................................................................... 16
Chương 3. KẾT QUẢ ......................................................................................... 27
3.1. Thông tin chung đối tượng nghiên cứu ......................................................... 27
3.2. Phân tích kết quả xác định genotpye HPV.................................................... 28

3.3. Kết quả xác định genotype HPV trong dịch cổ tử cung ............................... 31
Chương 4. BÀN LUẬN ...................................................................................... 40
4.1. Về kết quả xác định genotype HPV bằng kĩ thuật RDB ............................... 40
4.2. Về kết quả xác định genotype HPV .............................................................. 43
KẾT LUẬN ......................................................................................................... 50
KIẾN NGHỊ ........................................................................................................ 52
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ASCUS

Atypical

Squamous

Cells

of

Undetermined

Significance (Tổn thương tế bào nội biểu mô vảy
không điển hình ý nghĩa chưa xác định)
DNA

Deoxyribo Nucleic Acid

HPV

Human Papilloma Virus

HSIL

High - grade Squamous Intraepithelial Lesion (Tổn
thương tế bào nội biểu mô vảy độ cao)

IARC

International Agency for Research on Cancer (Tổ chức
nghiên cứu ung thư quốc tế)

LSIL

Low - grade Squamous Intraepithelial Lesion (Tổn
thương tế bào nội biểu mô vảy độ thấp)

Nu

Nucleotid

PAP test/PAP smear Papanicolaou Test/Papanicolaou smear (Xét nghiệm tế
bào học cổ tử cung)
PCR

Polymerase Chain Reaction

PV

Papilloma Virus

RDB

Reverse Dot Blot (Kĩ thuật lai phân tử ngược)

UTCTC

Ung thư cổ tử cung


DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1. Trình tự primer MY09 - MY11 của PCR phát hiện DNA HPV ........ 19
Bảng 2.2. Trình tự Nu của 24 probe HPV trên màng lai .................................... 24
Bảng 3.1. Phân bố nhóm tuổi ............................................................................. 27
Bảng 3.2. Phân bố kết quả PAP test ................................................................... 27
Bảng 3.3. Kết quả định tính HPV bằng kĩ thuật Realtime PCR ......................... 31
Bảng 3.4. Phân bố nhiễm đơn type HPV ............................................................ 34
Bảng 3.5. Tỉ lệ đồng nhiễm các type HPV ......................................................... 35
Bảng 3.7. Kết quả PAP test và sự đồng nhiễm HPV .......................................... 38


DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Hình ảnh mô phỏng HPV ..................................................................... 3
Hình 1.2. Hệ gen của HPV ................................................................................... 4
Hình 2.1. Sơ đồ các bước tiến hành nghiên cứu................................................. 17
Hình 2.2. Kết quả Realtime PCR. ...................................................................... 20
Hình 2.3. Mẫu dương tính với genotype 11 ....................................................... 23

Hình 3.1. Kết quả phân tích Realtime PCR định tính genotype HPV ............... 29
Hình 3.2. Hình ảnh màng lai dương tính với type 11......................................... 30
Hình 3.3. Hình ảnh màng lai dương tính với các type 11, 16 và 18 .................. 30
Hình 3.4. Hình ảnh màng lai dương tính với type HPV ngoài 24 type trên ...... 31
Hình 3.5. Biểu đồ tỉ lệ nhiễm HPV .................................................................... 32
Hình 3.6. Biểu đồ tỉ lệ nhiễm HPV theo tuổi ..................................................... 33
Hình 3.7. Biểu đồ tỉ lệ nhiễm HPV đơn type và đa type .................................... 33
Hình 3.8. Biểu đồ sự đồng nhiễm HPV .............................................................. 34
Hình 3.9. Biểu đồ phân bố các type HPV .......................................................... 36
Hình 3.10. Kết quả PAP test và tỉ lệ nhiễm HPV............................................... 37
Hình 4.1. Hình ảnh màng lai dương tính với các type HPV 71, 81, 18, 56 ....... 42
Hình 4.2. Hình ảnh màng lai dương tính với type HPV 11................................ 42


1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Human papilloma virus (HPV) là loại virus sinh u nhú ở người, là một
trong những tác nhân lây nhiễm qua đường sinh dục phổ biến. Nhiễm HPV ở
người thường gây ra các trạng thái tăng sinh nội biểu mô ở nhiều dạng khác
nhau. Dựa vào khả năng tiềm tàng gây ung thư, HPV được chia thành 2
nhóm: nhóm nguy cơ cao và nhóm nguy cơ thấp, đặc biệt nhóm nguy cơ cao
có thể biểu hiện thành các khối u điển hình như ung thư cổ tử cung (UTCTC),
u biểu mô vùng hậu môn - sinh dục (âm hộ - âm đạo, vùng trực tràng, hậu
môn, dương vật) và các khối u ở vòm họng, hầu họng [1]. Trong đó, UTCTC
là một trong những loại ung thư phổ biến nhất ở phụ nữ trên thế giới và là
nguyên nhân gây tử vong hàng đầu của phụ nữ ở các nước đang phát triển. Do
đó, việc phòng bệnh cũng như điều trị UTCTC ngày càng được quan tâm [2],
[3].
HPV được phát hiện ở trên 95% số trường hợp mắc UTCTC [4]. Khả

