ẢNH HƯỞNG của NỒNG độ và THỜI GIAN xử lý ORYZALIN lên sự SINH TRƯỞNG và PHÁT TRIỂN của CHỒI GỪNG (zingiber officinalerosc )

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG
-oOo-

VÕ PHƯƠNG TRINH

ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ VÀ THỜI GIAN XỬ
LÝ ORYZALIN LÊN SỰ SINH TRƯỞNG VÀ
PHÁT TRIỂN CỦA CHỒI GỪNG
(Zingiber officinale Rosc.)

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP
Ngành: CÔNG NGHỆ GIỐNG CÂY TRỒNG

Cần Thơ, 2012


TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG
-oOo-

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

Tên đề tài:
ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ VÀ THỜI GIAN XỬ
LÝ ORYZALIN LÊN SỰ SINH TRƯỞNG VÀ
PHÁT TRIỂN CỦA CHỒI GỪNG
(Zingiber officinale Rosc.)

Cán bộ hướng dẫn:
PGS.TS LÂM NGỌC PHƯƠNG

Cần Thơ, 2012

Sinh viên thực hiện:
Võ Phương Trinh
MSSV: 3083457
Lớp: CNGCT K34


TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG
-oOo-

Chứng nhận đã chấp nhận luận văn tốt nghiệp với đề tài:

ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ VÀ THỜI GIAN XỬ
LÝ ORYZALIN LÊN SỰ SINH TRƯỞNG VÀ
PHÁT TRIỂN CỦA CHỒI GỪNG
(Zingiber officinale Rosc.)
Do sinh viên Võ Phương Trinh thực hiện

Kính trình lên Hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp

Cần Thơ, ngày … tháng … năm 2012
Cán bộ hướng dẫn

PGS.TS. Lâm Ngọc Phương

ii

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân. Các số liệu, kết
quả trình bày trong luận văn tốt nghiệp là trung thực và chưa từng được ai công bố
trong bất kỳ luận văn nào trước đây.

Cần Thơ, ngày… tháng… năm 2012
Tác giả luận văn

Võ Phương Trinh

iii


TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG
-oOo-

Hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp đã chấp nhận luận văn tốt nghiệp kỹ sư ngành
Công nghệ giống cây trồng với đề tài:

ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ VÀ THỜI GIAN XỬ
LÝ ORYZALIN LÊN SỰ SINH TRƯỞNG VÀ
PHÁT TRIỂN CỦA CHỒI GỪNG
(Zingiber officinale Rosc.)
Do sinh viên Võ Phương Trinh thực hiện và bảo vệ trước Hội đồng.
Ý kiến của Hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp:………………………………. …….
………………………………………………………………………………………..
…………………………………………………………………………………..........
………………………………………………………………………………………..

Luận văn tốt nghiệp được đánh giá ở mức: ………………………………………….
Cần Thơ, ngày… tháng…. năm 2012
Thành viên Hội đồng

……………………..

…………………….

……………………….

Duyệt Khoa
Trưởng khoa Nông Nghiệp và Sinh học Ứng dụng

…………………………

iv


TIỂU SỬ CÁ NHÂN
I. LÝ LỊCH SƠ LƯỢC
Họ và tên: Võ Phương Trinh

Giới tính : Nữ

Ngày, tháng, năm sinh : 10/01/1990

Dân tộc: Kinh

Nơi sinh: Huyện Tam Bình, Tỉnh Vĩnh Long
Họ tên cha: Võ Văn Lộc

Sinh năm: 1958

Họ tên mẹ: Lê Lệ Thắm

Sinh năm: 1958

Quê quán: Huyện Tam Bình, Tỉnh Vĩnh Long
II. QUÁ TRÌNH HỌC TẬP
1. Tiểu học
Thời gian đào tạo: 1996 đến năm 2001
Trường: Tiểu học Ngãi Tứ A
Địa chỉ: Huyện Tam Bình, Tỉnh Vĩnh Long
2. Trung học cơ sở
Thời gian đào tạo: 2001 đến năm 2005
Trường: Trung học cơ sở Ngãi Tứ A
Địa chỉ: HuyệnTam Bình, Tỉnh Vĩnh Long
3. Trung học phổ thông
Thời gian đào tạo: 2005 đến năm 2008
Trường: Trung học phổ thông Trà Ôn
Địa chỉ: Huyện Trà Ôn, Tỉnh Vĩnh Long
4. Đại học
Thời gian đào tạo: 2008 đến năm 2012
Trường: Đại học Cần Thơ
Địa chỉ: Ninh Kiều - Cần Thơ
Ngày… tháng… năm 2012
Người khai

Võ Phương Trinh

v


LỜI CẢM TẠ

Kính dâng!
Cha mẹ suốt đời tận tụy vì tương lai, sự nghiệp của con.
Xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến!
Cô Lâm Ngọc Phương đã tận tình hướng dẫn, đóng góp ý kiến quý báu và
hết lòng giúp đỡ để em hoàn thành luận văn tốt nghiệp này.
Th.S Lê Minh Lý đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ em thực hiện, hoàn thành
đề tài.
Thành kính biết ơn!
Quý thầy cô, cán bộ thuộc Bộ môn Di truyền - Giống Nông nghiệp và Bộ
môn Sinh lý- Sinh hóa đã truyền đạt những kiến thức quý báu trong suốt quá trình
học và tạo điều kiện thuận lợi để em hoàn thành đề tài tốt nghiệp.
Chân thành cảm ơn thầy Phạm Văn Phượng và thầy Nguyễn Phước Đằng đã
dìu dắt chúng em qua giảng đường Đại học.
Thân gửi về!
Các thành viên lớp Công nghệ giống cây trồng khóa 34 những tình cảm, lời
cảm ơn, lời chúc sức khỏe và thành công trong cuộc sống.

