Xác định độc lực và tính chất gây bệnh của virút viêm não nhật bản trên chuột bạch

TÓM LƯỢC
Bệnh viêm não Nhật Bản là bệnh truyền nhiễm nguy hiểm chung cho nhiều
loài động vật thông qua vectơ truyền bệnh là muỗi culex. Heo đóng vai trò nguồn
chứa mầm bệnh quan trọng nhất. Bệnh lưu hành trên nhiều nước và Việt Nam cũng
nằm trong vùng dịch tễ của bệnh viêm não Nhật Bản.
Để có những hiểu biết về bệnh, từ đó có biện pháp phòng trị kịp thời. Tôi thực
hiện đề tài “Xác định độc lực và tính chất gây bệnh gây bệnh của virút viêm não
trên chuột bạch” từ tháng 02 đến tháng 05 năm 2005 đã thu được một số kết quả
sau:
 Tỷ lệ chết do virút viêm não Nhật Bản chủng CTM- P7 gây ra trên chuột
bạch là 61,18%, chủng Nakayama là 50%.
 Phần lớn chuột trước khi chết có các triệu chứng thần kinh như co giật toàn

Trung tâm Học Liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
thân, cứng gáy, cơ thể xanh tái, chạy hoảng loạn.. .

 Các bệnh tích ghi nhận được nhiều nhất là não tích nước, gan sung huyết,
thận sung huyết, tích nước xoang ngực và xoang bụng, gan hoại tử,…
 Khi tiến hành kiểm tra huyết thanh học, có 100% chuột thí nghiệm có kháng
thể kháng virút viêm não Nhật Bản ở ngày thứ 17 sau khi tiêm virút vào chuột.

viii


CHƯƠNG 1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Viêm não Nhật Bản (VNNB) là một bệnh truyền nhiễm chung của người và
nhiều loài động vật lây truyền bởi nhân tố trung gian là bởi muỗi. Mỗi năm trên
khắp thế giới có trên 50.000 ca bệnh do virút viêm não Nhật Bản gây ra. Virút
VNNB thuộc nhóm Arbovirus có ái tính với tế bào thần kinh, bệnh có thể dẫn đến
tình trạng tổn thương não vĩnh viễn, tỷ lệ tử vong 10- 40 %, trên 80% số bệnh nhân

bị bệnh VNNB qua khỏi được thường biểu hiện các dấu hiệu thần kinh suốt đời (Võ
Công Khanh, 2005).
Từ động vật nuôi đến hoang dại đều cảm thụ với bệnh viêm não Nhật Bản, bao
gồm: heo, trâu bò, ngựa, dê, cừu, chó, thỏ, chuột, bồ câu, gà, vịt, chim hoang….
Heo và chim hoang được xem là động vật cảm nhiễm nhất và là ổ chứa virút Viêm
Não Nhật Bản.

Trung

Bệnh viêm não Nhật Bản là một trong những nguyên nhân gây thất bại sinh sản
trên heo. Heo nái bị nhiễm virút trong thời gian mang thai có thể có những biểu
hiện Học
bất thường
đẻ như
thaiThơ
khô với
heo con chết
tâm
LiệukhiĐH
Cần
@nhiều
Tài kích
liệuthước
họckhác
tậpnhau,
và nghiên
cứu
sau khi sinh, heo con sinh ra yếu ớt với các triệu chứng thần kinh… (Chu và Joo,
1996).
Năm 2006, Hồ Thị Việt Thu và cộng sự đã phân lập được chủng virút viêm não

Nhật Bản (CTM- P7) trên muỗi tại thành phố Cần Thơ. Để có những hiểu biết hơn
về bệnh viêm não Nhật Bản, tôi thực hiện đề tài: “Xác Định Độc Lực Và Tính
Chất Gây Bệnh Của virút Viêm Não Nhật Bản Trên Chuột Bạch” nhằm:
 Theo dõi triệu chứng và khảo sát bệnh tích đại thể trên chuột bạch
 Khảo sát đáp ứng miễn dịch trên chuột bạch

1


CHƯƠNG 2
CƠ SỞ LÝ LUẬN
2.1 GIỚI THIỆU VỀ BỆNH VIÊM NÃO NHẬT BẢN
Viêm não Nhật Bản (VNNB) là một bệnh nhiễm trùng cấp tính gây ra bởi
một loại virút thuộc nhóm Arbovirus. Bệnh được nói đến năm 1871 ở Nhật Bản,
nhưng đến năm 1934 người ta mới phân lập được virút VNNB từ não bệnh nhân tử
vong do bệnh viêm não ở Tokyo, virút này được xem như chủng virút mẫu có tên là
Nakayama.
Bệnh VNNB đã được tìm thấy trên 25 quốc gia trên thế giới như: Australia,
Bangladesh, Bhutan, Brunei, Cambodia, Trung Quốc, Hồng Kông, Ấn Độ, Nhật
Bản, Hàn Quốc, Lào, Malaysia, Myanma, Nepal, Pakistan, Philippin, Nga,
Singapore, Sri Lanka, Đài Loan, Thái Lan, Việt Nam, quần đảo thái bình dương
(Konishi, 1998).
Ở Việt Nam viêm não Nhật Bản thường gặp ở trẻ nhỏ 1- 15 tuổi, nhất là từ 2

Trung tâm
Học Liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
đến 6 tuổi. Heo, ngựa, trâu, bò, dê, gà, ngan, ngỗng... đều có thể mắc viêm não
Nhật Bản . Các địa phương ở phía Nam bệnh thường phát sớm hơn ở phía Bắc; trẻ
nhỏ ở các vùng nông thôn mắc bệnh nhiều hơn trẻ nhỏ ở thành thị (Võ Công
Khanh, 2005).

2.2 TÁC NHÂN GÂY BỆNH
2.2.1 Đặc điểm hình thái học của virút VNNB
Virút VNNB (Japanese encephalitis virus – JEV) là một Flavivirus, trước
đây được xếp vào họ Togaviridae, thuộc nhóm B của Arbovirus. Hiện nay có trên
60 loài Flavivirus nhưng chỉ có 3 loài có ý nghĩa trong thú y: virút VNNB, virút gây
bệnh Louping và virút gây bệnh Wesselsbron (Chu và Joo, 1999).
Hình thái: virút có dạng hình cầu, nhân chứa axít ribonucleic (RNA), kích
thước 40nm, Chuỗi nucleotit hoàn hảo của virút viêm não Nhật Bản chứa 10976
nucleotit tương ứng với 3432 gốc amino axít . Virút qua được lọc, gồm 32 capsom
bao quanh, vỏ bọc chứa một sợi ARN dương. Capsit có cấu trúc hình khối, phần vỏ
giàu lipít.. Virút có 3 protein cấu trúc và nhiều protein không cấu trúc. Những

2


protein cấu trúc bao gồm glycoprotein E của vỏ, protein vỏ không có glycosylate M
và protein capxít C.
Vỏ lipít
Chuỗi đơn
ARN

Hình 2.1: Cấu trúc virút Viêm Não Nhật Bản
(Vietsciences2.free.fr/khaocuu/nguyenlandung/i...)