năng diễn tiến đến UTCTC ở trường hợp nhiễm HPV kéo dài gấp 250 lần so
với người không bị nhiễm [5]. Trên toàn thế giới, có khoảng 50 ÷ 80% phụ nữ
có quan hệ tình dục bị nhiễm HPV ít nhất một lần trong đời, nhưng bệnh ít
được biết đến vì sự nhiễm bệnh hầu như không gây ra triệu chứng lâm sàng
đáng phải quan tâm [6], [7]. Quá trình nhiễm virus là lâu dài, trung bình từ
giai đoạn loạn sản (giai đoạn tổn thương có thể hồi phục) đến giai đoạn ung
thư xâm nhập (việc điều trị đem lại ít hiệu quả) là từ 8 ÷ 10 năm [8]. Vì vậy,
sàng lọc trong nhóm nguy cơ cao để phát hiện và điều trị ở giai đoạn sớm tổn
thương tiền ung thư là hết sức cần thiết.
Việc xác định các genotype HPV (type HPV) có vai trò vô cùng quan
trọng trong việc đánh giá nguy cơ UTCTC cũng như điều trị sớm.
Có nhiều phương pháp phát hiện sớm sự có mặt của HPV. Phương
pháp PAP smear (xét nghiệm tế bào học cổ tử cung) cho biết sự thay đổi hình


2

thái tế bào bị nhiễm HPV, có tỉ lệ âm tính giả dao động từ 1,1 ÷ 29,7% [8],
tuy nhiên không xác định được type HPV [9]. Phương pháp Ts - PCR (Type
specific - PCR) phải qua bước phát hiện sản phẩm PCR, điện di agarose sử
dụng Ethidium bromide. Phương pháp sequencing (giải trình tự gen - so sánh,
đối chiếu với trình tự gen các type HPV) được coi là tiêu chuẩn vàng nhưng
giá thành cao, tốn nhiều thời gian và không xác định được đồng nhiễm. Kĩ
thuật lai phân tử Reverse Dot Blot (RDB) sử dụng các mẫu dò đặc hiệu để
phân biệt sự khác nhau giữa các alen ở vị trí một nucleotide (Nu). So với các
kĩ thuật trên, kĩ thuật Reverse Dot Blot đã khắc phục được một số nhược
điểm, đồng thời có thể xác định sự nhiễm và đồng nhiễm các type HPV trên
cùng một mẫu bệnh phẩm. Song ở Việt Nam chưa có nhiều nghiên cứu về kĩ
thuật này được thực hiện.
Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi thực hiện đề tài “Ứng dụng kĩ

thuật Reverse Dot Blot để xác định genotype HPV trong dịch cổ tử cung”
với mục tiêu:
1. Phân tích được kết quả xác định genotype HPV bằng kĩ thuật
Reverse Dot Blot.
2. Mô tả các genotype HPV trong dịch cổ tử cung xác định được bằng
kĩ thuật Reverse Dot Blot.


3

Chương 1
TỔNG QUAN
1.1.

Đặc điểm chung của HPV

1.1.1. Cấu trúc phân tử
HPV có kích thước nhỏ, đường kính 55 nm, không có vỏ bọc ngoài
cùng. Dưới kính hiển vi điện tử, HPV giống quả bóng golf. Cấu trúc đối xứng
hình khối gồm 72 capsomer, protein cấu trúc capsid gồm 2 lớp: lớp 1 (kí hiệu
là L1 - protein bề mặt) là lớp vỏ lớn, cấu trúc hình khối từ các đơn vị 5 góc
cạnh; lớp 2 (kí hiệu là L2 - protein cấu trúc) là lớp vỏ bé gồm nhiều đơn vị
xếp lớp (12 đơn vị/virus) - hình 1.1.

Hình 1.1. Hình ảnh mô phỏng HPV
Nguồn: />
Hệ gen HPV là một phân tử DNA sợi kép (dsDNA) khép kín thành
vòng tròn, dài khoảng 7.900 cặp Nu, được bao bởi nhiều phân tử histon. Về
chức năng: hệ gen chia thành 3 phân vùng quan trọng - Hình 1.2.

4

Hình 1.2. Hệ gen của HPV
Nguồn: />Chú thích: Long control region: vùng điều hòa lớn
E1, E2, E4, E5, E6, E7: các gen vùng sao chép sớm
L1, L2: các gen vùng sao chép muộn

Phân vùng thứ 1: vùng điều hòa lớn (long control region - LCR) là
vùng chứa DNA không mã hóa, dài 400 ÷ 1.000 bp, có chức năng điều hòa
sao chép, gồm chuỗi p97 là tiểu phần khởi động (p97 core promoter), các tiểu
phần kích hoạt và một số chuỗi gen “câm” [10].
Phân vùng thứ 2: vùng sao chép sớm (early region - E) gồm các gen:
E1, E2, E4, E5, E6, E7. Sản phẩm protein của chúng trợ giúp cho sự nhân lên
của DNA virus, tham gia cơ chế hình thành khối u cổ tử cung.
Phân vùng thứ 3: vùng sao chép muộn (late region - L), gồm các gen
tổng hợp protein L1, L2 - những protein cấu trúc capsid của virus, được sản
xuất muộn hơn.


