Nghiên cứu xây dựng quy trình tách chiết polysaccharide từ giá thể trồng nấm cordyceps militaris
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (3.19 MB, 56 trang )
VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
------
------
KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI:
NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT
POLYSACCHARIDE TỪ GIÁ THỂ TRỒNG NẤM
CORDYCEPS MILITARIS
Giáo viên hướng dẫn :
THS. VŨ DUY NHÀN
Sinh viên thực tập :
TRƯƠNG THUỲ TRANG
Lớp :
13.01 – K20
HÀ NỘI - 2017
VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
------
------
KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI:
NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT
POLYSACCHARIDE TỪ GIÁ THỂ TRỒNG NẤM
CORDYCEPS MILITARIS
Giáo viên hướng dẫn :
THS. VŨ DUY NHÀN
Sinh viên thực tập :
TRƯƠNG THUỲ TRANG
Lớp :
13.01 – K20
HÀ NỘI - 2017
Khoá luận Tốt Nghiệp 2017
LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới ThS. Vũ
Duy Nhàn, người đã trực tiếp hướng dẫn, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt
quá trình thực tập và nghiên cứu.
Tôi xincảm ơn ban lãnh đạo Viện Hoá học – Vật liệu/ Viện Khoa học và
Công nghệ quân sự và các anh chị Phòng Hoá sinh, đã tạo mọi điều kiện
thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian thực tập và làm đề tài tại đây.
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo Viện Đại học
Mở Hà Nội, các thầy cô đã tạo mọi điều kiện trong suốt quá trình học tập tại
trường và thực hiện luận văn này.
Cuối cùng tôi muốn gửi lời thân thương nhất đến gia đình, bạn bè, tập
thể lớp 13-01 Khoa Công Nghệ Sinh Học đã luôn ở bên động viên, giúp đỡ tôi
trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 15 tháng 5 năm 2017
Sinh viên
Trương Thuỳ Trang
Trương Thuỳ Trang – 1301 – CNSH
i
Khoá luận Tốt Nghiệp 2017
MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ................................................................................................ i
MỤC LỤC .................................................................................................... ii
DANH MỤC HÌNH ...................................................................................... v
DANH MỤC BẢNG .................................................................................... vi
DANH MỤC CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT ................................................ vii
MỞ ĐẦU ....................................................................................................... 1
PHẦN 1: TỔNG QUAN VỀ TÀI LIỆU ...................................................... 3
1.1. Giới thiệu về nấm Cordyceps militaris ...............................................................3
1.1.1. Đặc điểm của nấm Cordyceps militaris .......................................... 3
1.1.2. Thành phần hoá học chính của nấm Cordyceps militaris ................ 5
1.1.2.1. Cordycepin ............................................................................... 5
1.1.2.2. Adenosine ................................................................................. 6
1.1.2.3. Polysaccharide ......................................................................... 7
1.1.2.4. Acid cordycepic ........................................................................ 8
1.1.2.5. Nucleotides ............................................................................... 8
1.1.2.6. Sterol ........................................................................................ 9
1.1.2.7. Protein và các axit amin ........................................................... 9
1.1.2.8. Axit béo và nguyên tố kim loại ................................................ 10
1.1.3. Các ứng dụng từ sinh khối nấm Cordyceps militaris..................... 11
1.1.3.1. Cải thiện chức năng gan ......................................................... 11
1.1.3.2. Giải độc thận .......................................................................... 11
1.1.3.3. Giảm đường huyết .................................................................. 12
1.1.3.4. Chống rối loạn tình dục .......................................................... 12
1.1.3.5. Tăng sức bền, chống mệt mỏi ................................................. 12
1.1.3.6. Chống lão hoá ........................................................................ 12
1.2. Giới thiệu về Polysaccharide từ giá thể nấm Cordyceps militaris ......13
1.2.1. Đặc điểm Polysaccharide trong giá thể nấm Cordyceps militaris . 13
Trương Thuỳ Trang – 1301 – CNSH
ii
Khoá luận Tốt Nghiệp 2017
1.2.2. Vai trò của các Polysaccharide trong nấm Cordyceps militaris .... 14
1.2.3. Tình hình nghiên cứu tách chiết Polysaccharide từ Cordyceps
militaris .................................................................................................. 16
1.2.3.1. Tình hình nghiên cứu Polysaccharide từ Cordyceps militaris
trên thế giới ......................................................................................... 16
1.2.3.2. Tình hình nghiên cứu nuôi trồng Cordyceps militaris ở Việt
Nam .................................................................................................... 20
PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................... 22
2.1. Nguyên liệu và thiết bị nghiên cứu....................................................................22
2.1.1. Nguyên liệu .................................................................................. 22
2.1.2. Thiết bị và hoá chất ...................................................................... 22
2.2. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................................24
2.2.1. Phương pháp tách chiết Polysaccharide từ giá thể trồng nấm
Cordyceps militaris ................................................................................ 24
