Nghiên cứu chủng vi khuẩn có khả năng kháng vi khuẩn vibrio gây bệnh cho tôm

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
*****

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Đề tài
NGHIÊN CỨU CHỦNG VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG KHÁNG
VI KHUẨN Vibrio GÂY BỆNH CHO TÔM

Người hướng dẫn : TS. Kiều Thị Quỳnh Hoa
Sinh viên thực hiện : Nguyễn Thị Kim Dung
Lớp

: 13-02

Hà Nội - 2017


VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
*****

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI
NGHIÊN CỨU CHỦNG VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG KHÁNG
VI KHUẨN Vibrio GÂY BỆNH CHO TÔM

Người hướng dẫn

: TS. Kiều Thị Quỳnh Hoa

Sinh viên thực hiện : Nguyễn Thị Kim Dung
Lớp

: 13-02

Hà Nội – 2017


LỜI CẢM ƠN

Trước tiên, em xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô giáo Khoa Công nghệ
sinh học, Viện Đại học Mở Hà Nội đã cho em một cơ hội học tập với những
bài giảng hay và nhiệt tình, đã tận tình hướng dẫn và chỉ bảo em trong thời
gian học tập tại trường.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến TS. Kiều Thị Quỳnh Hoa,
Trưởng phòng Vi sinh vật dầu mỏ, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm
Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã luôn tận tình hướng dẫn, dìu dắt, giúp
đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho em trong suốt quá trình thực tập và làm
luận văn tốt nghiệp.
Em cũng xin gửi lời cảm ơn tới tập thể cán bộ Phòng Vi sinh vật dầu
mỏ, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt
Nam đã nhiệt tình giúp đỡ em hoàn thành luận văn này.
Cuối cùng, em xin được bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình, bạn bè và
những người thân đã luôn bên em, luôn ủng hộ, động viên khích lệ em trong
suốt quá trình học tập để em có được kết quả tốt nhất ngày hôm nay.

Hà Nội, ngày 10 tháng 04 năm 2017
Sinh viên
Nguyễn Thị Kim Dung

MỤC LỤC

CÁC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN .............................................. 6
DANH MỤC HÌNH ......................................................................................... 7
DANH MỤC BẢNG ........................................................................................ 9
MỞ ĐẦU ........................................................................................................ 10
PHẦN I : TỔNG QUAN TÀI LIỆU .............................................................. 3
1.1. Tình hình nuôi tôm ở trên thế giới và Việt Nam .................................... 3
1.1.1. Tình hình nuôi tôm trên thế giới ....................................................... 3
1.1.2. Tình hình nuôi tôm ở Việt Nam........................................................ 4
1.2. Các yếu tố ảnh hưởng tới năng suất nuôi tôm ........................................ 6
1.2.1. Mật độ con giống .............................................................................. 6
1.2.2. Các yếu tố vật lý và hóa học ............................................................. 6
1.2.3. Ô nhiễm nguồn nước ........................................................................ 9
1.3. Vi sinh vật gây hại trong nước nuôi tôm ............................................... 9
1.3.1. Vi sinh vật gây hại trực tiếp cho tôm ................................................ 9
 Vi rút gây bệnh cho tôm ................................................................. 13
 Nấm gây bệnh cho tôm ................................................................... 13
 Ký sinh trùng gây bệnh cho tôm .................................................... 13
1.3.2. Tảo và các vi khuẩn gây hại gián tiếp cho tôm .............................. 13
1.4. Tình hình nghiên cứu vi khuẩn kháng Vibrio gây bệnh cho nuôi tôm . 14
1.4.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ................................................. 14
1.4.2. Tình hình nghiên cứu vi khuẩn kháng Vibrio gây bệnh cho tôm ở
Việt Nam ................................................................................................... 15
PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................... 16
2.1. VẬT LIỆU ............................................................................................ 16
2.1.1. Chủng vi khuẩn nghiên cứu ............................................................ 16
2.1.2. Hóa chất .......................................................................................... 16

2.1.3. Thiết bị và dụng cụ ......................................................................... 16


2.2. Phương pháp nghiên cứu ...................................................................... 17
2.2.1. Môi trường nghiên cứu ................................................................... 17
2.2.2. Phương pháp phân lập vi khuẩn có khả năng kháng Vibrio ........... 17
2.2.3. Phương pháp xác định hình thái khuẩn lạc, hình thái tế bào, xác
định Gram và sự hình thành bào tử của vi khuẩn nghiên cứu .................. 18
2.2.4. Phương pháp bảo quản giống vi khuẩn .......................................... 19
2.2.5. Xác định sự phát triển của vi khuẩn theo mật độ quang................. 19
2.2.6. Phương pháp đánh giá khả năng kháng Vibrio của vi khuẩn lựa
chọn ........................................................................................................... 19
2.2.7. Phương pháp phân loại vi khuẩn kháng Vibrio bằng phân tích trình
tự gen 16S rRNA ...................................................................................... 20
2.2.8. Phương pháp đánh giá các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng kháng
Vibrio của vi khuẩn lựa chọn .................................................................... 20
PHẦN 3: KẾT QUẢ ...................................................................................... 22
3.1. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào của vi khuẩn kháng Vibrio ... 22
3.2. Lựa chọn các chủng vi khuẩn có khả năng kháng Vibrio ..................... 23
3.2. Phân loại chủng vi khuẩn nghiên cứu bằng phân tích trinh tự gen 16S
rRNA ............................................................................................................ 26
3.3. Động thái sinh trưởng và khả năng kháng Vibrio của chủng vi khuẩn B.
amyloliquefaciens AH-VT3-6 ...................................................................... 26
3.4. Ảnh hưởng của các yếu tố đến khả năng kháng V. parahaemolyticus
của chủng vi khuẩn B. amyloliquefaciens AH-VT3-6 . ............................... 29
3.4.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ .................................................................. 29
3.4.2. Ảnh hưởng của pH .......................................................................... 30
3.4.3. Ảnh hưởng của NaCl ...................................................................... 32
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 36

