ĐÁNH GIÁ độ SAI số TRONG PHÂN TÍCH TỒNG NITƠ (TN) BẰNG PHƯƠNG PHÁP KJELDAHL và PERSULFATE

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA THỦY SẢN

THẠCH NGỌC BÌNH

ĐÁNH GIÁ ĐỘ SAI SỐ TRONG PHÂN TÍCH TỒNG
NITƠ (TN) BẰNG PHƯƠNG PHÁP KJELDAHL VÀ
PERSULFATE

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN

2012


TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA THỦY SẢN

THẠCH NGỌC BÌNH

ĐÁNH GIÁ ĐỘ SAI SỐ TRONG PHÂN TÍCH TỒNG
NITƠ (TN) BẰNG PHƯƠNG PHÁP KJELDAHL VÀ
PERSULFATE

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH NUÔI TRỒNG T HỦY SẢN

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
HUỲNH TRƯỜNG GIANG

2012

ii


LỜI CẢM TẠ
Hoàn thành tốt đề tài này :
Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất đến thầy
Huỳnh Trường Giang đã tận tình quan tâm, hướng dẫn, động viên và tạo điều
kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn
tốt nghiệp.
Gởi lời tri ân đến các quý thầy cô Khoa thủy sản trường Đại học Cần
Thơ đã truyền đạt những kiến thức, kinh nghiệm trong quá trình học tập.
Cảm ơn anh Nguyễn Thanh Tâm đã giúp đỡ, động viên cố gắn tạo mọi
điều kiện trong quá trình thực hiện đề tài.
Cảm ơn đến tập thể lớp Nuôi trồng thủy sản khóa 34 đã sang sẽ, động
viên, kích lệ tôi trong học tập và thực hiện đề tài.
Cuối cùng, xin được bày tỏ lòng biết ơn đến gia đình, người thân và
bạn bè đã quan tâm, giúp đỡ, chia sẽ và động viên trong suốt thời gian tập
trung tại trường.
Chân thành cảm ơn!

i


TÓM TẮT
Kjeldahl và Persulfate là hai phương pháp xác định nitơ tổng số và
phosphor tổng số được dùng phổ biến trong phân tích chất lượng nước nuôi
trồng thủy sản. Năm 1998, Gross và Boyd thực hiện nghiên cứu xác định hàm
lượng phosphor ở môi trường môi trường acid và môi trường kiềm cho kết quả
tương tự nhau. Từ đó phương pháp persulfate được dùng xác định đồng thời
chỉ tiêu TN và TP. So sánh và tìm những lỗi dẫn đến sai số để khắc phục

nhằm nâng cao độ chính xác trong việc xác định tổng nitơ của phương pháp
Kjeldah và Persulfate là mục tiêu của đề tài “Đánh giá độ sai số trong phân
tích nitơ tổng số (TN) bằng phương pháp Kjeldahl và persulfate”. Hai thí
nghiệm được tiến hành
Thí nghiệm 1 được bố trí với 5 nghiệm thức với 5 nồng độ chuẩn là
acid glutamic khác nhau: 2 mgN/l, 5 mgN/l, 10 mgN/l, 20 mgN/l và 50 mgN/l
để so sánh kết quả giữa 2 phương pháp và xác định khoảng nồng độ công phá
tối ưu. Thí nghiệm 2 được bố trí với hai mẫu thực nghiệm: mẫu nước ngọt
(nước ao nuôi cá Tra) và mẫu nước lợ (nước ao nuôi thẻ chân trắng). Kết quả
đạt được cho thấy ở nồng độ 2 mgN/l phương pháp Persulfate cho kết quả
(26,19±4,52) rất thấp so với chuẩn. nhưng ở phương pháp Kjeldahl cho kết
quả tốt hơn ( 82,1±4,95). Khoảng nồng độ từ 5 mgN/l─20 mgN/l cả hai
phương pháp điều cho kết quả giống như và độ sai số nhỏ.
Thí nghiệm 2 cho thấy mẫu nước ao nuôi cá tra nằm trong khoảng 2
mgN/l cho nên kết quả đạt được của phương pháp Persulfate thấp hơn với mức
có ý nghĩa (1,07 mgN/l) so với Kjeldahl (1,9 mgN/l). đối với nước ao nuôi thẻ
chân trắng nồng độ nitơ tổng số nằm trong khoảng 5 mgN/l nhưng kết quả đạt
được từ quá trình phân tích Persulfate lại thấp có ý nghĩa (3,26±0,88) so với
Kjeldahl (4,47±0,84) từ đó ta kết luận được rằng độ mặn có ảnh hưởng đến
quá trình công phá.

ii


MỤC LỤC
Mục......................................................................................................... Trang
CHƯƠNG 1: ĐẶT VẤN ĐỀ.......................................................................... 1
1.Giới thiệu .................................................................................................... 1
2.Mục tiêu nghiên cứu.................................................................................... 2
3.Nội dung nghiên cứu ................................................................................... 2

CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU ......................................................... 3
2.1 Sơ lược về nitơ ......................................................................................... 3
2.1.Chu trình nitơ trong ao nuôi thủy sản........................................................ 3
2.2.1.Hấp thu của thực vật......................................................................... 3
2.2.2 Sự phản nitơ trong hợp chất hữu cơ.................................................. 4
2.2.3 Quá trình nitrate hóa......................................................................... 4
2.2.4 Quá trình phản nitrate hóa ................................................................ 5
2.2.5 Sự bay hơi của ammonia trong ao nuôi............................................. 5
2.2.6 Sự cố định đạm trong trong tự nhiên và trong ao nuôi ...................... 5
2.2. Sơ lược về phương pháp Kjeldahl (APHA 1999 Method 4500-N org B)...7
2.3 Sơ lược về phương pháp Persulfate(APHA 1999 Method 4500-NH3 C)….9
CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP............................................11
3.1 Vật liệu nghiên cứu .................................................................................11
3.1.1 Dụng cụ.......................................................................................... 11
3.1.2 Hóa chất......................................................................................... 11
3.2 Phương pháp nghiên cứu................................................................... 11
3.2.1 Thời gian và địa điểm thực hiện ..................................................... 11
3.2.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm ....................................................... 11
3.2.3 Phương pháp phân tích mẫu ........................................................... 13
Phương pháp Persulfate .......................................................................... 17
3.2.4 Phương pháp thu và xử lý số liệu ................................................... 17
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................18
4.1 Ảnh hưởng của thời gian lên quá trình oxi hóa lên hiệu suất phân tích nitơ
của phương pháp Persulfate...........................................................................18
CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ....................................................26
5.1 Kết luận...................................................................................................26
5.2 Đề xuất....................................................................................................26
TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................27
PHỤ LỤC…………………………………………………………………………...28

iii


DANH SÁCH BẢNG
Bảng 1. Hiệu quả thu hồi khi xác định N bằng phương pháp Kjeldahl và
Persulfat ....................................................................................................... 22