2.2.1.1. Khảo sát phương pháp chiết ................................................... 24
2.2.1.2. Khảo sát điều kiện chiết.......................................................... 25
2.2.2. Xác định hàm lượng Polysaccharide theo phương pháp phenolsulfuric của Michel. Dubois, K. A. Gilles và cs, 1956. ........................... 25
2.2.3. Thu nhận polysaccharide bằng phương pháp kết tủa .................... 28
2.2.4. Phân tích nhóm chức của Polysaccharide bằng IR: ...................... 29
PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................... 30
3.1. Nghiên cứu lựa chọn các điều kiện tách chiết Polysaccharide ............30
3.1.1.Nguyên cứu lựa chọn phương pháp tách chiết ............................... 30
3.1.2.Nghiên cứu lựa chọn tỷ lệ mẫu/dung môi ...................................... 32
3.1.3. Nghiên cứu xác định nhiệt độ chiết ............................................... 33
3.1.4. Nghiên cứu xác định thời gian chiết.............................................. 34
3.2. Bước đầu xây dựng quy trình tách chiết .......................................................35
Trương Thuỳ Trang – 1301 – CNSH
iii
Khoá luận Tốt Nghiệp 2017
3.3. Bước đầu xác định các nhóm chức của polysaccharide tách chiết
được............................................................................................................................................41
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................... 44
Kết luận ....................................................................................................................................44
Kiến nghị .................................................................................................................................44
TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................... 45
Trương Thuỳ Trang – 1301 – CNSH
iv
Khoá luận Tốt Nghiệp 2017
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1: Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris trong tự nhiên ................. 4
Hình 1.2: Cấu trúc hoá học của Cordycepin .................................................. 6
Hình 1.3: Cấu trúc hoá học của adenosine..................................................... 6
Hình 1.4: Cấu tạo hoá học của một số Nucleotides ........................................ 9
Hình 1.5: Công thức cấu tạo Polysaccharide ............................................... 13
Hình 2.1: Cordyceps militaris nuôi cấy tại Viện Hoá học-Vật liệu KH&CN
quân sự......................................................................................................... 22
Hình 2.2: Giá thể và bột để tách chiết .......................................................... 22
Hình 2.3: Máy siêu âm ................................................................................. 23
Hình 2.4: Sơ đồ quy trình tách chiết Cordyceps polysaccharide................... 24
Hình 2.5: Mẫu đo đường chuẩn.................................................................... 27
Hình 2.6: Đồ thị đường chuẩn glucose (ߤ݃/݈݉) .......................................... 27
Hình 2.7: Máy ép thuỷ lực ............................................................................ 29
Hình 2.8: Máy đo phổ hồng ngoại IR ........................................................... 29
Hình 3.1: Kết quả khảo sát dung môi chiết đối với mẫu Cordyceps militaris .. 31
Hình 3.2: Kết quả khảo sát sự thay đổi tỷ lệ mẫu/dung môi .......................... 32
Hình 3.3: Kết quả khảo sát nhiệt độ ............................................................. 33
Hình 3.4: Kết quả khảo sát thời gian ............................................................ 34
Hình 3.5: Sơ đồ tách chiết polysaccharide ................................................... 36
Hình 3.6: Phổ hồng ngoại IR của mẫu CM-hs-CPS2 chuẩn theo kết quả
nghiên cứu của Fengyao Wu ........................................................................ 41
Hình 3.7: Phổ hồng ngoại IR của mẫu P1 .................................................... 42
Hình 3.8: Phổ hồng ngoại IR của mẫu P2 .................................................... 42
Hình 3.9: Phổ hồng ngoại IR của mẫu P3 .................................................... 43
Trương Thuỳ Trang – 1301 – CNSH
v
Khoá luận Tốt Nghiệp 2017
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1: Phân loại khoa học ........................................................................ 3
Bảng 1.2: Hàm lượng các axit béo trong Cordyceps militaris ...................... 10
Bảng 1.3: Khả năng kháng khối u của một số polysaccharide thu nhận từ một
số loại nấm ................................................................................................... 15
Bảng 1.4: Hiện trạng kỹ thuật tách chiết Polysaccharides ........................... 19
Bảng 2.1: Thiết bị dùng trong thí nghiệm ..................................................... 23
Bảng 3.1: Hàm lượng polysaccharide từ Cordyceps militaris ...................... 40
Bảng 3.2: So sánh phổ IR giữa các mẫu ....................................................... 43
Trương Thuỳ Trang – 1301 – CNSH
vi
Khoá luận Tốt Nghiệp 2017
DANH MỤC CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT
Chữ viết tắt
Nội dung
C.
Cordyceps
Sp.
Species- một loài
Spp.
Species flural – nhiều loài
EtOH
Ethanol
EPS
Exopolysaccharide – polysaccharide ngoại bào
SOD
Chất chống oxy hoá
P1
Polysaccharide thu được sau khi chiết với nước nóng
P2
Polysaccharide thu được sau khi bổ sung NaOH 4%
P3
Polysaccharide thu được sau khi bổ sung cồn
Trương Thuỳ Trang – 1301 – CNSH
vii
MỞ ĐẦU
Trong những năm gần đây, rất nhiều loài nấm được quan tâm đến như
nguồn nguyên liệu để sản xuất thực phẩm chức năng phục vụ chăm sóc
sức khoẻ con người ngày một tăng lên. Ngoài ra chúng được các nhà
nghiên cứu y dược học hết sức chú ý vì sự đa dạng về các hợp chất sinh
học có trong mỗi loại.