CÁC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN
FAO

Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc

GOAL

Liên minh Nuôi trồng thủy sản toàn cầu

EU

Liên minh các nước Châu Âu

BOD

Nhu cầu oxy sinh học

HKTS

Hiếu khí tổng số

VSV

Vi sinh vật


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Sản lượng tôm của Việt Nam (2012-2014) ...................................... 4
Hình 1.2. Hình thái tế bào vi khuẩn Vibrio spp. dưới kính hiển vi điện tử quét

(SEM) ............................................................................................................. 10
Hình 1.3. Biểu hiện của tôm bị bệnh EMS .................................................... 11
Hình 3.1: Hình thái khuẩn lạc của chủng vi khuẩn AH-VT3-6 trên môi
trường HKTS .................................................................................................. 25
Hình 3.2: Hình thái tế bào của chủng AH-VT3-6 dưới kính hiển vi quang học
Olympus (Nhật) (1000 x) ............................................................................... 25
Hình 3.3: Chủng AH-VT3-6 sinh trưởng và phát triển sau khi sốc nhiệt ..... 26
Hình 3.4: Sự sinh trưởng và khả năng kháng V. parahaemolyticus của chủng
B. amyloliquefaciens AH-VT3-6 ................................................................... 27
Hình 3.5: Khả năng đối kháng với V. parahaemolyticus của chủng
B. amyloliquefaciens AH-VT3-6 trên môi trường thạch HKTS .................... 27
Hình 3.6: Sự sinh trưởng và khả năng kháng V. vulnificus của chủng
B. amyloliquefaciens AH-VT3-6 ................................................................... 28
Hình 3.7: Khả năng đối kháng với V. vulnificus của chủng
B. amyloliquefaciens AH-VT3-6 trên môi trường thạch HKTS .................... 28
Hình 3.8: Sự sinh trưởng và khả năng kháng V. parahaemolyticus của chủng
B. amyloliquefaciens AH-VT3-6 ở các nhiệt độ khác nhau .......................... 29
Hình 3.9: Ảnh hưởng của nhiệt độ tới khả năng sinh trưởng và kháng
V. parahaemolyticus của chủng B. amyloliquefaciens AH-VT3-6 ................ 30
Hình 3.10: Sự sinh trưởng và khả năng kháng V. parahaemolyticus của chủng
B. amyloliquefaciens AH-VT3-6 ở pH khác nhau ......................................... 31
Hình 3.11: Ảnh hưởng của pH tới sinh trưởng và khả năng kháng
V. parahaemolyticus của chủng B. amyloliquefaciens AH-VT3-6 ................ 31
Hình 3.12: Sự sinh trưởng và khả năng kháng V. parahaemolyticus của chủng
AH-VT3-6 ở các nồng độ NaCl khác nhau .................................................... 33
Hình 3.13: Ảnh hưởng của nồng độ NaCl tới khả năng sinh trưởng và kháng
V. parahaemolyticus của chủng B. amyloliquefaciens AH-VT3-6 ................ 33


DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1: Các chủng vi sinh vật thu được từ mẫu bùn và nước tại
Thanh Hóa............................................................................22
Bảng 3.2. Các chủng vi sinh vật có khả năng kháng Vibrio.......24


MỞ ĐẦU
Ngành thủy sản nói chung và ngành nuôi tôm nói riêng có vị trí đặc biệt
quan trọng trong chiến lược phát triển kinh tế - xã hội ở nước ta. Trong những
năm qua sản xuất thủy sản đã đạt được những thành tựu đáng kể góp phần
tăng trưởng GDP của cả nước. Năm 2016, tổng giá trị kim ngạch xuất khẩu
tính riêng ngành tôm là 3,1 tỉ USD tăng khoảng 4% so với năm 2015, đưa
tổng giá trị xuất khẩu thủy sản cả nước cán đích trên 7 tỉ USD. Tuy nhiên,
ngành nuôi tôm hiện đang gặp phải những vấn đề bất cập như: ô nhiễm nước
nuôi tôm do nước thải dư thừa thức ăn, chất hữu cơ dẫn đến xuất hiện vi sinh
vật gây bệnh làm tôm chết hàng loạt. Các vi sinh vật (VSV) chủ yếu gây bệnh
cho tôm phải kể đến là vi rút, vi khuẩn, nguyên sinh động vật, các ký sinh
trùng... Trong đó, vi khuẩn Vibrio là một trong số VSV gây bệnh nguy hiểm
nhất. Hầu như tất cả các loài động vật thủy sản nuôi nước lợ và mặn đều có
thể bị nhiễm và chịu tác hại của bệnh do vi khuẩn Vibrio gây ra. Nhóm vi
khuẩn này là yếu tố kìm hãm sự phát triển và mở rộng sản xuất trong nuôi
trồng thủy sản nói chung và nuôi tôm nói riêng. Chúng gây ra các bệnh nguy
hiểm như bệnh phát sáng trên ấu trùng tôm, bệnh nhiễm khuẩn và hoại tử gan
tụy ở tôm.
Vì vậy, việc nghiên cứu vi khuẩn kháng vi khuẩn gây bệnh cho tôm nói
chung và kháng Vibrio nói riêng giúp nâng cao sản lượng tôm là cần thiết.
Xuất phát từ nhu cầu tìm kiếm các chủng VSV hữu ích ức chế sự phát triển
của vi khuẩn gây bệnh cho tôm, đảm bảo cân bằng môi trường sinh thái giúp
nâng cao sản lượng tôm thương phẩm, đề tài luận văn: “Nghiên cứu chủng vi
khuẩn có khả năng kháng vi khuẩn Vibrio gây bệnh cho tôm’’ được tiến
hành. Mục tiêu của đề tài nhằm lựa chọn chủng vi khuẩn kháng Vibrio gây

bệnh cho tôm nhằm giải quyết những khó khăn của ngành nuôi trồng thủy
sản nói chung và ngành nuôi tôm công nghiệp nói riêng.
 Mục tiêu nghiên cứu:
- Lựa chọn được chủng vi khuẩn kháng Vibrio gây bệnh cho tôm
1