Trung

Trong 3 protein cấu trúc trên thì glycoprotein E được quan tâm nghiên cứu
nhiều nhất, protein E có chứa epitop gây đáp ứng kháng thể trung hòa, có ít nhất là
8 epitop, một epitop ở vị trí quyết định N trên protein biểu thị tính đặc hiệu của
virút (Kimura-Kuroda and Yasui, 1986). Glycoprotein E trên bề mặt hạt virút gây

đáp ứng miễn dịch tế bào và là kháng nguyên ngưng kết hồng cầu.
2.2.2 Sức đề kháng
VirútLiệu
tươngĐH
đối bền
với pH=
đến pH
9, thích
hợp tập
nhất ởvà
pHnghiên
= 8,5. Ở pH
tâm Học
Cần
Thơ7 @
Tài= liệu
học
cứu
= 9 là điều kiện cần thiết để giữ khả năng ngưng kết hồng cầu của virút.
Virút bị mất hoạt lực ở 560C trong 30 phút, ở 600 C virút chết sau 10 phút, ở
700 C virút chết sau 5 phút, virút bị bất hoạt nhanh bởi tia cực tím.
Virút có thể tồn tại nhiều tháng trong huyết thanh ở -200C và có thể gây
nhiễm tế bào nuôi cấy.
Các hóa chất như cồn, ether, aceton làm mất hoạt lực sau 3 ngày; lyson tiêu
diệt sau 5 phút; formol 0.5% tiêu diệt virút sau 48 giờ.
2.2.3 Đặc tính ngưng kết hồng cầu
Virút gây ngưng kết hồng cầu gà, ngỗng, bồ câu, chuột lang, thỏ nhưng tốt
nhất là hồng cầu gà 1 ngày tuổi.
Yếu tố ảnh hưởng đến ngưng kết hồng cầu
Kháng nguyên chế từ não pH tối ưu là 6,3 -6,5

Kháng nguyên chế từ nuôi cấy tế bào pH tối ưu là 6,0-6,2.
2.2.4 Đặc điểm nuôi cấy
Virút nhân lên nhanh chóng trên nhiều loại tế bào một lớp cũng như một số
dòng tế bào có nguồn gốc từ động vật có vú, chim, muỗi (Rechacek, 1968). Khi
nuôi cấy trên tế bào thận chuột, sau 60 phút đã có virút tiếp cận với màng tế bào,

3


sau hơn 3 giờ virút tiếp cận trong nguyên sinh chất của một số tế bào, còn hầu hết
các tế bào khác chưa có thay đổi, sau 3-4 ngày hầu hết các tế bào đã thoái hóa hoặc
bong ra khỏi thành chai, lúc này virút đã nhân lên ở mức độ cao và tập trung thành
những đám lớn hoặc rải rác trong nguyên sinh chất tế bào (Đỗ Quang Hà Và Ctv,
1976).
Có thể gây bệnh thực nghiệm trên chuột bạch và khỉ bằng cách tiêm vào
xoang não, 3-8 ngày sau chuột sẽ bị liệt, co giật rồi chết (Dương Đình Thiện, 2001).

Trung

2.3 DỊCH TỄ HỌC
2.3.1 Phân bố bệnh theo mùa và theo địa lí
Bệnh có tính mùa thể hiện rõ trên người, với phần lớn các ca bệnh tập trung
vào tháng của mùa hè hoặc gió mùa. Ở Đông Nam Á, đặc biệt các ca bệnh xảy ra
vào giữa tháng 5 đến tháng 9 hoặc giữa tháng 7 đến tháng 12 ở Bắc ấn Độ, Pakistan
và Bangladesh. Nhiệt độ ảnh hưởng đến mật độ muỗi và nó liên quan trực tiếp đến
số lượng người nhiễm bệnh.
Ở nước ta, khoảng thời gian từ tháng 5 đến tháng 8-9 âm lịch (cây quả phát
triển, mưa nhiều, ruộng lúa đầy nước tạo điều kiện tốt cho muỗi sinh sản và phát
triển mạnh trong thiên nhiên) là thời điểm phát triển bệnh VNNB ở trẻ em. Đỉnh
tâm

Họcbệnh
Liệu
ĐH6Cần
Thơ
@tháng
Tài10liệu
học
và giảm
nghiên
cứu
cao dịch
là tháng
và tháng
7. Từ
trở đi,
mậttập
độ muỗi
và bệnh
VNNB cũng giảm.
Vào mùa mưa và mùa hè thời tiết nóng, ở nhiệt độ từ 270C-300C, virút
thường phát triển tốt trong cơ thể muỗi. Nếu dưới 200C thì sự phát triển của virút
dừng lại. Đó là lý do tại sao mô hình dịch tễ học lại khác nhau giữa hai miền Nam,
Bắc Việt Nam. Tại Miền Bắc bệnh giảm vào những tháng lạnh, tăng vào những
tháng hè và đỉnh cao vào tháng 5 - 6 – 7 (Võ Công Khanh, 2005).

4


Hình 2.2: Vùng dịch tễ chịu ảnh hưởng của bệnh viêm não Nhật Bản (đỏ)
(www.Jyi.org/articleimages/605/orignal/img1.jpg)

Trung

2.3.2 Phân bố bệnh theo tuổi
Người ở mọi lứa tuổi chưa có miễn dịch đều có thể mắc bệnh. Ở những vùng
có bệnh VNNB lưu hành, trẻ em sớm tiếp xúc với tác nhân gây bệnh nên tỷ lệ mắc
bệnh ở trẻ cao thường từ 2 - 15 tuổi, phần lớn ở thể không triệu chứng lâm sàng, số
tâm
Học
Cần
@ tuổi
Tàinên
liệu
cứu
lượng
trẻ cóLiệu
khángĐH
thể đặc
hiệuThơ
tăng theo
tỷ lệhọc
mắc tập
bệnh và
giảmnghiên
ở trẻ lớn và
người lớn.
2.3.3 Trung gian truyền bệnh
2.3.3.1 Vai trò của muỗi trong truyền bệnh Viêm Não Nhật Bản
Muỗi là nhân tố quan trọng đối với sự nhiễm bệnh ở người và là yếu tố quan
trọng trong chu trình truyền bệnh VNNB. Muỗi Culex tritaeniorhynchus là loài

muỗi quan trọng nhất cho sự nhân lên của virút VNNB. Do đó, loài muỗi này được
xem là vectơ truyền bệnh chính ở hầu hết ở các nước Châu Á. Khi Culex
tritaeniorhynchus bị nhiễm virút VNNB ở nồng độ thấp, virút có thể nhân lên nhanh
chóng trong cơ thể loài muỗi này và tiếp tục gây nhiễm cho nhiều loài động vật
thích hợp như heo, chim. Trong cơ thể heo và chim virút được khuếch đại và gây
nhiễm cho muỗi. Kết quả lượng lớn virút VNNB được duy trì trong tự nhiên, trong
quần thể đông đúc Culex tritaeniorhynchus bị nhiễm (Endy và Nisalak, 2002).
Ở Việt Nam muỗi Culex phân bố rộng, hiện diện ở nhiều vùng đồng bằng và
trung du (chiếm 40-50% trong tổng số muỗi bắt), hoạt động mạnh vào mùa nóng,
mật độ cao vào tháng 3, 4 đến tháng 7, thích hợp ở nhiệt độ 22-280C, ẩm độ 8090%, sinh sản ở các ao hồ, vũng nước quanh nhà, chu kì sinh sản 15-16 ngày,
thường hoạt động và hút máu về đêm từ 18 giờ đến 20-22 giờ, giảm dần và ngừng
hoạt động vào lúc 8 giờ sáng.

5


Một số loài muỗi được xem là nhân tố trung gian truyền bệnh VNNB là:
Culex tritaeniorhynchus, Culex fuscocephala, Culex pseudovishnui, Culex
gelidus…
Ở miền bắc nước ta, muỗi Culex tritaeniorhynchus là trung gian truyền bệnh
VNNB. Ở Cần Thơ muỗi Culex .Pseudovishnui là trung gian truyền bệnh chủ yếu
của bệnh VNNB (Hồ Thị Việt Thu, 2005).