Đông trùng hạ thảo là một dạng sản phẩm cộng sinh giữa các loài nấm
như Cordyceps sisnensis (Berk.) hoặc Cordyceps militaris (L. Ex Fr).link lên
ấu trùng của một loài côn trùng thuộc chi Hepialus. Thường gặp nhất là ấu
trùng các loài bướm thuộc chi Thitarodes hoặc Hepialus armoricanus. Là một
loại nấm dược liệu quý hiếm từ lâu đã được cả thế giới biết đến. Sách y học
cổ truyền Trung Quốc từ xa xưa đã coi Đông trùng hạ thảo là vị thuốc để bồi
bổ sức khoẻ người và hỗ trợ điều trị hàng loạt bệnh như cải thiện chức năng
phổi và thận, chống ung thư điều hoà miễn dịch và tác dụng hạ huyết áp. Mặt
khác các nghiên cứu y học cổ truyền hiện đại đều xác định Đông trùng hạ
thảo hầu như không có tác dụng phụ với cơ thể người.
Polysaccharide là một trong những thành phần có hoạt tính sinh học
chính của Đông trùng hạ thảo, trong đó đã được chứng minh như chống
ung thư, điều hoà miễn dịch và tác dụng chống oxy hoá đáng lưu ý. Chính
vì vậy gần đây các phương pháp để tách chiết, tinh sạch, phân tích đánh giá
cấu trúc của Cordyceps polysaccharide từ sợi nấm và giá thể Cordyceps
militaris được quan tâm và nghiên cứu rộng rãi. Khi đó sẽ có thể ứng dụng
để sản xuất sản phẩm thực phẩm chức năng từ nguồn nguyên liệu
polysaccharide cũng như giải quyết được một phần nào trong việc chăm
sóc sức khoẻ con người.
Xuất phát từ thực tế đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên
cứu xây dựng quy trình tách chiết polysaccharide từ giá thể nấm Cordyceps
Trương Thuỳ Trang – 1301 - CNSH
1
militaris” với các mục tiêu sau: Xác lập được quy trình tách chiết
polysaccharide từ nguồn giá thểCordyceps militaris nuôi trồng được.
Nội dung nghiên cứu cần giải quyết:
- Nghiên cứu xây dựng quy trình tách chiết polysaccharide từ giá thể
trồng nấm Cordyceps militaris.
- Bước đầu xác định một số nhóm chức cơ bản trên các mẫu
polysaccharide phân lập được.
Trương Thuỳ Trang – 1301 - CNSH
2
PHẦN 1: TỔNG QUAN VỀ TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu về nấm Cordyceps militaris
1.1.1. Đặc điểm của nấm Cordyceps militaris
Đông trùng hạ thảo là một dạng sản phẩm cộng sinh giữa các loài nấm
như Cordyceps sisnensis hoặc Cordyceps militaris lên ấu trùng của một loài
côn trùng thuộc chi Hepialus. Thường gặp nhất là ấu trùng các loài bướm
thuộc chi Thitarodes hoặcHepialus armoricanus. Vào mùa đông, nấm
Cordyceps militaris(L.ex Fr.) link hoặc Cordyceps sinensis ký sinh vào cơ thể
côn trùng và làm cho côn trùng chết, khi đó nấm tồn tại trong cơ thể côn trùng
dạng hệ sợi và là giai đoạn vô tính. Đến mùa hè, nhiệt độ và độ ẩm không khí
cao, hệ sợi nấm vô tính tiến hành giao phối và chuyển giai đoạn hữu tính,
hình thành cây nấm (chất đệm) là cơ quan chứa bào tử vô tính và nhú lên khỏi
mặt đất nhưng gốc vẫn dính liền vào thân sâu. Các loài nấm này phân bố rộng
ở châu Á, châu Úc vùng Đông Á, đặc biệt là các cao nguyên cao hơn mặt biển
từ 4000-5000m như Tây Tạng, Tứ Xuyên, Thanh Hải, Cam Túc, Vân
Nam,..(Trung Quốc) [1,11].
Giới
Nấm
Ngành
Ascomycota
Phân ngành
Ascomycotina
Lớp
Ascomycetes/ Pyrenomycetes
Bộ
Hypocreales
Họ
clavicipataceae
Chi
Cordyceps
Loài
Cordyceps militaris
Bảng 1.1: Phân loại khoa học
Đông trùng hạ thảo có hơn 350 loài khác nhau tuy nhiên có hai loại
chính người ta đi sâu nghiên cứu và đưa vào nuôi trồng là Cordyceps sinensis
Trương Thuỳ Trang – 1301 - CNSH
3
và Cordyceps militaris. Loài nấm Cordyceps sinensis phân bố chủ yếu ở vùng
núi cao thuộc dẫy núi Hymalaya có độ cao trên 4000m so với mực nước biển
như vùng Tây Tạng (Trung Quốc), một số vùng thuộc Nepan và Butan. Loài
nấm Cordyceps militaris, phân bố ở vùng núi thấp hơn có độ cao từ 20003000m so với mực nước biển, có hàm lượng các hoạt chất có hoạt tính sinh
học trong quả thể như cordycepin, mannitol, cordypolysaccarid, superoxide
dismutise và nhiều thành phần khác tương đương, thậm chí còn cao hơn của
loài Cordyceps sinensis. Nhờ các hợp chất hóa học này giá trị dược liệu chính
của loại nấm Cordyceps militaris được các nhà khoa học thống kê như sau: kìm
hãm sự phát triển của tế bào ung thư máu (Kim et al., 2006, Lee H.et al.,2006,
Park C.et al.,2005) [6], ung thư phổi, ung thư vú (Ahn Y.J. et al., 2001)[18].