- Xác định được các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng kháng Vibrio của chủng
vi khuẩn lựa chọn.
- Đánh giá được khả năng kháng Vibrio của chủng vi khuẩn lựa chọn ở các
điều kiện phù hợp.
 Nội dung nghiên cứu:
- Phân lập và tuyển chọn một số chủng vi khuẩn có khả năng kháng vi khuẩn
gây bệnh Vibrio.
- Phân loại chủng vi khuẩng kháng vi khuẩn Vibrio lựa chọn.
- Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng kháng Vibrio của chủng vi
khuẩn lựa chọn.
- Đánh giá khả năng kháng Vibrio của chủng vi khuẩn lựa chọn với các điều
kiện nuôi cấy phù hợp.

2


PHẦN I : TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tình hình nuôi tôm ở trên thế giới và Việt Nam
1.1.1. Tình hình nuôi tôm trên thế giới
Ngành nuôi tôm thương mại trên thế giới bắt đầu vào những năm 1970
và tập trung chủ yếu ở các nước Châu Á và châu Mỹ La Tinh như Trung
Quốc, Thái Lan, Indonesia, Ấn Độ, Việt Nam, Brazil, Ecuador và Mexico.
Sản lượng tôm tăng trưởng mạnh mẽ nhằm đáp ứng nhu cầu tiêu thụ lớn tại

thị trường các nước như Hoa Kỳ, Nhật Bản và Tây Âu. Sản lượng tôm thế
giới dự kiến tăng 7,7%/năm trong giai đoạn từ năm 2013 đến năm 2017 và đạt
trên 4,5 triệu tấn. Tuy nhiên, tại hội thảo thị trường thủy sản toàn cầu ở Miami
- Florida đã có những dự đoán không mấy lạc quan về sản lượng tôm năm
2016, sản lượng chỉ đứng ở mức khoảng 3,5 triệu tấn, do dịch bệnh và thời
tiết đã làm ảnh hưởng đến việc tăng trưởng tôm ở Ấn Độ và Indonesia. Hiện
nay, khoảng 75% tổng sản lượng tôm được nuôi ở Châu Á đặc biệt là ở Trung
Quốc và Thái Lan, 25% tổng sản lượng tôm còn lại được nuôi ở các nước
châu Mỹ La tinh như Brazil, Ecuador và Mexico [24].
Châu Á là lục địa có sản lượng và tỉ lệ nuôi tôm lớn nhất. Trước năm
2003, các nước có sản lượng tôm nuôi lớn nhất thế giới (Thái Lan, Trung
Quốc, Inđônêxia, Ấn Độ) chủ yếu nuôi tôm sú hay tôm bản địa. Nhưng sau
đó, tôm thẻ chân trắng đã được tập trung phát triển mạnh. Theo Liên minh
Nuôi trồng thủy sản toàn cầu (GOAL), nếu như năm 2003 sản lượng tôm thẻ
chân trắng là 1 triệu tấn thì đến năm 2012 sản lượng tôm thẻ chân trắng tăng
lên là 4 triệu tấn tương đương 19,4 tỷ USD [24].
Theo số liệu của Tổ chức Nông lương Liên hiệp quốc (FAO), Sản lượng
tôm nuôi thế giới năm 2016 giảm so với năm 2015 vì giá tôm thế giới giảm và
dịch bệnh xảy ra ở một số nước sản xuất chính (Trung Quốc, Ấn Độ, Thái
Lan, Indonesia) [23].
3


1.1.2. Tình hình nuôi tôm ở Việt Nam
Việt Nam nằm bên bờ Tây của Biển Đông, là một biển lớn thuộc Thái
Bình Dương, bờ biển dài 3260 km, vùng nội thuỷ và lãnh hải rộng 226.000
km2, vùng biển đặc quyền kinh tế rộng hơn 1 triệu km2 với hơn 4.000 hòn
đảo, tạo nên 12 vịnh, đầm phá với tổng diện tích 1.160 km2 được che chắn tốt
dễ trú đậu tàu thuyền. Nước ta với hệ thống sông ngòi dày đặc và có đường
biển dài rất thuận lợi phát triển hoạt động khai thác và nuôi trồng thủy sản và

trong đó không thể thiếu nuôi tôm ven biển và nội địa [9].
Theo số liệu của Tổng cục thủy sản (Hình 1.1), năm 2014 sản lượng tôm
nước lợ ước đạt 660 nghìn tấn, tăng 22% so với năm 2013, mức tăng cao nhất
trong nhiều năm trở lại đây. Đặc biệt, sản xuất tôm chân trắng tăng trưởng
mạnh cả về diện tích và sản lượng. Trong khi đó, diện tích và sản lượng nuôi
tôm sú được duy trì ổn định so với năm trước. Giá trị xuất khẩu mặt hàng tôm
tăng 26,9%, chiếm tỷ trọng 50,8% tổng giá trị xuất khẩu thủy sản. Trong đó,
xuất khẩu tôm chân trắng tăng 46,3% và tôm sú tăng 4,2% với giá trị tương
ứng đạt 2,31 tỷ USD và 1,39 tỷ USD.