iv


DANH SÁCH HÌNH
Hình 1. Kết quả oxy hóa mẫu chuẩn 10 mgN/l ở khoảng thời gian khác nhau18
Hình 2. Hiệu suất thu hồi NO3- bằng phương pháp phân tích NO3- khác nhau19
Hình 3. Hiệu quả thu hồi tổng N bằng 2 phương pháp khác nhau ở nồng độ
mẫu chuẩn 2 mg/l ......................................................................................... 20
Hình 4. Hiệu quả thu hồi tổng N bằng 2 phương pháp khác nhau ở nồng độ
chuẩn 5 mg/l................................................................................................. 20
Hình 5 Property control chart Persulfate mẫu chuẩn 5 mg/l .......................... 21
Hình 6 Property control chart Kjeldahl mẫu chuẩn 5 mg/l ............................ 21
Hình 7. Hiệu quả thu hồi tổng N bằng 2 phương pháp khác nhau ở nồng độ
chuẩn 10 mg/l............................................................................................... 22
Hình 8 Property control chart Persulfate mẫu chuẩn 10 mg/l ........................ 22
Hình 9 Property control chart Kjeldahl mẫu chuẩn 10 mg/l .......................... 22
Hình 10. Hiệu quả thu hồi tổng N bằng 2 phương pháp khác nhau ở nồng độ
chuẩn 20 mg/l............................................................................................... 23
Hình 11 Property control chart Persulfate mẫu chuẩn 20 mg/l ...................... 23
Hình 12 Property control chart Kjeldahl mẫu chuẩn 20 mg/l ........................ 23
Hình 13. Hiệu quả thu hồi tổng N bằng 2 phương pháp khác nhau ở nồng độ
chuẩn 50 mg/l............................................................................................... 24
Hình 14. Kết quả phân tích TN mẫu nước ngọt bằng 2 phương pháp khác nhau

................................................................................................................... 25
Hình 15. Kết quả phân tích TN mẫu nước lợ bằng 2 phương pháp khác nhau25

v


CHƯƠNG 1: ĐẶT VẤN ĐỀ
1. Giới thiệu
Duy trì chất lượng nước luôn ổn định ở điều kiện thích hợp cho sự phát
triển của vật nuôi là mục tiêu trong công tác quản lý chất lượng nước ao nuôi
thủy sản. Cùng với phosphor nitơ đóng vai trò quan trọng trong ao nuôi thủy
sản là hai yếu tố giới hạn sự phát triển của tảo, nếu quản lý hai yếu tố này
không hợp lý thì dể gây ra hiện tượng phú dưỡng và làm giảm chất lượng
nước (Boyd và Clay 1998; Hein 2002). Vì vậy xác định hàm lượng nitơ có ý
nghĩa rất lớn trong việc đánh giá hàm lượng dinh dưỡng hay mức độ ô nhiễm
môi trường ao nuôi thủy sản, đồng thời là cơ sở xác định hàm lượng đạm thực
phẩm trong công tác điều tra chất lượng thực phẩm, định lượng hàm lượng
đạm trong thức ăn chăn nuôi giúp chúng ta điểu chỉnh hàm lượng đạm thích
hợp cho từng đối tượng và giai đoạn phát triển của chúng và là phương tiện hổ
trở cho lĩnh vực khoa học khác.
Trong những năm qua với sự phát triển vượt bậc của khoa học kỹ thuật
nhiều phương pháp phân tích đã được ứng dụng rộng rãi trong các lĩnh vực.
Phổ biến là hai phương pháp phân tích tổng nitơ Kjeldahl và Persulfate, cả hai
phương pháp này điều có cùng một nguyên tắc là sử dụng chất oxy hóa mạnh
để oxy hóa hoàn toàn hợp chất hữu cơ có chứa nitơ trong điều kiện nhiệt độ
cao. Sản phẩm cuối cùng của phương pháp Kjeldahl dưới dạng ammonium và
của persulfate dưới dạng nitrate. Vì thế vấn đề đặt ra là hiệu quả phân tích của
hai phương pháp trên có tương đương nhau không.
Đối với công tác phân tích, nghiên cứu việc phân tích đòi hỏi độ chính
xác, tin cậy nhất định. Vấn đề này ngoài phụ thuộc vào thao tác phân tích,

thiết bị phân tích, hóa chất sử dụng việc lựa chọn phương pháp phân tích phù
hợp còn là vài trò quyết định đến độ chính xác, tin cậy của công tác phân tích,
nghiên cứu. Đặc biệt nếu cùng một chỉ tiêu phân tích nhưng đồng thời có
nhiều phương pháp phân tích được sử dụng thì việc so sánh đánh giá giữa các
phương pháp để tìm ra phương pháp phân tích tối ưu, mức độ sai số nhỏ nhất
là điều hết sức cần thiết. Gross và Boyd (1998) đã thử nghiệm giữa phương
pháp phân tích phosphor tổng bằng phương pháp persulfate. Ở hai môi trường
oxi hóa khác nhau, thí nghiệm thứ nhất xảy ra trong môi trường acid và thí
nghiệm thứ hai xảy ra trong môi trường bazơ. Với 70 mẫu nước thu được từ ao
nuôi cá da trơn. Kết quả thu được của hai phương pháp trên khác biệt không
có ý nghĩa thống kê. Hiện nay chưa có nghiên cứu cụ thể nào về việc so sánh
giữa phương pháp phân tích đồng thời nitơ tổng số và phosphor tổng số bằng
hai phương pháp trên. Đề tài “Đánh giá độ sai số trong phân tích tổng Nitơ
(TN) bằng phương pháp Kjeldahl và Persulfate” được thực hiện để so sánh
1


mức sai số giữa phương pháp Kjeldahl và Persulfate trong phân tích nitơ tổng
số.
2. Mục tiêu nghiên cứu
Đánh giá độ sai số giữa hai phương pháp phân tích nitơ tổng số khác
nhau để hoàn thiện quy trình phân tích mẫu, đạt được độ chính xác cao nhất
trong phân tích tổng đạm trong môi trường nước ao nuôi thủy sản.
3. Nội dung nghiên cứu
 Xác định thời gian oxy hóa trong phân tích tổng nitơ bằng phương pháp
Persulfate
 Đánh giá độ sai số giữa hai phương pháp khử cột Cadmium và
Salicylate trong phân tích NO3- (thành phần trong tổng đạm).
 So sánh độ sai số trong phân tích tổng nitơ giữa phương pháp Kjeldahl
và phương pháp Persulfate.

 Kiểm tra độ sai khác giữa mẫu nước ngọt và mẫu nước lợ bằng hai
phương pháp phân tích trên.