5

1.1.2. Phân loại
Hầu hết các Papilloma Virus (PV) gây bệnh, có biểu hiện lâm sàng ở
động vật và người, đều thuộc siêu nhóm A (PV thích ứng đường sinh dục và
niêm mạc) hoặc B (PV gây u xơ cứng biểu mô sùi). Siêu nhóm C và D gồm
các PV gây khối u xơ papilloma và khối u đích thực do PV gây ra. Siêu nhóm
E chưa được phân loại chính xác, là hỗn hợp PV thích ứng và gây khối u ở da.
HPV là virus sinh u nhú ở người thuộc siêu nhóm A, chủ yếu gồm virus gây
UTCTC ở người gồm 12 nhóm phụ từ A1 ÷ A12, trong đó các type HPV

thuộc nhóm A9 là các virus có khả năng gây UTCTC cao.
PV được phân chia tiếp tục thành các genotype, gọi tắt là các type. Đối
với HPV, được coi là cùng type nếu gen L1 không khác nhau > 10%. Tuy
nhiên có nhiều trường hợp, phân type HPV không hoàn toàn dựa vào chênh
lệch % Nu trong gen L1 mà còn xem xét thêm đặc tính gây bệnh các type
[11], [12].
Hiện nay, HPV có khoảng 100 type khác nhau đã được xác định, mỗi
type có hàng chục phân type (subtype), mỗi phân type lại có hàng chục biến
thể (variant) khác nhau gọi là chủng virus. Các chủng virus thường được đặt
tên theo các địa danh, nhân danh, tuy nhiên nếu phân tích về mặt di truyền,
nhiều chủng có tên khác nhau lại rất có thể thuộc một biến thể. Do sự biến
động và đa dạng này nên việc định type và định chủng của HPV khá phức tạp,
đòi hỏi kĩ thuật cao và chính xác. Việc định type và chủng của HPV dựa vào
kết quả phân tích và xác định mức độ giống nhau của thành phần Nu cũng
như mức độ tương đồng giữa các thành phần Nu của các gen E6, E7 và L1.
Một mẫu virus HPV mới phân lập sẽ được gọi là cùng type với một
type HPV đã xác định trước đó nếu thành phần của các chuỗi E6, E7 và L1 có
mức độ đồng nhất > 90% [13].


6

Những mẫu virus khác nhau trong cùng một type lại được chia thành
các phân type (biến thể/chủng) trên cơ sở phân tích sự biến đổi Nu và acid
amin của các gen sao chép sớm (E) và sao chép muộn (L). Về nguyên tắc,
một virus HPV được coi là đồng phân type (đồng chủng) nằm trong một type
HPV nào đó nếu như thành phần Nu và acid amin của chúng có mức độ tương
đồng từ 90 ÷ 98%. Một biến thể độc lập của virus HPV phải có sai khác ít
nhất là 2% so với biến thể khác. Khi so sánh, nếu sự sai khác < 2%, chúng
được coi là cùng biến thể. Tuy có sai khác ít về hệ gen nhưng có một số biến

thể HPV trong tự nhiên lại có đặc tính sinh học và hóa sinh học khác nhau,
đặc biệt là khả năng gây ung thư và cơ chế hình thành khối u cổ tử cung [14].
Dựa trên tổn thương mô học (khả năng gây UTCTC), mà người ta chia
ta thành 3 nhóm [15], [16]:
Nguy cơ cao: gồm các type HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56,
58, 59, 68, 73, 82 và HPV 26, 53, 66: gây tổn thương tiền ung thư và ung thư.
Nguy cơ thấp: gồm các type HPV 6, 11, 40, 42, 43, 44, 54, 61, 70, 72,
81, 89 và CP6108: gây mụn cóc và các khối u lành tính.
Nhóm chưa xác định được nguy cơ: gồm các type HPV 2a, 3, 7, 10, 13,
27, 28, 29, 30, 32, 34, 55, 57, 62, 67, 69, 71, 74, 77, 83, 84, 85, 86, 87, 90, 91:
chưa xác định được khả năng gây ung thư.
Tuy nhiên có một số type như type 7, 10, 71, theo nghiên cứu được
thực hiện năm 2004 của nhóm tác giả Ethel - Michele de Villiers và cộng sự,
lại xếp vào nhóm nguy cơ thấp [17].
1.2.