Hình 1.1. Sản lượng tôm của Việt Nam (2012-2014)

4


Năm 2016, mặc dù tình hình hạn mặn và dịch bệnh làm ảnh hưởng nhiều
tới nuôi tôm nước lợ trong 9 tháng đầu năm. Tuy nhiên, mưa nhiều trong
những tháng cuối năm, độ mặn giảm, cùng với sự chỉ đạo sát sao của các cấp
trong việc kiểm soát dịch bệnh nên sản lượng thu hoạch tăng vào những tháng
cuối năm. Sản lượng tôm nước lợ cả nước ước tính đạt 650 nghìn tấn (tăng
3,2%).Tại các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long, diện tích tôm sú ước đạt
569.500 ha (tăng 1,8%), sản lượng ước đạt 251 nghìn tấn (tăng 2,1%). Diện
tích nuôi tôm thẻ chân trắng ước đạt 64.440 ha, tăng 11,5% so với năm 2015,
sản lượng ước tính đạt 253.1 nghìn tấn (tăng 15,6%) [3].
Theo số liệu của Tổng cục Hải quan, tính đến tháng 10/2016, kim ngạch
xuất khẩu tôm vào thị trường Mỹ của Việt Nam đạt 604,4 triệu USD, chiếm tỷ
trọng 23,4% tổng kim ngạch xuất khẩu tôm trong 10 tháng đầu năm. Mỹ cũng
là thị trường nhập khẩu tôm chân trắng lớn nhất của Việt Nam chiếm tỷ trọng
75% tổng nhập khẩu tôm từ Việt Nam; tôm sú chiếm 22% và tôm biển 3%
trong 9 tháng đầu năm nay [22].

Trong tháng 11/2016, xuất khẩu tôm sang EU đạt 50,5 triệu USD; tăng
14% so với cùng kỳ năm ngoái. Lũy kế tới tháng 11 năm nay, xuất khẩu sang
thị trường này đạt trên 548 triệu USD; tăng 7,3% so với cùng kỳ năm 2015.
EU vẫn là thị trường tiêu thụ tôm lớn thứ 2 của Việt Nam sau Mỹ, chiếm tỷ
trọng 19% trong tổng xuất khẩu tôm của Việt Nam. EU ưa chuộng các sản
phẩm có giá hợp lý như tôm thẻ chân trắng. Trong 9 tháng đầu năm, tôm thẻ
chân trắng chiếm 72% tổng giá trị tôm Việt Nam xuất khẩu sang EU, tôm sú
chiếm 18% và tôm biển chiếm 10% [22].
Năm 2016 còn là năm đánh dấu thắng lợi của ngành tôm Việt Nam về
mặt mở rộng thị trường xuất khẩu. Cùng với đó, các doanh nghiệp tôm còn
đẩy mạnh chế biến các sản phẩm giá trị gia tăng để xuất khẩu và cung ứng thị
trường nội địa. Sự đa dạng này sẽ tạo nên diện mạo mới cho ngành tôm trong
thời gian tới.
5


1.2. Các yếu tố ảnh hưởng tới năng suất nuôi tôm
1.2.1. Mật độ con giống
Mật độ con giống là số lượng tôm hoặc trọng lượng tôm thả trên 1 đơn vị
diện tích mặt nước (số con giống/1m2). Để xác định mật độ thả thích hợp cho
diện tích nuôi và từng phương thức nuôi, các yếu tố cần quan tâm đến là diện
tích mặt nước, nguồn thức ăn, năng lực người nuôi…cho từng loại tôm khác
nhau vì mỗi loại tôm đều có yêu cầu khác nhau về kích thước lẫn khả năng
sống phù hợp [6].
Mật độ nuôi thích hợp là tận dụng được nguồn thức ăn tự nhiên, diện tích
mặt nước, nhân công, nhưng hạn chế được ô nhiễm môi trường để tôm khoẻ
mạnh, ít bị bệnh hoặc khi bị bệnh thì mức độ lây bệnh thấp. Mật độ nuôi phải
phù hợp với mô hình nuôi, loại thức ăn sử dụng, điều kiện ao nuôi, trình độ
chuyên môn quản lý, thiết bị phụ trợ [4].
Mật độ nuôi tôm dày sẽ khiến tôm phải cạnh tranh cao về nguồn thức ăn

cũng như chỗ cư trú trong ao hoặc nơi nuôi. Điều này sẽ ảnh hưởng tới quá
trình sinh trưởng và phát triển của tôm làm tôm chậm lớn. Vì vậy, nếu lựa
chọn được mật độ tôm nuôi vừa phải, đồng đều, nguồn thức ăn cung cấp đủ
cho tôm thì năng suất sẽ đạt yêu cầu trong thời gian nuôi.
Ở Việt Nam có nhiều hình thức nuôi tôm khác nhau như: nuôi quảng
canh cải tiến, nuôi thâm canh, nuôi bán thâm canh, nuôi sinh thái … mỗi
phương thức nuôi tôm khác nhau sẽ yêu cầu mật độ tôm khác nhau.
1.2.2. Các yếu tố vật lý và hóa học


Nhiệt độ của nước
Tôm thuộc nhóm động vật biến nhiệt, nhiệt độ cơ thể chúng chủ yếu phụ

thuộc vào nhiệt độ của môi trường nước ao nuôi. Nhiệt độ quá cao hoặc quá
thấp đều không thuận lợi cho hoạt động của tôm. Nếu nhiệt độ môi trường
nước nuôi tôm vượt quá giới hạn cho phép sẽ dẫn tới việc tôm chết hàng loạt.
6


Mỗi loại tôm sẽ có một ngưỡng nhiệt độ thích hợp khác nhau. Nhiệt độ thích
hợp nhất đối với tôm sú nuôi thương phẩm là 28o-32oC [1]. Trong khi đó,
nhiệt độ thích hợp với tôm thẻ chân trắng là 25-30oC.
Trong quá trình nuôi dưỡng và vận chuyển tôm cần lưu ý sự chênh lệch
nhiệt độ và nhất là sự thay đổi nhiệt độ đột ngột. Nếu nhiệt độ chênh
5oC/ngày có thể khiến tôm sốc và chết. Vì vây, tốt nhất không để nhiệt độ
chênh quá 3oC và biên độ dao động nhiệt trong ngày không quá 3oC.
 Độ mặn của nước
Các loài tôm khác nhau thích ứng với độ mặn không giống nhau. Tôm sú
thích hợp với độ mặn là 5-31 o/oo, tôm chân trắng thích hợp với độ mặn là 1525o/oo [1]. Khi độ mặn của nước thấp hơn 1 o/oo tôm sẽ mất thăng bằng trong
khoảng 1 giờ.