2


CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1 Sơ lược về nitơ
Cùng với phosphor nitơ đóng vai trò quan trọng, quyết định đến năng
suất thủy vực, hai yếu tố giới hạn sự phát triển của tảo. Việc quản lý hai yếu tố
này không hợp lý sẽ dẫn đến tình trạng phú dưỡng gây giảm chất lượng nước
ao nuôi (Boyd và Clay 1998; Hein 2002). Theo Boyd (2002) hàm lượng tổng
đạm không được vượt quá 3 mg/l cùng với tổng lân không nên vượt quá 0,1
mg/l để hạn chế sự ô nhiễm nguồn nước. Gross et al.(2000) và Xia et al.(2004)
theo dõi nguồn N và P trong ao nuôi thủy sản đã khẳng định rằng hàm lượng
N cùng với hàm lượng P tăng dần theo tuổi của ao nuôi.
Nitơ trong ao nuôi thủy sản có nhiều nguồn gốc khác nhau, nitơ có thể đi
vào ao nuôi từ không khí dưới dạng phân tử, nước mưa có chứa nitrate và các
dạng nitơ khác nhau đi vào qua quá trình cấp nước. Các nitơ vô cơ được đưa
vào từ phân bón và hữu cơ được đưa vào môi trường ao nuôi bằng con đường
thức ăn, phân hữu cơ và xác động thực vật bị phân hủy. Ngoài ra phân tử nitơ
được tảo lam và một số vi khuẩn cố định trong nước và dưới dạng các chất
hữu cơ có chứa nitơ trong cơ thể. Trong nước, nitơ trãi qua sự biến đổi theo
hoạt động sinh học gọi là chu trình nitơ.
Đặng Ngọc Thanh và Hồ Thanh Hải (2007) cho rằng chu trình nitơ là
một quá trình sinh hóa phức tạp, trong đó nitơ với các dạng khác nhau được
luân phiên biến đổi bởi sự cố định, sự đồng hóa và sự khử nitrate. Trong thực
tế, chu trình nitơ là quá trình vi sinh vật diễn ra trong tự nhiên. Chu trình nitơ
bao hàm sự cân bằng giữa lượng nitơ đầu vào và nitơ đầu ra từ hệ sinh thái
thủy vực.

2.1.

Chu trình nitơ trong ao nuôi thủy sản

Theo Boyd (1998) sự chuyển hóa nitơ trong ao nuôi bao gồm các quá
trình: hấp thu của thực vật, sự phân hủy nitơ trong hợp chất hữu cơ, nitrate
hóa, phản nitrate hóa và sự bay hơi của ammonia.
2.2.1.Hấp thu của thực vật
Thực vật sử dụng nitrate, ammonium để tổng hợp hợp chất hữu cơ cần
thiết cho sự phát triển của chúng bằng hình thức tự dưỡng, thực vật phù du
hấp thu một lượng lớn ammonium và trở thành nhân tố chi phối giới hạn
ammonia trong ao nuôi. Trong cơ thể thực vật, nitơ bị khử thành dạng
ammonia kết hợp với các carbon hữu cơ tạo thành acid amin, các acid amin
liên kết với nhau tạo thành protein. Nitơ được động vật dị dưỡng sử dụng gián
tiếp thông qua chuỗi thức từ thực vật phù du, sau khi động vật, thực vật chết
3


khi sẽ phóng thích một lượng đáng kể nitơ vào môi trường thông qua quá trình
phân hủy hợp chất hữu cơ có chứa nitơ. Nếu trong đất, sự cố định nitơ bởi sinh
vật và tạo thành một lượng nitơ lớn thì trong thủy vực sự cố định nitơ được
thực hiện bởi vi sinh vật trong nước và tảo lam tạo ra một lượng ít nitơ hơn, sự
cố định nitơ của tảo lam bao giờ cũng lớn hơn so với sự cố định nitơ của vi
khuẩn.
2.2.2 Sự phản nitơ trong hợp chất hữu cơ
Hầu hết động thực vật chết đi cùng với các hợp chất hữu cơ, điều trở
thành chất nền cho vi khuẩn làm thức ăn. Ammonia được sinh ra từ vi khuẩn
dị dưỡng được xem là sản phẩm sơ cấp và sản phẩm cuối cùng của sự phân
hủy protein và các hợp chất hữu cơ chứa nitơ khác. Sự phân hủy các xác hữu
cơ còn phụ thuộc vào nhiều yếu tố môi trường như nhiệt độ, pH, hàm lượng

oxy hòa tan, bản chất của chất hữu cơ. Sự phân hủy hợp chất hữu cơ tăng cùng
với nhiệt độ đến 40 oC trong khoảng nhiệt độ này, nếu nhiệt độ tăng lên 10 oC
thì quá trình phân hủy diễn ra nhanh hơn gấp đôi. Trong khoảng pH 7-8 là môi
trường thích hợp cho quá trình phân hủy, cho nên ở các ao nuôi có độ acid cao
cần bón thêm vôi để điều chỉnh pH thích hợp kích thích sự phân hủy hợp chất
hữu cơ trong thủy vực tránh trường hợp các phân hữu cơ không phân hủy nằm
dưới đáy ao và phản ứng kỵ khí sinh ra khí độc. Vật chất hữu cơ có hàm lượng
nitơ cao hơn so với hàm lượng carbon của nó thì quá trình phân hủy diễn ra
nhanh hơn và ngược lại hàm lượng carbon nhiều hơn khó phân hủy. Hàm
lượng ammonia được biểu thị bằng ion NH4+ và sẳn sàng được thực vật đồng
hóa trong tầng sinh sản dinh dưỡng.
2.2.3 Quá trình nitrate hóa
Trong điều kiện hiếu khí, vi khuẩn nitrate đã chuyển hóa ammonia thành
nitrite và chuyển thành nitrate. Quá trình nitrate hóa, vi khuẩn tham gia vào là
vi khuẩn tự dưỡng hóa tổng hợp. Vai trò trực tiếp của động vật trong chu trình
nitơ là rất nhỏ. Tuy nhiên trong một điều kiện nhất định, động vật ăn thực vật
có thể ảnh hưởng đến quần thể vi sinh vật và tốc độ chuyển hóa nitơ cũng như
tỉ lệ sử dụng nitơ bởi các cơ thể có khả năng tồng hợp. Sự oxy hóa ammonium
bởi giống vi khuẩn Nitrosomonas là bước đầu của quá trình nitrate hóa:
NH4+ + ½ O2 = NO2- + 2H+ + H2O
Bước tiếp theo là nitrite bị oxy hóa bởi vi khuẩn Nitrobacter chuyển
nitrite thành nitrate: NO2- +1/2O2 = NO3Các vi khuẩn này sử dụng năng lượng từ việc chuyển hóa nitrate này để
khử O2 thành carbon hữu cơ, nói cách khác là vi khuẩn này có khả năng hóa tự
4


dưỡng. Quá trình nitrate hóa là một loại quá trình quan trọng bởi nó giúp loại
bỏ dạng độc của nitơ trong thủy vực chuyển sang dạng chất dinh dưỡng, hai
loại vi khuẩn trên được ứng dụng cấy vào bể lọc sinh học để làm giảm bớt các
khí độc trong ao nuôi. Tuy nhiên quá trình nitrate hóa sinh ra H+ và sử dụng