vi


VÕ PHƯƠNG TRINH, 2012. “Ảnh hưởng của nồng độ và thời gian xử lý
oryzalin lên sự sinh trưởng và phát triển của chồi gừng (Zingiber officinale
Rosc.)”. Luận văn tốt nghiệp Kỹ sư Trồng trọt, Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng
dụng, Trường Đại học Cần Thơ. Cán bộ hướng dẫn: PGS.TS.Lâm Ngọc Phương.
TÓM LƯỢC

Đề tài “Ảnh hưởng của nồng độ và thời gian xử lý oryzalin lên sự sinh
trưởng và phát triển của chồi gừng (Zingiber officinale Rosc.)” được thực hiện
nhằm tìm ra nồng độ và thời gian xử lý oryzalin thích hợp lên sự sinh trưởng và
phát triển cũng như khả năng tạo chồi gừng đa bội. Đề tài gồm 2 thí nghiệm được
bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên 2 nhân tố: (1) Ảnh hưởng của nồng độ và
thời gian xử lý oryzalin lên chồi gừng 3 tuần tuổi, thí nghiệm gồm 2 mức nồng độ
oryzalin: 5 mg/l và 10 mg/l với thời gian 84 và 96 giờ. Kết quả cho thấy, xử lý
oryzalin với nồng độ 5 mg/l trong 84 hoặc 96 giờ không ảnh hưởng đến tỷ lệ sống
của chồi nhưng làm tăng sự sinh trưởng của chồi 3 tuần tuổi. Không tìm thấy chồi
có hình thái đa bội trong thí nghiệm này. (2) Ảnh hưởng của nồng độ và thời gian
xử lý oryzalin lên chồi gừng 6 tuần tuổi, thí nghiệm gồm 2 mức nồng độ oryzalin:
15 mg/l và 20 mg/l với thời gian 48 và 72 giờ xử lý. Kết quả cho thấy, sử dụng
oryzalin ở nồng độ 15 mg/l trong 48 giờ không ảnh hưởng đến tỷ lệ sống của chồi,
đồng thời làm tăng sự sinh trưởng của chồi gừng 6 tuần tuổi. Xử lý chồi gừng với
nồng độ 15 mg/l oryzalin trong 72 giờ cho tỷ lệ cây đa bội cao nhất (6,6%) thông
qua mật số và kích thước khí khẩu.

vii


MỤC LỤC
Chương

Nội dung

Trang

Mục lục

viii

Mở đầu

1

1 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2

1.1 Sơ lược về cây gừng

2

1.1.1 Nguồn gốc và phân bố

2

1.1.2 Đặc tính thực vật

2

1.1.3 Hoạt tính chứa trong củ gừng

2

1.2 Đột biến đa bội trong chọn giống cây trồng

3

1.2.1 Đột biến

3

1.2.2 Phương pháp tạo đa bội thể

4

1.2.3 Một số đặc điểm của cây đa bội

5

1.3 Cơ sở khoa học trong việc tạo thể đa bội bằng Oryzalin

5

1.3.1 Cơ sở khoa học

5

1.3.2 Một số nghiên cứu đa bội hóa bằng Oryzalin trên cây trồng

6

1.4 Các kết quả nghiên cứu về đặc điểm hình thái và tế bào học của một số
cây trồng sau khi xử lý đa bội

7

2 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP

9

2.1 Phương tiện

9

2.1.1 Vật liệu thí nghiệm

9

2.1.2 Thời gian và địa điểm

9

2.1.3 Trang thiết bị và hóa chất

9

2.2 Phương pháp

9

2.2.1 Chuẩn bị môi trường nuôi cấy

9

2.2.2 Khử trùng mẫu cấy

10

2.3 Bố trí thí nghiệm

10
viii


2.3.1 Thí nghiệm 1 Ảnh hưởng của nồng độ và thời gian xử lý oryzalin
lên chồi gừng 3 tuần tuổi

10

2.3.2 Thí nghiệm 2 Ảnh hưởng của nồng độ và thời gian xử lý oryzalin
lên chồi gừng 6 tuần tuổi

10

2.3.3 Chỉ tiêu theo dõi

10

2.3.4 Phân tích số liệu

11

3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

12

3.1 Thí nghiệm 1

12

3.1.1 Tỷ lệ sống

12

3.1.2 Số chồi gia tăng

12

3.1.3 Chiều cao gia tăng

16

3.1.4 Số lá gia tăng

19

3.1.5 Tỷ lệ cây gừng có hình thái đa bội sau khi xử lý oryzalin in vitro

23

3.1.6 Mật số và kích thước khí khẩu

23

3.2 Thí nghiệm 2

25

3.2.1 Tỷ lệ sống

25

3.2.2 Số chồi gia tăng

25

3.2.3 Chiều cao gia tăng

28

3.2.4 Số lá gia tăng

31

3.2.5 Tỷ lệ cây gừng có hình thái đa bội sau khi xử lý oryzalin in vitro

35

3.2.6 Mật số và kích thước khí khẩu

36

3.2.7 Tỷ lệ cây gừng đa bội tính trên mật số khí khẩu

38

4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

39

TÀI LIỆU THAM KHẢO

40

ix


DANH SÁCH BẢNG

Bảng

Tên bảng

Trang

3.1

Tỷ lệ sống (%) của chồi gừng ở thời điểm sau bốn tuần nuôi cấy khi xử
lý oryzalin ở các nồng độ và thời gian khác nhau