 Độ đục của nước
Độ đục của nước có thể là kết quả từ nhiều nguyên nhân khác nhau: do
nguồn nước, nước rửa trôi, bụi phóng xạ từ không khí, do chuyển động của
dòng nước, sự phát triển của tảo, do thức ăn dư thừa hay do chất thải của
tôm… Độ đục sẽ khác nhau phụ thuộc vào vị trí ao, nguồn cấp nước, đối
tượng nuôi trong ao khác nhau.
Độ đục làm giảm ánh sáng mặt trời xâm nhập vào nước qua đó ức chế sự
tăng trưởng của thực vật phù du, giảm sản xuất oxy trong ao. Nếu nước quá
đục có thể gây ra chênh lệch nhiệt độ và phân tầng oxy hòa tan trong ao. Nó
cũng có thể gây tắc nghẽn mang tôm hoặc gây chấn thương trực tiếp đến các
mô của tôm. Ngược lại, nếu nước quá trong chứng tỏ nghèo dinh dưỡng làm
giảm năng suất trong ao nuôi tôm.
 Hàm lượng oxy hòa tan
Hàm lượng oxy hòa tan trong nước rất cần thiết cho sự sinh trưởng và
phát triển của tôm. Nhu cầu oxy phụ thuộc vào từng loài, từng giai đoạn phát
triển, trạng thái sinh lý và nhiệt độ. Khi nhiệt độ tăng thì nhu cầu oxy của tôm
cũng tăng lên. Nhu cầu oxy hòa tan tối thiểu với tôm là 5 mg/l. Trường hợp
7


oxy quá thấp, dưới mức giới hạn cho phép tôm sẽ bị sốc ảnh hưởng xấu sự
tăng trưởng và phát dục của chúng. Giới hạn gây chết của hàm lượng oxy hòa
tan đối với giống tôm sú và tôm thẻ chân trắng là 1,17-1,21 mg/l [1].
 Độ pH của nước
Các loài tôm khác nhau có thể sống được trong môi trường nước với dải
pH không giống nhau. Phần lớn pH phù hợp cho tôm sinh trưởng và phát
triển là 6,5-9,0. Ngoài giá trị pH trên, tôm chậm phát triển, còi cọc. pH dưới
4,0 hoặc trên 11 là giới hạn gây chết cho tôm.
Trong ngày pH biến thiên theo ánh sáng và cường độ nắng của mặt trời
do liên quan tới sự quang hợp của thực vật trong nước. Trong ao nuôi tôm pH

tốt nhất từ 7,5-8,5 và không biến thiên quá 0,5 [1].
 Nồng độ H₂S trong nước
H₂S là hợp chất sinh ra do quá trình phân hủy các chất hữu cơ chứa lưu
huỳnh trong lớp bùn ở điều kiện yếm khí. Khí H₂S ảnh hưởng tới sức khỏe
của tôm, phụ thuộc vào mức độ ô nhiễm trong môi trường nuôi tôm ở lớp bùn
đáy và pH của nước. Nếu pH thấp thì H₂S sẽ rất độc, đây là một trong những
nguyên nhân gây cho tôm nuôi bị sốc, dẫn đến tôm yếu và chết. Nồng độ H₂S
trong ao cho phép là 0,02 mg/l [1].
 Nồng độ Ammoniac (NH₃)
Ammoniac (NH₃) được tạo thành trong môi trường nước nuôi tôm do
các chất thải của nhà máy hóa chất, nước thải khu đô thị, dân cư gần địa bàn
nuôi tôm cũng như sự phân giải các chất hữu cơ trong nước và sản phẩm trao
đổi chất của vi sinh vật nói chung, tôm nuôi trong ao nói riêng.
Sự tồn tại NH₃ trong nước nuôi tôm phụ thuộc rất nhiều vào nhiệt độ,
pH, độ mặn của nước nuôi. Nước càng mang tính axit (độ pH thấp) NH₃ có
xu thế chuyển hóa thành NH₄+ sẽ ít độc, môi trường càng kiềm NH3 càng
bền vững và gây độc cho tôm. Nồng độ NH₃ thấp ở 0,09 mg/l đã gây cho tôm
càng xanh chậm phát triển và nồng độ 0,45 mg/l sẽ là giảm tốc độ sinh trưởng

8


của tôm he đi 50%. Nồng độ NH₃ giới hạn an toàn trong ao nuôi là 0,13mg/l
[1].
1.2.3. Ô nhiễm nguồn nước
Nước nuôi tôm đảm bảo chất lượng nước sạch, không bị ô nhiễm, không
chứa các loại hóa chất, vi khuẩn, vi trùng gây bệnh sẽ giúp cho tôm có thể
tăng trưởng và phát triển nhanh, tỉ lệ tôm nuôi bị chết, bị nhiễm bệnh thấp từ
đó cho năng suất thu hoạch cao trong cùng một diện tích ao nuôi.
Ngược lại, chất lượng nguồn nước không đảm bảo, bị ô nhiễm, chứa