Cơ chế gây bệnh
Cơ chế HPV gây UTCTC đã được Massimi và Banks [18] giải thích

như sau: ở người và động vật có 2 loại protein điều chỉnh sự phân chia và
mức độ phát triển tế bào là RB (retinoblast) và p53 (protein điều hòa khối u).
Khi 2 gen E6 và E7 của HPV tổng hợp protein, các protein này tiếp xúc với


7

RB và p53 gây cản trở quá trình điều chỉnh sự phân chia tế bào, kết quả là tế
bào bị nhiễm HPV sinh sản tự phát, không có sự kiểm soát, thay đổi cấu trúc,
gen không thể sửa chữa được và phát triển thành ung thư. Trong giai đoạn
sớm, những tế bào cổ tử cung bị nhiễm có thể chỉ thay đổi nhỏ về hình dáng

và kích thước, dẫn đến bị biến dạng, rối loạn trật tự cấu trúc, phá hủy biểu mô
bề mặt cổ tử cung. Những thay đổi này sẽ gây loạn sản hoặc hình thành khối
tân tạo hoặc ung thư trong biểu mô cổ tử cung [9], [19].
HPV lây truyền chủ yếu qua đường tình dục và có thể lây truyền khi
tiếp xúc trực tiếp từ da qua da. HPV có khả năng thích ứng ở biểu mô sừng và
niêm mạc gây tăng sinh tế bào biểu mô và biến đổi tế bào dẫn đến ung thư
qua các bước sau [20], [21]:
(1) Xâm nhập chuỗi gen của HPV vào tế bào chủ: bộ gen HPV xâm
nhập vào chuỗi gen của vật chủ ở dạng episome (DNA dạng vòng ở ngoài
nhiễm sắc thể vật chủ) đối với nhóm “nguy cơ thấp” hoặc tích hợp DNA vào
nhiễm sắc thể vật chủ đối với nhóm “nguy cơ cao”. Ở dạng episome, vùng
gen mã hóa E2 không bị biến đổi. Nồng độ protein E2 tăng lên cùng với sự
tăng sinh sao chép DNA HPV, gây hiện tượng tăng sinh tế bào đồng thời ức
chế giải mã gen sớm kìm chế hoạt động của E6 và E7. Khi E6 và E7 bị kìm
chế, sẽ hoạt hóa con đường p53 và yếu tố ức chế hình thành u của protein RB,
giúp tế bào hoặc sửa chữa hoặc chết theo chương trình, phụ thuộc mức độ của
sự tác động phá hủy. Do đó, có hiện tượng tăng sinh một số lượng lớn tế bào
nhưng vẫn dưới sự kiểm soát của p53 và protein RB.
Khi chuỗi gen HPV xâm nhập vào nhiễm sắc thể vật chủ sẽ phá vỡ gen
E2 và giải phóng sự kìm chế hoạt động của E6 và E7. Hai oncogen E6, E7 có
khả năng gắn và làm giảm chức năng của p53 và protein RB, đây là điều kiện
quan trọng để gây biến đổi gen của tế bào chủ [22].


8

(2) Gây bất tử hóa tế bào: protein E6, E7 của các genotype HPV nhóm
“nguy cơ cao” còn có khả năng kết hợp với protein ras. Protein ras là phân tử
truyền thông tin trong tế bào, khi protein ras được hoạt hóa làm tế bào phát
triển, biệt hóa và duy trì sự sống. Gen mã hóa protein ras được coi là gen gây

ung thư phát hiện đầu tiên. Cơ chế của protein E6 gây bất tử tế bào đã được
chứng minh bằng khả năng bất hoạt p53, bộc lộ hTERT (human telomerase
reverse transcriptase) và tăng hoạt động telomerase [22].
(3) Bất ổn định gen tế bào chủ: bất thường quá trình phân bào có thể
gây ra bởi protein E6 và E7 của các genotype nhóm “nguy cơ cao” mà không
gặp ở genotype nhóm “nguy cơ thấp”, gây mất alen ở một số gen nhất định
mà các gen này liên quan đến sự xuất hiện và tiến triển của ung thư. E6 gây
bất ổn định gen do khả năng ức chế chức năng p53 dẫn đến rối loạn quá trình
sửa chữa ADN bình thường và hậu quả gây thay đổi gen. E7 gây bất ổn định
gen thông qua sự bất hoạt của protein RB và tác động lên quá trình tổng hợp
trung thể, hậu quả gây biến đổi sự chia tách DNA trong quá trình phân bào
[23].
(4) Biến đổi đáp ứng với phá hủy DNA: gen E6 và E7 có thể gây mất
khả năng đáp ứng của cơ thể với sự phá hủy DNA. Khi có sự phá hủy DNA,
cơ thể đáp ứng bởi hoạt hóa p53 tạo ra protein điều hòa quá trình nghỉ giữa
hai chu trình nhân lên của tế bào. E6 và E7 có khả năng ức chế quá trình nghỉ
giữa phân bào được điều khiển bởi p53. E6 chỉ kết hợp và bất hoạt p53, trong
khi E7 không chỉ gây rối loạn chức năng của yếu tố điều hòa chu trình tế bào,
pRB mà còn bất hoạt p21 là chất ức chế enzym kinase phụ thuộc cycline, yếu
tố do p53 hoạt hóa [24].
(5) Tăng sinh và biệt hóa tế bào: HPV nhân lên theo quá trình biệt hóa
của tế bào đáy dưới dạng episome, đồng thời trong các tế bào lớp trên tế bào


9

đáy, chúng nhân lên và thoát khỏi chu trình nhân lên của tế bào nhờ vai trò tái
thiết lập chương trình tổng hợp DNA ở tế bào sừng bị nhiễm E6, E7 HPV
[25].
1.3.