Nhiều nghiên cứu cũng đã chứng minh nấm có hiệu quả trong chữa trị rối loạn
chức năng của gan (Nan J.X et al. 2001), sự lão hoá, các chứng viêm tấy (Won
S.Y and Park E.H., 2005). Ngoài ra còn có tác dụng kìm hãm sự oxy hoá của
lipid, lipoprotein và lipoprotein tỷ trọng thấp (Klaunig J.E và Kamendulis L.M.,
2004, Balaban R.S et al., 2005). Với giá trị hết sức có ý nghĩa đối với ngành y
dược như vậy thì việc nghiên cứu đặc điểm sinh học của nấm nhằm nhân nuôi
hệ sợi trong nuôi cấy thuần khiết là vô cùng quan trọng, đây là cơ sở để bảo
tồn được nguồn gen quý và gây trồng quả thể trong giá thể nhân tạo.
Hình 1.1: Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris trong tự nhiên
Trương Thuỳ Trang – 1301 - CNSH
1.1.2. Thành phần hoá học chính của nấm Cordyceps militaris
Các phân tích hoá học cho thấy trong sinh khối (biomass) của Đông
trùng hạ thảo Cordyceps militaris có 17 axít amin khác nhau, D-mannitol,
lipit và nhiều nguyên tố khoáng (Se, Zn, Cu, K, Na, Mg, Zn, Si...). Theo số
liệu của Viện sinh thái ứng dụng thuộc Viện Hàn lâm khoa học Trung Quốc,
thành phần hóa học của thể quả nấm Cordyceps militaris như sau:
+ Protein chiếm 40,69%
+ Các loại vitamin: vitamin A (34,7 mg/gam), vitamin B1 (13,0
mg/gam), vitamin B6 (62,2 mg/gam), vitamin B12 (70,3 mg/gam), vitamin
B3 (42,9 mg/gam)
+ Các nguyên tố khoáng: Se (0,44 ppm), Zn (130,0 ppm), Cu (29,15
ppm)
+ Hợp chất hóa học và nhóm hợp chất quan trọng: cordycepin (1,52%),
cordycepic axit (11,8%), polysaccharide (30%),(Shih et al, 2007)[19].
1.1.2.1. Cordycepin
Hợp chất cordycepin là một hợp chất quan trọng, quyết định phẩm chất,
chất lượng của nấm Đông trùng hạ thảo (Mina Masuda et al., 2005).
Cordycepin (3’-deoxyadenosine) là một dạng nucleotide có hoạt tính sinh học
phổ rộng, thường được chuyển đổi thành 5’-mono, di và triphosphate, hợp
chất này ức chế sự hoạt động của quá trình sinh tổng hợp mới của các tế bào
ung thư [6]. Sản lượng cordycepin thu được từ thể quả nấm phụ thuộc vào
khối lượng theo thể tích dung môi chiết xuất, thời gian chiết xuất và nồng độ
của cồn làm dung môi [2]. Sản lượng đạt cực đại khi sử dụng cồn có nồng độ
20,21%, thời gian chiết xuất là 101,88 phút, khối lượng dung môi là 33,13
ml/gam thể quả nấm (Jiang-Feng Song et al., 2007) [15].
Cordycepin có khả năng kháng nấm, kháng ung thư và kháng virus. Gần
đây hơn, cordycepin cũng cho thấy khả năng điều hòa sản phẩm của
Trương Thuỳ Trang – 1301 - CNSH
5
interleukins trong tế bào lympho T,
T do Ahn và cộng sự đã chứ
ứng minh năm
2000 [18]
1. Cấu trúc hoá học của Cordycepin
Hình 1.2:
1.1.2.2. Adenosine
Adenosine xuấtt hi
hiện khá nhiều trong quả thể và đượcc cho là phong phú ở
hầu hếtt các loài Cordyceps vvới hàm lượng dao động từ 0,28 tớ
ới 14,15 mg/g.
Khi thu nhận nấm
m Cordyceps trong ttự nhiên, nồng độ adenosine là
2,45±0,03mg/g trong qu
quả thể,ở C. sinensis hàm lượng là 1,643±0,03 mg/g, trong
khi đó, hàm lượng
ng trong ssợi nấm Cordyceps militaris lên men là 1,592±0,03
mg/g gần tương tự C. sinensis trong tự nhiên. Adenosine đượcc cho là có tác ddụng
điều hòa miễn dịch, bảoo vvệ tim mạch, bảo vệ gan thận rất tốt
Hình 1.
1.3: Cấu trúc hoá học của adenosine
Trương Thuỳ Trang – 1301 - CNSH
1.1.2.3. Polysaccharide
Nấm Cordyceps spp. được đánh giá cao về giá trị dinh dưỡng trong sản
xuất thực phẩm chức năng và sản xuất thuốc trong phòng và chữa bệnh.
Chúng chứa rất nhiều loại đường, bao gồm mono-, di-, và các
oligosaccharide, và nhiều polysaccharides phức tạp (gồm có cyclofurans
(đường 5C, mạch vòng, chưa rõ chức năng), beta-glucans; beta-mannans; và
phức hợp polysaccharides có cả đường 5 và 6C cùng tham gia vào các
chuỗi nhánh, dùng cả cầu nối alpha- và beta-). Các polysaccharides chính
trong nấm Cordyceps là một dạng glucans với các mối liên kết glycosidic
chứa các liên kết: (1/3) - (1/6) - β glucans và (1/3) - 1 – glucans [11].