oxy, cho nên sẽ hàm cho môi trường mất oxy và pH giảm.
2.2.4 Quá trình phản nitrate hóa
Trong điều kiện thiếu oxy nhiều vi sinh vật yếm khí có khả năng sử dụng
nitrate hay hợp chất nitơ oxy hóa khác như nguồn oxy và điện tử nhận hydro
trong quá trình hô hấp. Vì vậy, sự phân hủy hợp chất hữu cơ trong điều kiện
thiếu oxy có thể xảy ra và quá trình dị dưỡng này gọi là quá trình khử nitrate
hay phản nitrate hóa, bởi vì khí N2 được sử dụng như là chất trao đổi và mất
khỏi ao. Về mặt sinh lý, quá trình này được gọi là quá trình hô hấp nitrate.
Phản nitrate xảy ra trong đất ao nuôi có hàm lượng oxy hòa tan thấp, và làm
mất một lượng lớn nitơ trong ao:
6NO3 + 5CH3OH = 5CO2 + 3N2 + 7H2O + 6OHTrong ao nuôi thủy sản, cần hạn chế quá trình phản nitrate xảy ra. Quá
trình phản nitrate làm mất một lượng lớn N2, sinh ra khí độc. Cho nên chúng ta
cần cung cấp một lượng oxy nhất định trong quá trình nuôi. Cày, bừa phơi đáy
ao tốt, kích thích vi khuẩn hiếu khí phát triển.
2.2.5 Sự bay hơi của ammonia trong ao nuôi
Hàm lượng N2 trong nước bao giờ cũng cân bằng với hàm lượng N2
trong khí quyển. Nhưng trong một số trường hợp khi áp lực khí ammonia
trong nước lớn hơn áp lực ammonia trong không khí thì ammonia thoát trực
tiếp ra khỏi ao vào không khí. Quá trình này xảy ra nhiều ở pH bằng 9 (Boyd,
1998). Sự bay hơi của ammonia không có ý nghĩa, bởi ở pH bằng 9 điều
không thích hợp cho việc nuôi trồng thủy sản. Nhưng rất có ý nghĩa trong
phòng thí nghiêm, trong việc phân tích các chỉ tiêu tổng đạm.
2.2.6 Sự cố định đạm trong trong tự nhiên và trong ao nuôi
Ngoài các quá trình chuyển hóa nitơ trong ao nuôi được Boyd đề cập
trên, quá trình cố định N2 đóng vai trò quan trọng trong thủy vực chưa được đề
cập. Đặc biệt là sự cố định N2 ở tảo lam, bao giờ cũng lớn hơn so với sự cố
đinh N2 ở vi khuẩn. Sự phát triển quá mức của tảo Lam (Vũ Ngọc Út, 2008) ở
hầu hết tất cả các điểm khảo sát cho thấy có sự mất cân bằng về chất dinh
dưỡng giữa tỉ lệ TN và TP. Trong thủy vực tỉ lệ N:P thấp thường là điều kiện
thích hợp cho sự phát triển của tảo Lam, tảo này ít xuất hiện trong điều kiện tỉ

lệ N:P vượt quá 29:1 (Gross & Pfiester, 1988).

5


Cố định đạm trước hết đòi hỏi sự hoạt hoá phân tử nitơ để tách nó thành
2 nguyên tử, trong cố định nitơ sinh học thì đó là bước đòi hỏi năng lượng là
160 Cal/mol. Khi kết hợp nitơ với hydro tạo thành amoniac. Tất cả các sinh
vật cố định nitơ đều cần năng lượng từ bên ngoài, mà các hợp chất cacbon
đóng vai trò đó để thực hiện những phản ứng nội nhiệt (Endothermic). Trong
quá trình cố định đạm, vai trò điều hoà chính là 2 loại enzym: nitrogenase và
hydrogenase; chúng đòi hỏi nguồn năng lượng rất thấp.
Trong tự nhiên, cố định đạm xảy ra bằng con đường hoá - lý và sinh học,
trong đó con đường sinh học có ý nghĩa nhất và cung cấp 1 khối lượng lớn
đạm dễ tiêu cho môi trường đất. Sự cố định đạm bằng điện hoá và quang hoá
trung bình hàng năm tạo ra 7,6 triệu tấn (4-10kg/ha/năm), còn bằng con đường
sinh học khoảng 54 triệu tấn.
Những sinh vật có khả năng cố định đạm là vi khuẩn và tảo. Chúng gồm
2 nhóm chính: Nhóm sống cộng sinh (phần lớn là vi khuẩn, một số ít tảo và
nấm) và nhóm sống tự do (chủ yếu là vi khuẩn và tảo). Vi khuẩn cố định đạm
sống cộng sinh gặp nhiều trong đất, ngược lại các loài cố định đạm sống tự do
lại gặp nhiều trong nước và trong đất. Song nhóm cộng sinh về mặt số lượng
có vai trò quan trọng hơn, gấp trăm lần nhóm sống tự do. Ngoài những vi
khuẩn cố định đạm cần năng lượng lấy từ nguồn cacbon bên ngoài, còn có loài
vi khuẩn tía (Rhodopseudomonas capsulata) có thể sinh sống bằng nitơ phân
tử trong điều kiện kỵ khí mà ánh sáng được sử dụng như một nguồn năng
lượng (Madigan, 1979). Trong môi trường nước, vi sinh vật cố định nitơ khá
phong phú. Ở đây thường gặp những loài vi khuẩn kỵ khí thuộc các chi
Clostridium, Methano, Bacterium, Methanococcus, Desulfovibrio và một số vi
sinh vật quang hợp khác. Ở những nơi thoáng khí thường gặp các đại diện của

Azotobacteriaceae (như Azotobacter) và các loài tảo (vi khuẩn lam) thuộc các
giống Anabaena, Aphanozinemon, Nostoc, Microcystis, Nodularia,
Gloeocapsa. Để hoạt hoá nitơ, những sinh vật tự dưỡng sử dụng năng lượng
của quá trình quang hoá hoặc hoá tổng hợp, còn các vi sinh vật dị dưỡng sử
dụng năng lượng chứa trong các hợp chất hữu cơ có sẵn trong môi trường. Sự
cố định nitơ của tảo lam bao giờ cũng lớn hơn so với sự cố định nitơ của vi
khuẩn. Sự cố định nitơ của tảo lam phụ thuộc vào ánh sáng và bao giờ cũng
phù hợp với sự phân bố theo không gian và thời gian của tảo lam.
Nếu trong đất, sự cố định nitơ bởi vi sinh vật tạo thành một lượng nitơ
lớn thì trong thủy vực sự cố định nitơ vởi vi sinh vật và tảo ít hơn. Các cơ thể
cố định nitơ chuyển nitơ thành các phân tử nitơ khí quyển thành ammonia.
Quá trình cố định nitơ là một quá trình tạo năng lượng thừa thãi nhưng một số
lượng lớn các cơ thể sinh vật đã thực hiện được điều đó bao gồm cả vi khuẩn
6


