KHẢO sát ẢNH HƯỞNG của điều KIỆN môi TRƯỜNG NUÔI cấy đến sự NHÂN CHỒI và tạo rễ IN VITRO cây TRE RỒNG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG

BÙI MINH TƯƠI

KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN MÔI
TRƯỜNG NUÔI CẤY ĐẾN SỰ NHÂN CHỒI VÀ
TẠO RỄ IN VITRO CÂY TRE RỒNG
(Dendrocalamus giganteus Wallich ex Munro)

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

NGÀNH: NÔNG HỌC

Cần Thơ, 2011


TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG

Luận văn tốt nghiệp
Ngành: NÔNG HỌC

Tên đề tài:
KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN MÔI
TRƯỜNG NUÔI CẤY ĐẾN SỰ NHÂN CHỒI VÀ
TẠO RỄ IN VITRO CÂY TRE RỒNG
(Dendrocalamus giganteus Wallich ex Munro)

Cán bộ hướng dẫn:

Sinh viên thực hiện:

PGs. TS. Lê Văn Hòa

Bùi Minh Tươi

Ths. Nguyễn Văn Ây

MSSV: 3073215
Lớp: Nông Học

Cần Thơ, 2011


TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG


Luận văn tốt nghiệp Kỹ sư ngành Nông học với đề tài: “KHẢO SÁT ẢNH
HƯỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY ĐẾN SỰ NHÂN
CHỒI VÀ TẠO RỄ IN VITRO CÂY TRE RỒNG (Dendrocalamus giganteus
Wallich ex Munro)”

Do sinh viên Bùi Minh Tươi thực hiện

Kính trình lên hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp

Cần Thơ, ngày…..tháng…..năm 2011
Cán bộ hướng dẫn

PGs. Ts. Lê Văn Hòa

1

Ths. Nguyễn Văn Ây


TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG


Hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp đã chấp nhận luận văn tốt nghiệp Kỹ sư ngành
Nông học với đề tài: “KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN MÔI
TRƯỜNG NUÔI CẤY ĐẾN SỰ NHÂN CHỒI VÀ TẠO RỄ IN VITRO CÂY
TRE RỒNG (Dendrocalamus giganteus Wallich ex Munro)”. Do sinh viên Bùi
Minh Tươi thực hiện và bảo vệ trước Hội đồng ngày….tháng….năm 2011.

Luận văn đã được hội đồng đánh giá ở mức: ....................................
Ý kiến hội đồng: ......................................................................................................
.................................................................................................................................
.................................................................................................................................
.................................................................................................................................

Duyệt khoa Nông Nghiệp & SHƯD

Cần Thơ, ngày... tháng... năm 2011
CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

CHỦ NHIỆM KHOA

2


LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân. Các số liệu, kết quả
trình bày trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ
luận văn nào trước đây.

Tác giả luận văn

Bùi Minh Tươi

3


TIỂU SỬ CÁ NHÂN
Họ và tên

:

Bùi Minh Tươi

Ngày sinh

:

09 – 10 – 1988

Nơi sinh

:

xã Tân Thới, huyện Ô Môn, tỉnh Cần Thơ

Họ tên cha

:

Bùi Văn Vốn

Họ tên mẹ

:

Đào Thị Kim Phượng

Quê quán

:

xã Tân Thới, huyện Phong Điền, TP. Cần Thơ

Quá trình học tập

:

Năm 2007

:

Tốt nghiệp PTTH trường THPT Phan Văn Trị

Từ 2007-2011
:
Sinh viên trường Đại học Cần Thơ, chuyên ngành Nông
Học, khóa 33, Khoa Nông Nghiệp và SHƯD.

4


LỜI CẢM TẠ
Kính dâng
Cha, mẹ suốt đời tận tụy vì sự nghiệp và tương lai của con.
Thành kính ghi ân
Thầy Lê Văn Hòa và Thầy Nguyễn Văn Ây đã truyền đạt kiến thức, kinh
nghiệm quí báu tận tụy hướng dẫn và giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện và
hoàn thành luận văn này.
Thầy Nguyễn Phước Đằng đã hết lòng dìu dắt em trong suốt khóa học.
Các Thầy các Cô trong Khoa Nông Nghiệp và SHƯD đã truyền đạt những
kiến thức quý báu cho em trong suốt thời gian học tâp tại trường.
Chân thành cảm ơn
Quý Thầy Cô, Anh, Chị và các bạn đang công tác, học tập và nghiên cứu tại
phòng thực tập nuôi cấy mô.
Bạn Nguyễn Thị Bích Phượng lớp Nông Học II K33, bạn Mai Lê Đặng Ngọc
Dung và bạn Trần Thị Thủy Tiên lớp Hoa Viên Cây Cảnh K33 đã nhiệt tình giúp đỡ
tôi trong quá trình thực hiện đề tài.
Thân gửi về
Các bạn sinh viên Khoa Nông Nghiệp và SHƯD lời chúc sức khỏe, hạnh
phúc và thành đạt trong tương lai.