nhiều hóa chất và các loại vi sinh vật gây bệnh cao sẽ ngăn cản quá trình tăng
trưởng và phát triển của tôm nuôi, tôm bị còi, chậm lớn, tỉ lệ tôm mắc bệnh
cao qua đó ảnh hưởng tới năng suất thu hoạch của đơn vị chăn nuôi.
1.3. Vi sinh vật gây hại trong nước nuôi tôm
Trong môi trường nuôi tôm tồn tại rất nhiều vi sinh vật có lợi cũng như có
hại cho tôm nuôi. Vi sinh vật gây bệnh cho tôm bao gồm vi khuẩn, virut, ,
nguyên sinh động vật….
1.3.1. Vi sinh vật gây hại trực tiếp cho tôm
 Vi khuẩn gây bệnh cho tôm
 Vi khuẩn Vibrio
Vibrio là nhóm vi khuẩn gây bệnh trực tiếp cho tôm. Vibrio thuộc họ
Vibrionaceae,

bộ

Vibrionales,

lớp

Gammaproteobacteria,

ngành

Proteobacteria. Đặc điểm chung của nhóm vi khuẩn này là gram (-), hình que
thẳng hoặc hơi uốn cong, kích thước 0,3-0,5 x 1,4-2,6 μm, không hình thành
bào tử và chuyển động nhờ một tiên mao hoặc nhiều tiên mao mảnh. Vibrio
spp. không chỉ gây bệnh cho tôm mà còn gây bệnh cho cá, giáp xác, nhuyễn
thể...

9

Hình 1.2. Hình thái tế bào vi khuẩn Vibrio spp. dưới kính hiển vi điện tử quét
(SEM)
Vi khuẩn Vibrio gây bệnh phát sáng, đỏ dọc thân, ăn mòn vỏ kitin trên
tôm. Tôm bị nhiễm bệnh có hiện tượng biến đổi màu đỏ hay màu xanh, và ở
trạng thái không bình thường như: nổi lên mặt ao, dạt bờ, kéo đàn bơi lòng
vòng. Ngoài ra còn có trạng thái hôn mê, lờ đờ, kém ăn hoặc bỏ ăn, xuất hiện
các vết thương hoại tử, ăn mòn trên vỏ và các phần phụ.
 Một số bệnh của tôm do vi khuẩn Vibio gây ra
Một số ví dụ điển hình về bệnh do Vibrio gây ra như V. anguillarum và
V. vulnificus gây bệnh nhiễm khuẩn máu cá trình, V. salmonicida gây bệnh ở
vùng nước lạnh, V. parahaemolyticus gây bệnh phát sáng ở ấu trùng tôm sú,
V. alginolyticus gây bệnh đỏ dọc thân ấu trùng tôm, V. parahaemolyticus, V.
harvey, V. vulnificus, V. anguillarum... gây bệnh đỏ thân ở tôm sú thịt, ăn
mòn vỏ ở giáp xác.
 Bệnh hoại tử gan tụy cấp tính ( EMS/AHPND )
Nguyên nhân: Do chủng vi khuẩn Vibrio parhaemolyticus có độc lực cao
gây nên. Khi mắc bệnh tôm sẽ bị teo gan tụy, gan tụy có màu nhợt nhạt đến
trắng, ruột tôm không có thức ăn hoặc đứt đoạn, tôm thường mềm vỏ, tỷ lệ
tôm chết cao. Tôm sú mắc bệnh EMS (Early Mortality Syndrome) thường có
màu đậm, chậm lớn (tương tự như bệnh tôm còi MBV- Monodon Baculovirus
) các biểu hiện trên gan tụy tương tự như trên tôm thẻ chân trắng như màu sắc
nhợt nhạt, gan tụy teo, ruột không có thức ăn.
10


Hình 1.3. Biểu hiện của tôm bị bệnh EMS
 Bệnh phát sáng ở tôm
Bệnh phát sáng trên tôm do nhóm vi khuẩn Vibrio gây nên, trong đó

nguy hiểm nhất là Vibrio harveyi. Bệnh phát sáng xuất hiện quanh năm trên
các loài tôm sú, thẻ chân trắng, càng xanh...
Bệnh phát sáng có thể xảy ra trong tất cả các giai đoạn ương nuôi từ
trứng đến tôm trưởng thành hoặc có thể lây nhiễm từ môi trường nước khi ao
bị ô nhiễm. Trong sản xuất giống, mầm bệnh được lây lan chủ yếu bằng
đường ruột từ tôm mẹ sang ấu trùng trong giai đoạn sinh sản. Bệnh phát sáng
phát triển mạnh trong môi trường nước giàu dinh dưỡng, nhiều chất hữu cơ ở
độ mặn cao, thiếu oxy hòa tan, lây lan nhanh trong mùa nóng. Tôm nhiễm
bệnh, cơ thể sẽ phát sáng, yếu, bơi không định hướng, tấp mé bờ, phản ứng
chậm chạp, bỏ ăn, chết rải rác. Mang và thân tôm có màu sẫm, bẩn, thịt đục
màu, mất chức năng tiêu hóa, gan viêm và teo nhỏ. Tôm ấu trùng nhiễm bệnh
có màu trắng đục, nhiễm bệnh phát sáng nặng thì lắng dưới đáy bể ương và
chết hàng loạt. Ở Thái Lan (1996), bệnh phát sáng đã gây chết hàng loạt tôm
ở nhiều trang trại người dân buộc phải ngừng nuôi thả tôm [13].