Mặc dù, vách tế bào nấm là nguồn cung cấp chính của polysaccharides
đã được chứng minh kháng khối u, trong khi polysaccharide thu nhận từ
thực vật lại không có đặc điểm này, điều này chỉ có thể giải thích được
thông qua sự khác nhau trong cấu trúc hóa học của các polysaccharide.
Các polysaccharide có khả năng chống lại hoạt động của các tế bào
ung thư chúng bao gồm homopolyme có cấu tạo đơn giản đến phức tạp bao
gồm glucose, galactose, mannose, xylose, arabinose, fucose, ribose và acid
glucuronic. Trong một số loài nấm, polysaccharides liên kết với các protein
hoặc peptide tạo thành các hệ polysaccharide - protein hoặc polysaccharide
- peptide cấu trúc có hoạt tính kháng u mạnh hơn. Cấu trúc 1/3 - β - glucans
có khả năng kháng khối u được biết nhiều nhất, theo các nghiên cứu cho
biết những glucans có được hoạt tính sinh học này là trong cấu tạo các phân
tử có dạng mạch thẳng hoặc phân nhánh với cấu trúc chính là phân tử
đường glucose liên kết với các đơn vị trong chuỗi tại các vị trí khác nhau,
với các chuỗi bên bao gồm các đơn vị như acid glucuronic, xylose,
galactose, mannose, arabinose hoặc ribose. Heteroglycans là một nhóm lớn
polysaccharides có hoạt tính sinh học đa dạng được phân loại là galactans,
fucans, xylans, và mannans.
Trương Thuỳ Trang – 1301 - CNSH
7
Các
polysaccharide
CPS-1
và
CPS-2
được
tách
chiết
từ
nấm Cordyceps militaris cho thấy chúng có thành phần từ các đơn phân là
các đường monosaccharide, mannose và galactose. Kết quả nghiên cứu cho
thấy hai loại polysaccharides này có khả năng phục hồi các tổn thương gan
do ethanol, và tác dụng này tăng lên khi tăng liều dùng chiết xuất. Yan và
cộng sự cho rằng tác dụng này có thể do chức năng kháng oxy hóa của các
polysaccharide từ nấm (Yan et al, 2008) [17].
1.1.2.4. Acid cordycepic
Theo dược điển của Trung Quốc, acid cordycepic hay D-manitol, một
đồng phân của acid quinic với cấu trúc polyol chiếm khoảng 9% trong
Cordyceps, đây là thành phần được sinh ra trong hoạt động sinh tổng hợp và
được sử dụng như một dấu hiệu trong kiểm soát chất lượng nuôi cấy nấm C.
militaris. Acid cordycepic được tách ra từ Cordyceps sinensis từ những năm
1957, đã được chứng minh có tác dụng lợi tiểu và phòng ngừa biến chứng sau
phẫu thuật cắt thận, làm giảm ho và hen suyễn. Đặc biệt acid cordycepic có
thể cung cấp sự bảo vệ hiệu quả trong điều trị các bệnh nhân sau nhồi máu
não và chấn thương, chẳng hạn như cải thiện vi tuần hoàn não và lưu lượng
máu não, thúc đẩy phục hồi thần kinh và bảo tồn các khu vực thiếu máu cục
bộ, giảm điều tiết áp lực nội sọ, và giảm sự hình thành dịch não tủy và não mô
hàm lượng nước.
1.1.2.5. Nucleotides
Nucleotides (gồm có adenosine, uridine và guanosine) là các thành phần
khá đa dạng trong nấm Cordyceps. Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng, guanosine
có hàm lượng cao nhất trong tất cả các mẫu tự nhiên, khi nuôi cấy trong điều
kiện nhân tạo hàm lượng của nucleotide thường cao hơn Cordycep spp. tự
nhiên. Nucleotides trong Cordyceps tự nhiên bắt nguồn từ sự phân rã của
nucleotides trong suốt quy trình bảo quản, tiếp đó các nhà nghiên cứu cũng
tìm ra rằng độ ẩm có thể làm tăng đáng kể hàm lượng nucleotide
trong Cordyceps khi nuôi trên môi trường rắn.
Trương Thuỳ Trang – 1301 - CNSH
8
Hình 1.4: Cấu tạo hoá học của một số Nucleotides
1.1.2.6. Sterol
Ergosterol là sterol duy nhất của nấm và là tiền chất thiết yếu của
vitamin D2, có giá trị dược liệu quan trọng. Ergosterol trong C. sinensis có
thể được xác định bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC (High
Performace Liquid Chromatography) do Li và cộng sự thực hiện năm 1991
[16], được cho là chất ophiocordin, ở Cordyceps pseudomilitaris là chất
bioxanthracenes và tập hợp bốn exopolysaccharide với các trọng lượng phân
tử thay đổi từ 50 kDa tới 2260 kDa tìm thấy ở C. militaris. Hàm lượng
ergosterol trong quả thể nhân tạo của Cordyceps rất cao (10,68mg/g) cao hơn
nhiều so với hệ sợi nấm chỉ có 1,44mg/g [17] .
1.1.2.7. Protein và các axit amin
Nấm Cordyceps có hàm lượng protein thô trong khoảng 29,1 – 33%.
Protein này bao gồm 18 loại amino acid, gồm có aspartic, threonine, serine,
proline, glycine, valine, methionine, isoleucine, leucine, phenylalanine,
lysine, histidine, cystine, cysteine trong đó các thành phần có tác dụng dược
lý chính là arginine, glutamate, tryptophan và tyrosine.