12

3.2

Số chồi gia tăng (chồi/mẫu) sau khi xử lý oryzalin ở các nồng độ và
thời gian khác nhau sau một tuần nuôi cấy

13

3.3

Số chồi gia tăng (chồi/mẫu) sau khi xử lý oryzalin ở các nồng độ và
thời gian khác nhau sau hai tuần nuôi cấy

14

3.4

Số chồi gia tăng (chồi/mẫu) sau khi xử lý oryzalin ở các nồng độ và
thời gian khác nhau sau ba tuần nuôi cấy

15

3.5

Số chồi gia tăng (chồi/mẫu) sau khi xử lý oryzalin ở các nồng độ và
thời gian khác nhau sau bốn tuần nuôi cấy

16

3.6

Chiều cao gia tăng (cm) của chồi gừng sau khi xử lý oryzalin ở các
nồng độ và thời gian khác nhau sau một tuần nuôi cấy

17

3.7

Chiều cao gia tăng (cm) của chồi gừng sau khi xử lý oryzalin ở các
nồng độ và thời gian khác nhau sau hai tuần nuôi cấy

17

3.8

Chiều cao gia tăng (cm) của chồi gừng sau khi xử lý oryzalin ở các
nồng độ và thời gian khác nhau sau ba tuần nuôi cấy

18

3.9

Chiều cao gia tăng (cm) của chồi gừng sau khi xử lý oryzalin ở các
nồng độ và thời gian khác nhau sau bốn tuần nuôi cấy

19

3.10

Số lá gia tăng của chồi gừng sau khi xử lý oryzalin ở các nồng độ và
thời gian khác nhau sau một tuần nuôi cấy

20

3.11

Số lá gia tăng của chồi gừng sau khi xử lý oryzalin ở các nồng độ và

thời gian khác nhau sau hai tuần nuôi cấy

20

3.12

Số lá gia tăng của chồi gừng sau khi xử lý oryzalin ở các nồng độ và
thời gian khác nhau sau ba tuần nuôi cấy

21

3.13

Số lá gia tăng của chồi gừng sau khi xử lý oryzalin ở các nồng độ và
thời gian khác nhau sau bốn tuần nuôi cấy

22

3.14

Mật số và kích thước khí khẩu ở cây gừng nhị bội và cây gừng được
xử lý với oryzalin

24

3.15

Tỷ lệ sống (%) của chồi gừng ở thời điểm sau bốn tuần nuôi cấy sau
khi xử lý oryzalin ở các nồng độ và thời gian khác nhau

25

3.16

Số chồi gia tăng (chồi/mẫu) sau khi xử lý oryzalin ở các nồng độ và
thời gian khác nhau sau một tuần nuôi cấy

26

x


3.17

Số chồi gia tăng (chồi/mẫu) sau khi xử lý oryzalin ở các nồng độ và
thời gian khác nhau sau hai tuần nuôi cấy

26

3.18

Số chồi gia tăng (chồi/mẫu) sau khi xử lý oryzalin ở các nồng độ và
thời gian khác nhau sau ba tuần nuôi cấy

27

3.19

Số chồi gia tăng (chồi/mẫu) sau khi xử lý oryzalin ở các nồng độ và
thời gian khác nhau sau bốn tuần nuôi cấy

28

3.20

Chiều cao gia tăng (cm) của chồi gừng sau khi xử lý oryzalin ở các
nồng độ và thời gian khác nhau sau một tuần nuôi cấy

29

3.21

Chiều cao gia tăng (cm) của chồi gừng sau khi xử lý oryzalin ở các
nồng độ và thời gian khác nhau sau hai tuần nuôi cấy

30

3.22

Chiều cao gia tăng (cm) của chồi gừng sau khi xử lý oryzalin ở các
nồng độ và thời gian khác nhau sau ba tuần nuôi cấy

30

3.23

Chiều cao gia tăng (cm) của chồi gừng sau khi xử lý oryzalin ở các
nồng độ và thời gian khác nhau sau bốn tuần nuôi cấy

31

3.24

Số lá gia tăng của chồi gừng sau khi xử lý oryzalin ở các nồng độ và
thời gian khác nhau sau một tuần nuôi cấy

32

3.25

Số lá gia tăng của chồi gừng sau khi xử lý oryzalin ở các nồng độ và
thời gian khác nhau sau hai tuần nuôi cấy

32

3.26

Số lá gia tăng của chồi gừng sau khi xử lý oryzalin ở các nồng độ và
thời gian khác nhau sau ba tuần nuôi cấy

33

3.27

Số lá gia tăng của chồi gừng sau khi xử lý oryzalin ở các nồng độ và
thời gian khác nhau sau bốn tuần nuôi cấy

34

3.28

Tỷ lệ (%) cây gừng có hình thái đa bội sau khi xử lý oryzalin ở các
nồng độ và thời gian khác nhau