11


 Bệnh đỏ dọc thân
Tác nhân chính gây bệnh đỏ dọc thân ở tôm thẻ chân trắng nuôi thương
phẩm là WSSV (White spot syndrome virus) cùng với các tác nhân gây bội
nhiễm là các loài vi khuẩn Stapphylococus spl, Vibrio vulnificus, Vibrio.
anginolyticus…
Tôm bị hội chứng đỏ thân có biểu hiện bên ngoài rất rõ: tôm ăn yếu, tấp
bờ, cơ thể tôm bệnh chuyển sang màu hồng hoặc đỏ bầm. Có các đốm trắng
với đường kính 0,5 - 2 mm. Khi giải phẫu thấy gan tụy một số con có màu
trắng xám. Khi nhiễm bệnh tôm chết rải rác hoặc hàng loạt. Thậm chí có thể
chết 100% sau 4 - 8 ngày cảm nhiễm bệnh. Đây được coi là bệnh nghiêm
trọng trong ngành nuôi tôm. Trong điều kiện môi trường có nhiều vi khuẩn
gây bệnh, tôm nhanh chóng bị bội nhiễm, bùng phát hội chứng chết đỏ.

 Vi khuẩn Aeromonas
Aeromonas là vi khuẩn Gram (-), dạng hình que ngắn, hai đầu tròn, sống
trong điều kiện yếm khí tuỳ tiện, thường gây bệnh đốm nâu, đen mang, đốm
đen trên vỏ cho tôm càng xanh.
Vi khuẩn Aeromonas chia thành hai nhóm chính:
+ Nhóm 1: Aeromonas không di động (A. salmonicida) thường gây bệnh ở
nước lạnh.
+ Nhóm 2: Là các loài Aeromonas di động, bao gồm A. hydrophyla, A.
caviae và A. sobria. Đặc tính chung của ba loài vi khuẩn này là di động nhờ
có 1 tiên mao.
 Vi khuẩn Pesudomonas
Pseudomonas là nhóm vi khuẩn thuộc họ Pesudomonadaceae, Gram (-),
dạng hình que, không sinh bào tử, chuyển động bằng một hoặc nhiều tiên
mao. Chúng phân bố khắp trong môi trường đất và nước.Vi khẩn này là
nguyên nhân gây bệnh đốm nâu ở tôm càng xanh cùng với Aeromonas [3].


Vi khuẩn Escherichia coli (E.coli)

12


Tại Brazil, Teophilo và cộng sự (năm 2002) đã phân lập được các chủng
E.coli gây bệnh cho tôm [15]. Năm 2014, tại Nevada (Mỹ) một báo cáo đã
chỉ ra rằng độc tố trong E.coli là nguyên nhân gây bệnh bơi bướm ở tôm [18].
Tại Ấn độ, (năm 2010) bệnh đốm đỏ do E. coli gây ra trên tôm lần đầu tiên
được báo cáo bởi Surendraraj và cộng sự . Bệnh này đã gây thiệt hại đáng kể
về chất lượng tôm xuất khẩu ở nước này [16].
 Vi rút gây bệnh cho tôm
Vi rút Taura syndrome (TSV) gây bệnh cho tôm thẻ chân trắng và tôm

sú. Các dấu hiệu nhận biết bệnh do vi rút TSV gây ra là: Tôm thẻ chân trắng
và tôm sú nhiễm hội chứng Taura do vi rút TSV gây ra có màu đỏ nhạt, mềm
vỏ và ruột rỗng. Hội chứng Taura làm tôm chết với tỷ lệ cao (thường tỷ lệ gây
chết từ 40% đến 90%) và lây lan nhanh
 Nấm gây bệnh cho tôm
Một số loài nấm thuộc chi Fusarium như Fusarium solani, F. moniliforme
và F. oxysporum là tác nhân gây bệnh đen mang ở tôm he P. japonicus.,tôm sú
P. monodon và tôm hùm Homarus americanus.
Nấm Acremonium gây bệnh đen mang ở tôm tít Oratosquilla oratoria và
tôm he P. japonicus [8].
 Ký sinh trùng gây bệnh cho tôm
Ký sinh trùng Microsporidian gây bệnh hoại tử ở tôm. Sau 30 ngày
nhiễm ký sinh trùng Microsporidian, ống gan tụy của những con tôm bị bệnh
nhiễm giãn rộng và bắt đầu hoại tử [8].
1.3.2. Tảo và các vi khuẩn gây hại gián tiếp cho tôm
 Tảo
Tảo phát triển rất phổ biến trong các ao, hồ…Ngoài những mặt lợi thì tảo
cũng có tác hại rất lớn tới các sinh vật thủy sinh nói chung và tôm nói riêng.
Hiện tượng tảo nở hoa ảnh hưởng trực tiếp tới chất lượng nước như làm
cho pH thay đổi, oxy hòa tan dao động lớn theo chu kỳ ngày - đêm, tăng hàm
13


lượng ammoniac, cạnh tranh dinh dưỡng. Khi tảo tàn dễ gây hiện tượng thiếu
oxy cục bộ trong ao nuôi, tăng hàm hàm lượng các khí độc gây chết trực tiếp
đối với tôm. Trong ao, tảo nở hoa có thể gây bệnh đốm nâu hoặc gây thiếu
oxy cục bộ vào ban đêm từ đó dẫn đến sự thiếu oxy trong máu làm tôm chết
hàng loạt.


Vi khuẩn khử sulfate
Ở điều kiện yếm khí, vi khuẩn khử sulfate oxy hóa các chất hữu cơ lắng

tụ trong các ao nuôi tôm tạo thành hydrogen sulfide (H₂S). H₂S tạo ra rất độc
đối với tôm bởi vì nó cản trở quá trình hô hấp của tôm. Ái lực của H₂S mạnh
hơn O₂ do vậy được ưu tiên gắn vào hemoglobin ngăn cản việc vận chuyển
oxy trong máu dẫn tới tôm thiếu oxy vàchết tôm. Các chủng vi khuẩn khử
sulfate điển hình được phân lập từ các ao nuôi tôm là: Desulfovibrio,
Desulfotomaculum, Desunlfobacter, Desulfonema [1].
 Vi khuẩn sinh methan (CH4)
Thành phần lớp bùn trong ao nuôi tôm chủ yếu là các chất hữu cơ như
protein, lipit, axit béo, các hoocmon, cacbonhydrate, chất khoáng và vitamin,
vỏ tôm lột xác… Trong lớp bùn đó vi khuẩn sinh methan có khả năng phân
hủy các hợp chất trên tạo thành khí metan (CH4). Khí methan rất độc đối với
tôm. Khi hàm lượng khí metan vượt quá mức cho phép sẽ làm cho tôm bị sốc,
tê liệt và gây chết tôm.
1.4. Tình hình nghiên cứu vi khuẩn kháng Vibrio gây bệnh cho nuôi tôm
1.4.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Garriques và Arevalo (1995) đã sử dụng V. alginolyticus để tăng khả
năng sống sót và sự tăng trưởng của ấu trùng tôm P. vannamei như là một vi
khuẩn probiotic để loại trừ việc sử dụng kháng sinh trong hệ thống ao nuôi ấu
trùng tôm mật độ cao [18].

