Nghiên cứu chế tạo bộ xét nghiệm ELISA định lượng nọc rắn hổ mang miền bắc việt nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ QUỐC PHÒNG

HỌC VIỆN QUÂN Y

HÀ THỊ HẢI

NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO
BỘ XÉT NGHIỆM ELISA ĐỊNH LƢỢNG
NỌCRẮN HỔ MANG MIỀN BẮC VIỆT NAM
(Najaatra)
Chuyênngành: Y họcchứcnăng (Miễndịch)
Mãsố: 60 72 01 06

LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC
HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
TS. NGUYỄN ĐẶNG DŨNG

HÀ NỘI - 2015


LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoanluậnvănnàylàcủariêngtôivàcómộtphầnsốliệutrongđềtài
(cấpNhànước)

cótên:

hổmangNajaatracắn”.

Kết

“Nghiêncứuchếtạobộkítchẩnđoán

rắn

đềtàinàylàthành

quả

quả

nghiêncứucủatậpthểmàtôilàmộtthànhviênchính.
Tôiđãđượcchủnhiệmđềtàivàtoànbộcácthànhviêntrongnhómnghiêncứuđồng

ý

chophépsửdụngsốliệuđềtàinàyvàotrongluậnvănđểbảovệlấybằngthạcsĩ.
Cácsốliệu,

kết

quả

nêutrongluậnvănlàtrungthựcvàchưatừngđượcaicôngbốtrongbấtcứcôngtrìnhnào
khác.
Tácgiả

HàThịHải

LỜI CẢM ƠN
Trongquátrìnhhọctập,

nghiêncứuvàhoànthànhluậnvăn,

tôiđãnhậnđượcrấtnhiềusựgiúpđỡ,
tạođiềukiệnthuậnlợicủacácthầycô,
cácanhchị, cácbạnđồngnghiệpvàcáccơquan.
Trướctiên, tôi xin bàytỏlòngbiếtơnsâusắctới: TS. NguyễnĐặngDũng,
ChủnhiệmBộmônMiễndịch,
HọcviệnQuân
Y.
Thầyđãtậntìnhchỉdạy,
hướngdẫnvàtạomọiđiềukiệnthuậnlợinhấtchotôihoànthànhluậnvănnày.
Tôi

xin

bàytỏlòngkínhtrọngvàbiếtơntới

PGS.TS.

LêVănĐông,

nguyênphóChủnhiệmBộmônMiễndịch,
HọcviệnQuân
đãluôngiúpđỡvàtheosáttôitrongquátrìnhhọctậpvànghiêncứu.
Tôi
xin

trântrọngcảmơntấtcảcácthầycôđãđọcvàchotôinhững

Y
ý

kiếnđónggópquýbáutrongquátrìnhhoànthànhluậnvăn.
Tôi xin trântrọngcảmơn:
- Đảngủy, Ban giámhiệu, tậpthểcánbộBộmônSinhlýbệnh - Miễndịch,
tậpthểcánbộkhoaHuyếthọcbệnhviệntrườngĐạiHọc Y – DượcTháiBình.
- Đảngủy,
Ban
giámđốc,
tậpthểcánbộBộmônMiễndịch,
tậpthểcánbộphòng

D3

-

Trungtâmnghiêncứu

dượchọcQuânsựvàphòngSauđạihọc, HọcviệnQuân y.
- Đảngủy,

Y
Ban

giámđốcvàtậpthểcánbộTrungtâmchốngđộcBệnhviệnBạch Mai.
Đãgiúpđỡvàtạođiềukiệnthuậnlợichotôihoànthànhluậnvănnày.
Cuốicùng, tôi xin chânthànhcảmơnbố, mẹ, chồngvàcác con, anhchịem,

đãluônđộngviên,

giúpđỡtôicảvềvậtchấtcũngnhưtinhthầnđểtôiyêntâmhọctập,

nghiêncứuvàhoànthànhluậnvănnày.
Họcviên

HàThịHải

MỤC LỤC


Trang
Trang phụ bìa
Lời cam đoan
Mục lục
Danh mục chữ viết tắt trong luận văn
Danh mục bảng
Danh mục biểu đồ
Danh mục hình
Danh mục sơ đồ
Danh mục biểu đồ ....................................................................................... 4
ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................... 1
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN ........................................................................ 3
1.1. Tai nạn rắn hổ mang Naja atra cắn tại Việt Nam ................................. 3
1.1.1. Đặc điểm sinh học rắn hổ mang Naja atra ...................................... 3
1.1.2. Dịch tễ học tai nạn rắn hổ mang Naja atra cắn ............................... 4
1.2. Chẩn đoán và điều trị nạn nhân rắn hổ mang Naja atra cắn ................. 5
1.2.1. Chẩn đoán rắn hổ mang Naja atra cắn ............................................ 5
1.2.2. Điều trị nạn nhân bị rắn hổ mang Naja atra cắn.............................. 8

1.3. Đặc điểm kháng thể IgG và quá trình tinh chế kháng thể kháng nọc rắn... 13
1.3.1. Đặc điểm kháng thể IgG .............................................................. 13
1.3.2. Tinh chế kháng thể ....................................................................... 16
1.4. Các phương pháp miễn dịch phát hiện và định lượng nọc rắn ............ 19
1.4.1. Kỹ thuật khuếch tán miễn dịch (Immunodiffusion) ...................... 19
1.4.2. Kỹ thuật điện di miễn dịch (Immunoelectrophoresis) ................... 20
1.4.3. Kỹ thuật miễn dịch phóng xạ (Radioimmunoassay - RIA) ........... 21
1.4.4. Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang (Immunofluoresence) ............... 22
1.4.5. Kỹ thuật miễn dịch quang (optical immunoassay) ........................ 22