Tình hình nhiễm HPV ở Việt Nam và trên thế giới

1.3.1. Trên thế giới
Bắt đầu có sự nghiên cứu về HPV từ năm 1974 - 1976 và HPV được
chứng minh là nguyên nhân gây UTCTC nhưng mãi đến những năm 1980,
ứng dụng các kĩ thuật sinh học phân tử đã xác định sự có mặt của HPV trong
mô bệnh phẩm ung thư [26], [28]. Hai type HPV được tìm ra đầu tiên là HPV
16, 18 [26], [27]. Gần 200 type được biết đến, nhưng chỉ xác định được
khoảng 100 type bao gồm khoảng 40 type có khả năng lây truyền qua đường
sinh dục [29].
Năm 1983, Hausen Z. H. và cộng sự đã tìm ra mối liên quan giữa HPV
và UTCTC. Năm 2008, ông đã được nhận giải thưởng Nobel về y học.
Vaccine HPV được Frazer I. cùng cộng sự tìm ra năm 2005. Hiện nay,
vaccine HPV được sử dụng rộng rãi ở các quốc gia, chế phẩm Gardasil được
cấp phép bởi Cục quản lí thực phẩm và dược phẩm Mỹ năm 2006 và Cervarix
được phê duyệt 3 năm sau đó [30], [31], [32].
Năm 2010, Ronco G. và cộng sự đã báo cáo về thử nghiệm ngẫu nhiên
trên hơn 40.000 phụ nữ sàng lọc bằng tế bào và sàng lọc bằng test HPV, cho
thấy sàng lọc bằng test HPV hữu hiệu hơn sàng lọc bằng tế bào trong dự
phòng ung thư xâm lấn [33].
Năm 2013, Lauren E. W. và cộng sự nghiên cứu về đáp ứng miễn dịch
tự nhiên chống lại tác nhân gây ung thư HPV trong phân loại ASCUS - LSIL
[34].
Về tần suất nhiễm HPV, theo kết quả báo cáo của Tổ chức nghiên cứu
ung thư quốc tế (IARC), trên toàn thế giới có khoảng 6,6% phụ nữ độ tuổi từ


10

15 ÷ 74 bị nhiễm HPV và khoảng 80% phụ nữ nhiễm HPV ít nhất một lần
trong suốt đời sống tình dục của họ [35].
1.3.2. Ở Việt Nam
Tại Việt Nam, đã có nhiều nghiên cứu về HPV được tiến hành.
Năm 2005, Nguyễn Thị Ánh Hồng nghiên cứu về sử dụng kĩ thuật PCR
phát hiện virus gây ung thư cổ tử cung (HPV) ở một số bệnh nhân tại Hà Nội
[14].
Năm 2006, Vũ Thị Nhung khảo sát tình hình nhiễm các type HPV ở
phụ nữ thành phố Hồ Chí Minh bằng kĩ thuật PCR [36].
Năm 2009, Lê Trung Thọ và Trần Văn Hợp nghiên cứu tỉ lệ nhiễm
HPV ở cộng đồng phụ nữ Hà Nội và một số yếu tố liên quan [37].
Năm 2014, Hoàng Thị Thanh Huyền xác định tỉ lệ nhiễm và genotype
của Human Papilloma Virus trên gái mại dâm tại Hải Phòng [38].
Về dịch tễ học, theo nghiên cứu của tác giả Nguyễn Trọng Hiếu tỉ lệ
nhiễm HPV trong cộng đồng dân cư nữ từ 2% đến 10,9% thay đổi theo vùng
địa lý, miền Nam Việt Nam có tỉ lệ nhiễm cao hơn miền Bắc Việt Nam [39].
1.4.

Các phương pháp chẩn đoán và xác định genotype HPV

1.4.1. Phương pháp tế bào học (PAP smear/PAP test)
Năm 1943, Papanicolaou cùng cộng sự đã giới thiệu kết quả nghiên cứu
của mình trong một bài báo nổi tiếng “Diagnosis of Uterine Cancer by the
Vaginal Smear” (chẩn đoán ung thư bằng phết tế bào âm đạo). Từ đó đến nay,
phương pháp này đã có nhiều cải tiến để tăng tính chính xác và hiệu quả, hiện
nay đang được sử dụng rộng rãi.
PAP smear hay còn gọi là PAP test, là xét nghiệm tế bào học cổ tử
cung. Biểu hiện của nhiễm HPV là sự có mặt của tế bào “rỗng” Koilocyte hay
“tế bào bóng” đặc trưng với hình ảnh màng tế bào dày lên do sự cô đặc của