14


Jiravanichpaisal và Chuaychuwong (1997) đã thông báo việc sử dụng
Lactobacillus như là vi khuẩn probiotic để kháng lại các vi khuẩn gây bệnh
Vibrio và vi rút gây bệnh đốm trắng ở tôm sú (P. monodon Fabricius) [18].
Hernandez và cộng sự (2005) đã sử dụng chủng vi khuẩn Lactobacillus

plantarum TF711 kháng vi khuẩn Vibrio gây bệnh làm chế phẩm để nâng cao
năng suất ở các ao hồ nuôi tôm [11].
1.4.2. Tình hình nghiên cứu vi khuẩn kháng Vibrio gây bệnh cho tôm ở
Việt Nam
Chế phẩm BioF: Có chứa Lactobacillus acidophillus được sử dụng
trong nuôi trồng thủy sản có khả năng tăng hấp thụ thức ăn và hạn chế bệnh
do Aeromonas, Vibrio…gây ra. Kết quả của bước đầu cho thấy sử dụng chế
phẩm để nuôi tôm giống rất hiệu quả, tôm tăng trưởng nhanh, đồng đều [10].
Chế phẩm CNSH-KK của Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa
học và Công nghệ Việt Nam chứa các vi khuẩn hữu ích thuộc nhóm Bacillus
và Lactobacillus phân lập từ ao nuôi tôm có khả năng chuyển hóa các hợp
chất chứa nito và ức chế vi khuẩn gây bệnh Vibrio đã được ứng dụng thành
công ở các ao nuôi tôm công nghiepj tại Thanh Hóa và Huế [12].

15


PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. VẬT LIỆU
2.1.1. Chủng vi khuẩn nghiên cứu
- Mẫu bùn và nước: Các mẫu bùn và nước được lấy ở các địa điểm khác
nhau tại các ao nuôi tôm công nghiệp ở Hoằng Phụ, Hoằng Hóa, Thanh Hóa.
Mẫu được đựng trong bình Duran vô trùng và được bảo quản lạnh đến khi về
phòng thí nghiệm được bảo quản tiếp ở 40C. Mẫu được phân tích trên môi
trường hiếu khí tổng số (HKTS) trong vòng 24 giờ lấy mẫu.
- Chủng vi khuẩn Vibrio: Hai chủng Vibrio parahaemolyticus và Vibrio
vulnificus sử dụng trong nghiên cứu đối kháng được lấy từ bộ sưu tập chủng
giống của Phòng Vi sinh vật dầu mỏ, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm
Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.1.2. Hóa chất

Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu đều là những hóa chất có tiêu chuẩn
chất lượng cao.
2.1.3. Thiết bị và dụng cụ
Nghiên cứu được thực hiện tại Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm
Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Các thiết bị chuyên môn dùng trong
nghiên cứu đạt tiêu chuẩn quốc tế
- Cân phân tích Sartorius (Đức)
- Máy đo quang phổ SP – 3000 Nano (Nhật)
- Máy đo pH Test (Đức)
- Kính hiển vi quang học Olympus (Nhật)
- Máy li tâm Eppendoft (Đức)
- Máy lọc nước khử ion AQUAMAX Ultra 370 Series ( Ấn Độ )
- Máy Voltex (Đức)
- Nồi hấp khử trùng (Mỹ)
- Thiết bị ổn nhiệt Techne OSI (Nhật)
16


- Tủ ấm (Hungari)
- Tủ cấy vô trùng hồi lưu (Việt Nam)
- Tủ hút (Việt Nam)
- Tủ lạnh sâu (-20oC, -80oC) (Đức)
- Máy lắc Beckman (Đức)
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Môi trường nghiên cứu
Môi trường nuôi cấy vi sinh vật hiếu khí tổng số (g/l)
Glucose

1

KCl

0.25

Cao men

0.2

NaCl

5

Cao thịt

3

MgCl₂

1.2

Pepton

5

KH₂PO₄

1

NH₄NO₃

2

Thạch

18

pH = 7÷7,2
Môi trường được khử trùng ở 121oC trong 20 phút.
Tất cả các thí nghiệm đều được nuôi cấy trong môi trường hiếu khí tổng số
với 2 - 3% giống ban đầu đang ở pha log.
2.2.2. Phương pháp phân lập vi khuẩn có khả năng kháng Vibrio
Môi trường HKTS sau khi được khử trùng trong các bình tam giác được
đổ ra đĩa petri vô trùng. Bao gói đĩa để vào tủ ấm 24 giờ cho khô mặt thạch và
kiểm tra mức độ vô trùng của môi trường. Chỉ những đĩa không bị nhiễm mới
được sử dụng để phân lập.
Các mẫu được pha loãng ở các nồng độ khác nhau bằng dung dịch muối
sinh lý 0,85%. Lấy 0,5 ml mẫu vào 4,5 ml nước muối sinh lý được độ pha
loãng 10-1. Lấy tiếp 0,5 ml dung dịch đó chuyển sang lọ chứa 4,5 ml muối
17