quang tổng hợp và dị dưỡng trong điều kiện hiếu khí lẫn trong điều kiện yếm
khí. Quá trình này có thể diễn ra trong điều kiện cộng sinh lẫn không cộng
sinh (Đặng Ngọc Thanh, Hồ Thanh Hải, 2007).
Theo Đặng Ngọc Thanh và Hồ Thanh Hải nitơ hữu cơ hòa tan (DON)
thường chiếm 50% tổng lượng nitơ hòa tan trong nước ngọt. Trên một nửa
DON là chất nitơ amino, hầu hết dưới dạng polypeptit và hợp chất nitơ phức
hợp. Tỷ số của DON với nitơ dạng hạt (PON) ở suối và hồ bao giờ cũng từ 5/1
đến 10/1. với hồ phú dưỡng hơn thì tỷ số DON/PON giảm. Sự phân bố nitơ
trong hồ có thể biến đổi nhanh chống. Thí dụ, sự phân bố nitơ ở tầng nước sâu
biểu thị rằng hồ đang trơ nên có khả năng sản sinh hơn, hàm lượng của nitrate
và NH4+ trong tầng sản sinh dinh dưỡng có thể bị giảm chút ít bởi sự đồng hóa
quang tổng hợp. Tảo lam có khả năng cố định nitơ có thể trở nên chiếm ưu
thế. Trong tầng nước sâu, yếm khí, hàm lượng NH4+ được tích lụy trầm tích
trong điều kiện yếm khí.

Có nhiều nitơ tổng số trong lớp trầm tích dưới dạng không có khả năng
sử dụng sinh học. Trong số đó, có một số có khả năng sử dụng dưới dạng hòa
tan trong tầng nước và trong khối nưới sát trầm tích đáy (và cả thảm thực vật
ven bờ của hồ có khả năng sản sinh). Tốc độ xoay vòng NH4+ diễn ra nhanh
trong nước nhưng chậm trong lớp trầm tích. Ngược lại, NO3 vay vòng chậm
trong nước nhưng nhanh trong lớp trầm tích mà ở đó, trong điều kiện yếm khí
ở hồ phú dưỡng, NO3- nhanh chống bị khử thành N2.
Lượng nitơ vô cơ tăng trong sông, hồ bởi các hoạt động nông nghiệp,
hoặc từ nước thảy và từ ô nhiễm khí quyển do con người tạo ra. Trong các hồ
nghèo dinh dưỡng, không có khả năng sản sinh thì phosphor lại là chất dinh
dưỡng giới hạn sự phát triển của thực vật. Lượng phosphor tới các thủy vực
nước ngọt tăng lên làm cho thủy vực đó có khả năng sản sinh hơn thì nitơ lại
trở thành chất dinh dưỡng giới hạn phát triển thực vật.
2.2. Sơ lược về phương pháp Kjeldahl (APHA 1999 Method 4500-N org
B)
Phương pháp Kjeldahl được nhà hóa học người Đan Mạch, Johan
Christoffer Thorsager Kjeldahl (1849-1900) phát triển vào năm 1883. Để xác
định hàm lượng nitơ trong một số hợp chất hữu cơ bằng kỹ thuật phòng thí
nghiệm (laboratory technique) và sau này gọi là phương pháp Kjeldahl.
Nguyên tắc của phương pháp kjeldahl là các dạng đạm hữu cơ bị oxy hóa
bởi acid H2SO4 đậm đặc với chất xúc tác là K2SO4 và CuSO4 hoặc H2O2 trong
điều kiện nhiệt độ cao (375-385 oC) hợp chất sẽ chuyển hóa hoàn toàn thành
đạm ammonium (NH4+), ammonia cũng chuyển thành ammonium, sau khi
7


thêm dung dịch baz, ammonium sẽ hòa tan trong kiềm và bị hấp thụ bởi acid
boric hay acid sulfuric, ammonia có thể xác định bằng phương pháp so màu
quang phổ Indophenol blue.
Các dạng lân hữu cơ cũng bị oxy hóa trong điều kiện tương tự như đạm

hữu cơ, sẽ chuyển hóa hoàn toàn thành orthophosphate. Orthophosphate có thể
được xác định bằng phương pháp so màu quang phổ ascorbic acid hay xanh
molypden. Do đó, để oxi hóa tổng đạm và tổng lân ta có thể oxi hóa cùng một
mẫu, sau đó tiến hành phân tích hai chỉ tiêu bằng phương pháp phân tích các
chỉ tiêu muối đạm và muối lân vô cơ.
Thiết bị:
Để thực hiện quá trình vô cơ hóa đạm, lân hữu cơ, chúng ta cần dùng
máy oxi hóa mẫu (digestion apparatus). Hiện nay trên thị trường có bán rất
nhiều máy oxi hóa mẫu, có thể cài đặt chương trình điều khiển trong quá trình
oxi hóa mẫu
Tiến trình oxi hóa mẫu
Chuẩn bị các mẫu nước (V = 50 ml hoặc 100 ml) cho vào các ống oxi
hóa, sử dụng 2-3 ống mẫu trăng (nước cất), thêm 2-3 viên sỏi loại chuyên
dụng cho quá trình oxi hóa (chống nước bị bắn ra khi sôi) vào mỗi ống. Thêm
mỗi ống và mẫu nước trắng 10 ml H2SO4 đặm đặc, trộn điều, đợi đến khi mẫu
nguội lại.
Sau khi nguội, thêm 10 ml H2O2 đậm đặc (có thể dùng 6,7g K2SO4 và
0,365g CuSO4, để mẫu qua đêm trước khi oxi hóa.
Mở máy oxi hóa và máy hút (quá trình oxi hóa nước bốc hơi nên thường
dùng máy hút).
Cài đặt chương trình điều khiển nhiệt độ:
- Temp 1: 110 oC, giữ nhiệt độ này khoảng 20 phút(không tính thời gian lúc
nhiệt độ từ nhiệt độ phòng tăng lên đến 110 oC)
- Temp 2: 200 oC, giữ nhiệt độ này trong 20 phút (không tính thời gian nhiệt
độ từ 110 oC lên đến 200 oC)
- Temp 3: 300 oC, giữ nhiệt độ này đến khi mẫu oxi hóa có màu trắng, chú ý
có thể tăng nhiệt độ oxi hóa lên đến 375 oC, nhiệt độ càng cao thì thời gian
oxi hóa mẫu càng ngắn.
- Tổng thời gian oxi hóa ở 3 bước trên ước tính khoảng 90 phút.
- Sau khi quá trình oxi hóa hoàn thành, tắt máy, để nguội.