11

bào tương, protein đặc lại ở sát màng tế bào. Tế bào Koilocyte điển hình có
vùng sáng trong bào tương, quầng sáng quanh nhân và nhân thường nằm lệch.
Những bất thường của tế bào biểu mô do HPV bao gồm sự biến đổi tế
bào từ giai đoạn mới ASCUS (tổn thương tế bào nội biểu mô vảy không điển
hình ý nghĩa chưa xác định), LSIL (tổn thương tế bào nội biểu mô vảy độ
thấp) tới các tổn thương tiền ung thư HSIL (tổn thương tế bào nội biểu mô
vảy độ cao) và ung thư biểu mô vảy tại chỗ hoặc xâm nhập [40].
Theo phân loại mới của hệ thống Bethesda 2001, các dạng tổn thương
tế bào trên PAP test: ASCUS, LSIL, HSIL có đặc điểm sau [46]:
ASCUS (Atypical Squamous Cells of Undetermined Significance): tổn
thương tế bào nội biểu mô vảy không điển hình ý nghĩa chưa xác định, đôi khi
do HPV.
LSIL (Low - grade Squamous Intraepithelial Lesion): tổn thương tế bào
nội biểu mô vảy mức độ thấp, thường gặp, nhất là ở phụ nữ trẻ, thường được
coi là tổn thương do HPV, đa số tự khỏi sau vài tháng đến vài năm.
HSIL (High - grade Squamous Intraepithelial Lesion): tổn thương tế
bào nội biểu mô mức độ cao. Tổn thương này có kích thước và hình dạng tế
bào khác nhiều so với tế bào bình thường, là tổn thương nặng, có thể tiến triển
thành ung thư nếu không được điều trị đúng và kịp thời.
Phương pháp PAP smear được sử dụng để sàng lọc vì đơn giản, dễ thực
hiện. Tuy nhiên, nó chỉ cho biết sự thay đổi hình thái tế bào bị nhiễm HPV,
không xác định được type HPV, có tỉ lệ âm tính giả dao động từ 1,1 ÷ 29,7%
[6], [8].
1.4.2. Chẩn đoán HPV bằng các kĩ thuật sinh học phân tử
1.4.2.1. Polymerase Chain Reaction (PCR)
PCR do Karry Mullis và cộng sự phát minh năm 1983 là một phương
pháp tổng hợp DNA in vitro, không cần sự hiện diện của tế bào. Ngày nay,

12

PCR đã trở thành một trong những kĩ thuật đầu tiên và được sử dụng nhiều
nhất trong lĩnh vực sinh học phân tử.
PCR là một phản ứng sinh hoá phụ thuộc nhiệt độ, sử dụng đặc điểm
của quá trình sao chép DNA với sự tham gia của enzym DNA - polymerase
chịu nhiệt. Để khởi đầu quá trình tổng hợp DNA cần cung cấp đoạn mồi
oligonucleotid (có độ dài từ 6 ÷ 30 Nu). Đoạn này gắn kết với DNA khuôn tại
điểm khởi đầu sao chép dưới tác dụng của enzym DNA - polymerase để tổng
hợp nên một đoạn DNA đặc thù.
PCR trong trường hợp này phải sử dụng các cặp mồi (primer) chung
cho nhiều type HPV, nhưng chỉ riêng cho HPV mà không chung cho các virus
khác. Cặp mồi cổ điển nhất được thiết kế là MY09 - MY11, có khả năng nhân
lên được đoạn DNA có độ dài 450 cặp nucleotide, nằm trong gen L1 là gen
cấu trúc vỏ capsid của HPV. Cặp mồi thứ hai là GP5 - GP6 cũng được sử
dụng để thu nhận một đoạn DNA nằm bên trong giới hạn của vùng DNA do
MY09 - MY11 nhân lên [41].
Có khoảng 7% số lượng phản ứng PCR với cặp mồi MY09 - MY11
không cho kết quả phát hiện DNA HPV, có thể do không có DNA của virus
HPV trong tế bào ung thư của mẫu nghiên cứu hoặc DNA - HPV đã nhập gen
vào tế bào cổ tử cung và do vậy virus không còn tồn tại trong bệnh phẩm [42].
Nhiều phương pháp nghiên cứu được sử dụng để định type HPV sau
khi nhân một đoạn gen bằng kĩ thuật PCR với các cặp mồi chung. Cặp mồi
chung của PCR hoạt động trên hệ gen HPV của nhiều type, nhưng không cho
biết sản phẩm PCR là của type nào. Do vậy, việc xác định type chỉ có thể
thành công sau khi phân tích sản phẩm. Trong nhiều cách phân tích, người ta
thường sử dụng phương pháp giải trình tự (sequencing) và so sánh đối chiếu
các chuỗi Nu và acid amin của sản phẩm hoặc sử dụng phương pháp phân tử

với các mẫu dò DNA đã biết.