Trung

Hình 2.3 : Muỗi Culex tritaeniorhynchus đẻ trứng
(www.jyi.org/articleimages/605/originals/img3.jpg)
2.3.3.2 Chu trình truyền virút VNNB trong tự nhiên
tâm Học
ĐH

Cần
Thơ
@thiên
Tàinhiên
liệudohọc
tập
cứu
VirútLiệu
VNNB
được
bảo tồn
trong
truyền
sinhvà
họcnghiên
từ động vật
có xương sống này sang động vật có xương sống khác qua trung gian hút máu là
muỗi.
Muỗi nhiễm
nhiễm
Muỗi
bệnh
chích
động
bệnh cắn động
vật và
và truyền
truyền
vật
virút VNNB

Muỗi cắn chim
& mang virút
VNNB

Vật mang
mang
Vật
mầm bệnh
bệnh
mầm
Muỗi cắn
chích
chim
Muỗi
chim
& chim
chim mang
mang
&
mầm bệnh
bệnh
mầm

Muỗi chích động
vật chứa mầm
bệnh

Muỗi nhiễm bệnh đốt người

Hình 2.4: Chu trình truyền virút VNNB
(www.rfa.org.TheJapaneseMeningitis)

6


Heo là vật chủ quan trọng nhất làm lan tràn virút VNNB vì ở heo có nồng độ
virút huyết cao, và chu trình heo - muỗi tồn tại quanh năm.
Chim là ký chủ sau heo chứa virút VNNB quan trọng, với nồng độ virút
huyết cao. Gà, vịt nuôi cũng là nguồn truyền virút cho muỗi, sau đó lại truyền sang
cho con người và động vật khác.
Người sống gần chu trình sinh thái tự nhiên này, có thể mắc bệnh khi bị muỗi
đốt. Người được coi là vật chủ cuối cùng đối với virút VNNB vì virút trong máu
người tồn tại trong thời gian ngắn với nồng độ thấp, nên không thể lây bệnh từ
người này sang người khác qua muỗi đốt (Huỳnh Phương Liên, 1988).

Trung

2.4 CƠ CHẾ SINH BỆNH
Virút từ nước bọt của muỗi đốt, qua da, giai đoạn đầu virút nhân lên tại chỗ
và ở các hạch lympho vùng, đây là nguồn dẫn đến virút huyết đầu tiên. Từ máu
virút đi đến các tổ chức và nội tạng khác như tổ chức lympho, mô liên kết, cơ vân,
cơ tim, tuyến nội và ngoại tiết. Virút tiếp tục nhân lên tại tổ chức ngoài thần kinh
đưa đến virút huyết lần nữa kéo dài 3-5 ngày, thường với nồng độ thấp ở người.
Ở người và chuột, virút VNNB xâm nhiễm có tính hướng thần kinh. Những
biến đổi bệnh lý trong quá trình phát triển của virút trong hệ thần kinh trung ương
tâm
Liệu
@ với
Tàinồng

liệu
tậpgấp
vàtriệu
nghiên
cứu
virút nhân
lênĐH
trongCần
tế bàoThơ
thần kinh
độ học
trong não
lần so với
như:Học
ở vị trí khác ngoài thần kinh. Trong giai đoạn cấp tính, nói chung màng não bình
thường hoặc thoáng mờ, não bị sung huyết, phù nề, xuất hiện điểm xuất huyết hoặc
chảy máu tại chất xám, hoại tử ở đồi thị, nhân xám nền sọ, não giữa, tiểu não, nhân
xám thân não, chất xám của vỏ não. Sừng trước tủy sống bị tổn thương giống như
trong sốt bại liệt (Phạm Văn Ty, 2004)
2.5 MIỄN DỊCH HỌC
Trong miễn dịch đặc hiệu, sau khi nhiễm virút ta có phát hiện được kháng thể
IgG và IgM. Kháng thể IgM được tạo ra rất sớm nhưng lại giảm nhanh, chỉ tồn tại
khoảng 2 tuần và thường ứng dụng trong chẩn đoán.
Sau khi tiêm ngừa bằng những chủng virút vắc xin giảm độc lực cho heo, hiệu
giá kháng thể HI đạt khoảng 40-640 phát hiện sau 4 tuần và hiệu giá 160 được duy
trì ít nhất 6 tuần (Fuijisaki và ctv, 1975).
Khi viêm vắc xin VNNB vào chuột 3 tuần tuổi thì kết quả 90 -100% chuột
này đều có kháng thể chống bệnh VNNB với hàm lượng tháng thể >= 1/1600 sau 24 tuần sau tiêm (Konoshi, 1998).

7

Khi gây nhiễm cho heo mẫn cảm với virút VNNB, sau 1 tuần cả kháng thể HI
và kháng thể trung hòa có thể phát hiện cùng một lúc, các kháng thể này có thể đạt
cao nhất ở 2-4 tuần sau khi nhiễm và giảm sau 4 tuần khi nhiễm (Otsuka và Ctv,
1966).
2.6 TRIỆU CHỨNG VÀ BỆNH TÍCH
2.6.1 Triệu chứng
 Trên người
Sau 1 tuần nhiễm virút, bệnh khởi phát đột ngột với các triệu chứng:

Trung



Sốt cao liên tục



Các biểu hiện giống như cảm cúm như đau nhức cơ thể, chảy nước mũi



Những rối loạn thần kinh như trẻ bị nhức đầu, nôn ói, quấy khóc nhiều, vã
mồ hôi, ngủ gà, li bì



Các triệu chứng nặng hơn là các tình trạng gồng cứng toàn thân, tay chân
run, mê sảng, cổ cứng.

Bệnh có thể diễn tiến rất nhanh trong 1-2 ngày và trầm trọng đến mức gây tử
vong.Học
Các Liệu
trường ĐH
hợp khác
có thể
hồi @
phụcTài
nhưng
không
hoàn
toàn.
tâm
Cần
Thơ
liệu
học
tập
và nghiên cứu
Phần lớn người bị nhiễm virút VNNB ở thể ẩn, chỉ rất ít có triệu chứng lâm
sàng, với thể hiện rất đa dạng, thay đổi từ nhẹ như cảm cúm đến nặng gây tử vong.
Dù ở bất cứ thể nào cơ thể vẫn tạo kháng thể đặc hiệu.
Thể ẩn:
Chiếm đa số, không có triệu chứng lâm sàng, cứ một trường hợp điển hình
thì có vào khoảng 200 đến 300 thể ẩn. Theo Tổ chức Y tế Thế giới con số này dao
động từ một điển hình /20 - 1000 trường hợp thể ẩn.
Thể nhẹ:
Sốt, nhức đầu, nôn. Không có triệu chứng đặc hiệu.
Thể màng não:

Ngoài hội chứng nhiễm trùng, xuất huyết màng não, đôi khi có rối loạn ý
thức nhẹ, dịch não tủy thay đổi như trong viêm màng não siêu vi khác.
Thể tủy sống:
Khởi bệnh với sốt, sau đó liệt mềm cấp giống như sốt bại liệt, liệt không
đồng đều, ưu thế ở chân nhiều hơn tay, dịch não tủy biến đổi như trong thể điển
hình. Khoảng 30% của thể này có rối loạn tri giác và xuất hiện hội chứng viêm não
sau đó.