8


Khi các mẫu đã được oxi hóa và nguội hoàn toàn, pha loãng phần acid còn dư
trong quá trình oxi hóa với 25 ml nước cất không đạm rồi đổ toàn bộ nước này
vào ống đông (V = 250 ml). trung hòa dung dịch bằng cách nhỏ từng giọt
NaOH 40% (10M) có sự hiện diện của chất chỉ thỉ para-nitro-phenol (4-nitrophenol), sau đó chuẩn lại môi trường acid bằng vài giọt H2SO4 20%, dung dịch
sau cùng được thêm vào 1 giọt H2SO4 20% để giữ dung dịch có môi trường
pH dưới 7,0 ( từ 5,0-7,0).
Xác định hàm lượng tổng đạm (TN)
Xác định hàm lượng đạm của mẫu nước (TAN) bằng phương pháp
Indophenol blue và orthophosphate bằng phương pháp xanh Molypden.
Với phương pháp kjeldahl, kết quả hàm lượng đạm thu được gọi là tổng
đạm kjeldahl. TKN bao gồm hàm lượng đạm hữu cơ và TAN có trong mẫu
nước . Trong trường hợp này tổng đạm là tổng hàm lượng đạm TKN cộng với
hàm lượng nitrite, nitrate thu được.
Nếu trước khi oxi hóa mẫu, chúng ta loại bỏ TAN bằng cách nâng pH của
mẫu nước lên 9,5. Khi đó NH4+ sẽ chuyễn hóa hoàn toàn thành NH3. Đun nhẹ
mẫu NH3 sẽ thoát ra công khí, sau đó mới oxi hóa mẫu. Trong trường hợp này
kết quả hàm lượng đạm thu được chính là hàm lượng đạm hữu cơ.
Hàm lượng lân thu được từ phương pháp kjeldahdl thu được chính là tổng
lân.
2.3 Sơ lược về phương pháp Persulfate(APHA 1999 Method 4500-NH 3 C)
Trong môi trường kiềm ở nhiệt độ 110 oC, đạm hữu cơ và đạm vô cơ bị
oxy hóa bởi K2S2O8 sẽ chuyển hóa thành nitrate (NO3-), lân hữu cơ cũng bị
oxy hóa thành orthophosphate.
Thuốc thử:
NaOH 1M: hòa tan 40 gam NaOH trong 800 ml nước cất, để nguội rồi pha
thành 1000 ml

Thuốc thử oxy hóa: hòa tan 50 gam Potassium peroxodisulfate và 30 gam acid
boric trong 350 ml NaOH 1M rồi pha thành 1000 ml với nước cất, bảo quảng
trong chai nút mài.
Tiến trình
Dùng lọ nhựa 30ml, cho vào 25ml mẫu nước và mẫu chuẩn, rồi thêm
3,3 ml thuốc oxy hóa, trộn điều.

9


Đậy nắp lọ nhựa rồi cho vào nồi autoclave, khoảng 20 phút ở 1210C và
áp suất 15 psi. cho phép làm lạnh 1 giờ.
Thực hiện ít nhất 3 mẫu trắng bằng nước cất trong suốt.
Xác định hàm lượng tổng đạm(TN)
Hàm lượng tổng đạm có thể xác định được bằng phương pháp phân tích
các chỉ tiêu NO3-. Lân hữu cơ cũng bị oxy hóa thành orthophosphate và xác
định bằng phương pháp xanh Molypden ( kết quả hàm lượng đạm phân tích
được trong phương pháp Persulfate là tổng đạm (bao gồm: nitrite, nitrate,
TKN) và hàm lượng lân thu được là tổng lân.
Phương pháp Griess llosvay, Diazonium
Nguyên tắc:
NO2 trong môi trường acid mạnh sẽ hình thành HNO2, HNO2 mới hình
thành kết hợp với acid sulfanilique cho ra muối Diazonium sulfanilique.
NaNO 2  HCl  HSO 3  C 6 H 4  NH 2  HSO 3  C 6 H 4  N  N  Cl  NaCl  H 2 O

Sau đó muối diazonium sulfanilique sẽ kết hợp với thuốc thử napthylamine diazinium sulfanilique.
HSO 3  C 6 H 4  N  N  Cl  C10H 9 NH 2  HSO 3  C 6 H 4  N  N  C10 H 9 NH 2  HCl

-Napthylamine diazonium sulfanilique là một hợ chất có màu hồng. Cường
độ đậm nhạt phụ thuộc vào hàm lượng NO2-có trong mẫu lúc đầu. Nồng độ

NO2- được đo bằng phương pháp so màu quang phổ ở bước sóng 543 nm.

10


CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
3.1 Vật liệu nghiên cứu
3.1.1 Dụng cụ
 Máy oxi hóa đạm kjeldahl DK 20
 Máy oxi hóa đạm persulfate: Autoclave SA 232
 Máy đo quang phổ
 Cột khử cadmium
 Cốc thủy tinh
 Bình định mức
 Các dụng cụ khác
3.1.2 Hóa chất
 Dung dịch H2SO4đặm đặc
 Dung dịch H2O2 đặm đặc
 K2S2O8
 Dung dịch HCl
 Nước cất
 Dung dịch Acid glutamic
 Hóa chất khác
3.2 Phương pháp nghiên cứu
3.2.1 Thời gian và địa điểm thực hiện
Đề tài được thực hiện từ tháng 3 đến tháng 7 năm 2012. Tại Phòng thí
nghiệm phân tích chất lượng nước, Khoa Thủy sản trường Đại học Cần Thơ.
3.2.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm
Nghiên cứu bao gồm 4 thí nghiệm
Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của thời gian lên quá trình oxi hóa lên hiệu suất

phân tích nitơ của phương pháp oxi hóa Persulfate
Mục tiêu của thí nghiệm là nhằm xác định thời gian oxi hóa thích hợp để
để đạt được hiệu xuất thu hồi cao nhất. Acid glutamic chứa 10 mgN/L dùng
làm mẫu chuẩn với 3 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức phân tích 20 mẫu lặp lại.
+ Nghiệm thức 1: oxi hóa 20 phút

11


+ Nghiệm thức 2: oxi hóa 40 phút
+ Nghiệm thức 3: oxi hóa 60 phút
Mỗi nghiệm thức lặp lại 20 lần, sản phẩm cuối cùng sinh ra dạng NO3được xác định bằng phương pháp cột khử Cadmium.
Thí nghiệm 2: Đánh giá độ sai số giữa hai phương pháp khử cột Cadmium và
Salicylate trong phân tích NO3- (thành phần trong tổng đạm).
Mục tiêu của thí nghiệm là lựa chọn phương pháp xác định hàm lượng
NO3 sau quá trình oxi hóa mẫu theo phương pháp Persulfate hoàn tất. Acid
Glutamic có nồng độ 10 mgN/L được dùng làm mẫu chuẩn, tiến hành oxi hóa
bằng phương pháp Persulfate với khoảng thời gian thích hợp được xác định ở
thí nghiệm 1. Sau khi kết thúc, hàm lượng NO3- sinh ra được xác định bằng
hai phương pháp. Thí nghiệm gồm 2 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức phân tích
20 mẫu lặp lại. Acid glutamic 10 mgN/L được dùng làm mẫu chuẩn để phân
tích.
-

+ Nghiệm thức 1: Phương pháp xác định khử Cadmium và so màu Diazonium
+ Nghiệm thức 2: Phương pháp xác định thông qua tạo muối Salicylate
Thí nghiệm 3: So sánh độ sai số trong việc phân tích tổng đạm bằng phương
pháp oxi hóa Kjeldahl và Persulfate
Thí nghiệm bao gồm 5 thí nghiệm nhỏ với các nồng độ của acid glutamic
ở các nồng độ khác nhau. Nếu hai phương pháp cho kết quả thu hồi giống

nhau ta dùng biểu đồ kiểm soát (Property control chart) để kiểm tra sai số
trong quá trình phân tích.
Thí nghiệm 3.1: acid glutamic chuẩn 2 mgN/L.
Thí nghiệm gồm 2 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức phân tích 20 mẫu lặp.
+ Nghiệm thức 1: Phương pháp Persulfate
+ Nghiệm thức 2: Phương pháp Kjeldalh
Thí nghiệm 3.2: acid glutamic chuẩn 5 mgN/L.
Thí nghiệm gồm 2 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức phân tích 20 mẫu lặp.
+ Nghiệm thức 1: Phương pháp Persulfate
+ Nghiệm thức 2: Phương pháp Kjeldalh
Thí nghiệm 3.3: acid glutamic chuẩn 10 mgN/L.
Thí nghiệm gồm 2 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức phân tích 20 mẫu lặp.