5


MỤC LỤC
Nội dung

Trang

Mục lục ............................................................................................................vi
Danh sách chữ viết tắt và thuật ngữ ............................................................... viii
Danh sách bảng ................................................................................................ix
Danh sách hình ..................................................................................................x
Tóm lược..........................................................................................................xi
MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU ............................................................ 2
1.1 ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT CỦA CÂY TRE RỒNG .............................. 2
1.1.1 Nguồn gốc – phân loại .................................................................2
1.1.2 Đặc tính thực vật .........................................................................2
1.1.3 Phân bố ........................................................................................ 3
1.2 SƠ LƯỢC VỀ NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT .....................................3
1.2.1 Các giai đoạn vi nhân giống ......................................................... 3
1.1.2 Tầm quan trọng của nuôi cấy mô thực vật ....................................3
1.2.3 Thành phần môi trường nuôi cấy mô thực vật .............................. 4
1.2.4 Các yếu tố khác ............................................................................ 8
1.3 MỘT SỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU TRÊN CÂY TRE ĐÃ ĐƯỢC
CÔNG BỐ ........................................................................................................9
1.4 MỘT SỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU NUÔI CẤY MÔ IN VITRO
BẰNG MÔI TRƯỜNG NGOẠI CẢNH ĐÃ ĐƯỢC CÔNG BỐ ..................... 11
CHƯƠNG 2: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP ..................................... 12

2.1 PHƯƠNG TIỆN................................................................................ 12
6


2.1.1 Địa điểm và thời gian ................................................................. 12
2.1.2 Vật liệu ...................................................................................... 12
2.1.3 Thiết bị và dụng cụ..................................................................... 12
2.1.4 Hóa chất ..................................................................................... 12
2.2 PHƯƠNG PHÁP............................................................................... 12
2.2.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của điều kiện môi trường nuôi cấy
lên sự nhân chồi in vitro cây tre Rồng ............................................................ 13
2.2.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của điều kiện môi trường nuôi cấy
lên sự tạo rễ in vitro cây tre Rồng .................................................................... 13
2.2.3 Cách lấy chỉ tiêu......................................................................... 14
2.3 XỬ LÝ SỐ LIỆU .............................................................................. 15

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................... 16
3.1 ẢNH HƯỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY LÊN
SỰ NHÂN CHỒI IN VITRO CÂY TRE RỒNG .............................................. 16
3.1.1 Số lượng chồi lớn ....................................................................... 16
3.1.2 Số lượng chồi nhỏ ...................................................................... 17
3.1.3 Chiều cao chồi gia tăng ............................................................. 18
3.1.4 Hàm lượng các sắc tố trong lá (mg/g lá tươi).............................. 19
3.2 ẢNH HƯỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY LÊN
SỰ TẠO RỄ IN VITRO CÂY TRE RỒNG ...................................................... 21
3.2.1 Tỷ lệ (%) ra rễ của cụm chồi ...................................................... 21
3.2.2 Số rễ trên cụm chồi .................................................................... 21
3.2.3 Chiều dài rễ................................................................................ 22
3.2.4 Hàm lượng các sắc tố trong lá (mg/g lá tươi).............................. 23
7

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ........................................................ 24
4.1 KẾT LUẬN....................................................................................... 24
4.2 ĐỀ NGHỊ .......................................................................................... 24
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 25

8


DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT VÀ THUẬT NGỮ
Chữ viết tắt

Chữ viết đầy đủ

PTT

Phòng tăng trưởng

SKC

Sau khi cấy

MS

Murashige và Skoog

NAA

Naphthalene acetic acid

BA

Benzyl adenine

In vitro

Trong ống nghiệm

Ex vitro

Ngoài điều kiện tự nhiên

9


DANH SÁCH BẢNG

Bảng

Tên bảng

Trang

3.1 Ảnh hưởng của điều kiện môi trường nuôi cấy đến số lượng chồi
lớn (≥ 2 cm) của cụm chồi cây tre Rồng in vitro theo thời gian
(ngày SKC)

16

3.2 Ảnh hưởng của điều kiện môi trường nuôi cấy đến số lượng chồi
nhỏ (< 2 cm) của cụm chồi cây tre Rồng in vitro theo thời gian
(ngày SKC)

17

3.3 Ảnh hưởng của điều kiện môi trường nuôi cấy đến chiều cao (cm)
gia tăng của cụm chồi cây tre Rồng in vitro theo thời gian (ngày
SKC)

18

3.4 Ảnh hưởng của điều kiện môi trường nuôi cấy đến hàm lượng các
sắc tố trong lá (mg/g lá tươi) của cụm chồi cây tre Rồng in vitro
vào thời điểm 50 ngày SKC

20

3.5 Ảnh hưởng của điều kiện môi trường nuôi cấy đến tỷ lệ (%) ra rễ
của cụm chồi cây tre Rồng in vitro 30 ngày SKC

21

3.6

Ảnh hưởng của điều kiện môi trường nuôi cấy đến số rễ/cum chồi
của cụm chồi cây tre Rồng in vitro 30 ngày SKC

21

3.7 Ảnh hưởng của điều kiện môi trường nuôi cấy đến chiều dài rễ của
cụm chồi cây tre Rồng in vitro vào thời điểm 30 ngày SKC

23

3.8 Ảnh hưởng của điều kiện môi trường nuôi cấy đến hàm lượng các
sắc tố trong lá (mg/g lá tươi) của cụm chồi cây tre Rồng in vitro
vào thời