Trương Thuỳ Trang – 1301 - CNSH
Kết quả nghiên cứu của Hyun (2008) cho thấy trong quả thể
nấm Cordyceps militaris có chứa lượng acid amin tổng số cao hơn trong sinh
khối nấm (69,32 mg/g trong quả thể và 14,03 mg/g trong sinh khối
nấm).Thành phần acid amin của mỗi loại trong quả thể bao gồm: lysine (15,06
mg/g), glutamic acid (8,79 mg/g), prolin (6,68 mg/g), threonine (5,99 mg/g),
arginine (5,29 mg/g), và alanine (5,18 mg/g) trong quả thể. Số liệu phân tích
của Chang và cộng sự (2001) cho thấy phần lớn trong sinh khối nấm chứa
acid aspartic (2,66 mg/g), valine (2,21 mg/g) và tyrosine (1,57 mg/g)
(Chang, 2001).
1.1.2.8. Axit béo và nguyên tố kim loại
Acid béo bao gồm carbon, hydro và oxy là thành phần chính của lipid,
phospholipid và glycolipid, chúng được phân loại thành acid béo no và
không no ở Cordyceps, lượng acid béo no được tìm thấy là 57,84% gồm có
C16:1, C17:1, C18:1,C18:2. Các acid béo không no có chức năng giảm lipid
máu và bảo vệ chống lại bệnh tim mạch. Chứa một loạt các hợp chất dinh
dưỡng như acid amin thiết yếu, vitamin E và K, các vitamin tan trong nước
như B1, B2, B12 và các nguyên tố đa lượng và vi lượng (K, Na, Ca, Mg, Fe,
Cu, Mn, Zn, Pi, Se, Al, Si, Ti, Cr, Ga, V [15].
Axit béo
Phần trăm acid béo tổng (%)
Quả thể
Sinh khối
Palmitic axit (C16:0)
24,5
21,5
Palmitoeic axit (C16:1)
2,3
2,1
Stearic axit (C18:0)
5,8
5,0
Oleic axit (C18:1)
6,0
17,7
Linoleic axit (C18:2)
61,3
33,0
Linolenic axit (18:3)
-
20,6
Bảng 1.2: Hàm lượng các axit béo trong Cordyceps militaris
Trương Thuỳ Trang – 1301 - CNSH
10
1.1.3. Các ứng dụng từ sinh khối nấm Cordyceps militaris
Các nhà y học cổ truyền trong và ngoài nước đã nghiên cứu sử dụng nấm
Cordyceps militaris để điều trị thành công các chứng bệnh như rối loạn máu,
viêm phế quản mãn và hen phế quản, viêm thận mãn tính và suy thận, rối loạn
nhịp tim, cao huyết áp, viêm mũi dị ứng, viêm gan B mãn tính, ung thư phổi
(có tác dụng hỗ trợ) và thiểu năng sinh dục. Viện nghiên cứu nội tiết Thượng
Hải (Trung Quốc) cũng đã dùngCordyceps militaris để điều trị cho các bệnh
nhân bị liệt dương, kết quả đạt được khá tốt.
1.1.3.1. Cải thiện chức năng gan
Polysaccharide CPS – 1 và CPS – 2 được tách chiết từ nấm Cordyceps
militaris cho thấy chúng có thành phần từ các đơn phân là các đường
monosaccharide, mantose và galactose. Kết quả nghiên cứu cho thấy hai loại
Polysaccharide này có khả năng phục hồi các tổn thương gan do ethanol và
tác dụng này tăng lên khi tăng liều dùng chiết xuất. Yan et al. , 2008 cho rằng
tác dụng này có thể do chức năng kháng oxy hoá của các Polysaccharide[15].
1.1.3.2. Giải độc thận
Rất nhiều công trình y học hiện đại đã xác nhận là nhờ nấm có khả năng
làm tăng những loại hoocmon ở tuyến thượng thận và tuyến sinh dục tiết.
Thực hiện trên 51 bệnh nhân bị hỏng thận mãn tính, theo liệu trình điều trị
từ 3-5g Cordyceps militaris/ngày. Kết quả cho thấy chức năng thận được
cải thiện đáng kể. Một nghiên cứu khác trên 51 bệnh nhân bị hỏng thận do
sử dụng geltamixin, người ta quan sát thấy bệnh nhân có sử dụng
Cordyceps militarisvới lượng 4,5g/ngày thì thận được bảo vệ tốt hơn,
89% chức năng thận được phục hồi. Kiểm nghiệm trên 69 bệnh nhân ghép
thận, kết quả là Cordyceps militaris đã làm giảm độc tính của Cyclosporine
trên thận [1]
Trương Thuỳ Trang – 1301 - CNSH
11
1.1.3.3. Giảm đường huyết
Cordyceps militaris có hiệu quả với hệ thống chuyển hoá glucose trong
máu. Các nhà khoa học đã nghiên cứu ngẫu nhiên có đến 95% bệnh nhân
được cải tiện chỉ số đường huyết khi sử dụng 3g nấm/ngày, hiệu quả đạt được
là do tác nhân ung thư phổi đã được uống 6g Cordyceps militaris/ngày cùng
với liệu pháp vật lý trị liệu thì khối u đã giảm đi ở 23 bệnh nhân chiếm 46%.