12


+ Nghiệm thức 1: Phương pháp Persulfate
+ Nghiệm thức 2: Phương pháp Kjeldalh
Thí nghiệm 3.4: acid glutamic chuẩn 20 mgN/L.
Thí nghiệm gồm 2 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức phân tích 20 mẫu lặp.
+ Nghiệm thức 1: Phương pháp Persulfate
+ Nghiệm thức 2: Phương pháp Kjeldalh
Thí nghiệm 3.5: acid glutamic chuẩn 50 mgN/L.
Thí nghiệm gồm 2 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức phân tích 20 mẫu lặp.
+ Nghiệm thức 1: Phương pháp Persulfate
+ Nghiệm thức 2: Phương pháp Kjeldalh
Thí nghiệm 4: kiểm tra mẫu thực
Mục đích thí nghiệm này là đánh giá độ sai khác của 2 phương pháp khi phân
tích mẫu thực trong ao nuôi thủy sản. Thí nghiệm đánh giá áp dụng 2 phương
pháp trong phân tích tích mẫu trong ao nuôi cá nước ngọt (cá tra) và ao nuôi

nước lợ (tôm thẻ chân trắng). Mỗi moii trường nước ngọt và lợ đều được phân
tích tổng đạm bằng 2 phương pháp Persulfate và Kjeldalh.
3.2.3 Phương pháp phân tích mẫu
Phương pháp kjeldahl
Thu mẫu và bảo quản: Thu mẫu vào bình 1lít và bảo quản mẫu lạnh cho đến
khi phân tích mẫu xong
Chuẩn bị:
- Dung dịch H2SO4 98%.
- Dung dịch H2O2 30%: Pha 600 ml H2O2 50% thành 1.000 ml với nước
cất.
- Dung dịch 4-nitrophenol 0.2%: cân 0.2g 4-nitrophenol hoà tan với nước
cất thành 100 ml.
- Dung dịch NaOH 10N: hòa tan 400g NaOH với nước cất thành
1000ml.
Tiến hành:
- Đong 50 ml mẫu vào ống oxi hóa và đồng thời làm một mẫu trắng bằng
nước cất.

13


- Cho vào 5 ml H2SO4 98%.
- Để nguội, tiếp tục cho vào 2 ml H2O2 30%.
- Oxi hóa trên hệ thống Kejdalh với thời gian và nhiệt độ đã được set up
sẵn..
Chú ý: Sau khi oxi hóa nếu mẫu chưa trắng (mẫu chưa oxi hóa hết thì tiếp tục
thêm 1 ml H2O2 và oxi hóa tiếp (để nguội mới thêm vào để phòng nguy hiểm).
- Oxi hóa xong, để nguội.
-

Pha loãng bằng một ít nước cất cho vào bình định mức.

- Nhỏ vào 3 giọt nitrophenol.
- Chuẩn độ bằng NaOH 10 N đến khi dung dịch vừa có màu vàng.
- Để nguội.
- Dùng H2SO4 1:3 chuẩn độ cho đến khi dung dịch không màu.
- Pha loãng bằng nước cất đến 100 ml.
Chú ý: Để mẫu lắng sau 24 giờ mới đem phân tích.
Đo Tổng đạm kjeldahl :
Lấy 5 ml mẫu nước đã oxi hóa + 20ml nước cất và dùng phương pháp
Idophenol blue để xác định TAN.
Xác định hàm lượng TAN bằng phương pháp Indophenol Blue (APHA et
al,1995)
Chuẩn bị thuốc thử:
Nước cất không đạm: hòa tan 2 ml FeSO4.7H2O có nồng độ 100 g/l vào 1000
ml nước máy, thêm vào 0,1-0.2 ml H2SO4 đậm đặc để hạ pH xuống dưới 4,5
(phản ứng với chỉ thị methyl cam). Sau đó, chưng cất đến khi còn lại ¼ thể
tích, loại bỏ 50 ml nước đầu.
Dung dịch A: Hòa tan 11,1 ml phenol(>89%) với ethanol 95% thành 100ml.
Dung dịch được sử dụng trong một tuần.
Dung dịch B: Hòa tan 0.5g Sodium Nitroprusside với 100 ml nước cất không
đạm. Chứa trong lọ nâu và được sử dụng trong một tháng.
Dung dịch C: Hòa tan 20 g Trisodium citrate và 1g NaOH với nước cất không
đạm thành 100 ml, sau đó thêm vào 25 ml NaOCl 5%. Dung dịch C được
chuẩn bị và sử dụng hết trong một ngày.
Dung dịch chuẩn:

14

 Dung dịch stock N-NH4 500 mg/l: Hòa tan 0.2358 g (NH4)2SO4 với nước
cất không đạm thành 100 ml.
 Dung dịch chuẩn N-NH4 10 mg/l: pha 1 ml dung dịch stock (500 mg/l) với
nước cất không đạm thành 50 ml.
Tiến hành phân tích:
 Chuẩn bị đường chuẩn:
Chuẩn bị 6 ống nghiệm và nước cất không đạm: từ dung dịch chuẩn ta
dùng nước cất không đạm pha thành 5 ml với nồng độ giảm một nữa dần từ
ống đâu tiên là 1 mg/l và ống số 5 là 0,0625 mg/l ống số 6 không có nồng độ
(5 ml nước cất không đạm)
Thêm lần lượt các thuốc thử sau:
 4 giọt dung dịch A, lắc điều
 4 giọt dung dịch B, lắc điều
 10 giọt dung dịch C, lắc điều.
Đậy mẫu, ủ trong nhiệt độ phòng và trong điều kiện ánh sáng yếu trong
vòng 30 phút. Đo độ hấp thụ quang ở bước sóng 630 nm ở nước ngọt và 640
nm ở nước lợ.
Tính kết quả
Dựa vào nồng độ tương quan giữa nồng độ C và độ hấp thụ quang A của mẫu
chuẩn , lập phương trình tương quang dạng:
A = aC+b.
Trong đó:
A: độ hấp thụ quang,
C: nồng độ của mẫu chuẩn (mg/l)
Từ đó suy ra nồng độ của mẫu cần phân tích: C M 