36

3.29

Mật số và kích thước khí khẩu ở cây gừng nhị bội và cây gừng có hình
thái đa bội sau khi xử lý oryzalin

37

3.30

Tỷ lệ (%) cây gừng có hình thái đa bội sau khi xử lý oryzalin ở các
nồng độ và thời gian khác nhau

38

xi


DANH SÁCH HÌNH
Hình

Tên hình

Trang

3.1

Chồi gừng (3 tuần tuổi) sau 4 tuần xử lý với oryzalin

22

3.2

Mật số và kích thước khí khẩu của chồi gừng nhị bội và
chồi gừng xử lý với oryzalin ở vật kính 40X

24

3.3

Chồi gừng (6 tuần tuổi) sau 4 tuần xử lý với oryzalin

34

3.4

Mật số và kích thước khí khẩu của chồi gừng nhị bội và
chồi gừng có hình thái đa bội ở vật kính 40X

37

xii


DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT

BA

Benzyl adenin

ĐC

Đối chứng

MS

Murashige and Skoog

NAA

Napthaleneacetic acid

TSKC

Tuần sau khi cấy

xiii


MỞ ĐẦU
Gừng (Zingiber officinale Rosc.) là một trong những loại cây gia vị phổ biến
trong nghệ thuật ẩm thực được biết đến sớm nhất đồng thời cũng là một vị thuốc rất
có giá trị được sử dụng từ lâu trong dân gian (Kavyashree, 2009). Ngoài ra, gừng đã
được chứng minh là có nhiều tác dụng dược lý khác nhau điển hình như chống oxy
hóa, kháng viêm, ngăn chặn ung thư ...
Kể từ khi Ramachandran (1982) thu được dạng gừng tứ bội đầu tiên bằng

việc xử lý với colchicine cho đến nay cũng chỉ có một vài báo cáo tập trung vào vấn
đề này. Sakhanokho (2009) cũng đã thành công khi tiến hành xử lý oryzalin trên
gừng Borneo (H. muluense) và tỷ lệ chồi cảm ứng đa bội đạt khoảng 15% hoặc
trong một nghiên cứu mới nhất của Wei Kun Hua (2011) khi xử lý đa bội trên gừng,
sau khi kiểm tra, tất cả các dòng gừng đa bội đều cho năng suất và phẩm chất tốt
hơn so với giống gừng địa phương. Từ đó có thể thấy, đột biến đa bội có ý nghĩa rất
quan trọng trong công tác chọn tạo giống mới.
Đề tài "Ảnh hưởng của nồng độ và thời gian xử lý oryzalin lên sự sinh
trưởng và phát triển của chồi gừng (Zingiber officinale Rosc.)" được thực hiện
nhằm xác định nồng độ và thời gian xử lý oryzalin thích hợp lên sự sinh trưởng,
phát triển cũng như khả năng tạo được cây gừng đa bội.

1


CHƯƠNG 1
LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

1.1 Sơ lược về cây gừng
1.1.1 Nguồn gốc và phân bố
Gừng còn gọi là khương hay sinh khương, tên khoa học Zingiber officinale
Rosc. thuộc họ gừng Zingiberaceae có nguồn gốc từ vùng Đông Nam châu Á, ngày
nay, gừng được trồng ở nhiều nơi trên thế giới.
Chi Zingiber Boehmer ở châu Á có khoảng 45 loài, Việt Nam có 11 loài.
Gừng là loại cây gia vị cổ điển được trồng ở nhiều nước trong vùng nhiệt đới và cận
nhiệt từ Đông Á đến Đông Nam Á và Nam Á. Trung Quốc, Ấn Độ, Nhật Bản là
những nước trồng nhiều gừng nhất trên thế giới. Ở Việt Nam, gừng được trồng từ
thế kỷ thứ II trước Công nguyên. Hiện nay cây được trồng khắp các địa phương do
gừng thích hợp với khí hậu nóng ẩm (Đỗ Huy Bích et al., 2004).
1.1.2 Đặc tính thực vật

Gừng là loại cây thân thảo, sống lâu năm, cao 0,6- 1 m. Thân rễ mẫn lên
thành củ, lâu dần thành xơ. Củ có mùi thơm, màu vàng nhạt. Lá mọc so le thành hai
dãy, hình mác thuôn, thắt lại ở gốc, đầu nhọn, không cuống, có gân giữa hơi trắng
nhạt, vò có mùi thơm. Lá dài 15- 20 cm, rộng khoảng 2 cm. Trục hoa xuất phát từ
gốc dài 20 cm, cụm hoa dài khoảng 5cm do nhiều vảy lợp thành, những vảy phía
dưới ngắn, càng lên trên càng dài và rộng hơn, lá bắc hình trứng, màu lục nhạt, mép
viền vàng, đài có 3 răng ngắn, tràng có ống dài gấp đôi đài, mép cánh hoa màu tím,
nhị cũng tím (Đỗ Tất Lợi, 2003).
1.1.3 Hoạt tính chứa trong củ gừng
Theo Đỗ Huy Bích et al. (2004) thành phần hóa học trong củ gừng gồm: 23% tinh dầu với thành phần chủ yếu là các hợp chất hydrocarbon sesquiterpenic:
zingiberen (35%), ar-curcumenen (17%), farnesen (10%) và một lượng nhỏ các hợp
chất alcol monoterpenic như geraniol, linalool, borneol.
Nhựa dầu chứa 20-25% tinh dầu và 20-30% các chất cay. Thành phần chủ
yếu của nhóm chất cay là zingeron, shogaol và zingerol, trong đó gingerol chiếm tỷ

2


lệ cao nhất. Đó là chất lỏng màu vàng, tan trong cồn, ether, chloroform, benzene.
Ngoài ra trong tinh dầu gừng còn chứa α-camphen, -phelandren, eucalyptol.
1.2 Đột biến đa bội trong chọn giống cây trồng
1.2.1 Đột biến
Đột biến là sự thay đổi đột ngột về vật chất di truyền của tế bào, nghĩa là
những biến đổi trong cấu trúc gen hoặc các biến đổi trong cấu trúc và số lượng
nhiễm sắc thể. Đột biến tạo nên vô số các biến dị, làm tăng tính biến dạng trong
sinh giới và là cơ sở của quá trình chọn lọc.
Theo Chu Thị Thơm et al. (2006); Trần Đình Long et al. (1997) thì đột biến
có các dạng sau:
- Đột biến gen: gây ra sự thay đổi cấu trúc gen. Đột biến này không liên quan
đến biến đổi về cấu trúc nhiễm sắc thể và phá hoại quá trình bắt chéo.

- Đột biến làm thay đổi cấu trúc nhiễm sắc thể, đứt đoạn, đảo đoạn… bất cứ
sự biến đổi nào đều kèm theo sự biểu hiện của tính trạng và đặc tính mới.
- Đột biến số lượng nhiễm sắc thể: tăng hay giảm bộ nhiễm sắc thể cơ bản
(đa bội thể, đơn bội thể).
Đột biến là con đường quan trọng dẫn đến việc làm tăng biến dị. Các tác
nhân vật lý hoặc hóa học tác động vào tế bào làm biến đổi các cấu trúc hay thay đổi
số lượng nhiễm sắc thể hoặc ion hóa các phân tử protein, DNA, chất vô cơ, nước
làm thay đổi phản ứng sinh lý, hóa sinh trong tế bào, thay đổi cấu trúc và thành
phần của DNA gây ra đột biến gen và sai khác về kiểu hình. Theo Lê Duy Thành
(2001), các đột biến xảy ra trong tự nhiên với tần số rất thấp, trong khi đó tần số
xuất hiện đột biến nhân tạo cao hơn trong tự nhiên gấp 1000 lần. Theo Anonumous
(1991), năm 1964 chưa đến 30 giống được tạo ra bằng phương pháp đột biến nhân
tạo nhưng chỉ 25 năm sau con số này đã lên đến 1300 giống.
Đặc biệt trong chọn giống đột biến ở thực vật, nuôi cấy in vitro là cách hiệu
quả nhất để duy trì và bảo quản những biến dị di truyền, khắc phục được hiện tượng
đột biến khảm nhờ đó không những khắc phục được sự đào thải những tế bào quý
hiếm do tính cạnh tranh trong mô mà còn làm tăng tính đồng nhất và ổn định về tính
trạng mong muốn (Nagatomi, 2000).

3


1.2.2 Phương pháp tạo đa bội thể
* Nguyên tắc
Theo Phạm Văn Duệ (2005) để gây đa bội thể thì phải tác động vào cây
trồng giai đoạn cây đang sinh trưởng mạnh, đặc biệt là trong kỳ giữa của quá trình
nguyên phân làm cho nhiễm sắc thể phân ly không bình thường và các tế bào mới sẽ
có số lượng nhiễm sắc thể tăng gấp đôi, gấp ba.
* Phương pháp tạo đa bội thể
Theo Trần Thượng Tuấn (1992) thì có một số phương pháp sau:

- Gây thay đổi nhiệt độ: thay đổi nhiệt độ một cách đột ngột và giữ trong một
thời gian nhất định sẽ làm các tế bào đang phân chia bị rối loạn và có thể gây đa bội
nhưng tỷ lệ thành công không cao.
- Gây chấn thương cơ giới: cắt ngang đỉnh sinh trưởng, từ chỗ vết cắt hình
thành mô sẹo (callus) sau đó hình thành mầm bất định có thể gây ra hiện tượng đa
bội.
- Xử lý tia Ronghen: với phương pháp này, lần đầu tiên vào năm 1930
Goodspeed và Demol đã thu được dạng đa bội trên thuốc lá và một số cây khác.
- Phương pháp lai: năm 1927, Carpesenco khi tiến hành lai giữa củ cải
Raphanus sativus với bắp cải Brassica oleracea thu được con lai bất thụ nhưng dạng
tứ bội lại hữu thụ cao.
- Xử lý bằng hóa chất: đây là phương pháp được nhiều người chú ý và có
hiệu quả nhất, một số hóa chất có thể kể đến như Colchicine, Hyprit, Acenapthene,
Gemaxan… Trong đó Colchicine được ứng dụng từ rất sớm, nó được biết đến
không chỉ là tác nhân tạo đa bội mà còn là tác nhân gây đột biến (Chu Thị Thơm et
al., 2006; Phạm Văn Duệ, 2005).
1.2.3 Một số đặc điểm cây đa bội
Theo Trần Thượng Tuấn (1992) cây đa bội nói chung có thân, cành to, phiến
lá xanh đậm, dày, khí khẩu và hạt phấn to… Tuy nhiên nhiều trường hợp dạng tứ
bội lại có kích thước chỉ bằng hoặc nhỏ hơn dạng lưỡng bội bởi vì điều này phụ
thuộc vào phản ứng của từng loại cây với tính đa bội, đồng thời tùy thuộc vào số
lượng và kích thước tế bào.

4


Theo Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang (2007) đặc điểm cây tứ bội là tế bào
to, hiện tượng thụ tinh giảm… Cây đa bội tiến hóa hơn cây đơn bội vì có sức sống
cao, phạm vi thích ứng rộng, chống chịu với điều kiện bất lợi tốt.
Ở cây đa bội hàm lượng đường và các vitamin cũng tăng theo (Chu Thị

Thơm et al., 2006). Một số nghiên cứu trên thuốc lá và đại mạch cho thấy hàm
lượng tro ở cây đa bội cao do màng tế bào dày (Lê Duy Thành, 2001). Tuy nhiên
cây đa bội lại có nhịp điệu sinh trưởng, phát dục chậm, ra hoa muộn và kéo dài hơn
cây lưỡng bội (Trần Thượng Tuấn, 1992).
Theo Gu et al. (2005) hoa của cây tứ bội nở trễ hơn cây nhị bội trong cùng
một cánh đồng 3- 4 ngày, bên cạnh đó Chen et al. (2011) cũng nhận thấy kích thước
khí khẩu của cây hồng môn Anthurium andraeanum “Arizona” tứ bội lớn hơn cây
lưỡng bội, tuy nhiên mật độ khí khẩu lại thấp hơn.
Omidbaigi et al. (2010) kết luận rằng hơn 60% chồi tái sinh từ hạt của cây
Ocimum basilicum sau khi xử lý colchicine lá trở nên dày, xanh đậm hơn so với cây
đối chứng. Kết quả này cũng tương tự với nhận định của Dunn et al. (2007) khi cho
rằng kích thước và độ dày lá là hai đặc điểm hình thái tốt nhất để phân biệt dạng cây
đa bội ở giai đoạn đầu khi xử lý chồi Buddleja L. với oryzalin trong khi các chỉ tiêu
về kích thước hoa, chiều dài lóng, đường kính thân, hạt phấn... là những đặc điểm
để phân biệt ở giai đoạn trồng thử nghiệm trong nhà kính.
1.3 Cơ sở khoa học của việc tạo thể đa bội bằng Oryzalin
1.3.1 Cơ sở khoa học
Oryzalin có công thức hóa học C12H18N4O6S là một loại thuốc cỏ
dinitroaniline và được dùng để kích thích sự đa bội hóa ở nhiều loại cây trồng
(Morejohn et al., 1987) có tác dụng ức chế sự phân bào ở các loại cây. Oryzalin
được đăng ký đầu tiên ở Mỹ 1974 và được sử dụng để tiêu diệt các loại cỏ hàng
năm, lá rộng, cây bụi.
Tác động của oryzalin đến sự phân bào cũng giống như colchicine nhưng
hoạt động gắn kết của colchicine với vi ống yếu hơn oryzalin. Những cây trồng
được xử lý với oryzalin ở nồng độ micromolar (µM) cho kết quả tương đương với
những cây trồng được xử lý bằng colchicine ở nồng độ milimolar (mM) (Dolezel et

5

al., 2004). Oryzalin gắn kết chặt chẽ với vi ống tạo thành phức hợp oryzalin- vi ống.
Phức hợp này làm thoi vô sắc ngừng hoạt động và ngăn cản sự phân chia tế bào
(Morejohn et al., 1987).
1.3.2 Một số nghiên cứu đa bội hóa bằng oryzalin trên cây trồng
Van Tuyl et al. (1992), đã tiến hành xử lý oryzalin lên cây Lilium in vitro với
các nồng độ 0,005 và 0,01% trong 4 giờ. Kết quả ghi nhận được 4 cây tứ bội và 10
cây bội tạp ở nồng độ oryzalin 0,005%, 6 cây bội tạp ở nồng độ oryzalin 0,01%.
Theo Kermani et al. (2003), khi xử lý oryzalin trên chồi đỉnh cây hoa hồng in
vitro với 2 mức nồng độ (5 μM và 15 μM) và 3 mức thời gian (14, 21 và 28 ngày)
thu được tỷ lệ cây tứ bội đạt cao nhất ở nồng độ oryzalin 5 μM với thời gian xử lý
14 ngày là 40%.
Trong một nghiên cứu khác, khi cho oryzalin tiếp xúc lên chồi đỉnh của cây
Amonica x amazonica in vitro với 3 mức nồng độ: 0,005; 0,01 và 0,05% và 3 mức
thời gian: 24, 48, 72 giờ. Kết quả đạt được 4 cây tứ bội, 5 cây bội tạp và 32 cây nhị
bội ở nồng độ oryzalin 0,005% và thời gian xử lý 48 giờ (Thao et al., 2004).
Mặc dù được đánh giá là hóa chất có hiệu quả hơn colchicine trong việc tạo
thể đa bội (Ganga and Chezhiyan, 2002; Zlesak et al., 2005), nhưng trong một
nghiên cứu của Barandalla (2006) khi xử lý oryzalin lên chồi của 6 giống khoai tây
ở 2 mức nồng độ 10 mg/l; 20 mg/l và 2 mức thời gian 24, 48 giờ, kết quả chỉ được
2 cây tứ bội, 3 cây bội tạp, 71 cây nhị bội ở nồng độ oryzalin 10 mg/l và thời gian
xử lý 48 giờ trên giống L37. Tương tự, khi xử lý oryzalin ở nồng độ 10 mg/l trong
24 giờ trên giống H84.42/4 tác giả chỉ thu được 2 cây bội tạp, 28 cây nhị bội, ở mức
nồng độ và thời gian này không có cây tứ bội nào được tạo ra.
Không giống như các thí nghiệm khác khi xử lý oryzalin trên chồi, Lehrer et
al. (2008) đã tiến hành tạo cây Berberis thumbergii var. atropurpurea đa bội bằng
cách ngâm hạt trong dung dịch oryzalin với các nồng độ: 0,002; 0,005; 0,01 và
0,02% và 3 mức thời gian xử lý: 6, 12, 24 giờ. Kết quả có đến 28% cây tứ bội ở
nồng độ oryzalin 0,002%.

6

Theo Ascough (2008), nồng độ oryzalin tối ưu cho việc tạo cây Watsonia
lepida N.E. Brown tứ bội là 120 μM trong 24 giờ, mặc dù tỷ lệ sống thấp khoảng
30% sau khi xử lý nhưng có đến 33% cây tứ bội được tạo thành.
Một nghiên cứu khác cho thấy, oryzalin hiệu quả hơn colchicine trong việc
tạo cây H. muluense R. M. Smith đa bội. Tần số cảm ứng cao nhất khoảng 15% tạo
cây tứ bội khi được xử lý oryzalin 60 μM trong 72 giờ (Sakhanokho, H.F et al.,
2009).
1.4 Các kết quả nghiên cứu về kích thước và mật số khí khẩu của một số cây
trồng sau khi xử lý đa bội
Khi ứng dụng oryzalin hoặc các hóa chất gây đa bội trên cây trồng, các nhà
khoa học thường chú ý đến kích thước và mật số khí khẩu sau khi xử lý và nuôi cấy
vì đây là một trong những chỉ tiêu quan trọng để xác định dạng cây đa bội (van
Duren et al., 1996; Azhar et al., 2000). Tương tự, Hamill et al. (1992) cũng xem
mật số khí khẩu là tiêu chuẩn để phân biệt sự khác nhau giữa thể lưỡng bội (2n) và
thể tứ bội (4n) của tế bào thực vật. Hơn nữa đây là một kỹ thuật tương đối đơn giản,
rẻ tiền, không đòi hỏi thiết bị tinh vi, đặc biệt phương pháp này rất nhanh chóng và
thuận tiện trong việc phân tích (Kadota and Niimi, 2000).
Sun (2008) đã nghiên cứu trên cây Nepenthes gracilis cho thấy chiều dài khí
khẩu ở cây nhị bội là 31,42 μm, trong khi đó ở cây tứ bội là 45,39 μm, cây nhị bội
có 413,71 khí khẩu/ mm2 và ở cây tứ bội có 346,15 khí khẩu/ mm2. Một nghiên cứu
khác cũng cho thấy sự khác biệt nhau về kích thước khí khẩu trên cây Chamomilla
recutita (L.) Rausch, trung bình chiều dài khí khẩu ở cây nhị bội chỉ đạt từ 39,05
μm đến 44,28 μm, trong khi đó cây tứ bội đạt từ 53,88 μm đến 59,95 μm (Katarzyna
2003). Kết quả này cũng đã được báo cáo bởi Czabajska (1963) và Letchamo et
al.(1994).
Silva et al. (2000) đã xác định được 106 cây nhị bội và 42 cây tứ bội ở lan
Cattleya intermedia dựa vào mật số khí khẩu. Nilanthi et al. (2009) xác định được
kích thước khí khẩu của cây Echinacea purpurea tứ bội 144,8 μm, cây nhị bội

104,5 μm. Điều này cho thấy kích thước khí khẩu là một trong các chỉ tiêu quan
trọng và được ứng dụng khá phổ biến trong các nghiên cứu, điển hình như trong

7


nghiên cứu của Wei Kun Hua et al. (2011) khi xử lý chồi gừng với các nồng độ
colchicine khác nhau, tác giả kết luận rằng khí khẩu ở lá của cây tứ bội dài và rộng
hơn so với khí khẩu ở cây nhị bội được quan sát nhưng mật số khí khẩu lại giảm
một nửa.
Sarinee et al. (1995) xác định kích thước khí khẩu ở cây nhị bội Morus alba
Var. là 0,23 mm và ở cây tứ bội 0,34 mm. Số lượng khí khẩu ở cây nhị bội là 230
khí khẩu/mm2 và cây tứ bội là 129 khí khẩu/ mm 2.
Tuy nhiên, trong một số trường hợp, phương pháp đánh giá cây đa bội dựa
vào mật số và kích thước khí khẩu lại không chính xác. Điển hình như trong nghiên
cứu của Madon et al. (2005), tác giả cho rằng đếm số khí khẩu là phương pháp
không hiệu quả để phân biệt cây cọ dầu nhị bội và cây tứ bội khi mà mật số khí
khẩu ở cả 2 dạng cây này khác biệt không ý nghĩa qua phân tích thống kê. Theo
Chen et al. (2006), đây chỉ là phương pháp gián tiếp để phân biệt các dạng cây đa
bội, trong trường hợp có sự xuất hiện của cây đa bội tạp thì phương pháp này trở
nên không đáng tin cậy và cần được kết hợp với các phương pháp khác.

8


CHƯƠNG 2
PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1 Phương tiện
2.1.1 Vật liệu thí nghiệm
Sử dụng chồi gừng in vitro 3 và 6 tuần tuổi sau khi cấy trong môi trường

nhân chồi.
2.1.2 Thời gian và địa điểm
- Thời gian: thí nghiệm được tiến hành từ 01/2012 đến 05/2012.
- Địa điểm: phòng thí nghiệm nuôi cấy mô thuộc bộ môn Sinh Lý- Sinh Hoá,
khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, trường Đại Học Cần Thơ (KNN &
SHƯD, ĐHCT).
2.1.3 Trang thiết bị và hóa chất
Trang thiết bị: Cân điện tử, nồi thanh trùng, máy đo pH, tủ sấy giấy, tủ cấy
vô trùng và các dụng cụ thủy tinh dùng cho thí nghiệm: ống đong, keo, ống
nghiệm…
Hóa chất:
+ Hóa chất khử trùng mẫu: cồn 70o, HgCl2 0,1%, HgCl2 0,05%, CaOCl2
+ Khoáng đa lượng và vi lượng theo công thức MS (Murashige and Skoog,
1962), vitamin (thiamin, pyridoxin, acid nicotinic, myo-inositol), chất điều hòa sinh
trưởng BA và NAA, các chất khác (agar, đường sucrose, nước dừa).
+ Hóa chất gây đa bội hóa: Oryzalin (Merck)
Điều kiện thí nghiệm: Thí nghiệm được thực hiện trong phòng nuôi cấy với
nhiệt độ: 26 ± 20C, cường độ chiếu sáng 1.500 lux, thời gian chiếu sáng 16
giờ/ngày.
2.2 Phương pháp
2.2.1 Chuẩn bị môi trường nuôi cấy
Sử dụng môi trường cơ bản MS (Murashige and Skoog, 1962) bổ sung
đường sucrose 30 g/l, thiamine 1 mg/l, pyridoxise 1 mg/l, nicotinic acid 1 mg/l và
nước dừa tươi 100 ml/l. Chất điều hòa sinh trưởng được bổ sung vào môi trường

9


nuôi cấy là BA (Benzyl adenin), NAA (Napthaleneacetic acid). Môi trường nuôi
cấy được điều chỉnh pH từ 5,7- 5,8. Bình cấy chứa 40 ml môi trường được hấp khử

trùng ở nhiệt độ 121oC, áp suất 1 atm trong thời gian 20 phút.
2.2.2 Khử trùng mẫu cấy
Chồi gừng non (2, 3 tuần tuổi) được rửa sạch dưới vòi nước chảy, loại bỏ bớt
các bẹ lá bên ngoài sau đó ngâm trong xà phòng khoảng 10 phút rồi rửa lại nhiều
lần trước khi đưa mẫu vào khử trùng. Ngâm các chồi này trong clorin 5% ở 5 phút,
rửa lại 3 lần bằng nước cất vô trùng. Tiếp tục ngâm mẫu với HgCl2 0,1% trong 20
phút, sau đó rửa lại bằng nước cất khử trùng. Cuối cùng khử lại với HgCl2 0,05%
trong 2 phút.
2.3 Bố trí thí nghiệm
2.3.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của nồng độ và thời gian xử lý oryzalin lên chồi
gừng 3 tuần tuổi.
Mục tiêu: Xác định nồng độ và thời gian xử lý oryzalin hiệu quả lên chồi
gừng 3 tuần tuổi
Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên
2 nhân tố, 6 nghiệm thức, 5 lần lặp lại, mỗi lần lặp 3 keo, mỗi keo cấy 3 chồi.
2.3.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của nồng độ và thời gian xử lý oryzalin lên chồi
gừng 6 tuần tuổi
Mục tiêu: Xác định nồng độ và thời gian xử lý oryzalin hiệu quả lên chồi
gừng 6 tuần tuổi.
Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên
2 nhân tố, 6 nghiệm thức, 5 lần lặp lại, mỗi lần lặp 3 keo, mỗi keo cấy 3 chồi.
2.3.3 Chỉ tiêu theo dõi:
- Tỷ lệ sống (%).
- Số chồi gia tăng: chỉ đếm các chồi > 0,2 cm.
- Chiều cao gia tăng (cm): chiều cao cây được đo từ mặt môi trường cho tới
điểm cao nhất của cây.
- Số lá gia tăng: đếm các lá đã mở ra hoàn toàn.

10

- Mật số khí khẩu trên lá (số khí khẩu/ đơn vị diện tích): quan sát dưới kính
hiển vi 10x40, đếm số tế bào khẩu ở thị trường (đường kính vật kính 440 μm). Lặp
lại 3 lần trên 3 vùng thị trường khác nhau của một mẫu tương ứng 1 lá.
2.3.4 Phân tích số liệu
Các số liệu được xử lý bằng phần mềm thống kê SPSS. Phân tích phương sai
(ANOVA), so sánh các giá trị trung bình bằng phương pháp kiểm định Duncan với
mức ý nghĩa 5% hoặc 1%.

11