23

10


DANH SÁCH HÌNH
Bảng

Tên hình

Trang

2.1

Mẫu tre Rồng in vitro

14

3.1

Sự sinh trưởng của chồi tre Rồng in vitro ở thời điểm 50

ngày SKC

17

3.2

Các sắc tố sau khi được ly trích bằng dung môi acetone
80%

19

3.3

Phổ diện sắc tố của các nghiệm thức sau khi đo bằng máy
quang phổ Perkin Elmer

19

3.4

Sự sinh trưởng của cụm chồi tre Rồng in vitro trên môi trường
tạo rễ vào thời điểm 30 ngày SKC

22

11


BÙI MINH TƯƠI. 2011. “Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện môi trường nuôi cấy
đến sự nhân chồi và tạo rễ in vitro cây tre Rồng (Dendrocalamus giganteus Wallich

ex Munro)”. Luận văn tốt nghiệp Kỹ sư ngành Nông Học, Khoa Nông nghiệp và
SHƯD, Trường Đại học Cần Thơ. Cán bộ hướng dẫn PGs. TS. Lê Văn Hòa và Ths.
Nguyễn Văn Ây.
TÓM LƯỢC

Đề tài “Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện môi trường nuôi cấy đến sự nhân
chồi và tạo rễ in vitro cây tre Rồng” được thực hiện tại phòng nuôi cấy mô, Bộ môn
Sinh Lý Sinh Hóa, Khoa Nông nghiệp và SHƯD, Trường Đại học Cần Thơ từ tháng
12/2010 dến tháng 05/2011 nhằm hoàn thiện quy trình sản xuất giống in vitro và tìm
ra môi trường nuôi cấy thích hợp góp phần giảm giá thành cây giống tre Rồng nuôi
cấy mô.
Kết quả thí nghiệm cho thấy: (1) trong giai đoạn nhân chồi cần tiến hành
nhân chồi tre Rồng trong PTT sẽ đạt hệ số nhân chồi cao (15,14 chồi sau 50 ngày
SKC). (2) Giai đoạn tạo rễ có thể sử dụng ánh sáng tự nhiên bên ngoài PTT để góp
phần giảm giá thành cây giống. Các chồi tre Rồng bên ngoài PTT vẫn sinh trưởng
và phát triển rất tốt, tỷ lệ tạo rễ cao thích hợp cho giai đoạn trồng ra vườn ươm.

12


MỞ ĐẦU
Ở nước ta cây tre rất gần gũi với người dân, tre được sử dụng trong nhiều
lĩnh vực như: măng tre làm thực phẩm, thân tre làm nhà cửa, dụng cụ lao động,
nguyên liệu sản xuất các mặt hàng thủ công mỹ nghệ. Cây tre cũng được xem là cây
xóa đói giảm nghèo. Hiện nay xu hướng sử dụng các vật liệu hữu cơ thân thiện với
môi trường đang rất thịnh hành tại các nước phát triển.
Ngoài ra cây tre cũng được xem là cây của môi trường vì thời gian sinh
trưởng ngắn, khả năng chịu đựng với điều kiện khắc nghiệt cao. Tre có thể thay thế
gỗ giúp giảm phá rừng.
Trong số các loại tre ở Việt Nam, tre Rồng (Dendrocalamus giganteus

Wallich ex Munro) là một trong những loại tre có thân to, thích nghi với nhiều vùng
đất và điều kiện khí hậu khác nhau. Từ những kết quả đạt được cùng với những
tiềm năng trong tương lai không xa, việc nhân giống cây tre này là rất cần thiết. Kỹ
thuật nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô đã hoàn thiện về mặt quy trình và
đang được ứng dụng rộng rải, cây giống được tạo ra bằng phương pháp nuôi cấy mô
có một số ưu điểm như: tạo ra được số lượng giống lớn, kích thước và chất lượng
đồng đều, sạch bệnh và nhanh tuy nhiên giá thành cây con giống còn cao. Cây
giống cây tre Rồng nuôi cấy mô còn rất khan hiếm. Quy trình nhân giống in vitro
cây tre Rồng đã được Nguyễn Văn Ây (2009) xây dựng nhưng giá thành còn khá
cao. Vì vậy việc làm giảm giá thành giống tre này là việc làm cần thiết. Vì những lý
do trên, đề tài “Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện môi trường nuôi cấy đến sự
nhân chồi và tạo rễ in vitro cây tre Rồng” được thực hiện nhằm hoàn thiện quy
trình sản xuất và tìm ra môi trường nuôi cấy mô thích hợp góp phần giảm giá thành
cây giống cây tre Rồng nuôi cấy mô.

13


CHƯƠNG 1
LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
1.1

ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT CỦA CÂY TRE RỒNG

1.1.1 Nguồn gốc – phân loại
Tre Rồng có tên khoa học là Dendrocalamus giganteus Wallich ex Munro
thuộc nhóm cây một lá mầm, họ Hoà Thảo (Poaceae), họ phụ Tre – Trúc
(Bambusoideae). Theo Ngô Quang Đê (2003), từ “tre” theo cách gọi và cách hiểu
của người Việt Nam là để chỉ các loài có thân mọc cụm, vách thân khí sinh dày, từ
“nứa” để chỉ chung các loài có thân mọc cụm nhưng vách thân khí sinh mỏng, từ