[1,3].
1.1.3.4. Chống rối loạn tình dục
Cordyceps militarisdùng để điều trị rối loạn tình dục ở cả nam giới và nữ
giới bao gồm giảm ham muốn lãnh cảm, liệt dương. Nghiên cứu đã được tiến
hành ở Trung Quốc với 756 bệnh nhân bị suy giảm ham muốn sau 40 ngày sử
dụng 3g Cordyceps militaris/ngày thì có 64,8% bệnh nhân đã được cải thiện
được tình trạng tình dục. Đối với nữ giới, tình trạng rối loạn kinh nguyệt,
chứng đa khí hư cũng được cải thiện [1,7]
1.1.3.5. Tăng sức bền, chống mệt mỏi
Theo báo cáo thì khi sử dụng mỗi ngày 3g Cordyceps militaris thì kết
quả làm tăng năng lượng cơ thể cho người cao tuổi bị các bệnh mãn tính.
Năm 2004 tại MỸ các nhà khoa học đã làm thí nghiệm cho người 40-70
tuổi, nếu sử dụng Cordyceps militaris trong 12 tuần thì sự tăng sức bền
thể lực sức mạnh được cải thiện ở cả hai yếu tố là gia tăng Adenosin
triphosphate (ATP) và giải phóng năng lượng ty lạp thể của tế bào cũng
như hệ số sử dụng hiệu quả oxy hoá của tế bào trong quá trình giải phóng
năng lượng [1,7]
1.1.3.6. Chống lão hoá
Cordyceps militarischứa nhiều chất SOD (superoxide dismutafe) là chất
chống oxy hoá nên nó có tác dụng làm chậm quá trình lão hoá của cơ thể
Trương Thuỳ Trang – 1301 - CNSH
12
1.2. Giới thiệu về Polysaccharide từ giá thể nấm Cordyceps militaris
1.2.1. Đặc điểm Polysaccharide trong giá thể nấm Cordyceps militaris
Polysaccharide là các polyme ngưng tụ được hình thành từ một lượng
lớn monosaccharide được liên kết với nhau bởi O-glycosidic. Một liên kết
glycosidic được hình thành từ một nửa là glycosyl của hemiacetal kết hợp với
nhóm hydroxyl của mono khác để hình thành nên một đơn vị glycosyl trong
chuỗi polysaccharide. Polysaccharide có cấu trúc mạch thẳng hoặc phân
nhánh, tuỳ theo số lượng các monome chứa trong polysaccharide mà được
chia thành hai nhóm: homopolysaccharide chỉ bao gồm một loại
monosaccharide và heteropolysaccharide được hình thành từ hai hay nhiều
chủng loại monosaccharide.
Hình 1.5: Công thức cấu tạo Polysaccharide
Các glycosidic liên kết với nhau tại các vị trí, như liên kết α – (1/2),
(1/3), (1/4) hay β – (1/2), β – (1/3), β – (1/4). Cả hai homopolysaccharide và
heteropolysaccharide có thể chứa các liên kết dạng α, β phụ thuộc vào đơn vị
hình thành nên chúng. Các heteropolysaccharide không chỉ khác nhau về đơn
vị cấu tạo, số lượng và trình tự của các đơn vị monosaccharide mà chúng
cũng khác nhau về trình tự của các mối liên kết glycosidic. Điều này dẫn đến
một đa dạng gần như vô hạn trong cấu trúc của các polysaccharide.
Các polysaccharide chính trong nấm Cordyceps có một số dạng glucans
với các mối liên kết glycosidi được hình thành từ liên kết (1/3) – (1/6) – β
Trương Thuỳ Trang – 1301 - CNSH
glucans và (1/3) – 1 – glucans. Mặc dù, vách tế bào nấm là nguồn cung cấp
chính của polysaccharide được chứng minh kháng khối u, trong khi với
polysaccharide thu nhận từ thực vật lại không có đặc điểm này, điều này chỉ
có thể được giải thích được thông qua sự khác nhau trong cấu trúc hoá học
của các polysaccharide.
1.2.2. Vai trò của các Polysaccharide trong nấm Cordyceps militaris
Kết quả nghiên cứu từ các công bố khoa học cho thấy nấm C.militaris
được nhiều nghiên cứu khẳng định tiềm năng ứng dụng trong điều trị bệnh,
đồng thời cũng được sử dụng rộng rãi trong ngành công nghiệp dược phẩm
hiện nay, ví dụ như trong điều trị ung thư, điều hòa miễn dịch, suy giảm chức
năng gan, thận… (Seulmee et al., 2009; Shonkor, 2010)[4].
Các polysaccharide có khả năng chống lại hoạt động của các tế bào ung
thư chúng bao gồm homopolyme có cấu tạo đơn giản đến phức tạp bao gồm
glucose, galactose, mannose, xylose, arabinose, fucose, ribose và acid
glucuronic. Trong một số loài nấm, polysaccharides liên kết với các protein
hoặc peptide tạo thành các hệ polysaccharide – protein hoặc polysaccharide –
peptide cấu trúc có hoạt tính kháng u mạnh hơn. Cấu trúc 1/3 – β – glucans có
khả năng kháng khối u được biết nhiều nhất, theo các nghiên cứu cho biết
những glucans có được hoạt tính sinh học này là trong cấu tạo các phân tử có
dạng mạch thẳng hoặc phân nhánh với cấu trúc chính là phân tử đường
glucose liên kết với các đơn vị trong chuỗi tại các vị trí khác nhau, với các
chuỗi bên bao gồm các đơn vị như acid glucuronic, xylose, galactose,
mannose, arabinose hoặc ribose.