AM  b
.
a

Sau khi biết được tổng nitơ Kjeldahl ta tiếp tục xác định hàm lượng nitrite và
nitrate tự do trong nước
Xác định hàm lượng NO3- bằng phương pháp khử cadmium và so màu
diazonium(APHA et al,1995)
Chuẩn bị thuốc thử:

15


Nước cất không chứa NO2- : Thêm vào 1 lít nước cất 1 ml H2SO4 đậm đặc, 0,2
ml MnSO4 (36,4 g MnSO4.H2O /100 ml) và 1-3 ml KMnO4. sau đó chưng cất
lại, loại bỏ 50ml nước đâu. Dùng nước này để pha dung dịch và mẫu chuẩn,
thuốc thử.
Thuốc thử: cân 0,2 g N-1-Naphthylethylenesiamine Dihydrochloride, 2 g
Sulfanilamide pha, trộn 2 hỗn hợp với nhau thêm khoảng 50 ml nước cất
không đạm không nitrite vào, dùng đũa thủy tình khuấy điều cho vào bình
định mức thêm 20 ml dung dịch acid sulfuric đậm đặc và định mức thành 100
ml
Dung dịch chuẩn
 Dung dịch NaNO2 500 mg/l: Sử dụng dung dịch NaNO2 500 mg/l do nhà
sản xuất cung cấp hoặc hòa tan 0,2463g NaNO3 trong 100 ml nước cất.
 Dung dịch NaNO2 10 mg/l : hòa tan 2 ml dung dịch NaNO2 500 mg/l với
nước cất thành 100 ml
Thiết lập đường chuẩn:
Chuẩn bị 6 ống nghiệm để sẵn 5 ml thể tích nước cất không đạm không
nitrite riêng ống sau cùng ( ống thứ 6) chưa 9 ml nước cất, sau đó hút 1 ml
dung dịch mẹ vào ống 6 ta được dung dịch NaNO2 1 mg/l, sau đó giảm một
nữa nồng độ dần, bằng cách hút một nữa thể tích dd ống 6 qua 5, 5 qua
4….đến ống 2 ta hút một nữa còn dư của ống 2 bỏ, vậy nồng độ của ống 1
bằng 0.

Lần lược cho 0,2 ml thuốc thử vào các ống nghiệm, chờ dung dịch có
màu hồng, tiến hành đo mẫu ở bước sóng 540 nm.
Mẫu được lọc qua cột cadmium để khử NO2 thành NO3-, sau đó cho
thuốc thử vào, thao tác tương tự như mẫu đường chuẩn, tiến hành so màu
diazonium. Nồng độ NO3- của mẫu được tính dựa vào phương trình đường
chuẩn và hiệu suất cột khử.
Tính kết quả:
Kết quả phân tích của tổng nitơ kjeldahl được tính như sau:
TKNwater = (a - ablank )*(100/50)*(25/5)
Tổng nitơ trong mẫu nước ta có là:
TNwater=TKNwater + [NO2-] + [NO3-]

16


Phương pháp Persulfate theo APHA, 1998 (Method 4500-N C. Persulfate
method)
Thu mẫu: Thu mẫu vào chai nhựa 1 lít, trữ lạnh
Chuẩn bị hoá chất:
Dung dịch oxy hóa: 20.1 g Postassium persulfate (< 0.001 %N) và 3 g NaOH
khan bằng 800 ml nước cất. Sau đó định mức thành 1000 ml, trữ trong bình
repipet để sử dụng.
Dung dịch đệm borate: hòa tan 60.8 g H3BO3 và 8 g NaOH khan bằng 800 ml
nước cất. Sau đó định mức thành 1000 ml, trữ trong bình repipet để sử dụng.
Dung dịch NaOH 6N: hòa tan 12 g NaOH khan với 35 ml nước cất và chuẩn
về 50 ml. Trữ trong chai nâu, ở nhiệt độ thấp để sử dụng.
Tiến hành:
-

Hút 10 ml nước mẫu (lưu ý: không lọc mẫu) vào ống công phá

-

Thêm vào 5 ml dung dịch oxy hóa, đậy chặt lắc điều

-

Autoclave trong 20 phút ở 121 oC

-

Làm lạnh ở nhiệt độ phòng

-

Thêm vào 1 ml dung dịch đệm borate (đậy nắp lắc điều)

-

Thêm 3 giọt dung dịch NaOH 6 N ( đậy nắp lắc điều)

-

Định mức với nước cất thành 50 ml

-

Phân tích NO3- bằng cột khử Cadmium và so màu Diazonium

Tính kết quả: Hàm lượng NO3- đo được cũng chính là hàm lượng nitơ tổng số.

3.2.4 Phương pháp thu và xử lý số liệu
Số liệu trong từng thí nghiệm được tính trung bình theo nghiệm thức, độ lệch
chuẩn. Sử dụng phần mềm Statistica 6.0 để xử lý thống kê sự khác biệt giữa
các nghiệm thức ở mức ý nghĩa p = 0,05.

17


CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Ảnh hưởng của thời gian lên quá trình oxy hóa và hiệu suất thu hồi
nitơ của phương pháp Persulfate
Kết quả ở Hình 1 và Bảng 1 cho thấy sự khác nhau giữa các thời gian
oxi hóa có ý nghĩa thống kê (p < 0,05), thời gian công phá càng kéo dài thì
nồng độ phần trăm đạt được so với chuẩn (10 mg/l) càng thấp. Điều này thể
hiện rõ ở cả 3 mức thời gian khác nhau. Ở thời gian oxi hóa khoảng 20 phút
cho kết quả phân tích cao nhất (92%) so với thời gian 40 phút (44,1%) và 60
phút (11,87%).
Khảo sát các bước thực hiện của một phương pháp để tiến hành so sánh
các phương pháp với nhau là vấn đề đặt ra nhằm tối ưu hóa phương pháp thực
hiện. Với phương pháp Persulfate quá trình chuyển hóa các hợp chất hữu cơ
và phi hữu cơ có chứa nitơ trở về dạng nitrate để định lượng tổng nitơ (TN) có
liên quan đến một vài yếu tố như: môi trường oxy hóa, thời gian oxy hóa, chất
oxy hóa, lượng nitơ có trong mẫu… Đối với môi trường oxy hóa, một vài tác
giả (Elia et al.,1977; Ehina et al.,1983; Housumi và Sudo,1986) đã thừa nhận
quá trình oxy hóa xảy ra hoàn toàn ở môi trường kiềm có khoảng pH=12 lúc
bắt đầu, sau đó pH giảm dần trong quá trình oxi hóa, hoàn tất quá trình oxy
hóa phá sinh ra sản phẩm cuối cùng là nitrate ở trong khoảng pH= 2.
110
100

a

90
80

%

70
60

b

50
40
30

c

20
10
0
20 phút

40 phút

60 phút

Hình 1: Kết quả oxy hóa mẫu chuẩn 10 mgN/L ở khoảng thời gian khác nhau

4.2. Đánh giá độ sai số giữa hai phương pháp khử cột Cadmium và

Salicylate trong phân tích NO3- (thành phần trong tổng đạm).
18