13

1.4.2.2. Realtime PCR
Kĩ thuật nhân bản DNA đích trong ống nghiệm thành hàng tỉ bản sao
dựa vào các chu kì nhiệt và kết quả khuếch đại trong ống phản ứng được hiển
thị cùng lúc với phản ứng khuếch đại xảy ra để người làm thí nghiệm có thể
thấy được. Realtime PCR là phương pháp khuếch đại đích có độ nhạy cao,
thường được sử dụng trong định tính và định lượng DNA HPV.
Phát hiện HPV bằng phương pháp Realtime PCR có nhiều ưu điểm hơn
so với PCR - điện di: có thao tác đơn giản và thời gian ngắn hơn, độ nhạy và
độ đặc hiệu cao hơn, không phải trải qua bước điện di trên thạch agarose sử
dụng Ethidium bromide có tính độc, đồng thời tránh được ngoại nhiễm sản
phẩm PCR dẫn đến dương tính giả.
1.4.2.3. Ts - PCR (Type specific - PCR)
Phương pháp Ts - PCR đặc hiệu theo type là phương pháp PCR phát
hiện riêng cho từng type HPV khác nhau dựa vào sự khác nhau trên vùng gen
E6 và E7, đây là các gen “độc”, quyết định độc lực của HPV (tính gây bệnh
của HPV) và chúng có mức độ biến đổi khác nhau. Hiện nay, đã có 14 cặp
mồi đặc hiệu cho PCR, sử dụng một cách đặc hiệu và nhạy, nhân đoạn gen có
độ dài 100 bp trong gen E7, phát hiện HPV thuộc các type 16, 18, 31, 33, 35,
39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 và 68. Phản ứng có độ nhạy rất cao, chỉ cần 10 ÷
200 virus HPV là đủ cung cấp DNA hệ gen làm khuôn để thực hiện PCR
thành công [43].
Ts - PCR phát hiện đa nhiễm HPV trong cùng một mẫu cũng phải được
thực hiện riêng biệt cho từng type, phải qua bước phát hiện sản phẩm PCR
điện di agrose và sử dụng Ethidium bromide, nguy cơ ngoại nhiễm cao.

14

1.4.2.4. Sequencing
Năm 1975, Frederick Sanger đã phát minh ra phương pháp giải trình tự
gen bằng enzym. Phương pháp này ngày càng được sử dụng rộng rãi trong
nhiều lĩnh vực bởi tính chính xác của nó.
Phương pháp sequencing là phương pháp giải trình tự gen, so sánh, đối
chiếu với trình tự gen các type HPV, được sử dụng để định genotype HPV với
các mẫu đã có kết quả PCR dương tính. Phương pháp này được coi là tiêu
chuẩn vàng nhưng giá thành cao, tốn nhiều thời gian và không xác định được
đồng nhiễm.
1.4.2.5. Kĩ thuật RDB
RDB là một kĩ thuật lai phân tử. Kĩ thuật lai phân tử sử dụng phương
pháp gắn đồng thời nhiều trình tự đích lên một bộ lọc hay màng theo thứ tự,
phương pháp thấm điểm (Dot Blot) được Kafatos và cộng sự (1979) đưa ra.
Với kĩ thuật này, các trình tự đích được cố định trên màng lai sau đó được lai
với mẫu dò (thường là trình tự acid nucleic đã đánh dấu). Saiki và cộng sự
(1989) đã cải tiến kĩ thuật lai phân tử theo một cách khác, đó là kĩ thuật RDB,
trong đó gắn nhiều mẫu dò theo thứ tự trên màng và sau đó lai với các trình tự
đích.
Lai theo phương pháp RDB là phương pháp sàng lọc nhanh thường
được thực hiện với những mẫu dò đặc hiệu (ASO: allele - specific
oligonucleotid) để phân biệt sự khác nhau giữa các alen ở vị trí một Nu.
Phương pháp này không cần điện di trên thạch mà thấm trực tiếp từ đó để xác
định những đoạn Nu khác nhau, thao tác đơn giản, cho kết quả nhanh, độ
nhạy, độ đặc hiệu cao.
Xác định các genotype HPV bằng kĩ thuật lai phân tử tiên tiến RDB có
thể xác định chính xác sự nhiễm và đồng nhiễm của các genotype HPV trên
cùng một mẫu bệnh phẩm, bộ kit thường sử dụng hiện nay xác định được 24

15

type (gồm 16 type nguy cơ cao: 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58,
59, 66, 68, 82 và 8 type nguy cơ thấp: 6, 11, 42, 43, 61, 70, 71, 81), đây là
những lợi thế so với phương pháp giải trình tự gen. Đồng thời, kĩ thuật được
thực hiện trên những mẫu có kết quả Realtime PCR dương tính, làm tăng
thêm độ nhạy của xét nghiệm này.


16

Chương 2
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
Gồm 50 bệnh phẩm được lấy từ dịch cổ tử cung của 50 bệnh nhân nữ,
độ tuổi từ 20 ÷ 69, đã được làm xét nghiệm tế bào học - PAP test có những
thay đổi bất thường của tế bào biểu mô ở các mức độ khác nhau.
Các bệnh nhân được khám lâm sàng và làm xét nghiệm tế bào học tại
Bệnh viện Phụ sản trung ương và phòng khám số 1 Bệnh viện Đại học Y Hà
Nội.
Xét nghiệm xác định genotype HPV được tiến hành tại bộ môn Y sinh
học - Di truyền, trường Đại học Y Hà Nội.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Loại hình nghiên cứu
Nghiên cứu mô tả cắt ngang.
2.2.2. Thời gian
Từ tháng 9/2014 đến tháng 3/2015.
2.2.3. Các bước tiến hành nghiên cứu

Lấy mẫu và bảo quản mẫu: để bảo đảm xét nghiệm genotype HPV
được chính xác, quy trình lấy mẫu và bảo quản mẫu của bác sĩ lâm sàng được
thực hiện theo các bước hướng dẫn của phòng sinh học phân tử, Bộ môn Y
sinh học - Di truyền (được trình bày ở phần 2.2.3.1).
-

Thu thập thông tin, làm bệnh án theo mẫu (phụ lục).