Trương Thuỳ Trang – 1301 - CNSH
14
Chủng nấm
Nguồn thu nhận
Polysaccharide
Kháng khối u dạng
Cordyceps militaris
Sinh khối
Khối u ác tính, ung thư phổi
Phellinus
Cơ thể nấm
Ung thư phổi
Ganoderma lucidum
Cơ thể nấm
Ung thư phổi, ung thư vú
Lentinula edodes
Cơ thể nấm
Ung thư vú
Lepista inversa
Cơ thể nấm
Ung thư phổi
Grifola frondosa
Cơ thể nấm
Ung thư vú
Bảng 1.3: Khả năng kháng khối u của một số polysaccharide thu nhận từ
một số loại nấm
Đặc tính kháng khối u của các polysaccharides có thể bị ảnh hưởng bởi kích
thước củaphân tử, mức độ phân nhánh, hình thức, và khả năng hòa tan trong nước.
Nói chung, các polysachcharidecàng có trọng lượng phân tử lớn và hòa tan trong
nước tốt có khả năng kháng khối u cao hơn. Một số nghiên thu được trên lâm sàng
cho biết về khả năng kháng khối u cao thuộc về phức hợp polysaccharide - protein
tách ra từ quả thể, đây là các heteropolysaccharides có chứa galactose, glucose,
mannose và fucose [6,9,15]. Hầu hết các Polysaccharide công bố có hoạt động
kháng u đã biết đều có cấu trúc cơ bản β-glucan chỉ khác nhau về loại hình liên kết
glucosidic [17]. Do vậy, hoạt động chống khối u đòi hỏi có cấu trúc đặc trưng như
liên kết β-(1-3) trong chuỗi chính của glucan và thêm vào đó là nhánh β-(1-6).
Nếu β-glucan chủ yếu là mạch thẳng, chứa các nhánh không quá dài, chúng sẽ cho
thấy hoạt động chống ung thư. Polysaccharide cho thấy khả năng chống tế bào
ung thư có thể chứa các cấu trúc khác nhau như hetero-β-glucan, heteroglycan, βglucan-protein, α-manno-β-glucan liên kết glucoside [15].
Hợp chất exopolysaccharide (EPS) là một polysaccharide ngoài bào, có thể
được thu nhận bằng lên men chìm từ một số loài nấm lớn. Một số nghiên cứu đã
rất thành công trong thu nhận EPS và sinh khối nấm Cordyceps trong lên men
Trương Thuỳ Trang – 1301 - CNSH
15
chìm trên môi trường gồm glucose-peptone-cao nấm men với lượng EPS cao nhất
là (0,2-1,01g/L) thu được sau từ 7-15 ngày lên men. Lượng sản phẩm thu được
thường trùng với động học phát triển hệ sợi, hình thái nấm và trạng thái dinh
dưỡng. Trong số các các nghiên cứu, sản phẩm tổng hợp ngoại bào ở một số
chủng nấm Cordyceps đạt được có mức độ cao khi lên men trên môi trường khoai
tây-malt-peptone. Như vậy, sự tích lũy EPS trong nuôi lỏng tương quan chặt chẽ
với lượng sinh khối nấm tạo ra. Sự sinh tổng hợp các dạng EPS trong lên men
chìm sẽ phụ thuộc đặc điểm sinh học của các chủng nấm. Hơn nữa, sự sản xuất
polysaccharide ngoại bào có vai trò như như một chất bám dính trên bề mặt, cố
định các enzyme, ngăn cản sự mất nước của sợi nấm, lưu trữ các chất dinh dưỡng
dư thừa [2,19].
1.2.3. Tình hình nghiên cứu tách chiết Polysaccharide từ Cordyceps
militaris
1.2.3.1. Tình hình nghiên cứu Polysaccharide từ Cordyceps militaris trên
thế giới
Để đáp ứng nhu cầu sử dụng các sản phẩm có nguồn gốc từ nấm Cordyceps
trong việc chăm sóc sức khỏe con người ngày một tăng, từ những năm 1980 của
thế kỷ trước nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu nuôi các chủng nấm Cordyceps sp.
trong điều kiện nhân tạo. Năm 1982, Shen Nanying tại Viện Nghiên cứu Tứ
Xuyên đã tách và nuôi thành công chủng Cordyceps sp. CS4 trong môi trường
nhân tạo. Chủng nấm CS4 sau quá trình tinh sạch trải quả quá trình lên men trong
điều kiện vô trùng với các điều kiện tương tự như điều kiện tự nhiên của vùng núi
Tây Tạng như nhiệt độ thấp, thành phần không khí được tối ưu hóa về nồng độ
nitơ, carbondioxide, carbonmonoxide và oxy chỉ có mức độ thấp. Với qui trình lên
men bề mặt, sản phẩm thu được đã được thử nghiệm lâm sàng trên 2000 bệnh
nhân đang điều trị ung thư đã đem nhiều kết quả tốt, từ đó các sản phẩm thuốc có
bổ sung sinh khối nấm Cordyceps sp. CS4 ngày càng được sự dụng rộng rãi và
nổi tiếng trên toàn thế giới [16].
Trương Thuỳ Trang – 1301 - CNSH
16