1.4.6. Kỹ thuật ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) .......... 23
1.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả phản ứng ELISA .......................... 26
1.5.1. Vật liệu bộ xét nghiệm ................................................................. 26
1.5.2. Dụng cụ thí nghiệm...................................................................... 26
1.5.3. Tiến hành thí nghiệm ................................................................... 26
CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........ 28
2.1. Đối tượng và vật liệu nghiên cứu ....................................................... 28
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu .................................................................. 28
2.1.2. Vật liệu nghiên cứu ...................................................................... 28
2.2. Phương pháp nghiên cứu .................................................................... 29
2.2.1. Nguyên lý .................................................................................... 29
2.2.2. Phương pháp tối ưu hóa ............................................................... 31
2.2.3. Tiến hành nghiên cứu ................................................................... 34
2.3. Xử lý số liệu ....................................................................................... 37
2.4. Đạo đức nghiên cứu ........................................................................... 37
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .................................................. 38
3.1. Kết quả chế tạo bộ xét nghiệm ELISA định lượng nọc rắn hổ mang .. 38
Naja atra................................................................................................... 38
3.1.1. Tinh chế kháng thể IgG từ huyết thanh ........................................ 38

3.1.2. Đánh giá hiệu giá kháng thể ......................................................... 39
3.1.3. Lựa chọn kháng thể ...................................................................... 40
3.1.4. Kết quả tối ưu hóa bộ xét nghiệm ELISA định lượng nọc rắn hổ
mang Naja atra ............................................................................. 41
3.1.5. Thẩm định bộ xét nghiệm ELISA định lượng sau khi đã tối ưu .... 50
3.2. Kết quả đánh giá hiệu quả định lượng nọc rắn của bộ xét nghiệm
ELISA trong các mẫu bệnh phẩm lâm sàng ....................................... 52
3.2.1. Đặc điểm đối tượng nghiên cứu ................................................... 52


3.2.2. Kết quả định lượng nọc rắn của bộ xét nghiệm ELISA trong các
mẫubệnh phẩm lâm sàng .............................................................. 54
CHƢƠNG 4: BÀN LUẬN .......................................................................... 56
4.1. Chế tạo bộ xét nghiệm ELISA định lượng nọc rắn hổ mang miền Bắc (Naja atra) 56
4.1.1. Tinh chế kháng thể IgG thỏ và IgG ngựa đặc hiệu với rắn hổ mang
Naja atra ....................................................................................... 56
4.1.2. Hiệu giá kháng thể của kháng thể IgG thỏ và IgG ngựa đặc hiệu
kháng nọc rắn hổ mang Naja atra sau chạy sắc kí ái lực................ 56
4.1.3. Lựa chọn cặp kháng thể ............................................................... 57
4.1.4. Kết quả tối ưu hóa bộ xét nghiệm ELISA định lượng nọc rắn hổ
mang Naja atra ............................................................................. 57
4.2. Thẩm định bộ xét nghiệm ELISA định lượng với các điều kiện đã tối ưu. . 64
4.3. Kết quả đánh giá hiệu quả định lượng nọc rắn của bộ xét nghiệm
ELISA trong các mẫu bệnh phẩm lâm sàng ........................................ 65
4.3.1. Đặc điểm đối tượng nghiên cứu ................................................... 65
4.3.2. Kết quả định lượng nọc rắn trên các mẫu bệnh phẩm lâm sàng của
bộ xét nghiệm ELISA định lượng nọc rắn hổ mang Naja atra ....... 67
KẾT LUẬN ................................................................................................. 69
KIẾN NGHỊ ................................................................................................ 70
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI LUẬN VĂN ............................ 71
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC CHỮ, KÝ HIỆU VIẾT TẮT

STT

Chữviếttắt

Chữviếtđầyđủ

1

BN

Bệnhnhân

2

BSA

Bovin serum albumin (abuminhuyếtthanhbò)

3

CS

Cộngsự

4

ELISA

Enzyme-linked immunosorbent assay
(Kỹ thuật hấpphụmiễndịchgắn enzyme)

5

HRP

Horse Radish Peroxidase (enzyme Peroxidasetừcủcảingựa)

6

HTKNR

Huyếtthanhkhángnọc rắn

7

IAC

Immuno Affinity Chromatography (sắckýáilựcmiễndịch)

8

IgG

Immunoglobulin G (khángthểlớpIgG)

9

IVAC

Việnvắc xin vàSinhphẩm y tếNhaTrang

10

KNNR

Khángnguyênnọc rắn

11

KTKNR

Khángthểkhángnọc rắn

12

OD

Optical density (mậtđộquang)

13

OIA

Optical immunoassay (xétnghiệmmiễndịchquang)

14

OPD

O -phenylenediamine (cơchất)

15

PBS

Phosphat buffer salin (dung dịchđệmphosphat)

16

SVDK

Snake venoms detection kit (bộxétnghiệmpháthiệnnọc rắn)

17

WHO

World health oganization (Tổchức y tếthếgiới)


DANH MỤC BẢNG
Bảng

Tên bảng

Trang

3.1.

Kết quả lựa chọn cặp kháng thể gắn bản và kháng thể phát hiện ............. 40

3.2.

Kết quả tối ưu hóa nồng độ kháng thể phát hiện tại nồng độ kháng thể
gắn bản 7,5 µg/ml .............................................................................. 41

3.3.

Kết quả tối ưu hóa nồng độ kháng thể phát hiện tại nồng độ kháng thể gắn
bản 10µg/ml ........................................................................................ 42

3.4.

Kết quả tối ưu hóa nồng độ kháng thể phát hiện tại nồng độ kháng thể
gắn bản 12,5 µg/ml ............................................................................ 43

3.5.

Kết quả tối ưu hóa dung dịch blocking ............................................... 44

3.6.

Kết quả tối ưu hóa thời gian ủ mẫu .................................................... 45

3.7.

Kết quả tối ưu hóa thời gian ủ kháng thể phát hiện ............................ 46

3.8.

Kết quả tối ưu hóa thời gian ủ kháng thể gắn enzyme ........................ 47

3.9.

Kết quả tối ưu hóa nồng độ kháng thể gắn enzyme ............................ 48

3.10. Kết quả tối ưu hóa thời gian ủ cơ chất ................................................ 49
3.11. Ngưỡng phát hiện của bộ xét nghiệm ELISA ..................................... 50
3.12. Hệ số biến thiên ................................................................................. 51
3.13. Tỷ lệ phục hồi trên mẫu chuẩn ........................................................... 51


DANH MỤC BIỂU ĐỒ
Biểu đồ

Tên biểu đồ

Trang

3.1.

Hiệu giá kháng thể sau tinh sạch....................................................... 39

3.2.

Đồ thị đường chuẩn của phản ứng .................................................... 50

3.3.

Phân bố tuổi và giới của nhóm BN nghiên cứu ................................. 52

3.4.

Phân bố nghề nghiệp của nhóm BN nghiên cứu ............................... 52

3.5.

Phân bố thời gian nhập viện sau khi bị rắn cắn của nhóm BN
nghiên cứu ........................................................................................ 53

3.6.

Thời gian nằm viện của nhóm BN nghiên cứu ................................. 53

3.7.

Phân bố nồng độ nọc rắn của BN lúc vào viện ................................. 54

3.8.

Tương quan giữa nồng độ nọc rắn lúc vào viện và số liều huyết
thanh điều trị ................................................................................... 54

3.9.

Tương quan giữa nồng độ nọc rắn lúc vào viện và số liều huyết
thanh điều trị của nhóm bệnh nhân nhập viện trong 6 giờ đầu . ........ 55


DANH MỤC HÌNH
Hình

Tên hình

Trang

1.1.

Rắn hổ mang ..................................................................................... 3

1.2.

Phân bố của rắn hổ mang Naja atra ở Châu Á .................................... 4

1.3.

Biến chứng hoại tử tổ chức do rắn hổ mang Naja atra cắn và hình
ảnh mẫu vật do bệnh nhân đem đến .................................................... 8

1.4.

Cấu trúc phân tử IgG của động vật có vú ......................................... 14

1.5.

Mô hình của sắc ký lọc gel .............................................................. 17

1.6.

Nguyên lý và trình tự sắc ký ái lực ................................................... 18

1.7.

Nguyên lý sắc ký ái lực miễn dịch – IAC ......................................... 19

1.8.

Kỹ thuật Mancini ............................................................................. 20

1.9.

Kỹ thuật điện di miễn dịch ............................................................... 21

1.10.

Nguyên lý kỹ thuật miễn dịch phóng xạ .......................................... 21

1.11.

Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang ...................................................... 22

1.12.

Nguyên lý kỹ thuật miễn dịch quang phát hiện nọc rắn .................... 23

1.13.

Nguyên lý kỹ thuật ELISA .............................................................. 26

1.14.

Các thao tác ảnh hưởng đến kết quả phản ứng ELISA ..................... 27

2.1.

Nguyên lý của kỹ thuật ELISA sandwich ......................................... 29

3.1.

Sắc ký đồ tinh chế kháng thể IgG từ huyết thanh thỏ và huyết thanh
ngựa sử dụng cột Protein A và G ...................................................... 38

3.2.

Phản ứng ELISA với mẫu nọc rắn chuẩn .......................................... 50


1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Tai nạn do rắn độc cắn là một trong những tai nạn nguy hiểm thường
gặp trên thế giới, nhất là các nước nhiệt đới như ở Việt Nam. Theo thống kê
của Tổ chức y tế thế giới trong 40 năm qua, hàng năm có khoảng 2,5 triệu

người bị rắn độc cắn, khoảng 125 nghìn người tử vong do rắn độc cắn và trên
100.000 người để lại di chứng nặng nề [38].
Ở Việt Nam, chưa có số liệu được công bố chính thức nhưng các
chuyên gia ước tính khoảng 30 nghìn nạn nhân bị rắn độc cắn mỗi năm,miền
Bắc chủ yếu do rắn hổ cắn chiếm khoảng 93% số trường hợp; miền Nam chủ
yếu do rắn lục cắn chiếm khoảng 74% số trường hợp. Tại Trung tâm chống
độc Bệnh viện Bạch Mai, số bệnh nhân bị rắn độc cắn đứng thứ 5 trong số các
trường hợp đến cấp cứu. Ở miền Bắc những năm gần đây, số bệnh nhân bị rắn
cắn tăng mà thủ phạm được ghi nhận chủ yếu là do rắn hổ mang Naja atra.
Theo nghiên cứu của Nguyễn Kim Sơn (2008) tại Trung tâm chống độc Bệnh
viện Bạch Mai tỷ lệ bệnh nhân bị rắn hổ mang Naja atra cắn chiếm khoảng
43% trong tổng số bệnh nhân rắn độc cắn được điều trị tại khoa [17].
Nọc của rắn hổ mang Naja atra gây tử vong do độc tố thần kinh có
trong nọc rắn tác động lên hệ thần kinh hoặc gây hoại tử tổ chức tại chỗ vết
cắn do tác động của các enzym có trong nọc rắn [29], [31], [44].Phương pháp
điều trị hiệu quả nhất là huyết thanh kháng nọc rắn đặc hiệu [11]. Tuy nhiên
chẩn đoán xác định rắn hổ mang Naja atra cắn còn gặp nhiều khó khăn do
nạn nhân không mang theo rắn khi nhập viện.Hơn thế nữa, ngay cả khi đã
chẩn đoán chính xác được loài rắn gây ra vết cắn thì việc sử dụng huyết thanh
đặc hiệu sao cho đạt hiệu quả đó là ngăn cản được các biến chứng thần kinh
và hoại tử tổ chức tại chỗ đồng thời giảm được chi phí cho bệnh nhân là điều
rất khó đối với các nhà lâm sàng. Vì vậy việc định lượng nọc rắn ở những


2

bệnh nhân bị rắn cắn là cơ sở để xác định liều huyết thanh kháng nọc rắn cho
phù hợp. Trên thế giới đã có một số xét nghiệm được dùng để phát hiện và
định lượng nọc rắn của Úc, Đài Loan, Thái Lan. Tại Đài Loan, Dong- Zong
Hung (2003) đã chế tạo thành công bộ xét nghiệm ELISA (enzyme - linked

immunosorbent assay) định lượng nọc rắn hổ mang Naja attra [31]. Ở Việt
Nam, Lê Văn Đông và cộng sự (2003) cũng chế tạo thành công bộ xét nghiệm
ELISA phát hiện nọc rắn của 4 loài rắn thường gặp ở miền Nam Việt Nam
[42]. Tuy nhiên, với thủ phạm gây ra phần lớn các vết cắn có độc ở miền Bắc
là rắn hổ mang Naja atra lại chưa có công bố nào về xét nghiệm phát hiện
hay định lượng nọc của rắn hổ mang Naja atra. Từ đó có thể thấy, phát triển
một bộ xét nghiệm định lượng nọc rắn hổ mang Naja atra là rất có ý nghĩa
trong thời điểm hiện nay.
Bộ xét nghiệm ngoài khả năng phát hiện chính xác và định lượng nồng độ
nọc rắn hổ mang Naja atra trong máu của bệnh nhân bị rắn cắn giúp cho quá trình
điều trị và tiên lượng đối với bệnh nhân bị rắn hổ mang cắn còn đòi hỏi phải đơn
giản, dễ sử dụng và ổn định trong các điều kiện bảo quản và sử dụng.
Xuất phát từ những cơ sở lý luận và thực tiễn nêu trên, chúng tôi tiến
hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu chế tạo bộ xét nghiệm ELISA định
lƣợng nọc rắn hổ mang miền Bắc Việt Nam (Naja atra)”nhằm các mục tiêu
sau:
1. Chế tạo bộ xét nghiệm ELISA định lượng nọc rắn hổ mang miền Bắc
(Naja atra).
2. Đánh giá khả năng định lượng của bộ xét nghiệm trên mẫu của bệnh
nhân bị rắn hổ mangmiền Bắc (Naja atra) cắn.


3

CHƢƠNG 1
TỔNG QUAN
1.1. Tai nạn rắn hổ mang Naja atra cắn tại Việt Nam
1.1.1. Đặc điểm sinh học rắn hổ mang Naja atra
Rắn hổ mang Naja atra là một trong những loài rắn phổ biến nhất ở
Trung Quốc, Đài Loan và miền Bắc Việt Nam, đây là thủ phạm gây ra phần

lớn các vết cắn có độc.Rắn hổ mang Naja atra là loài thuộc họ Elapidae.
Trung Quốc gọi là Taiwan cobra, Chinese cobra. Ở Việt Nam rắn hổ mang
Naja atragọi là rắn hổ mang miền Bắc hay rắn mang phì [13], [17].

Hình 1.1. Rắn hổ mang (Naja atra)
*Nguồn: www.snakesofttaiwan.com

Rắn hổ mang Naja atra được mô tả lần đầu tiên vào năm 1842 bởi
Theodore Edward Cantor, nhà động vật học người Đan Mạch. Rắn trưởng
thành có chiểu dài 1m trở lên. Đầu hơi rộng và dẹt, có hình tam giác, không
có vảy má và có khả năng bạnh cổ theo chiều ngang khi bị kích thích. Khi
bạnh cổ ở phía mặt lưng xuất hiện một vòng tròn màu trắng gọi là mắt kính
với hình gọng kính 2 bên là vệt màu vàng hoặc trắng. Rắn có một đôi móc
độc lớn có rãnh tương ứng là răng nanh vĩnh viễn nằm ở phía trước hàm trên


4

và có tuyến nọc ở bên trong. Rắn có khả năng phun nọc độc tới 2m. Rắn có lỗ
mũi khá lớn và nổi bật, mống mắt màu vàng bẩn lấm tấm đốm màu xanh đen,
đồng tử tròn màu đen. Lưng rắn thường màu đen hoặc xám, vảy ở lưng mịn
và bóng. Rắn có thân hình hơi dẹt, đuôi ngắn.
Rắn thường sống trong hang chuột, hang mối ở cánh đồng, trong
rừng…Ngày nay do con người khai thác và làm thay đổi môi trường tự nhiên
khiến cho môi trường sống của rắn cũng thay đổi thậm chí rắn trú ngụ ngay
trong khu vực đông dân. Thức ăn của rắn hổ mang là những con thú nhỏ,
chuột, ếch, cóc, thậm chí cả các loài rắn khác. Rắn non ăn cả nòng nọc, ếch
nhái. Rắn kiếm ăn cả ngày lẫn đêm, chủ yếu vào ban đêm. Thời gian hoạt
động sinh sản của rắn hổ mang từ tháng 3 đến tháng 10, thường đẻ trứng vào
tháng 6 và trứng nở vào tháng 8. Rắn đẻ từ 9-20 trứng mỗi lứa, có hiện tượng

con cái canh giữ trứng [13], [17].
1.1.2. Dịch tễ học tai nạn rắn hổ mang Naja atra cắn
Tai nạn do rắn hổ mang Naja atra cắn thường gặp ở các nước nông
nghiệp nằm trong khu vựcChâu Á, các tai nạn thường xảy ra vào mùa hè hoặc
đầu thu.Tại Đài loan, rắn hổ mang Naja atra là một trong 6 loài rắn độc có ý
nghĩa dịch tễ quan trọng [29]. Trong nghiên cứu của Wang JD và CS từ 1994
đến 2007, có đến 38% số trẻ em bị rắn độc cắn được xác định là do rắn hổ
mang Naja atra.

Hình1.2. Phân bố của rắn hổ mang Naja atra ở Châu Á [44].


5

Tại Việt Nam, rắn hổ mang Naja atra là loài rắn độc cỡ lớn gặp chủ
yếu ở miền Bắc. Theo nghiên cứu Nguyễn Kim Sơn (2008), cho thấy tai nạn
rắn hổ cắn xảy ra ở hầu hết các vùng trong cả nước, miền Bắc thủ phạm chính
là rắn hổ mang Naja atra. Tại Trung tâm chống độc Bạch Mai Hà Nội, năm
2001 có 155 trường hợp, năm 2002 có 129 trường hợp bị rắn cắn nhập viện,
trong 5 năm từ 1999 đến 2004, có 380 bệnh nhân bị rắn hổ cắn trong đó có
163 (43%) bệnh nhân bị rắn hổ mang Naja atra cắn [6], [17]. Trong những
năm gần đây số bệnh nhân bị rắn cắn vẫn không giảm, phần lớn những bệnh
nhân bị rắn cắn nhập viện điều trị là nam giới trong độ tuổi lao động và
thường xuyên tiếp xúc với môi trường hoạt động của rắn. Họ là những nông
dân làm ruộng hoặc những người hoạt động bắt rắn, chăn nuôi rắn, những
người làm rừng, ngư dân [17].
1.2. Chẩn đoán và điều trị nạn nhân rắn hổ mang Naja atra cắn
1.2.1. Chẩn đoán rắn hổ mang Naja atra cắn
Việc chẩn đoán xác định nạn nhân bị rắn hổ mang Naja atra cắn là điều
hết sức quan trọng trong điều trị và tiên lượng. Tại Việt Nam, chưa có công

bố chính thức nào về các xét nghiệm phát hiện và định lượng nọc rắn hổ mang
Naja atra. Vì vậy chẩn đoán rắn hổ mang Naja atra chủ yếu vẫn dựa vào lâm
sàng.
Rắn hổ mang Naja atra cắn là một cấp cứu nội khoa, bệnh cảnh lâm
sàng có thể từ nhẹ như chỉ tổn thương tại chỗ hoặc nặng đó là đe dọa tính
mạng của bệnh nhân. Các triệu chứng và mức độ nặng nhẹ ở người bị rắn hổ
mang cắn phụ thuộc vào nhiều yếu tố như tuổi, giới, vị trí vết cắn, tình trạng
của rắn khi cắn người… Các triệu chứng đó phụ thuộc vào lượng nọc rắn xâm
nhập vào cơ thể nạn nhân.
Triệu chứng toàn thân chủ yếu là triệu chứng nhiễm độc thần kinh, triệu
chứng về tim mạch và rối loạn tiêu hóa có thể gây tử vong. Hội chứng nhiễm


6

độc thần kinh do tác dụng của nọc rắn hổ gây liệt các dây thần kinh sọ não,
liệt cơ hô hấp cũng như liệt mềm ngoại vi. Độc tố thần kinh tác động lên tất
cả hệ thống cơ vân trong đó có hô hấp gây suy hô hấp ở mức độ khác nhau,
nặng có thể gây ngừng thở dẫn đến tử vong nếu không điều trị kịp thời. Kèm
theo dấu hiệu liệt các cơ ở mặt và các cơ vận động bởi các dây thần kinh sọ
não, bệnh nhân không nói được, khó nuốt và khó khạc đờm, sa mí mắt, trùng
cơ mắt. Có biểu hiện tinh thần từ lơ mơ đến hôn mê do hậu quả của thiếu oxy.
Triệu chứng về tim mạch do phospholipase A2 tác động gián tiếp hoặc trực
tiếp lên cơ tim làm tăng thời gian khử cực, gây co cơ kéo dài, do đó cơ tim
mất khả năng đáp ứng mọi kích thích [2], [3]. Triệu chứng về tiêu hóa như
buồn nôn, nôn, đau bụng, tiêu chảy. Chưa có trường hợp nào được ghi nhận
có triệu chứng rối loạn đông máu do ảnh hưởng trực tiếp của nọc rắn hổ mang
Naja atra, đa số có những biểu hiện rối loạn đông máu là tổn thương thứ phát
do nhiễm khuẩn vết thương [17]. Mặc dù nọc độc của rắn hổ mang có thể gây
viêm loét giác mạc dẫn tới mù nhưng chưa có trường hợp nào ở Đài Loan bị

tổn thương mắt do rắn hổ mang phun nọc độc được báo cáo [29], [31], [44].
Khi bị rắn hổ mang Naja atra cắn ngoài dấu vết của răng độc, đau đớn
thường xảy ra trong vòng 10 phút tại vị trí vết cắn [13]. Các triệu chứng đau,
đỏ da, sưng nề, chảy máu thậm chí có bọng nước dần nặng lên. Các vết
thương tổ chức tại chỗ tương đối rõ ràng, nguyên nhân chính là do tác dụng
của cardiotoxin và phospholipase A2. Hình ảnh mô bệnh học nghiên cứu trên
vết cắn của Naja atra trên cơ thể người cho thấy trung tâm hoại tử của lớp
biểu bì với cục máu đông với lắng đọng fibrin ở lớp bề mặt và mạch máu lớp
sâu ở trung bì. Sự phá hủy tổ chức lan rộng của nọc rắn hổ mang được cho là
kết quả của tác động gây độc tế bào với thiếu máu thứ phát của các mạch máu
trung bì và hậu quả của nhiễm khuẩn. Do vậy tổn thương bởi vết cắn của rắn
hổ mang nhìn chung là ở bề mặt, giới hạn đến da và tổ chức dưới da [44].


7

Chiều sâu và chiều rộng của tổn thương hầu như chắc chắn phụ thuộc vào độ
sâu của nọc độc đưa vào. Rắn hổ mang có răng nanh ngắn vì vậy nọc độc
được đưa vào lớp dưới da và hiếm khi gây ra hoại tử cơ lan rộng. Theo nghiên
cứu Chi-Wen Juan (2012), triệu chứng sưng tấy cục bộ chiếm 94,4% ; 38,9%
có hoại tử hoặc khó liền vết thương và 19,4% có triệu chứng toàn thân không
đặc hiệu. Các nghiên cứu gần đây cũng cho thấy vết cắn của rắn Naja atra
gây ra biến chứng tại chỗ nặng nề với hoại tử tổ chức rộng và ít có biểu hiện
nhiễm độc thần kinh [29]. Tình trạng hoại tử lan rộng và nhiễm trùng tạo mủ
làm tế bào cơ bị hủy hoại hoàn toàn là nguyên nhân làm cho trị số CK
(Creatinine được chuyển từ creatine) tăng rất nhanh từ ngày thứ 2 sau khi bị
rắn hổ mang cắn. Kết quả nghiên cứu của Nguyễn Kim Sơn (2008) cho thấy
men CK của nhóm bệnh nhân bị rắn hổ mang cắn có tới 66,6% có CK tăng
cao. Đây cũng là mối nguy hiểm gây suy thận ở những bệnh nhân bị rắn hổ
mang cắn [17].

Trong một nghiên cứu ở Hong Kong, trong miệng của rắn hổ mang
Naja atra có sự hiện diện của nhiều vi khuẩn gây bệnh như Morganella
morganii, Enterococcus faecalis… Những vi khuẩn này đóng vai trò quan
trọng trong biến chứng gây hoại tử tổ chức [29].


8

Hình 1.3. Biến chứng hoại tử tổ chức do rắn hổ mang Naja atra cắn và hình
ảnh mẫu vật do bệnh nhân đem đến. (A1-A3: hoại tử tổ chức lan rộng khắp
mu bàn chân trái sau khi bị rắn hổ mang cắn gần mắt cá chân trái, A4: sau
ghép da.B1-B2: da hoại tử lan rộng sau khi bị rắn cắn ở ngón chân thứ 5, B3B4: mở ổ hoại tử ghép da. C1-C2: mẫu vật chết) [44].
1.2.2. Điều trị nạn nhân bị rắn hổ mang Naja atra cắn
1.2.2.1. Sơ cứu
Các biện pháp sơ cứu được khuyến cáo [17]:
- Động viên bệnh nhân yên tâm, đỡ lo lắng.
- Không để bệnh nhân tự đi lại. Bất động chi bị cắn bằng nẹp (vì bất kỳ
sự vận động nào của chi hoặc co cơ đều làm tăng sự vận chuyển của nọc độc
về tuần hoàn hệ thống). Cởi bỏ đồ trang sức ở chi bị cắn tránh gây chèn ép khi
chi sưng nề.
- Cần băng ép bất động để làm chậm sự xuất hiện triệu chứng liệt.
- Vận chuyển bệnh nhân bắng phương tiện cơ giới (ô tô cấp cứu) đến cơ
sở y tế đồng thời với việc duy trì băng ép, bất động. Nếu liệt phải khai thông
đường hô hấp (tư thế, hút đờm dãi…), hô hấp nhân tạo.
- Nếu đau nhiều: Uống hoặc tiêm thuốc giảm đau.


9

- Nếu có HTKNR đặc hiệu thì tiêm ngay một lọ tĩnh mạch hoặc tiêm tại

chỗ xung quanh vết cắn.
- Nếu không có phương tiện cấp cứu lưu động cần phải chuyển nạn nhân
ngay không mất nhiều thì giờ để chờ sơ cứu.
- Duy trì băng ép bất động tới khi bệnh nhân đến được cơ sở y tế có khả
năng cấp cứu hồi sức hoặc có HTKNR đặc hiệu. Việc băng ép giống như một
khớp bị bong gân, không làm mất mạch ngoại biên và đầu chi vẫn có thể cử
động dễ dàng sau khi băng ép. Lý tưởng là không làm giảm áp lực băng ép
cho đến khi bệnh nhân nhập viện và sau khi được tiêm HTKNR đặc hiệu vì
giải phóng băng ép đột ngột làm cho nọc độc có thể gây triệu chứng toàn thân
nhanh chóng.
- Vết cắn ở thân mình: ép lên vùng bị cắn nhưng không làm hạn chế cử
động thành ngực.
- Vết cắn ở đầu, mặt, cổ: khẩn cấp vận chuyển bệnh nhân đến bệnh viện.
- Cần nhanh chóng rửa mắt bằng nước muối sinh lý hoặc nước thường
trong 15 phút. Nếu như vẫn còn kích thích, đau, sưng, chảy nước mắt, sợ ánh
sáng sau rửa thì cần phải cho bệnh nhân khám chuyên khoa mắt.
- Nếu trong vòng 30 phút đã có thể tới nơi có đầy đủ trang thiết bị y tế
thì không cần băng ép và nhanh chóng vận chuyển bệnh nhân tới ngay cơ
sở y tế.
- Các biện pháp sơ cứu không được khuyến cáo và không nên làm đó là
các kỹ thuật bao gồm: garo động mạch, chích rạch và hút nọc ở vết cắn, bôi
các hóa chất, chườm lạnh hoặc gây điện giật tại vị trí vết cắn. Không uống
hoặc đắp bất kì thuốc lá gì lên vết cắn.
1.2.2.2. Xử trí tại bệnh viện
- Nhanh chóng đánh giá chức năng tim phổi, hồi sức hô hấp nếu cần.
- Lập đường truyền tĩnh mạch, truyền các dịch tinh thể (NaCl 0,9%,


10

Ringerlactat), sau đó tháo băng ép một cách từ từ.
- Phân biệt giữa rắn lành và rắn độc, các loài động vật khác cắn hoặc các
tổn thương do vật nhọn. Đánh giá thời gian và hậu quả của các triệu chứng.
Rửa sạch vết thương bằng xà phòng và nước sạch. Bất động vùng bị cắn bằng
dây treo với chi trên và nẹp với chi dưới.
- Để bệnh nhân nghỉ ngơi, động viên.
- Nếu việc tiêm phòng uốn ván quá xa, cần tiêm phòng lại.
- Trường hợp bị rắn hổ cắn không có triệu chứng: cho ra viện nếu không
có triệu chứng sau theo dõi 24h.
- Trường hợp bị rắn hổ cắn có triệu chứng nhưng nhẹ:
+ Để bệnh nhân nằm trên giường và bất động chi bị cắn.
+ Đặt đường truyền tĩnh mạch.
+ Làm các XN cơ bản theo dõi triệu chứng, ĐTĐ, chuẩn bị sẵn các
phương tiện cấp cứu (nội khí quản, thở máy…).
+ Tiêm SAT phòng uốn ván, test HTKNR.
+ Chuẩn bị HTKNR nếu có chỉ định.
+ Chăm sóc vết thương: rửa sát khuẩn, băng ép…
- Trường hợp bị rắn hổ cắn có triệu chứng trung bình và nặng:
+ Đảm bảo chức năng sống.
+ Dùng HTKNR, SAT phòng uốn ván.
+ Điều trị triệu chứng.
+ Dùng kháng sinh.
+ Giảm đau nếu cần.
+ Theo dõi và xử trí các biến chứng.
1.2.2.3. Sử dụng huyết thanh kháng nọc rắn
Tại Viện Pasteur Sài Gòn (1892), bác sỹ Albert Calmette phát minh ra
huyết thanh kháng nọc rắn đầu tiên nhưng chưa ứng dụng trên lâm sàng. Cho


11

đến năm 1991, Trịnh Xuân Kiếm và cộng sự đã chế tạo thành công HTKN rắn
hổ đất ứng dụng trên lâm sàng[10],[11]. Ở Việt Nam hiện nay có 2 nơi sản
xuất được HTKNR tinh chế là: Đơn vị nghiên cứu rắn và sản xuất HTKNR
cạp nia, hổ chúa thuộc trung tâm chống độc Bạch Mai và huyết thanh kháng
nọc rắn lục xanh, huyết thanh kháng nọc rắn hổ đất do Viện vắc xin và Sinh
phẩm y tế (IVAC) tại Nha trang sản xuất [6].
HTKNR có thể là HTKNR đơn giá (monovalent) hoặc là HTKNR đa
giá (polyvalent). HTKNR đơn giá hay còn gọi là HTKNR đơn đặc hiệu
(monospecific) là loại huyết thanh kháng nọc rắn được tạo ra bằng cách gây
miễn dịch với nọc độc chỉ một loài rắn. HTKNR đa giá hay còn gọi là
HTKNR đa đặc hiệu (polyspecific) là loại huyết thanh được tạo ra bằng cách
gây miễn dịch với hỗn hợp nọc độc của nhiều loại rắn, do đó khả năng trung
hòa nọc của HTKNR nhiều loại rắn là khác nhau như HTKNR của Braxin,
Châu phi [27].
Theo tổ chức y tế thế giới (WHO), đến nay HTKNR vẫn là loại thuốc điều trị
đặc hiệu và hiệu quả nhất cho các nạn nhân bị rắn độc cắn. Nguyên tắc của
việc sử dụng HTKNR là cần được sử dụng càng sớm càng tốt theo đường tĩnh
mạch khi bệnh nhân được chứng minh hoặc nghi ngờ bị rắn cắn có các triệu
chứng toàn thân và sưng nề tại chỗ vết cắn [52].
- Biểu hiện nhiễm độc toàn thân:
+ Bất thường cầm máu: Chảy máu hệ thống tự phát, rối loạn đông cầm
máu hoặc giảm tiểu cầu (<100G/l).
+ Triệu chứng nhiễm độc thần kinh: Sụp mí, liệt cơ mắt, liệt cơ vv..
+ Bất thường về tim mạch: Hạ huyết áp, sốc, rối loạn nhịp tim, điện
tâm đồ bất thường.
+ Tổn thương thận cấp tính (suy thận): Thiểu niệu, vô niệu, tăng CK và
ure máu.
+ Hemoglobin hoặc myoglobin niệu: Nước tiểu sẫm màu bằng chứng

12

của tan máu hoặc tiêu cơ vân toàn thể.
- Biểu hiện nhiễm độc nọc rắn tại chỗ:
+ Sưng nề tại chỗ lan đến toàn bộ chi bị cắn (trong trường hợp không
garo) trong 48h sau khi cắn. Sưng sau khi cắn ở các ngón (đặc biệt các ngón tay).
+ Sưng tăng lên nhanh chóng.
 Theo phân loại của Poisindex, hệ thống phân loại dưới đây nhằm mục
đích đánh giá tổn thương sau khi nọc độc vào cơ thể:
- Mức độ 0: Sưng và tấy đỏ tại vết cắn đường kính < 2.5cm
- Mức độ 1: Sưng và tấy đỏ tại vết cắn đường kính từ 2.5 – 15cm
- Mức độ 2: Sưng và tấy đỏ tại vết cắn đường kính 15 – 40cm với triệu
chứng toàn thân mức độ nhẹ
- Mức độ 3: Sưng và tấy đỏ tại vết cắn đường kính > 40cm, với các dấu
hiệu toàn thân
- Mức độ 4: Triệu chứng toàn thân nặng bao gồm hôn mê và sốc.
 Tại Trung tâm chống độc – Bệnh viện Bạch Mai từ năm 1999 đã áp dụng
phân loại mức độ nặng nhẹ theo lâm sàng cho bệnh nhân bị rắn hổ cắn:
- Độ 1: Có dấu hiệu sụp mi, đồng tử giãn
- Độ 2: Có các dấu hiệu sụp mi, đồng tử giãn, liệt chi
- Độ 3: Như độ 2 hoặc 1 nhưng có thêm dấu hiệu liệt cơ hô hấp:
+ Độ 3a: như độ 2 thêm liệt cơ liên sườn
+ Độ 3b: như độ 3a thêm liệt cơ hoành
+ Độ 3c: như 3b thêm liệt toàn bộ cơ hô hấp và các chi
- Độ 4: như 3c có thêm rối loạn nhịp tim và trụy mạch
Sau khi chẩn đoán xác định loài rắn cắn gây ra vết cắn, dựa vào các
biểu hiện trên và phân loại mức độ nhiễm độc trên lâm sàng mà người bác sỹ

13

điều trị đưa ra liều lượng huyết thanh kháng nọc rắn đặc hiệu cho bệnh nhân.
Mục đích của việc dùng huyết thanh kháng nọc rắn là để trung hòa lượng nọc
rắn có trong cơ thể chứ không phải điều trị các rối loạn đang xảy ra cho bệnh
nhân. Song thực tế, việc chỉ định sử dụng huyết thanh kháng nọc rắn trong
điều trị cho bệnh nhân bị nhiễm độc chủ yếu vẫn dựa vào lâm sàng và phải
đợi đến khi triệu chứng rõ ràng mới có chỉ định sử dụng HTKNR nên thường
chậm khi mà các độc tố đã gắn vào các tế bào đích. Vì vậy cần phát triển bộ
xét nghiệm định lượng nọc rắn để chẩn đoán loài rắn độc cắn và xác định
được mức độ nhiễm độc giúp cho quá trình điều trị và tiên lượng đối với bệnh
nhân bị rắn độc cắn đặc biệt trong việc chỉ định HTKNR.Việc sử dụng
HTKNR cần phải được tiến hành càng sớm càng tốt mới có tác dụng ngăn
ngừa các hoại tử, liều HTKNR hổ đất trung bình ở Bạch Mai dùng thường là
7 -8 lọ [11].
1.3. Đặc điểm kháng thể IgG và quá trình tinh chế kháng thể kháng nọc rắn
1.3.1. Đặc điểm kháng thể IgG
Kháng thể kháng nọc rắn hổ mang được tạo ra khi dùng kháng nguyên
nọc rắn hổ mang gây mẫn cảm cho động vật hoặc khi bị rắn cắn. Kháng thể
kháng nọc rắn có bản chất là globulin miễn dịch (chủ yếu là IgG). Theo
nghiên cứu của Victor Morais và cộng sự (2012) đã phát hiện được kháng thể
IgG kháng nọc rắn hình thành ở bệnh nhân bị rắn cắn. Kháng thể kháng nọc
rắn có có cấu tạo giống với IgG của động vật có vú [51].
Cấu trúc của IgG ở động vật có vú, bao gồm hai chuỗi nặng H (heavy
chain) và hai chuỗi nhẹ L (light chain) liên kết với nhau bằng các cầu nối
disulfua (-S-S-). Trọng lượng phân tử của IgG là 159 kilo-dalton (kDa). Chuỗi
nhẹ L của IgG gồm một vùng thay đổi VL (variable region) và một vùng hằng
định CL (constant region). Chuỗi nặng H gồm một vùng thay đổi VH và ba
vùng hằng định ký hiệu từ Cγ1 đến Cγ3 [1], [9].

14

Hình 1.4. Cấu trúc phân tử IgG của động vật có vú [9].
IgG có nồng độ cao nhất trong huyết thanh, chiếm khoảng 80% tổng
lượng globulin miễn dịch trong huyết thanh. Có 4 lớp nhỏ IgG được đánh
dấu theo nồng độ giảm dần của chúng trong huyết thanh: IgG1, IgG2, IgG3
và IgG4. Bốn lớp nhỏ này được mã hoá bởi 4 gene vùng hằng định chuỗi
nặng (gene CH) khác nhau mà có 90 - 95% trình tự ADN giống nhau. Đặc
trưng cấu trúc để phân biệt lớp nhỏ này với lớp nhỏ khác là kích thước của
vùng bản lề, số lượng cũng như vị trí của các cầu disulfide liên chuỗi nối
các chuỗi nặng. Sự khác biệt về acid amine giữa các lớp nhỏ của IgG đã
làm cho hoạt tính sinh học của phân tử có những khác nhau. IgG1, IgG3 và
IgG4 có thể chuyển vận dễ dàng qua nhau thai và đóng vai trò trong việc
bảo vệ thai phát triển. Một số lớp nhỏ IgG có thể hoạt hoá bổ thể mặc dù hiệu
quả của chúng khác nhau. Lớp nhỏ IgG3 hoạt hoá bổ thể hiệu quả nhất, tiếp
theo là IgG1 rồi đến IgG2 còn IgG4 thì không có khả năng hoạt hoá bổ thể.
IgG cũng hoạt động như một kháng thể opsonin do chúng có thể gắn vào thụ
thể dành cho Fc có trên bề mặt đại thực bào, nhưng chức năng này cũng thay
đổi tuỳ theo lớp nhỏ: IgG1 và IgG3 có ái lực cao với thụ thể dành cho Fc,
trong khi IgG4 có ái lực yếu hơn và IgG2 có ái lực rất yếu.
Trật tự sắp xếp các axít amin ở vùng thay đổi giữa chuỗi nặng và
chuổi nhẹ tạo ra vị trí gắn đặc hiệu với các quyết định kháng nguyên
(epitope) tương ứng [9].


15

Tính ổn định của IgG[36]
Tính ổn định của IgG phụ thuộc vào các yếu tố như nhiệt độ, pH và tác

động của các enzyme thủy phân protein .
 pH: Ở môi trường pH acid hoạt tính của IgG bị giảm một phần khi pH
= 3,5 hoặc thấp hơn và bị thay đổi hoàn toàn ở pH = 3,0; Trongmôi trường pH
kiềm, hoạt tính của IgG gần như không thay đổi cho tới pH = 11.
 Nhiệt độ:IgG không bị mất hoạt tính trong quá trình tiệt trùng bằng
phương pháp Pasteur ở 60ºC. IgG bền vững trong điều kiện xử lý nhiệt từ 60 65ºC trong 30 phút. Hoạt tính của IgG sẽ giảm khi tăng nhiệt độ lên tới 75ºC. IgG
mất hoàn toàn hoạt tính ở 80 ºC trong 20 phút. Tuy nhiên, lạnh và khô không làm
ảnh hưởng đến hoạt tính của IgG, trừ khi quá trình đông lạnh được lặp đi lặp lại
nhiều lần, làm thay đổi cấu trúc cũng như khả năng bám dính của protein.
 Các enzyme thủy phân protein: IgG có khả năng chịu đựng rất cao
với các enzyme đường tiêu hóa: trypsin, chymotrypsin…, nhưng lại rất nhạy
cảm với pepsin hoặc papain. Theo một số nghiên cứu, sau thời gian 8h để
trong môi trường có các enzyme trysin và chymotrypsin, hoạt tính IgG còn lại
tới 39% đến 41%. Porter đã phân cắt IgG bằng enzyme papain thành các
mảnh khác nhau. Mặc dù papain là một enzyme hoạt động thuỷ phân protein
không đặc hiệu và phân cắt toàn bộ phân tử protein, nhưng nếu thời gian tác
dụng ngắn thì enzyme này chỉ phân cắt các cầu disulfide nhậy cảm nhất.
Trong điều kiện như vậy papain đã phân cắt phân tử IgG thành hai mảnh
giống nhau (mỗi mảnh có trọng lượng phân tử là 45.000 dalton) được gọi là
các mảnh Fab (antigen binding fragment), bởi vì mảnh Fab vẫn giữ nguyên
khả năng gắn với kháng nguyên của phân tử kháng thể nguyên vẹn. Ngoài hai
mảnh Fab tác giả còn thu được một mảnh nữa có trọng lượng phân tử là
50.000 dalton được gọi là mảnh Fc vì khi bảo quản trong lạnh chúng bị kết
tinh hoá (chữ c bắt nguồn từ chữ cristalliable nghĩa là có khả năng kết tinh).