“trúc” phần lớn chỉ những loài có thân khí sinh mọc tầng như trúc sáo, trúc cần câu,
trúc quân tử,…
Trên thế giới, họ phụ Tre – Trúc có trên 1.200 loài, 70 chi, phân bố chủ yếu
ở vùng nhiệt đới và á nhiệt đới, một số ít phân bố ở vùng ôn đới và hàn đới.
Theo Phạm Hoàng Hộ (2003), ở Việt Nam đã thống kê được 23 chi tre, với
121 loài, đa số là loài có thân khí sinh mọc cụm, một số ít loài có thân mọc tầng như
trúc sáo, trúc cần câu,… thường được trồng ở các tỉnh miền Bắc như: Cao Bằng,
Bắc Kạn, Vĩnh Phúc,…
1.1.2 Đặc tính thực vật
Tre Rồng (Dendrocalamus giganteus Wallich ex Munro) là một trong những
loài tre thân to, cao đến 35 m, lóng rộng đến 25 cm, đáy thân không nhánh, đường
kính gốc đến 30 cm, đường kính thân trung bình từ 15 – 20 cm, trọng lượng thân
trên 100 kg (cây 4 năm tuổi).
Thân tre thẳng, tròn, có màu lục mốc, cấu tạo suông, thịt tre rắn chắc, rất
dày, giao lóng từ 20 – 50 cm, mắt tre lồi cách thân từ 2 – 6 mm. Bẹ ở thân có lông
màu vàng, mép cao 5 – 12 mm, phiến thon.
Lá có phiến to, dài đến 50 cm, rộng 5 – 12 mm, mép phiến lá cao, chùm tàn.
Điều rất đặc biệt để phân biệt loài tre này với tre Mành Tông là: thân tàn thẳng,
không cạnh tranh quang hợp, tán không xòe rộng và thân rất cao.
14


Hoa tre có dạng chùm to đều, từ 2 – 2,5 cm, gié hoa dài 2 cm, có lông mịn,
mang 2 – 3 hoa. Đỉnh quả tròn dài, cao khoảng 8 mm (Phạm Hoàng Hộ, 2003).
1.1.3 Phân bố
Biên độ phân bố của loài tre này rất rộng, nó được phát hiện tại tỉnh Bình
Phước. Theo người dân địa phương, một số người cho rằng đây là tre Mành Tông vì
tre này rất giống với tre Mành Tông, một số khác cho rằng tre này có từ thời Pháp.
Tre Rồng phát triển tốt nhất ở vùng đất đỏ Bazan. Đặc biệt là những vùng đất có
lượng mưa trung bình hàng năm từ 1.500 – 2.000 mm, ẩm độ cao như: Lâm Đồng,

Bình Phước,…
1.2

SƠ LƯỢC VỀ NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT
Nuôi cấy mô là ngành khoa học sử dụng sự phát triển nhân tạo và nhân các

đỉnh sinh trưởng tồn tại hoặc mô phân sinh trong cây. Sự thành công của vi nhân
giống phụ thuộc vào nhiều yếu tố: môi trường nuôi cấy, tỷ lệ các chất điều hoà sinh
trưởng thực vật, giống, nhiệt độ, ánh sáng, cách chọn mẫu vật (Dương Công Kiên,
2007) và tất cả các giai đoạn nuôi cấy (Debergh và Zimmerman, 1991).
1.2.1 Các giai đoạn vi nhân giống
Nuôi cấy mô thực vật được chia làm 4 giai đoạn, mỗi giai đoạn có một chức
năng riêng:
Giai đoạn 1: khử trùng mẫu cấy
Giai đoạn 2: nhân chồi nhanh
Giai đoạn 3: kéo dài, tạo rễ và tiền thuần dưỡng
Giai đoạn 4: thuần dưỡng
Trong đó giai đoạn 2 là giai đoạn quyết định số lượng cây con có thể tạo ra.
Sự thành công ở giai đoạn này không những phụ thuộc vào sự kích thích chồi bất
định hay là sự phát triển chồi bên mà còn tuỳ thuộc vào số lần cấy truyền, hệ số
nhân giống và môi trường xung quanh (Debergh và Zimmerman, 1991).
Thí nghiệm được thực hiện ở giai đoạn 2 và 3.
1.2.2 Tầm quan trọng của phương pháp nuôi cấy mô thực vật
Nuôi cấy mô là một kỹ thuật nhân giống mang lại nhiều ưu điểm nổi bật như
tạo cây sạch bệnh, hệ số nhân giống cao và thời gian sản xuất được rút ngắn (Dương
15


Công Kiên, 2007). Vì vậy, kỹ thuật nuôi cấy mô có ý nghĩa kinh tế cao, nhất là đối
với những cây sinh sản chậm hoặc là những cây cần cung cấp số lượng giống lớn

(Nguyễn Như Hiền, 2005).
Nuôi cấy mô là phương pháp làm giảm giá thành (Nguyễn Bảo Toàn, 2010).
Đồng thời, tạo số lượng cây lớn và đồng điều đáp ứng nhu cầu thị trường (Dương
Công Kiên, 2007). Phương pháp này có thể nhân được một số lượng cây lớn trong
một diện tích nhỏ. Trong 1 m 2 nền có thể để được 18.000 cây nuôi cấy mô. Thuận
tiện và hạ giá thành vận chuyển (một thùng 40.000 cây dâu tây chỉ nặng 15 kg).
Ngoài ra, việc bảo quản cây giống cũng rất thuận tiện (Nguyễn Đức Thành, 2000).
Bằng phương pháp nuôi cấy mô người ta có thể nhân giống rất nhiều loại cây
từ các vùng khí hậu khác nhau trên thế giới mà nhân giống vô tính ex vitro không
thể thực hiện được (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thuỷ Tiên, 2002). Đồng thời có
thể duy trì các kiểu gen quý hiếm làm vật liệu cho công tác lai tạo giống (Nguyễn
Xuân Linh, 1998).
Bên cạnh đó, nuôi cấy mô còn bao gồm những ưu điểm nổi bật: có thể tạo
được một số loài thực vật mà không thể tiến hành ex vitro do nhân giống in vitro có
thể cảm ứng được sự trẻ hoá của mô; sự sinh trưởng của các cây nhân giống vô tính
in vitro thường mạnh hơn những cây nhân giống vô tính ex vitro vì những cây này
đã được trẻ hoá và sạch bệnh; việc nhân giống cây in vitro tạo được những cây sạch
bệnh do có sự chọn lọc các đối tượng sạch bệnh để đưa vào nuôi cấy đồng thời cũng
có thể xử lý mẫu cấy của các cây mang mầm bệnh trước khi đưa vào môi trường
nuôi cấy; trong nuôi cấy in vitro chỉ sử dụng lượng mẫu cấy ban đầu rất nhỏ cho
nên có thể chọn lọc kỹ lưỡng và dễ dàng; việc nhân giống in vitro giúp làm giảm
không gian sử dụng so với nhân giống ex vitro; do cây in vitro được nuôi cấy trong
điều kiện hoàn toàn thích hợp nên có thể sản xuất cây con quanh năm (Nguyễn Đức
Lượng và Lê Thị Thuỷ Tiên, 2002).
1.2.3 Thành phần môi trường nuôi cấy mô thực vật
Theo Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thuỷ Tiên (2002), một trong những yếu
tố quan trọng nhất trong sự sinh trưởng, phát triển của tế bào và mô thực vật trong
nuôi cấy mô là thành phần môi trường nuôi cấy. Đồng thời, theo Vũ Văn Vụ et al.
16

(2006) thành phần môi trường nuôi cấy thay đổi tuỳ thuộc vào loài thực vật, loại tế
bào, mô và bộ phận nuôi cấy. Mặc dù có sự đa dạng về thành phần và nồng độ các
chất nhưng tất cả các loại môi trường nuôi cấy đều gồm các thành phần sau: các
khoáng đa lượng, các khoáng vi lượng, đường, các vitamin và các chất điều hoà
sinh trưởng.
Ngoài ra người ta còn bổ sung một số chất hữu cơ có thành phần xác định
(amino acid, EDTA,…) và một số chất có thành phần không xác định như: nước
dừa, dịch trích nấm men,… (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thuỷ Tiên, 2002).
 Nước
Phẩm chất nước là điều kiện quan trọng trong nuôi cấy. Nước sử dụng trong
nuôi cấy thường là nước cất một lần. Trong một số trường hợp người ta sử dụng
nước cất hai lần hoặc nước khử khoáng (Nguyễn Bảo Toàn, 2010).
 Các nguyên tố khoáng đa lượng
Khoáng đa lượng rất cần cho cây, có ảnh hưởng rất tốt cho sự hấp thu của mô
cây và không gây độc (Lê Văn Hoà và Nguyễn Bảo Toàn, 2004). Nhu cầu khoáng
đa lượng của mô, tế bào thực vật không khác nhiều so với cây trồng tự nhiên. Các
nguyên tố đa lượng cần phải cung cấp là: Nitrogen (N), Phosphorus (P), Potassium
(K), Magnesium (Mg) và Calcium (Ca) (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thuỷ Tiên,
2002).
 Các nguyên tố khoáng vi lượng
Đây là những nguyên tố mà cây trồng cần rất ít nhưng không thể thiếu cho sự
sinh trưởng và phát triển bình thường của cây. Các nguyên tố vi lượng được cung
cấp là: Iode (I), Bo (B), Mangan (Mn), Kẽm (K), Đồng (Cu), Molybden (Mo),
Cobalt (Co), Sắt (Fe). Nồng độ khoáng vi lượng sử dụng thường thấp hơn 30 mg/l,
các nguyên tố này đóng vai trò quan trọng trong hoạt động của các enzyme (Nguyễn
Xuân Linh, 1998).
 Nguồn carbohydrate
Các mẫu nuôi cấy mô thực vật nói chung không thể quang hợp hoặc quang
hợp rất ít do thiếu chlorophyll, nồng độ CO2 và nhiều điều kiện khác. Vì vậy phải

đưa thêm hợp chất carbohydrate vào thành phần môi trường nuôi cấy và hợp chất
17


carbohydrate thường dùng là đường sucrose (Vũ Văn Vụ et al., 2006). Lý do nó
được sử dụng là vì nó ổn định trong hấp khử trùng và được cây sử dụng (Dương
Công Kiên, 2007).
Đường sucrose vừa là nguồn carbohydrate cung cấp cho mẫu cấy, đồng thời
còn tham gia điều chỉnh khả năng thẩm thấu của môi trường. Hàm lượng đường quá
cao cây mô khó hút được nước, ngược lại hàm lượng đường quá thấp là một trong
những nguyên nhân gây hiện tượng mọng nước ở mẫu cấy (Vũ Văn Vụ et al.,
2006). Đường còn có vai trò quan trọng trong sự tạo rễ bất định (Nguyễn Đức
Lượng và Lê Thị Thuỷ Tiên, 2002).
 Vitamin
Thực vật cần vitamin để xúc tác các quá trình biến dưỡng khác nhau. Các
vitamin thường được sử dụng trong nuôi cấy mô là: thiamin, nicotinic acid,
pyridoxine và myo – inositol (Nguyễn Bảo Toàn, 2010). Theo Vũ Văn Vụ et al.
(2006), vitamin có tác dụng thúc đẩy sinh trưởng, phát triển của mẫu cấy và trong
nhiều trường hợp nó có vai trò như nguồn carbohydrate của môi trường nuôi cấy.
 Agar
Việc làm đặc môi trường thường là nhờ những hợp chất polysaccharide cao
phân tử, chúng giữ nước và môi trường khoáng cung cấp cho cây, có thể dùng là
phytagell (gelrite) hay agar. Agar thường được sử dụng hơn vì nó trơ không chịu tác
dụng nhiều trong các phản ứng hoá học, tính ổn định cao và giá cũng tương đối rẻ
(Dương Công Kiên, 2007).
Agar được trích từ tảo và được dùng để chuẩn bị môi trường đặc hay môi
trường bán đặc để nuôi cấy mô thực vật. Agar tan ở 100oC và đông đặc ở 45 oC
(Nguyễn Đức Thành, 2000). Độ cứng của agar quyết định bởi nồng độ sử dụng và
độ pH của môi trường nuôi cấy (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thuỷ Tiên, 2002).
Nồng độ agar thường sử dụng trong môi trường nuôi cấy mô thực vật là 6 – 8 g

(Nguyễn Xuân Linh, 1998). Nồng độ agar được sử dụng sẽ ảnh hưởng đến thế năng
nước trong môi trường nuôi cấy, độ cứng của môi trường, sự sinh trưởng của mẫu
cấy, các vấn đề sinh lý của mẫu cấy như sự thừa nước và hoạt động của cytokinin
trong môi trường agar (Nguyễn Bảo Toàn, 2010).
18


Độ tinh khiết của agar trong môi trường nuôi cấy rất quan trọng. Người ta
chứng minh được rằng trong agar có chứa Ca, Mg, K, Na và sự thay đổi hàm lượng
agar sẽ làm thay đổi hàm lượng khoáng trong môi trường nuôi cấy (Nguyễn Đức
Lượng và Lê Thị Thuỷ Tiên, 2002).
 Nước dừa
Thành phần nước dừa khá phong phú như: myo – inositol, các chất thuộc
nhóm cytokinin (Vũ Văn Vụ et al., 2006) và một số amino acid khác (Nguyễn Đức
Lượng và Lê Thị Thuỷ Tiên, 2002). Diphenylurea (DPU) có hoạt tính giống như
cytokinin là chất chính trong nước dừa (Nguyễn Bảo Toàn, 2010). Các thành phần
này có hàm lượng thay đổi khác nhau giữa quả non, quả già, thậm chí khác nhau
giữa những quả cùng độ tuổi (Vũ Văn Vụ et al., 2006). Trong nuôi cấy mô thường
sử dụng nước dừa từ quả dừa bánh tẻ và quả dừa già.
 Chất điều hoà sinh trưởng
Các chất điều hoà sinh trưởng có vai trò quan trọng trong quá trình phát sinh
hình thái thực vật nuôi cấy mô. Hiệu quả tác động của nó phụ thuộc vào: nồng độ sử
dụng, mẫu nuôi cấy và hoạt tính vốn có của nó (Vũ Văn Vụ et al., 2006).
Tỷ lệ cytokinin và auxin trong môi trường nuôi cấy ảnh hưởng đến sự thành
lập chồi và tạo rễ. Tỷ lệ cytokinin cao và auxin thấp thích hợp cho sự tạo chồi,
ngược lại thích hợp cho việc tạo rễ, còn ở mức cân bằng thì thích hợp cho việc tạo
mô sẹo (Nguyễn Bảo Toàn, 2010).
Auxin
Auxin được chia làm hai loại: auxin tự nhiên và auxin tổng hợp. Auxin tự
nhiên được tìm thấy là indole – 3 – acetic acid (IAA) và auxin tổng hợp là indole –

3 – butyric acid (IBA), 2,4 – Dichlrophennoxyacetic acid (2,4 – D), naphthalene
acetic acid (NAA) (Nguyễn Bảo Toàn, 2010). IAA nhạy cảm với nhiệt và bị phân
huỷ trong quá trình hấp khử trùng và IAA không ổn định trong môi trường nuôi cấy
mô. NAA và 2,4 – D không bị biến tính trong quá trình hấp khử trùng (Nguyễn Đức
Lượng và Lê Thị Thuỷ Tiên, 2002).
Trong nuôi cấy mô, nhóm auxin được đưa vào môi trường nuôi cấy mô nhằm
thúc đẩy sự sinh trưởng và giản nở của tế bào, tăng cường các quá trình sinh tổng
19


hợp và trao đổi chất, kích thích hình thành rễ và tham gia vào cảm ứng phát sinh
phôi vô tính. Tuỳ theo loại auxin, hàm lượng sử dụng và đối tượng nuôi cấy mà tác
động sinh lý của auxin là kích thích sinh trưởng của mô, hoạt hoá sự hình thành rễ
hay hình thành mô sẹo (callus). Nồng độ auxin thường được sử dụng trong môi
trường nuôi cấy là 0,1 – 2,0 mg/l vì chúng có hiệu quả ở nồng độ thấp (Vũ Văn Vụ
et al., 2006).
Cytokinin
Cytokinin tự nhiên là zeatin được trích từ hạt bắp nảy mầm. Cytokinin tổng
hợp đầu tiên là kinetin và benzyl adenine (BA) nhưng gần đây người ta chứng minh
được chúng được một số loài cây tạo ra trong tự nhiên (Nguyễn Bảo Toàn, 2010).
Cytokinin kích thích phân chia tế bào, sự hình thành và sinh trưởng của chồi nuôi
cấy mô. Đồng thời, nó ức chế sự tạo rễ và hình thành mô sẹo. Nồng độ sử dụng
thường là 0,1 – 2,0 mg/l. Ở nồng độ cao, cytokinin có tác dụng kích thích rõ rệt đến
sự hình thành chồi bất định, đồng thời ức chế sự tạo rễ của chồi nuôi cấy (Vũ Văn
Vụ et al., 2006).
Tuy nhiên nếu không bổ sung cytokinin thì sau 10 – 12 ngày cũng cho ra chồi
nhưng tỷ lệ rất thấp (Dương Công Kiên, 2007).
 Chỉ số pH
pH của môi trường là một yếu tố quan trọng, sự ổn định của pH là một yếu tố
duy trì trao đổi chất trong tế bào. Ngoài ra sự bền vững và hấp thu một loạt các chất

phụ thuộc vào pH môi trường. Đặc biệt mẫn cảm với pH là NAA, gibberellin và các
vitamin. Sự hấp thu các hợp chất sắt cũng phụ thuộc vào pH. Để điều chỉnh pH có
thể dùng dung dịch NaOH 10% hoặc NaOH 1N và dung dịch HCl 1N (Nguyễn Đức
Thành, 2000). pH của đa số môi trường nuôi cấy được điều chỉnh giữa 5,5 – 6 trước
khi hấp khử trùng (Nguyễn Bảo Toàn, 2010). pH dưới 5,5 làm agar khó chuyển
sang trạng thái gel còn pH lớn hơn 6 agar có thể rất cứng (Vũ Văn Vụ et al., 2006).
1.2.4 Các yếu tố khác
Theo Nguyễn Bảo Toàn (2010), các yếu tố sinh lý như cường độ và thời gian
chiếu sáng, nhiệt độ, nồng độ CO2, ẩm độ bình nuôi cấy, ẩm độ vườn ươm,… cũng
có ảnh hưởng đáng kể đến vi nhân giống. Nhiệt độ chung cho các phòng tăng
20


trưởng được điều chỉnh là 26 ± 2 oC. Nhiệt độ trong các keo lọ nuôi cấy thường cao
hơn nhiệt độ trong phòng vài độ do hiệu ứng nhà kính. Cần giữ ổn định nhiệt độ
trong suốt quá trình nuôi cấy.
Quang phổ ảnh hưởng đến hình thái của cây cho nên cần lưu ý đến tỷ lệ của
phổ ánh sáng xanh dương/đỏ hoặc đỏ/cuối đỏ.
Cường độ ánh sáng thích hợp là khoảng 30 µmol.m-2.s-1 dưới điều kiện này
sự nuôi cấy còn trong giai đoạn tạp dưỡng.
Nhiệt độ trong khoảng từ 17 – 25oC thường được áp dụng để cảm ứng sự tạo
mô sẹo và sự tăng trưởng của tế bào nuôi cấy. Nhưng mỗi loài thực vật sẽ thích hợp
với một nhiệt độ khác nhau (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thuỷ Tiên, 2002).
1.3

MỘT SỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU TRÊN CÂY TRE ĐÃ ĐƯỢC

CÔNG BỐ
Ở nước ta các công trình nghiên cứu trên cây tre còn hạn chế, việc nhân
giống chủ yếu bằng phương pháp truyền thống như bằng gốc, thân ngầm, hom cành,

đoạn thân khí sinh (hom thân) hoặc bằng hạt. Kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thị
Thu Hiền (2006) về hiệu quả của các chất điều hòa sinh trưởng, vị trí cành và yếu tố
môi trường trên sự ra rễ của cành ba giống tre: lục trúc, điền trúc và trúc tạp giao đã
được báo cáo.
Theo Nguyễn Văn Ây và Lê Văn Hòa (2010) môi trường thích hợp để nhân
chồi cây tre Rồng in vitro là môi trường MS có bổ sung BA 7,5 mg/l; sử dụng môi
trường cơ bản ½ MS lỏng có bổ sung IBA 3 – 5 mg/l hoặc môi trường cơ bản ½ MS
đặc có bổ sung than hoạt tính 2 g/l và NAA 3 – 5 mg/l để tạo rễ cho cây tre rồng in
vitro cho tỷ lệ tạo rễ cao; sử dụng giá thể: phân rơm mục; tro trấu; mụn xơ dừa hay
phân rơm mục : tro trấu : mụn xơ dừa (1:1:1) để tiến hành thuần dưỡng đều cho tỷ
lệ sống cao.
Trên thế giới, việc nhân giống tre đã được nhiều tác giả thực hiện và đạt
được một số kết quả rất khả quan. Arya et al. (1999) nhân chồi in vitro giống tre
Dendrocalamus asper trên môi trường MS đặc có bổ sung BA 3 mg/l và tạo rễ in
vitro trên môi trường MS đặc có bổ sung IBA 10 mg/l hoặc NAA 3 mg/l là hiệu quả
nhất. Sool et al. (2002) đã xây dựng quy trình nhân giống tre Dendrocalamus
21


hamiltonii Nees et Arn trên môi trường cơ bản MS. Islam và Rahman (2005) đã tiến
hành vi nhân giống trên sáu giống tre có triển vọng thương mại hóa (Bambusa
balcooa, B. nutans, B. salarkhanii, B. vulgaris var. striata và Thyrsostachys oliveri)
được nuôi cấy từ đốt thân và nuôi cấy trên môi trường MS. Kết quả cho thấy: môi
trường MS có bổ sung từ BA 1 – 5 mg/l thích hợp cho giai đoạn nhân chồi, và môi
trường ½ MS có bổ sung NAA 1 – 3 mg/l hoặc IBA 1 – 5 mg/l thích hợp cho giai
đoạn tạo rễ in vitro và cho tỷ lệ sống 100% khi thuần dưỡng trong vườn ươm.
Jimenez et al. (2006) đã vi nhân giống thành công giống tre Guadua
angustifolia Kunth bằng sự kích thích chồi bên trên môi trường MS có bổ sung BAP
3 mg/l trong giai đoạn tạo chồi. Song song đó, Ndiaye et al. (2006) cũng đã nuôi
cấy in vitro giống tre Bambusa vulgaris trên môi trường MS có cải tiến cho thấy

việc bổ sung BAP 2 mg/l sẽ thích hợp cho sự nhân chồi hay bổ sung IBA 20 mg/l sẽ
thích hợp cho giai đoạn tạo rễ.
Theo Lin et al. (2007) sử dụng môi trường MS có bổ sung TDZ 0,45 µM để
nhân chồi và cho thấy môi trường lỏng có hiệu quả hơn môi trường đặc khi nhân
giống tre Bambusa oldhamii Munro; hiệu quả tạo rễ đạt 83% khi sử dụng môi
trường MS lỏng có bổ sung NAA 10,74 – 26,85 µM trong giai đoạn tạo rễ in vitro.
Mặt khác, Gillis et al. (2007) cũng đã nghiên cứu thành công kỹ thuật tạo phôi vô
tính giống Bambusa balcooa Roxburgh trên môi trường MS cải tiến.
Diab và Mohamed (2008) sử dụng đốt thân của giống tre Oxytenanthera
abyssinica A. Rich. Munro ở giai đoạn 12 tháng tuổi để tiến hành nhân giống in
vitro trên môi trường MS. Kết quả cho thấy: môi trường MS bổ sung BA 5 mg/l kết
hợp với NAA 0,2 mg/l là thích hợp nhất trong giai đoạn tạo chồi; môi trường tạo rễ
thích hợp nhất là môi trường MS có bổ sung IBA 8 mg/l.
Mudoi và Borthakur (2009) đã sử dụng môi trường MS bổ sung BAP 1 mg/l
cho thấy hiệu quả nhân chồi gấp 10 lần sau 4 tuần nuôi cấy từ cụm chồi chứa 2 – 3
chồi con trên giống tre Bambusa balcooa Roxb., tỷ lệ tạo rễ lên đến 75% khi sử
dụng môi trường MS có bổ sung BAP 1 mg/l kết hợp với NAA 3 mg/l trong giai
đoạn tạo rễ và tỷ lệ sống sau thuần dưỡng đạt trên 90%.

22


1.4

MỘT SỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU NUÔI CẤY MÔ IN VITRO BẰNG

MÔI TRƯỜNG NGOẠI CẢNH ĐÃ ĐƯỢC CÔNG BỐ
Theo kết quả nghiên cứu trên cây Khóm và cỏ Vetiver (Lê Văn Bé et al.,
2003) và cây phong lan (Vũ Ngọc Phượng et al.,2007) thì hai điều kiện nuôi cấy
(trong và ngoài phòng tăng trưởng) cho kết quả nhân chồi không khác biệt có ý

nghĩa thống kê. Theo Nguyễn Thùy Dương (2009) khi khảo sát điều kiện nuôi cấy
trong và ngoài phòng tăng trưởng trên cây hoa Hồng Nhung cho thấy tỷ lệ nhân
chồi không khác biệt có ý nghĩa thống kê, chỉ khác biệt có ý nghĩa thống kê ở
nghiệm thức tạo rễ. Trên cây Nghệ kết quả nghiên cứu cho thấy tỷ lệ nhân chồi ở
điều kiện trong lồng kiếng cao hơn trong phòng tăng trưởng, khả năng tạo rễ thì như
nhau ở hai điều kiện nuôi cấy (Trần Thị Ngọc Anh, 2008). Một kết quả nghiên cứu
khác trên cây Gấc của Bùi Minh Kim (2008) cũng cho kết quả tương tự.

23