8


Thể điển hình:
Thời gian ủ bệnh trung bình một tuần, tối thiểu 5 ngày tối đa 15 ngày.
Giai đoạn tiền triệu:
Trung bình từ 1 - 4 ngày, với các hội chứng nhiễm trùng không điển hình:
sốt, kèm rối loạn tiêu hóa, nôn, đau bụng, tiêu chảy, viêm long đường hô hấp, ho,...

Trung

Giai đoạn toàn phát:
Có thể kéo dài từ 1 đến 2 tuần. Thường xảy ra đột ngột không qua giai đoạn
tiền triệu, với các hội chứng nhiễm trùng xen kẽ với hội chứng thần kinh: sốt, buồn
nôn, và nhức đầu ở trẻ lớn. Nhiệt độ tăng lên 390 – 400C , các cơn co giật toàn thân,
đôi khi cục bộ. Rối loạn tri giác thay đổi từ nhẹ như li bì, hôn mê, kèm những rối
loạn thần kinh thực vật.
Các dấu hiệu thần kinh xuất hiện như co giật toàn thân, quay đầu, cơn quay
mắt, co cứng, co vặn cơ, run, ngón tay mân mê như vấn thuốc, liệt chi, liệt thần kinh
sọ não, múa vờn múa giật, mặt nhăn nhó (Võ Công Khanh, 2005).
 Trên chuột
Khi tiêm virút vào não ở chuột 6-7g thấy thời gian ủ bệnh kéo dài 3-4 ngày,

triệu chứng lâm sàng xuất hiện vào ngày thứ 4 như: kém ăn, xù lông, co ro, ít hoạt
tâm
ĐH
@đóTài
tậprồivà
cứu
động,Học
xuất Liệu
hiện từng
cơnCần
động Thơ
kinh, sau
bại liệu
liệt 2 học
chân sau
chếtnghiên
(Đỗ Quang
Hà, 1965).
 Trên heo
Tất cả heo nái không hoặc mang thai và heo trưởng thành đều không có triệu
chứng đặc trưng. Tuy nhiên bệnh lý trên các heo nái mang thai được thể hiện ở sự
bất thường của lứa đẻ như: thai khô, thai chết, heo con chết biểu hiện phù thủng,
heo con yếu ớt, run, ứ nước dưới da, ở não (Shimuzi và ctv, 1954), có triệu chứng
thần kinh và chết sau một vài ngày.

2.6.2 Bệnh tích.
Bệnh tích đại thể
Não thủy thũng, tích dịch, sung huyết não, phù nề, xuất hiện điểm xuất
huyết, hoại tử đồi thị (trường hợp cấp tính), tích nước xoang ngực, phù dưới da,
hoại tử gan, lách, sung huyết hạch lâm ba.

Bệnh tích vi thể
Viêm não không mủ, xuất huyết quanh mạch, với sự xâm nhiễm nhiều của
lympo bào, đại thực bào, tăng sinh tế bào thần kinh đệm.

9


Trung

2.7 CHẨN ĐOÁN
Việc chẩn đoán bệnh VNNB phải dựa vào các điều kiện dịch tễ và triệu
chứng lâm sàng. Có nhiều phương pháp trong việc chẩn đoán bệnh VNNB như: HI
(haemagglutination inhibition), SN (seroneutralization), CF (complement Fixation),
ELISA (enzyme linked immuno sorbent assay), PCR (polymerase chain reaction).
2.7.1 Phân lập virút
Những bệnh phẩm thường được dùng trong phân lập virus như: não của thai
chết, huyết thanh thai chết, huyết thanh heo mẹ, … Tất cả cần được bảo quản ở
nhiệt độ lạnh và vận chuyển ngay đến phòng thí nghiệm. đối với bệnh phẩm là não
cần được chia đôi cho việc thực hiện phiến đò tổ chức.
Phân lập virút có thể được thực hiện bằng cách tiêm huyễn dịch bệnh phẩm
vào não chuột từ 1-5 ngày tuổi. Chuột sẽ có triệu chứng thần kinh và chết sau 4-14
ngày, virút trong não chuột có thể được xác định bằng phản ứng trung hòa trên
chuột hoặc trên tế bào một lớp.
Tế bào có nguồn gốc từ muỗi Ae.albopictus dòng C6/36 là môi trường tốt
nhất cho sự nhân lên của virút.
Việc phân lập virút trên người ít thành công do hàm lượng kháng thể trung
hòa cao khi bệnh nhân có triệu chứng lâm sàng.
tâm
Học Liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
2.7.2 Phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI : Haemagglutination

Inhibition).
Đây là phương pháp cơ bản để xét nghiệm chẩn đoán virút bệnh VNNB.
Tiền thân của xét nghiệm là phản ứng ngưng kết hồng cầu (HA), khi Sabin và cộng
sự phát hiện Arbovirus, đặc biệt là virút VNNB có đặc tính ngưng kết hồng cầu kết
hồng cầu của một số loài động vật.
Phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu tương đối đơn giản, ít tốn kém lại có
khả năng định tính và định lượng kháng thể kháng virút VNNB .
2.7.3 Phương Pháp ELISA (Enzyme linked Imuno sorbent Assay).
Phương pháp này được sử dụng rộng rải để chẩn đoán nhiều bệnh do virút,
xét nghiệm nhiều mẫu cùng lúc.
Hiện nay để chẩn đoán bệnh người ta thường dùng phương pháp MacELISA để phát hiện sớm kháng thể IgM kháng virút VNNB.

2.7.4 Phản ứng khuếch đại chuỗi gen (PCR- Polymerase chain reaction)
PCR là một kĩ thật sinh học phân tử dựa trên sự nhân lên một lượng nhỏ
DNA thành một lượng lớn có khả năng phát hiện được qua việc sử dụng những cặp

10


mồi phân tử, men trùng hợp và máy khuếch đại DNA. Xét nghiệm này có giới hạn
vì hiện tượng virút huyết ngắn vì vậy bệnh phẩm dùng xét nghiệm tốt nhất là não.
Phản ứng này khó thực hiện, đòi hỏi chi phí cao.
2.8 PHÒNG VÀ ĐIỀU TRỊ BỆNH
2.8.1 Điều trị bệnh VNNB
Hiện nay không có thuốc điều trị đặc hiệu trên người và gia súc. Điều trị chủ
yếu là hồi sức cấp cứu và điều trị triệu chứng trong giai đoạn cấp như: chống sốt
cao, chống phù não, chống co giật, chống suy hô hấp, chòng chống bội nhiễm, bồi
hoàn nước và điện giải.
2.8.2 Phòng bệnh
Việc khống chế và phá vỡ chu trình lây truyền bệnh trong tự nhiên là biện tốt

nhất trong việc phòng chống bệnh.
2.8.2.1 Kiễm soát nhân tố trung gian truyền bệnh
Sử dụng hóa chất diệt muỗi tuy có hiệu quả nhưng chỉ giới hạn trong một
không gian và thời gian nhất định.
MuỗiLiệu
sinh sản
phát triển
ở ruộng
lúa, nơi
bụihọc
rậm, ẩm
bẩn… Do
Trung tâm Học
ĐHvà Cần
Thơ
@ Tài
liệu
tậpthấp,
và dơ
nghiên
cứu
đó để hạn chế muỗi cũng như hạn chế nguồn chứa virút trong heo cần thực hiện vệ
sinh môi trường chăn nuôi, vệ sinh dụng cụ, vật chứa nước, sử dụng hóa chất diệt
muỗi, cải tiến phương pháp canh tác, cải tiến chăn nuôi, nuôi cá để hạn chế sự phát
triển và sinh sản của muỗi.
Đối với người biện pháp phòng bệnh tốt nhất là ngủ trong mùng mặc quần áo
dài tay, vệ sinh môi trường xung quanh thoáng mát, dùng thuốc xịt muỗi.
2.8.2.2 Phòng bệnh bằng vắc xin
Gây miễn dịch cho heo:
Việc gây miễn dịch cho heo còn nhiều khó khăn. Ở Việt Nam chưa thấy có

vắc xin VNNB dùng cho heo.
Gây miễn dịch cho người
Vắc xin VNNB bất hoạt chế từ não chuột
Miễn dịch cơ bản: 2 liều cách nhau 1 - 2 tuần, tiêm dưới da tại cơ delta.
Nhắc lại 1 liều bổ sung 1 năm sau, 3 - 4 năm tiêm nhắc lại một liều.
Dưới 3 tuổi tiêm 0,5ml, trên 3 tuổi tiêm 1ml.

11


Chống chỉ định: sốt cao hoặc bệnh nhiễm trùng đang tiến triển. Bệnh tim,
thận, gan, bệnh tiểu đường hoặc suy dinh dưỡng, bệnh ung thư máu và các bệnh ác
tính nói chung, quá mẫn,phụ nữ có thai.
Phản ứng phụ: tại chỗ vùng tiêm sưng đỏ, toàn thân, sốt, ớn lạnh, nhức đầu.

Hình 2.5: Vắc xin viêm não Nhật Bản
(www.vabiotechvn.com/upload/images/thumb_produ...)
2.9 LỊCH SỬ NGHIÊN CỨU VỀ BỆNH VIÊM NÃO NHẬT BẢN
2.9.1Học
Một số
nghiên
cứuCần
bệnh Thơ
VNNB@
trênTài
thế giới
Trung tâm
Liệu
ĐH
liệu học tập và nghiên cứu

Năm 1934, virút viêm não Nhật Bản được phân lập từ não bệnh nhân chết do
viêm não, virút này được xem như chủng virút mẫu của virút viêm não Nhật Bản và
được đặt tên là Nakayama.
Năm 1942, Sabin và đồng nghiệp đã sản xuất những lô vắc xin đông khô và
vắc xin bất hoạt bằng formon từ huyễn dịch não chuột 10% đã được gây nhiễm với
chủng Nakayama. Qua kiểm nghiệm cho thấy vắc xin đã bảo vệ được chuột thí
nghiệm khi tiêm virút viêm não Nhật Bản qua đường phúc mạc (Otsuka,1966).
Năm 1975, Miura và đồng nghiệp đã nghiên cứu những ảnh hưởng của virút
viêm não Nhật Bản trên thai chuột (Miura, 1975).
Năm 1981, Mathur và cộng sự đã thí nghiệm trên chuột mang thai, khi tiêm
truyền virút viêm não Nhật Bản vào màng phúc mạc của con cái mang thai. Virút
tác động trên thai khác nhau tuỳ từng giai đoạn mang thai. Sự nhiễm bệnh viêm não
Nhật Bản trong suốt tuần đầu tiên của thai kì gây ra số lượng chết thai và chết chuột
thí nghiệm sơ sinh (66%) cao hơn khi gây nhiễm vào tuần thứ 3 của thai kì (13.8%).
Số chuột sẩy thai, chết thai và chết chuột sơ sinh cao hơn ở những chuột đối xứng
(Mathur, 1981).

12


Trung

Năm 1988, Kulshreshtha và cộng sự đã khảo sát sự nhễm bệnh tiềm tàng trên
chuột khi cấy truyền virút viêm não Nhật Bản với tế bào nhớ B (Kulshreshtha,
1988)
Năm 1992, Hasegawa và cộng sự đã nghiên cứu về sự đột biến gen mã hoá
protein màng của virút viêm não Nhật Bản qua việc gây nhiễm tế bào nuôi cấy và
thử độc tính trên chuột (Hasegawa, 1992).
Năm 1996, Krishna và cộng sự đã thí nghiệm cấy truyền lympo bào T gây độc
tế bào của virút viêm não Nhật Bản vào não chuột với liều gây chết cho phép. Kết

quả cho thấy trên chuột trưởng thành có kháng thể bảo hộ với virút viêm não Nhật
Bản trong khi đó ở chuột con mới sinh (4 ngày tuổi) và chuột con còn bú (8-14 ngày
tuổi) thì không được bảo hộ (Krishna, 1996).
Năm 2002, Lee và Lobigs đã theo dõi cơ chế biến dị của virút viêm não Nhật
Bản và virút viêm não Murray valley trên chuột bằng phương pháp vivo (Lee và
Lobig, 2002).
Năm 2003, Chuang và cộng sự đã thực hiện xét nghiệm virút viêm não Nhật
Bản trong tế bào đơn nhân ở máu ngoại vi chuột bằng xét nghiệm RT-PCR. Kết
quả tìm thấy virút trong máu chuột vào ngày thứ nhất và ngày thứ 3, nhưng không
tìm thấy virút nào vào ngày thứ 5 sau khi tiêm virút viêm não Nhật Bản vào tĩnh
tâm
ĐH
Cần
@ Tài
họcthứtập
vàngày
nghiên
cứu
mạchHọc
chuột,Liệu
chỉ phát
hiện
virút Thơ
trong máu
chuộtliệu
vào ngày
2 đến
thứ 3 sau
khi tiêm (Chuang, 2003).
Năm 2004, Yang và cộng sự đã nghiên cứu tính chất vật lí, sinh học của virút

viêm não Nhật Bản (chủng KV1899) phân lập trên heo ở Hàn Quốc qua việc tiêm
truyền cho chuột con còn bú. Những chuột này sẽ bị liệt và chết trong vòng 7 ngày
sau khi tiêm, dịch não chuột gây ngưng kết hồng cầu ngỗng. Virút được phân lập
có khả năng gây bệnh khi được tiêm vào trong não và trong màng phúc mạc của
chuột con 3-4 tuần tuổi với liều lần lượt là 104.5LD50/0,03ml và 103.0LD50/0,5ml.
Những hạt virút gây nhiễm tế bào vero có kích thước 40-50nm dưới kính hiển vi
điện tử.
Năm 2005, Yang và cộng sự tiếp tục nghiên cứu về tính miễn dịch của
protein tái tổ hợp của virút Viêm Não Nhật Bản trên chuột. Kết quả cho thấy hiệu
giá kháng thể trung hoà huyết thanh trước khi tiêm virút tạo miễn dịch thấp từ 1/2
đến 1/4 nhưng sau khi tiêm virút với liều gây chết cho phép thì hiệu giá kháng thể
trung hoà tăng lên từ 1/4 đến 1/32. Không tìm thấy kháng thể trung hoà ở nhóm đối
chứng (Yang, 2005).

13


2.9.2 Một số nghiên cứu về bệnh VNNB trong nước
Năm 1956, Caubet và Netter viện Pasteur Nha Trang, thực hiện điều tra huyết
thanh học đã phát hiện có 20% người Việt Nam tiếp xúc với virút VNNB.
Năm 1960, có 4 chủng virút viêm não Nhật Bản được phân lập trong đó có 3
chủng từ não bệnh nhân và 1 từ não chim liếu điếu là HN-51, HN-59, HN-60, LD68.
Năm 1990-1992 Huỳnh Phương Liên nghiên cứu thành công trong việc chế
vắc xin viêm não Nhật Bản trên não chuột từ chủng Nakayama (Huỳnh Phương
Liên, 1990-1992).
Năm 1964, có 4 chủng virút VNNB được phân lập, trong đó có 2 chủng từ
não của 23 bệnh nhân có hội chứng viêm não (tất cả đều là trẻ em dưới 12 tuổi),
một chủng từ 28 mẫu máu trẻ em dưới 10 tuổi với chẩn đoán lâm sàng là viêm não,
viêm màng não, tăng lâm ba cầu, 1 chủng từ 23 não của 14 loài chim hoang. Từ
những nghiên cứu trên tác giả đã khẳng định sự lưu hành rộng rãi của virút VNNB

ở miền bắc Việt Nam và giải thích phần nào sự tồn tại của virút trong các ổ chứa
virút trong tự nhiên (Đỗ Quang Hà và Đoàn Xuân Mượu, 1965).

Trung tâm Học Liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
Năm 2006, Hồ Thị Việt Thu và cộng tác viên đã phân lập được một chủng
virút viêm Não Nhật Bản (CTM-P7) trên muỗi Culex pseudovishnui tại thành phố
Cần Thơ (Hồ Thị Việt Thu, 2006).

14


CHƯƠNG 3
PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM

Trung

3.1 PHƯƠNG TIỆN THÍ NGHIỆM
3.1.1 Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài
Thời gian:
Thí nghiệm được tiến hành từ tháng 02 đến tháng 05 năm 2008
Địa điểm
Trại thực nghiệm Khoa Nông Nghiêp, phòng thí nghiệm bệnh truyền nhiễm,
bộ môn Thú Y, trường Đại Học Cần Thơ.
3.1.2 Đối tượng thí nghiệm : Chuột bạch 14 ngày tuổi, số lượng thí nghiệm là 36
con.
3.1.3 Nội Dung Thí Nghiệm
Xác định độc lực và tính chất gây bệnh của virút VNNB trên chuột bạch (14
ngày tuổi) qua các đường tiêm khác nhau bằng cách khảo sát:
- Khảo sát triệu chứng của chuột sau khi tiêm virút VNNB.
- Đối với chuột chết tiến hành khảo sát bệnh tích đại thể.

- Đối với chuột còn sống tiến hành lấy máu chiết huyết thanh kiểm tra kháng
thể kháng virút VNNB bằng phương pháp ngăn trở ngưng kết hồng cầu.
tâm Học Liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
3.1.4 Vật liệu thí nghiệm
Ống nghiệm vô trùng, kéo, dao mổ, ống tiêm 1ml, găng tay, bông gòn vô
trùng, thùng trữ lạnh, đèn cồn, dụng cụ nuôi chuột, thức ăn nuôi chuột, máy ly tâm,
hematocrit, týp nhựa chứa huyết thanh, đĩa mictoplate đáy hình chữ U có 96 giếng,
micropipette.
Sinh phẩm
Kháng nguyên virút viêm não Nhật Bản chủng CTM- P7
Kháng nguyên virút viêm não Nhật Bản chuẩn chủng Nakayama
Dung dịch PBS có bovalbumin 0.4%
3.2 PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM
3.2.1 Phương pháp nuôi chuột
Chuột bạch được nuôi trong các hộp mủ hình chữ nhật, phía trên có nắp lưới
có thể kéo ra vào được. Mỗi hộp nuôi 1 chuột mẹ và chuột con. Đáy hộp được lót
bằng trấu và có thức ăn, nước uống riêng. Nước uống được đựng trong chai mủ có
nắp đậy và có ống cắm vào hộp cho chuột hút nước uống. Mỗi tuần thay nước và
trấu 2-3 lần. Khẩu phần ăn của mỗi chuột là khoảng 5g/ngày. Mỗi ngày cho ăn 2
lần vào sáng và chiều. Chuột nuôi được che chắn cẩn thận tránh mưa tạt, gió lùa, có

15


mùng che để tránh muỗi đốt chuột. Tất cả các chuột nuôi đều được chăm sóc cẩn
thận cùng điều kiện.

Hình 3.1 Chuột nuôi được giăng mùng cẩn thận tránh bị muỗi đốt
3.2.2 Kết quả tính liều LD50 trên chuột ổ (1-3 ngày tuổi)
Mục tiêu tính liều LD50 trên chuột bạch 1-3 ngày tuổi là để tiến hành tính liều

LD50 tiêm truyền cho chuột ổ 14 ngày tuổi.
3.1 kết quả tính LD50 trên chuột ổ
Trung tâm Học Liệu ĐHBảng
Cần
Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
Chủng

LD50

CTM- P7

10-5,75

Nakayama

10-4,23

(Kết quả và cách tính LD50 cụ thể được trình bày ở phụ chương)
Kết quả tính LD50 trên chuột ổ (1-3 ngày tuổi) đối với chủng CTM– P7 là
10 . Tức ở độ pha loãng 1:105,75, khi tiêm 0,02 ml huyễn dịch virút VNNB chủng
CTM– P7 sẽ gây chết 50% chuột ổ thí nghiệm.
-5,75

Kết quả tính LD50 trên chuột ổ đối với chủng Nakayama là 10-4,23. Tức ở độ
pha loãng 1:104,23, khi tiêm 0,02 ml huyễn dịch virút VNNB chủng Nakayama sẽ
gây chết 50% chuột ổ thí nghiệm.
3.2.3 Tiến hành thí nghiệm
 Bố trí thí nghiệm và tính liều tiêm trên chuột bạch 14 ngày tuổi
Thí nghiệm được tiến hành trên 36 chuột 14 ngày tuổi. Thí nghiệm được bố
trí với hai chủng virút VNNB CTM-P7 với chủng Nakayama với 3 đường tiêm khác

16


nhau. Liều tiêm được bố trí bằng cách tiêm 100 liều LD50 (cả chủng CTM- P7 &
Nakayama), tức 0,02 ml huyễn dịch sẽ chứa 100 liều LD50.
Mỗi chuột được tiến hành tiêm 100 liều LD50/0,02ml huyễn dịch chứa virút.
Bảng 3.2 Bố trí thí nghiệm tiêm virút VNNB cho chuột
Số lượng chuột thí nghiệm (con)
Chủng CTM –P7

Chủng
Nakayama

Liều tiêm (ml)

Xoang não

6

6

0,02

Phúc mạc

6

6

0,02

Bắp thịt

6

6

0,02

Đường tiêm

Trung tâm Học Liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Hình 3.2 Pha loãng và tiêm virút vào chuột trong phòng thí nghiệm
3.2.4 Chỉ tiêu theo dõi:
 Tỷ lệ chuột chết
 Tần số xuất hiện triệu chứng
 Tần số xuất hiện bệnh tích đại thể từ các chuột chết .
3.2.5 Các bước nghiên cứu sự đáp ứng kháng thể ở chuột bạch
Bố trí thí nghiệm
Số chuột còn sống sót sẽ được tiến hành lấy máu đuôi, chiết huyết thanh và
thực hiện phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu để kiểm tra kháng thể kháng virút
VNNB
Các bước cần thiết để thực hiện phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu

17


+ Chuẩn bị hóa chất

 Dung dịch Alsever (chất chống đông)
 Dung dịch DGV (Dextrose-gelatin- veronal)
 Dung dịch borat (pH =9)
 Dung dịch BABS 0.4%
 Dung dịch VAD (virus adjusting diluent)
 Kháng nguyên có 8 đơn vị ngưng kết hồng cầu kết, pha loãng trong dung
dịch BABS 0.4%, để ở nhiệt độ trong 40C trong 1 giờ.
+ Lấy mẫu máu và chiết lấy huyết thanh chuột bạch
Lấy máu chuột bạch: máu được lấy bằng cách cắt đuôi. Sau khi tiêm truyền
17 ngày, số chuột sống sót được tiến hành lấy máu cho vào ống nghiệm vô trùng.
Chiết lấy huyết thanh và cho vào týp nhựa và bảo quản ở nhiệt độ -200C.
+ Rửa và bảo quản hồng cầu ngỗng

Trung tâmHọc
Liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
Máu ngỗng được lấy từ tĩnh mạch cánh, trước khi lấy phải sát trùng vị trí lấy
máu.
 Hồng cầu ngỗng được rửa 4 lần trong dung dịch DGV, kỹ thuật làm vô trùng
 Lấy 1,5ml chất chống đông Alsever vào ống tiêm, rút 8,5 ml máu từ tĩnh
mạch cánh ngỗng trộn đều.
 Một khối lượng máu toàn phần + 2,5 khối lượng DGV, lắc nhẹ cho đều rồi
tâm 1000 vòng/ phút, trong 15 phút, hút bỏ phần nước nỗi trên.
 Hòa hồng cầu với 3 khối lượng DGV, lắc nhẹ để trộn đều, ly tâm 1000 vòng/
phút trong 15 phút, bỏ phần nước trên. Rửa tiếp 2 lần nửa với DGV (tổng
cộng 4 lần rửa).
 Dùng hematocrit để xác định tỷ lệ hồng cầu, sau đó pha loãng hồng cầu 8%
trong DGV và bảo quản ở nhiệt độ 40C.
 Hồng cầu sẽ được tiếp tục pha loãng trong VAD theo tỷ lệ 1/23 khi sử dụng
trong phản ứng HI (hồng cầu 0,33%).

18


Hình 3.4 Lấy máu ngỗng làm thí nghiệm
+ Xử lý huyết thanh
Trước khi làm phản ứng phải xử lý huyết thanh loại bỏ chất kìm hãm ngưng
kết hồng cầu kết hồng cầu không đặc hiệu.

Trung

- Xử lý bằng kaolin: dùng micropipet hút 0,05ml huyết thanh cho vào ống
nghiệm vô trùng, cho tiếp 0,01 ml dung dịch borat pH = 9 và 0,01 ml dung dịch
kaolin, lắc kỹ hổn dịch trong 5 phút/lần trong 20 phút, ly tâm 2000 vòng/phút trong
tâm
HọchútLiệu
ĐH
Cần
@huyết
Tàithanh
liệupha
học
tập
15 phút,
lấy phần
nước
trongThơ
ta được
loãng
1/5.và nghiên cứu
- Xử lý bằng hồng cầu: cho huyết thanh đã pha loãng 1/5 vào ống nghiệm vô

trùng, cho thêm một giọt hồng cầu ngỗng đặc, lắc nhẹ cho đều, để trong nước đá,
cho tiếp xúc 20 phút, ly tâm 2000 vòng/ phút, trong 20 phút, hút lấy phần nước
trong bên trên cho vào týp nhựa vô trùng, ta được huyết thanh đã xử lý. Trữ huyết
thanh ở nhiệt độ -200C.

+ Thực hiện phản ứng ngưng kết hồng cầu (HA)
Kháng thể kháng virút VNNB gây cản trở sự ngưng kết hồng cầu.
 Thành phần phản ứng:
- Kháng nguyên chuẩn, chủng Nakayama pha loãng 1/10 trong dung dịch
borat.
- Dung dịch borat
- Hồng cầu ngỗng đã pha loãng 0,33% trong dung dịch VAD

19


 Tiến hành phản ứng:
Cho vào tất cả 12 giếng của microplate 0,05ml dung dịch borat, tiếp tục cho
vào giếng thứ nhất 0,05ml kháng nguyên đã pha loãng 1/10, trộn đều, hút 0,05ml
sang giếng thứ 2, trộn đều, hút 0,05ml sang giếng thứ 3,… Tiếp tục như thế đến
giếng thứ 12 thì bỏ đi 0,05ml. Sau đó, cho 0,05ml hồng cầu ngỗng 0,33% vào mỗi
giếng, lắc tấm nhựa để trộn đều kháng nguyên và hồng cầu, để ở nhiệt độ phòng. 1
giờ sau đọc kết quả.
 Đọc kết quả phản ứng HA:
Dương tính 4+: Hồng cầu kết thành một lớp mỏng, che kín cả đáy giếng.
Dương tính 3+: đại đa số hồng cầu kết thành một lớp mỏng, nhưng đáy
giếng còn một ít hồng cầu không ngưng kết tụ lại thành hình nhẫn.
Dương tính 2+: đại đa số hồng cầu tụ lại ở đáy giếng thành cụm, xung quanh
có một ít hồng cầu ngưng kết lấm tấm.
Âm tính: hồng cầu tụ lại thành một cụm tròn nhỏ ở đáy giếng.

Trung

Hiệu giá ngưng kết hồng cầu của kháng nguyên là độ pha loãng cuối cùng
của kháng
còn khả
năngThơ
ngưng@
kết Tài
ở mứcliệu
độ 4+
hay 3+
gọi là
một đơn cứu
vị
tâm
Học nguyên
Liệu ĐH
Cần
học
tậpvà và
nghiên
ngưng kết.
+ Phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI)
 Nguyên lý: virút VNNB có khả năng gây ngưng kết hồng cầu ngỗng ở một
pH nhất định. Kháng thể đặc hiệu của virút VNNB có khả năng làm mất
hiện tượng ngưng kết hồng cầu.
Mục đích: Định tính và định lượng kháng thể kháng virút VNNB trong huyết
thanh chuột.
 Tiến hành

Cho vào mỗi giếng của microplate 25µl dung dịch BABS 0,4%, cho tiếp 25µl
huyết thanh đã xử lý ở giếng thứ nhất, trộn đều, hút 25µl cho sang giếng thứ 2, làm
tiếp tục như vậy cho đến giếng thứ 12 thì bỏ đi 25µl . Tiếp theo cho 25µl kháng
nguyên pha loãng trong dung dịch BABS 0,4% trữ lạnh ở 40C, lắc đều. Sau đó đem
ủ ở 40C trong khoảng 8-18 giờ hoặc ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ.

20


 Đọc kết quả sau 1 giờ
Lổ nào không xảy ra ngưng kết hồng cầu là dương tính
Lổ nào có ngưng kết hồng cầu là âm tính
Hiệu giá ngăn ngưng kết hồng cầu trở ngưng kết hồng cầu của huyết thanh là
độ pha loãng cuối cùng của huyết thanh có khả năng ngăn ngưng kết hồng cầu.
Có thể đọc được:
Dương tính lỗ thứ 1 tương đương với hiệu giá 1/10
Dương tính lỗ thứ 2 tương đương với hiệu gia 1/20
Dương tính với lỗ thứ 3 tương đương với hiệu giá 1/40
……………………………………………………………
Âm tính: hồng cầu ngưng kết ở hiệu giá nhỏ hơn 1/10
Chỉ tiêu theo dõi: đáp ứng kháng thể ở chuột bạch sau khi tiêm virút viêm
não Nhật Bản.

Trung tâm Học Liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
3.2.6 Xử lý số liệu
Công thức tính hiệu giá kháng thể trung bình (GMT):
GMT = Antilog [

 log10 (mshg)

/n]

mshg: mẫu số hiệu giá của mẫu dương tính
n : số mẫu dương tính

Các số liệu về kết quả được tính toán và xử lý bằng Excell và phần mềm Minitab.

21


CHƯƠNG 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 KẾT QUẢ THEO DÕI TỶ LỆ CHẾT Ở CHUỘT THÍ NGHIỆM
Số chuột chết sau khi tiêm sẽ được biểu hiện qua bảng 4.1
Bảng 4.1 Tỷ lệ chuột chết sau khi tiêm đối với chủng CTM-P7 (n =18)
Đường
tiêm

Số chuột
TN
4
(con)
X. não
6
1
Phúc mạc 6
Bắp thịt
6
Tổng

Số chuột chết theo thời gian sau tiêm (ngày)
5
7
8
9
12 17 Tổng Tỷ lệ
(con) (%)
1
1
3 50,00
1
1
2
1
1
6 100,00
1
1
2 33,33

18

11

61,18

n: tổng số chuột thí nghiệm
X.não : đường tiêm xoang não
TN: thí nghiệm

Qua kết
quả ĐH
bảng Cần
4.1 choThơ
thấy chủng
CTM
– P7
chuột
chếtvà
bắtnghiên
đầu từ ngày
Trung tâm Học
Liệu
@ Tài
liệu
học
tập
cứu
thứ 4 đến ngày thứ 17. Sau ngày thứ 17 thì chuột không còn chết nữa.
Ở đường tiêm xoang não thì thời gian chuột chết vào ngày thứ 4 đến ngày thứ
7 và làm 50% chuột thí nghiệm (3/6). Ở đường tiêm phúc mạc chuột chết bắt đầu từ
ngày thứ 7 đến ngày thứ 17 chậm hơn đường tiêm xoang não nhưng tỷ lệ chết cao
nhất 100% (6/6). Đường tiêm bắp thịt có số chuột chết thấp nhất 33,33% (2/6) và
thời gian chết bắt đầu từ ngày thứ 7 đến ngày thứ 9.
Bảng 4.2 Tỷ lệ chuột chết đối với chủng Nakayama (n=18)
Đường
tiêm

Số chuột
TN

5
(con)
X.não
6
1
Phúc mạc
6
Bắp thịt
6
18
Tổng

Số chuột chết theo thời gian sau tiêm (ngày)
6
7
9
10
17
Tổng Tỷ lệ
(con) (%)
1
1
3 50,00
1
1
4
6 100,00
0
0,00
9 50,00

n tổng số chuột thí nghiệm
X.não : đường tiêm xoang não
TN: thí nghiệm

22


Qua kết quả thí nghiệm đối với chủng Nakayama ở bảng 4.2 cho thấy chuột
chết bắt đầu từ ngày thứ 5 đến ngày thứ 17 gần giống với chủng CTM – P7.
Ở đường tiêm xoang não từ ngày thứ 5 đến ngày thứ 7 có 50% chuột chết
(3/6), đường phúc mạc thì tỷ lệ chuột chết cao 6/6 (100%) nhưng thời gian chết bắt
đầu từ ngày thứ 9 đến ngày thứ 17. Ở đường tiêm bắp thịt thì không có chuột chết.
Kết quả thí nghiệm ở bảng 4.1 và bảng 4.2 cho thấy tỷ lệ chuột chết ở chủng
CTM – P7 là 61,18% cao hơn chủng Nakayama là 50%. Tỷ lệ gây chết chuột thí
nghiệm của 2 chủng CTM – P7 và Nakayama khác nhau không có ý nghĩa thống kê
(P = 0,502). Điểm chung của 2 chủng CTM- P7 và Nakayama là đường tiêm phúc
mạc là đường tiêm gây chết nhiều chuột thí nghiệm nhất (100%).
4.2 KẾT QUẢ THEO DÕI TRIỆU CHỨNG TRÊN CHUỘT THÍ NGHIỆM
Tổng số chuột thí nghiệm đối với chủng CTM- P7 là 18 chuột được bố trí đều nhau
ở 3 đường tiêm. Kết quả về tần số xuất hiện triệu chứng trên chuột sẽ được tổng
hợp ở bảng 4.3
Bảng 4.3 Triệu chứng trên chuột bạch đối với chủng CTM– P7 (n = 18)
Tần số xuất hiện triệu chứng theo đường tiêm

Triệu

Trung tâm Họcchứng
Liệu ĐH Cần X.não
Thơ @Phúc

Tàimạc
liệu học
tập Tổng
và nghiên
Bắp thịt
Tỷ lệ (%)cứu
Xù lông, ủ rủ
Cơ thể xanh tái
Co giật toàn thân
Cứng gáy
Chảy hoảng loạn
Chân run
Liệt 2 chân sau
Chuột ẩn dưới trấu
Chảy nước dãi

6
4
3
3
3
2
1
1
1

5
6
6
6

4
3
1
0
1

6
2
2
2
2
2
0
1
0

15/18
12/18
11/18
11/18
9/18
7/18
2/18
2/18
2/18

83,33
66,66
61,11
61,11

50,00
38,88
11,11
11,11
11,11

n tổng số chuột thí nghiệm
X.não : đường tiêm xoang não

Kết quả bảng 4.3 cho thấy chuột biểu hiện rất nhiều triệu chứng khác nhau ở
các đường tiêm khác nhau. Tuy nhiên, triệu chứng ủ rủ, xù lông chiếm tỷ lệ cao
nhất (83,33%), kế đến là triệu chứng cơ thể xanh tái (66,66%), triệu chứng co giật
toàn thân, cứng gáy là triệu chứng thường thấy và chiếm tỷ lệ tương đối cao
(61,11%).

23


Kết quả về tần số xuất hiện triệu chứng trên chuột đối với chủng Nakayama sẽ
được biểu hiện ở bảng 4.4
Bảng 4.4 Triệu chứng trên chuột bạch ở chủng Nakayama (n = 18)
Triệu
chứng
Xù lông, ủ rủ
Co giật toàn thân
Cứng gáy
Cơ thể xanh tái
Chảy hoảng loạn
Chân run
Chảy nước mắt

Liệt 2 chân sau
Chuột ẩn dưới trấu
Chảy nước dãi

Tần số xuất hiện triệu chứng theo đường tiêm
X.não
Phúc mạc Bắp thịt Tổng Tỷ lệ (%)
6
6
6
18/18 100,00
3
6
2
11/18
61,11
3
6
2
11/18
61,11
3
6
0
9/18
50,00
3
2
0
5/18

27,77
3
1
0
4/18
22,22
2
1
0
3/18
16,66
1
1
0
2/18
11,11
1
0
1
2/18
11,11
1
0
0
1/18
5,55

Trung tâm Học
Liệu
ĐHthần

Cần
@lông,
Tàiủliệu
tậpthân,
và nghiên
cứu
Các triệu
chứng
kinhThơ
như: xù
rủ, cohọc
giật toàn
cứng gáy, cơ
thể xanh tái, liệt 2 chân sau, là triệu chứng thường thấy trong thời gian theo dõi
chuột mắc bệnh. Các triệu chứng kém ăn, xù lông, co ro, co giật, liệt 2 chân, cơ thể
xanh tái phù hợp với nghiên cứu của Đỗ Quang Hà (1965) và Yang (2004).
Ngoài các triệu chứng giống như chủng CTM – P7 thì ở chủng Nakayama còn
có xuất hiện các triệu chứng như chảy nước dãi và nước mắt, mà không thấy ở
chủng CTM– P7.

Hình 4.1: Chuột ủ rủ, xù lông, co cụm ăn ít

24