-

Thu nhận và xử lí bệnh phẩm: ghi tên tuổi bệnh nhân, ngày xét nghiệm,

bảo quản mẫu theo tiêu chuẩn…
-

Tách chiết DNA của HPV.


17

-

Thực hiện Realtime PCR định tính HPV.

-

Mẫu dương tính với HPV sẽ được đem lai, xác định genotype HPV

bằng kĩ thuật RDB.
-

Đọc và phân tích kết quả lai.

Hình 2.1. Sơ đồ các bước tiến hành nghiên cứu
2.2.3.1. Cách lấy mẫu và bảo quản mẫu
-

Dụng cụ lấy mẫu: tăm bông vô trùng và dịch bảo quản mẫu.


18

-

Cho que tăm bông vô trùng vào lỗ cổ tử cung (vùng ranh giới giữa cổ

trong và cổ ngoài) xoay nhẹ vài lần và giữ khoảng 1 phút, sau đó lấy tăm
bông ra (chú ý: khi lấy tăm bông ra tránh để chạm vào thành âm đạo).
-

Cho tăm bông đã lấy vào tube eppendorf sạch chứa dung dịch bảo quản

TE.
-

Dùng tay bẻ phần đầu dụng cụ lấy mẫu cho lọt hẳn vào trong tube.

-

Đậy nắp eppendorf thật chặt sau khi cho mẫu vào (không để tăm bông

nhô lên miệng tube làm hở nắp gây đổ mẫu).
-

Bảo quản mẫu trong ngăn đá tủ lạnh hoặc ở -200C cho đến khi tiến

hành xét nghiệm.
2.2.3.2. Tách chiết DNA HPV
-

Đánh dấu các tube 1,5 ml vô trùng bằng kí hiệu mẫu.

-

Vortex eppendorf chứa bệnh phẩm.

-

Phá vỡ màng tế bào:
Cho 100 - 200 µl mẫu vào 1 tube vô trùng có sẵn 900 µl dung dịch

trizol pH8, vortex 30s, để yên 10 phút.
-

Loại bỏ protein:
Thêm vào 200 µl dung dịch chloroform, trộn đều sao cho toàn bộ dung

dịch trong tube phải chuyển thành màu trắng đục, ly tâm 13.000 vòng/phút
trong 10 phút, thu 600 µl dịch nổi.
-

Kết tủa DNA:
Thu 600 µl dịch nổi có chứa DNA vào 1 tube vô trùng có sẵn 600 µl

dung dịch isopropanol. Trộn đều, để yên trong 10 phút. Ly tâm 13.000
vòng/phút trong vòng 10 phút.
Loại bỏ dịch nổi, thu cặn màu xanh (hoặc hồng). Cho từ từ 900 µl dung
dịch ethanol 70% vào. Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 5 phút.


19

Loại bỏ dịch nổi, thu cặn. Để khô ở 600C trong 10 ÷ 15 phút. Cho vào
100 µl dung dịch TE 1X. Trước khi sử dụng dùng pipet trộn đều cho đến khi
phần cặn tan hoàn toàn.
Bảo quản mẫu DNA ở -200C.

-

2.2.3.3. Realtime PCR định tính HPV
Xác định sự có mặt của virus HPV bằng kỹ thuật Realtime PCR, sử
dụng cặp mồi (primer) MY11 - MY09 để nhân đoạn DNA HPV.
Bảng 2.1. Trình tự primer MY09 - MY11 của PCR phát hiện DNA HPV
Primer

Trình tự Nu

MY11 (F)

5' GCM CAG RGW CAT AAY AAT GG 3'

MY09 (R)

5' CGT CCM ARR GGA WAC TGA TC 3'

Mỗi mẫu DNA được chiết tách từ dịch cổ tử cung được thực hiện với 3
phản ứng PCR: phản ứng của mẫu, phản ứng của chứng dương, phản ứng của
chứng âm. Trong thành phần của phản ứng gồm có: DNA mẫu, mồi, chứng
nội và các thành phần cho phản ứng PCR (Taq DNA polymerase, dNTP,
MgCl2, H2O).
Chu kì luân nhiệt: 40 chu kì luân nhiệt (95oC - 5 phút/50oC - 30
giây/720C - 30 giây).
Tiến hành
-

Bật máy Realtime PCR trước 15 phút, bật máy tính và cài đặt chương

trình.
-

Cho 10 µl chứng (+) hoặc dịch DNA tách chiết vào từng tube, ly tâm

và chuyển ngay các tube vào máy Realtime PCR.
-

Chạy Realtime PCR.
Đọc kết quả: