XÁC ĐỊNH một số điều KIỆN THÍCH hợp để tạo môi TRƯỜNG tế bào xơ PHÔI gà một lớp và THỬ NGHIỆM NUÔI cấy VIRUS NEWCASTLE

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG

LÊ TRẦN HOÀI KHANH

XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN THÍCH HỢP ĐỂ TẠO
MÔI TRƯỜNG TẾ BÀO XƠ PHÔI GÀ MỘT LỚP VÀ
THỬ NGHIỆM NUÔI CẤY VIRUS NEWCASTLE

Luận văn tốt nghiệp
Ngành: THÚ Y

Cần Thơ, 2009


TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG

Luận văn tốt nghiệp
Ngành: THÚ Y

Đề tài:

XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN THÍCH HỢP ĐỂ TẠO
MÔI TRƯỜNG TẾ BÀO XƠ PHÔI GÀ MỘT LỚP VÀ
THỬ NGHIỆM NUÔI CẤY VIRUS NEWCASTLE

Giáo viên hướng dẫn:

Sinh viên thực hiện :

TS. Hồ Thị Việt Thu

Lê Trần Hoài Khanh
MSSV: 3042884
Lớp: Thú y K30

Cần Thơ, 2009
i


TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG
BỘ MÔN THÚ Y


Đề tài : « Xác định một số điều kiện thích hợp để tạo môi trường tế bào xơ
phôi gà một lớp và thử nghiệm nuôi cấy virus Newcastle » do sinh viên
Lê Trần Hoài Khanh thực hiện tại Phòng thí nghiệm Virus học, Bộ môn Thú
Y, Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ, từ
tháng 01 năm 2009 đến tháng 05 năm 2009.

Cần Thơ, ngày tháng năm 2009
Duyệt Bộ môn

Cần Thơ, ngày tháng năm 2009
Duyệt Giáo viên hướng dẫn

HỒ THỊ VIỆT THU

Cần Thơ, ngày tháng năm 2009

Duyệt Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng

ii


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân tôi. Các số liệu, kết
quả trình bày trong bài luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất
kỳ công trình khoa học nào trước đây.
Tác giả

Lê Trần Hoài Khanh

iii


LỜI CẢM TẠ
Xin gởi lòng biết ơn sâu sắc và kính trọng nhất đến Cha Mẹ, đấng sinh thành đã
dạy dỗ và cho tôi ăn học đến ngày hôm nay, luôn động viên khuyến khích tôi trong
suốt quá trình học tập.
Qua thời gian học tập và rèn luyện tại trường Đại học Cần Thơ, cũng như trong
suốt quá trình thực hiện luận văn này, tôi đã được quý Thầy Cô tận tình hướng dẫn và
truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm quý báu về chuyên ngành Thú Y mà tôi
đang học.
Xin chân thành cảm ơn đến:
- Cô Hồ Thị Việt Thu đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này.
- Cô Trần Thị Minh Châu (cố vấn học tập) đã dìu dắt chúng tôi trong 5 năm học qua.
- Quý Thầy Cô bộ môn Thú Y đã tận tình giảng dạy, truyền thụ cho tôi nhiều kiến thức
chuyên ngành quý báu.
- Tập thể lớp Thú Y K30 đã bên cạnh và giúp đỡ tôi trong những năm tháng trên

giảng đường đại học.
- Chị Nguyễn Thị Thu Trang - K27 Bộ môn CNSH, Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ
Chí Minh - đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và truyền đạt cho tôi những kiến thức về
Công nghệ sinh học tế bào, virus để tôi hoàn thành luận văn này.
- Chị Huỳnh Ngọc Trang đã tận tình chỉ dẫn và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong
những ngày làm việc tại phòng thí nghiệm.
- Các anh chị trong lớp Cao học Thú Y K14: anh Nguyễn Tiến Sĩ, chị Mai Trương
Hồng Hạnh, chị Nguyễn Hải Ngân đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong phòng thí nghiệm.
- Các quý đọc giả đã đọc, tham khảo luận văn này và góp ý cho tôi để hoàn chỉnh bài
luận văn.
Kính gởi đến Cha Mẹ, quý Thầy Cô, anh chị và bạn bè của tôi lời chúc sức khỏe,
thành công và xin nhận nơi tôi lòng biết ơn sâu sắc.
Lê Trần Hoài Khanh

iv


TÓM LƯỢC
Với mục đích xác định những điều kiện thích hợp để tạo môi trường tế bào xơ phôi
gà một lớp phù hợp điều kiện nuôi cấy in vitro, sau đó nuôi cấy tăng sinh nguồn virus
Newcastle và khảo sát tác động của virus Newcastle trên môi trường tế bào, đề tài:
« Xác định một số điều kiện thích hợp để tạo môi trường tế bào xơ phôi gà một lớp và
thử nghiệm nuôi cấy virus Newcastle » được thực hiện từ tháng 1-2009 đến tháng 52009. Chúng tôi thu được một số kết quả sau: 1) Với 4 nồng độ tế bào thử nghiệm: 3 x
105, 5 x 105, 7 x 105 và 10 x 105 tb/ml thì nồng độ 5 x 105 tb/ml cho hiệu quả tạo lớp tế
bào đều và đồng nhất hơn so với hai nồng độ 7 x 105 và 10 x 105 tb/ml, nồng độ 3 x
105 tb/ml không tạo được lớp đơn. 2) Khi so sánh 3 nồng độ thử nghiệm LGlutamine:3%, 6%, 9% được bổ sung vào môi trường tăng trưởng EMEM lên hiệu
quả tạo lớp đơn tế bào đã cho kết quả không có sự khác biệt về hình thái lớp đơn tế
bào và thời gian tạo lớp tế bào giữa 3 nồng độ L-Glutamine này là như nhau qua 3
mốc thời điểm quan sát: 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ. 3) Trong 2 loại thuốc nhuộm được
chọn lựa để nhuộm tế bào đã nhiễm virus Newcastle thì Crystal violet cho hiệu quả

khảo sát hình thái tế bào, quan sát bệnh lý tế bào (CPE) và tính liều gây nhiễm 50% tế
bào nuôi cấy (TCID50) tốt hơn Neutral red. 4) Bằng phản ứng HA cho thấy có sự tăng
sinh của virus Newcastle qua hai lần cấy truyền virus trên môi trường tế bào xơ phôi
gà và gây bệnh tích tế bào rõ ràng hơn.

v


MỤC LỤC
Trang phụ bìa .........................................................................................................................i
Trang duyệt ...........................................................................................................................ii
LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................................... iii
LỜI CẢM TẠ ......................................................................................................................iv
TÓM LƯỢC..........................................................................................................................v
MỤC LỤC ...........................................................................................................................vi
Danh mục hình .....................................................................................................................ix
Danh mục bảng .....................................................................................................................x
Danh mục chữ viết tắt...........................................................................................................xi
CHƯƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ..................................................................................................1
CHƯƠNG 2 CƠ SỞ LÝ LUẬN ............................................................................................2
2.1 Lịch sử nghiên cứu và phát triển kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật .............................. 2
2.2 Cấu tạo của tế bào động vật ......................................................................................... 3
2.3 Đặc điểm của tế bào động vật nuôi cấy ........................................................................ 4
2.3.1 Sự điều hòa trao đổi chất ....................................................................................... 4
2.3.2 Tính chất cơ học yếu ............................................................................................. 4
2.3.3 Khả năng phân chia và tốc độ tăng trưởng chậm.................................................... 5
2.3.4 Cần giá đỡ trong quá trình phát triển, nhân đôi...................................................... 5
2.3.5 Chịu ảnh hưởng rất mạnh bởi sản phẩm trao đổi chất của chúng............................ 5
2.3.6 Khả năng tiếp nhận gen lạ ..................................................................................... 5
2.3.7 Khả năng bảo quản trong điều kiện nhân tạo ......................................................... 5

2.4 Tổng quan về nuôi cấy tế bào động vật ........................................................................ 6
2.4.1 Các hình thức nuôi cấy tế bào động vật ................................................................. 6
2.4.2 Các dòng tế bào nuôi cấy (Cell line)...................................................................... 6
2.4.3 Dụng cụ nuôi cấy tế bào........................................................................................ 6
2.4.4 Một số môi trường nuôi cấy tế bào xơ phôi gà....................................................... 7
2.5 Một số điều kiện thích hợp cho nuôi cấy tế bào động vật ............................................. 8
2.5.1 Nhiệt độ ủ ấm ....................................................................................................... 8
2.5.2 Chỗ bám (giá đỡ) .................................................................................................. 8
2.5.3 Môi trường nuôi cấy.............................................................................................. 8
2.5.4 Các thành phần khác trong môi trường nuôi cấy.................................................... 9
2.6 Đánh giá tình trạng tế bào nuôi cấy............................................................................ 10
2.7 Sự tạp nhiễm khi nuôi cấy tế bào động vật ................................................................. 10
2.8 Các pha trong nuôi cấy tế bào động vật ...................................................................... 11
2.8.1 Pha ức chế (lag phage) ........................................................................................ 11
2.8.2 Pha phát triển (log phage) ................................................................................... 12
2.8.3 Pha ổn định (stationary phage) ............................................................................ 12
2.8.4 Pha suy giảm (decline phage) .............................................................................. 12
2.9 Ứng dụng của kỹ thuật nuôi cấy tế bào ...................................................................... 12
2.10 Nuôi cấy và thu nhận virus trên tổ chức tế bào ......................................................... 13
2.10.1 Lịch sử nuôi cấy và thu nhận virus .................................................................... 13
2.10.2 Định nghĩa và đặc tính chung của virus ............................................................. 13
2.10.3 Mối quan hệ giữa virus và tế bào vật chủ - sự nhân lên của virus....................... 14
2.10.3.1 Giai đoạn virus hấp phụ trên bề mặt tế bào ................................................. 14
2.10.3.2 Giai đoạn virus xâm nhập vào tế bào .......................................................... 14
2.10.3.3 Giai đoạn tổng hợp các thành phần của virus .............................................. 14
2.10.3.4 Giai đoạn lắp ráp, hình thành các hạt virus ................................................. 15
2.10.3.5 Giai đoạn phóng thích virus ra bên ngoài tế bào.......................................... 15
2.10.4 Nuôi cấy và thu nhận virus trên môi trường tế bào CEF .................................... 15
vi

2.10.4.1 Nuôi cấy virus ............................................................................................ 15
2.10.4.2 Thu nhận virus ........................................................................................... 16
2.10.5 Các biểu hiện bệnh tích tế bào dưới tác động của virus trong môi trường tế bào
lớp đơn ........................................................................................................................ 16
2.10.6 Virus Newcastle (NDV-Newcastle Disease Virus) ............................................ 17
2.10.6.1 Hệ thống phân loại ..................................................................................... 17
2.10.6.2 Đặc điểm hình thái và cấu trúc của virus Newcastle.................................... 17
2.10.6.3 Tính chất sinh học của virus Newcastle ...................................................... 18
2.10.6.4 Sức đề kháng.............................................................................................. 18
2.10.6.5 Chẩn đoán virus Newcastle ở phòng thí nghiệm ......................................... 19
2.10.6.6 Nuôi cấy virus Newcastle trong phòng thí nghiệm ...................................... 19
CHƯƠNG 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU........................................20
3.1 Thời gian và địa điểm ................................................................................................ 20
3.1.1 Thời gian ............................................................................................................ 20
3.1.2 Địa điểm ............................................................................................................. 20
3.2 Vật liệu và hóa chất ................................................................................................... 20
3.2.1 Đối tượng thí nghiệm .......................................................................................... 20
3.2.2 Các dụng cụ và thiết bị thí nghiệm ...................................................................... 20
3.2.3 Các hoá chất và môi trường................................................................................. 21
3.3 Nội dung nghiên cứu.................................................................................................. 22
3.4 Phương pháp nghiên cứu............................................................................................ 22
3.4.1 Xây dựng quy trình tạo môi trường tế bào xơ phôi gà (CEF) một lớp .................. 22
3.4.1.1 Phương pháp tạo môi trường CEF một lớp ................................................... 22
3.4.1.2 Thí nghiệm 1: Xác định nồng độ tế bào nuôi cấy thích hợp với điều kiện thí
nghiệm..................................................................................................................... 23
3.4.1.3 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của các nồng độ L-Glutamine khi bổ sung
vào môi trường tăng trưởng EMEM lên hiệu quả tạo lớp đơn tế bào......................... 24
3.4.1.4 Quy trình tạo môi trường tế bào xơ phôi gà một lớp ..................................... 25
3.4.2 Phương pháp nuôi cấy và phân lập virus Newcastle trong môi trường tế bào xơ

phôi gà một lớp............................................................................................................ 26
3.4.2.1 Phương pháp tạo nguồn virus Newcastle ...................................................... 26
3.4.3.2 Phương pháp nuôi cấy và thu nhận virus Newcastle trong môi trường tế bào xơ
phôi gà một lớp........................................................................................................ 26
3.4.3.3 Sơ đồ quy trình nuôi cấy, tăng sinh và thu nhận virus Newcastle trên môi
trường tế bào CEF.................................................................................................... 28
3.4.4 Phương pháp pha loãng và chuẩn độ virus Newcastle vào môi trường tế bào xơ
phôi gà một lớp............................................................................................................ 29
3.4.4.1 Pha loãng virus............................................................................................. 29
3.4.4.2 Chuẩn độ virus ............................................................................................. 29
3.4.4.3 Cách xác định chỉ số TCID50 dựa vào CPE ...................................................29
3.4.5 Thí nghiệm 3: Xác định hiệu quả tăng sinh NDV qua 2 lần cấy truyền trên môi
trường CEF.................................................................................................................. 30
3.4.6 Thí nghiệm 4: So sánh hiệu quả sử dụng hai loại thuốc nhuộm tế bào: Neutral red
và Crystal violet trong quan sát CPE và tính chỉ số TCID50 .......................................... 30
3.4.6.1 Phương pháp nhuộm tế bào bằng Neutral red ............................................... 30
3.4.6.2 Phương pháp nhuộm tế bào bằng Crystal violet ............................................ 30
3.4.6.3 Sơ đồ quy trình nhuộm tế bào bằng hai loại thuốc nhuộm Neutral red và
Crystal violet ........................................................................................................... 31
3.4.6.4 Bố trí thí nghiệm .......................................................................................... 32
CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN........................................................................33
vii


4.1 Thí nghiệm 1: Xác định nồng độ tế bào nuôi cấy thích hợp với điều kiện thí nghiệm . 33
4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ L-Glutamine khi bổ sung vào môi
trường tăng trưởng EMEM lên hiệu quả tạo lớp đơn tế bào.............................................. 37
4.3 Thí nghiệm 3: Xác định hiệu quả tăng sinh NDV qua 2 lần cấy truyền trên môi trường
CEF................................................................................................................................. 40
4.4 Thí nghiệm 4: So sánh hiệu quả sử dụng hai loại thuốc nhuộm tế bào: Neutral red và

Crystal violet trong quan sát CPE và tính chỉ số TCID50 .................................................. 41
4.5 Xác định chỉ số TCID50 dựa vào CPE ........................................................................ 43
CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ............................................................................44
5.1 Kết luận..................................................................................................................... 44
5.2 Đề nghị...................................................................................................................... 44
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................................45
PHỤ CHƯƠNG ..................................................................................................................46
Phụ chương 1. Một số thao tác thí nghiệm ....................................................................... 47
Phụ chương 2. Xử lý số liệu............................................................................................. 52
Phụ chương 3. Một số hình ảnh thực hiện đề tài............................................................... 53

viii


DANH MỤC HÌNH
Hình

Tên hình

Trang

Hình 2.1: Mô hình của một tế bào động vật ..........................................................................3
Hình 2.2: Cấu tạo của trứng có phôi 10 ngày tuổi .................................................................3
Hình 2.3: Các loại dụng cụ nuôi cấy lớp đơn tế bào ..............................................................7
Hình 2.4: Các loại dụng cụ nuôi cấy huyền phù tế bào .........................................................7
Hình 2.5: Các môi trường nuôi cấy tế bào xơ phôi gà ...........................................................8
Hình 2.6: Sự tạp nhiễm trong môi trường tế bào .................................................................11
Hình 2.7: Đường cong tăng trưởng của nguyên bào sợi người qua 3 lần cấy truyền ............11
Hình 2.8: Vaccine Gumboro, vaccine dịch tả vịt được sản xuất từ nuôi cấy virus nhược
độc trên môi trường tế bào CEF .........................................................................12

Hình 2.9: Cấu trúc virus Newcastle ....................................................................................17
Hình 3.1: Bố trí thí nghiệm xác định nồng độ tế bào thích hợp cho nuôi cấy .......................23
Hình 3.2: Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của các nồng độ L-Glutamine lên hiệu
quả tạo lớp đơn tế bào .........................................................................................24
Hình 3.3: Sơ đồ quy trình nuôi cấy tế bào xơ phôi gà một lớp ........................................... 25
Hình 3.4: Sơ đồ quy trình nuôi cấy, tăng sinh và thu nhận virus Newcastle trên môi
trường tế bào CEF....................................................................................................28
Hình 3.5: Sơ đồ quy trình nhuộm tế bào bằng hai loại thuốc nhuộm Neutral Red và Crystal
violet .......................................................................................................................... 31
Hình 3.6: Bố trí thí nghiệm so sánh hiệu quả sử dụng hai loại thuốc nhuộm tế bào:
Neutral red và Crystal violet ..............................................................................32
Hình 4.1: Biểu đồ thời gian trung bình tạo lớp tế bào với các mật độ nuôi cấy ban đầu ......33
Hình 4.2: TN1 - Tế bào xơ phôi gà sau 24 giờ nuôi cấy (phóng đại 200 lần) ....................... 34
Hình 4.3: TN1 - Tế bào xơ phôi gà sau 48 giờ nuôi cấy (phóng đại 200 lần) ....................... 35
Hình 4.4: TN1 - Tế bào xơ phôi gà sau 72 giờ nuôi cấy (phóng đại 200 lần) ....................... 35
Hình 4.5: TN1 - Tế bào xơ phôi gà sau 96 giờ nuôi cấy (phóng đại 200 lần) ...................... 36
Hình 4.6: TN2 - Tế bào phôi gà sau 24 giờ nuôi cấy, 5x10 5 tb/ml (phóng đại 100 lần)........ 38
Hình 4.7: TN2 - Tế bào phôi gà sau 48 giờ nuôi cấy, 5x10 5 tb/ml (phóng đại 100 lần).........38
Hình 4.8: TN2 - Tế bào phôi gà sau 72 giờ nuôi cấy, 5x10 5 tb/ml (phóng đại 100 lần).........38
Hình 4.9: Kết quả xét nghiệm HA của các huyền dịch NDV qua các lần cấy truyền .......... 40
Hình 4.10: Tế bào CEF nhiễm virus sau 7 ngày, nhuộm với 2 loại thuốc nhuộm (phóng
đại 100 lần) ..................................................................................................... 41
Hình 4.11: Các biểu hiện CPE trên tế bào nhiễm virus sau 5 ngày (trạng thái tươi, phóng
đại 200 lần) ....................................................................................................... 42
Hình 4.12: Tế bào CEF nhiễm virus sau 7 ngày nhuộm với 2 loại thuốc nhuộm (phóng
đại 200 lần) ...................................................................................................... 42

ix

DANH MỤC BẢNG
Bảng

Tên bảng

Trang

Bảng 4.1: Thời gian trung bình tạo lớp tế bào với các nồng độ nuôi cấy ban đầu ...............33
Bảng 4.2: Hiệu quả tạo lớp tế bào tương ứng với 3 nồng độ L-Gluamine qua 3 thời
điểm quan sát .....................................................................................................36
Bảng 4.3: Kết quả xét nghiệm HA xác định hiệu quả tăng sinh NDV trên môi trường CEF
của các huyền dịch NDV qua các lần cấy truyền ..................................................40
Bảng 4.4: So sánh hiệu quả quan sát CPE khi quan sát tươi , nhuộm Neutral red và nhuộm
Crystal violet .......................................................................................................43
Bảng 4.5: Kết quả xác định CPE để tính chỉ số TCID50 qua nhuộm Crystal violet ..............43

x


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Viết tắt
CEF
MEM
E’MEM
D’MEM
HEPES
UV
IFN
CPE
PFU

TCID50
PD
NDV
RNA
DNA
HN
F
L
N
P
M
HI
HA
EDTA
DPBS
FBS
CAM
MTTT
FU
TN
Tb

Nguyên chữ
Chicken Embryo Fibroblast
Minimum Essential Medium
Eagle Minimum Essential Medium
Dulbecco – Modified Eagle Medium
Hydroxy – Ethyl – Piperazine – Ethane – Sulphonic acid
Ultraviolet light
Interferon

Cytopathic Effect
Plaque Forming Unit
Tissue Culture Infective Dose 50
Proportional distance
Newcastle Disease Virus
Ribonucleic acid
Deoxyribonucleic acid
Haemagglutinin-Neuraminidase protein
Fusion protein
Polymerase protein
Nucleocapsid protein
Phosphoprotein
Matrix protein
Haemagglutination inhibition
Haemagglutination
Ethylene Diamine Tetra Acetic Acid
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Solution
Foetal Bovine Serum
Chorioallantoic membrane
Môi trường tăng trưởng
Fungicide
Thí nghiệm
Tế bào

xi


CHƯƠNG 1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Động vật cũng như nhiều loài sinh vật đa bào khác được cấu tạo từ những loại mô

khác nhau. Các mô cấu tạo từ những tế bào cùng loại. Như vậy, tế bào là đơn vị cấu
trúc nhỏ nhất của một cơ thể, là đơn vị chức năng cơ bản của sự sống.
Thuyết tế bào của Schleiden và Schwann (1838) đã mở ra khả năng nuôi cấy tế
bào thực vật và động vật. Từ đó, nhiều nhà khoa học đã có những nghiên cứu sâu về
khả năng phát triển và ứng dụng của tế bào với mục đích cung cấp nguyên liệu cho
các nghiên cứu sinh học, y học...
Trên thế giới, công nghệ nuôi cấy tế bào động vật đã trải qua một giai đoạn dài tìm
hướng đi về kỹ thuật, tìm môi trường tương ứng và đang bước vào giai đoạn sản xuất
theo quy mô công nghiệp ở giai đoạn vừa và nhỏ. Tuy nhiên, ở Việt Nam, kỹ thuật
nuôi cấy tế bào động vật vẫn chưa phát triển mạnh. Do vậy, việc nghiên cứu phát triển
kỹ thuật này là điều cần thiết.
Tế bào phôi gà là loại tế bào dễ bám vào bề mặt dụng cụ nuôi cấy và môi trường
không cần nồng độ huyết thanh cao như các dòng tế bào khác (ví dụ các tế bào tách từ
phôi chuột, các dòng tế bào ung thư...) (Phan Kim Ngọc, 2002). Vì vậy, việc sản xuất
tế bào xơ phôi gà trong điều kiện Việt Nam là hoàn toàn có khả năng thực hiện được
nhằm phục vụ nhiều lĩnh vực, nhiều mục đích khác nhau như: chẩn đoán các bệnh do
virus gây ra, phân lập, tăng sinh nguồn virus để sản xuất vaccine gia cầm trong tình
hình hiện nay, cũng như làm nền tảng cho những nghiên cứu sau này.
Xuất phát từ nhu cầu thực tế trên, với điều kiện của phòng thí nghiệm virus học,
Bộ môn Thú y, Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng, chúng tôi tiến hành thực
hiện đề tài:
« Xác định một số điều kiện thích hợp để tạo môi trường tế bào xơ phôi gà một
lớp và thử nghiệm nuôi cấy virus Newcastle ».
Mục đích của đề tài :
- Xác định những điều kiện thích hợp để tạo môi trường tế bào xơ phôi gà một lớp
như nồng độ tế bào nuôi cấy ban đầu, nồng độ L-Glutamine...
- Phân lập, tăng sinh virus Newcastle trên môi trường tế bào.
- So sánh các loại thuốc nhuộm tế bào trong quan sát bệnh lý tế bào và tính liều
gây nhiễm 50% tế bào nuôi cấy.

1


CHƯƠNG 2
CƠ SỞ LÝ LUẬN
2.1 Lịch sử nghiên cứu và phát triển kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật
Nuôi cấy tế bào động vật
Năm 1838, Schleiden và Schwann công bố thuyết tế bào, đặt nền tảng cho nhiều
nhà khoa học nghiên cứu sâu về khả năng phát triển tế bào từ một tế bào gốc ban đầu.
Đến năm 1885, Roux nhận xét rằng tế bào phôi gà có thể giữ ở trạng thái sống
trong dung dịch muối sinh lý bên ngoài cơ thể, đây là ghi nhận đầu tiên về khả năng
nuôi tế bào động vật.
Sau đó năm 1907, Harrison lần đầu tiên tách thành công tế bào thần kinh ếch để
làm thí nghiệm nuôi chúng ngoài cơ thể. Ông đã quan sát được dưới kính hiển vi sợi
thần kinh hình thành từ tế bào chất của tế bào thần kinh.
Một nghiên cứu có tính chất làm nền tảng cho công nghệ nuôi cấy tế bào động vật
thuộc về Carrel (1913), ông chứng minh tế bào có thể sống lâu ngày trong điều kiện
in vitro nếu được thường xuyên bổ sung chất dinh dưỡng trong điều kiện vô trùng.
Năm 1952, Gey tạo được dòng tế bào liên tục từ tế bào ung thư biểu bì của người.
Không lâu sau đó năm 1955, Earle lần đầu tiên nghiên cứu có hệ thống nhu cầu
dinh dưỡng thiết yếu của tế bào nuôi cấy trong điều kiện in vitro và phát hiện rằng tế
bào động vật có thể phân chia được trong một hỗn hợp chứa các dinh dưỡng có phân
tử lượng nhỏ và có sự hiện diện của một lượng huyết thanh nhất định.
Những nghiên cứu sau này của Puck (1956), Temin và Rubin (1958), Hayflick
(1961), Ham (1965), Kohler và Milstein (1975), Sato (1976), Wigler (1977) rất thành
công trong những lĩnh vực cơ bản sau (trích dẫn Nguyễn Ngọc Thanh Thảo, 2007):
- Tìm ra được nhiều môi trường thích hợp cho sự phát triển nhiều loại mô khác
nhau của người và động vật trong điều kiện in vitro.
- Hoàn thiện quy trình nuôi cấy mô động vật.
- Tạo ra được một số đột biến có ích.

Những nghiên cứu liên tục từ năm 1950 đến nay đã có ý nghĩa thực tế rất lớn trong
kỹ thuật sản xuất vaccine cho người và động vật.
Nuôi cấy tế bào xơ phôi gà (CEF: Chicken Embryo Fibroblast)
Năm 1929, Fell dùng những mảnh cơ quan phát triển từ phôi gà để nghiên cứu sự
phát triển của xương và khớp trong ống nghiệm.
Vài năm sau, Goodpasture và cộng sự (1931) bắt đầu lưu ý khả năng dùng cho
nghiên cứu và ứng dụng vào thực tiễn từ sự phát triển của tế bào phôi gà.
Trong một nghiên cứu khác của Earle và cộng sự (1943) cho rằng trong khi mô
của phôi gà có thể cung cấp sự đa dạng về loại tế bào trong nuôi cấy sơ cấp thì mô của
loài gặm nhấm có nhiều thuận lợi trong việc tạo dòng liên tục (trích dẫn Võ Thị Minh
Thư, 2002).

2


2.2 Cấu tạo của tế bào động vật

Hình 2.1: Mô hình của một tế bào động vật
( />
Các bào quan gồm: (1) hạch nhân, (2) nhân, (3) ribosome, (4) túi tiết, (5) mạng nội
chất sần, (6) bộ máy Golgi, (7) khung tế bào, (8) mạng nội chất trơn, (9) ty thể, (10)
không bào, (11) tế bào chất, (12) lysosome, (13) trung thể.
Cấu tạo của trứng gà có phôi 10 ngày tuổi - nguồn nguyên liệu cho nuôi cấy tế
bào CEF
Vỏ trứng
Buồng khí
Túi niệu

Màng đệm túi niệu

Phôi

Mắt

Cánh

Noãn hoàng

Túi phôi

Chân

Đuôi
Vỏ lụa

Lòng trắng trứng

Hình 2.2: Cấu tạo của trứng có phôi 10 ngày tuổi
( />
3


2.3 Đặc điểm của tế bào động vật nuôi cấy
2.3.1 Sự điều hòa trao đổi chất
Quá trình trao đổi chất của cơ thể được tập trung chủ yếu trong từng tế bào. Sự
chuyển hóa vật chất chủ yếu xảy ra trong tế bào và có tính quyết định đến sự tồn tại
của cơ thể sống.
Ở tế bào động vật, ngoài tác động của enzyme và hệ dịch quanh tế bào, chúng còn
bị tác động rất mạnh của hệ thần kinh. Hệ thần kinh thu nhận những phản xạ phong
phú từ bên ngoài và bên trong tế bào, điều khiển một cách hài hòa toàn bộ quá trình

trao đổi chất ở tế bào. Sự rối loạn quá trình trao đổi chất ở tế bào có liên quan rất chặt
chẽ với sự điều khiển từ hệ thần kinh. Do đó, việc điều khiển trao đổi chất của tế bào
động vật trong cơ thể sống trở nên hết sức phức tạp.
Tuy nhiên, việc điều khiển dinh dưỡng tế bào trong nuôi cấy in vitro khác quá
trình dinh dưỡng tế bào trong cơ thể. Khi nuôi cấy tế bào in vitro, các quá trình trao
đổi chất của tế bào hoàn toàn tuân theo các đặc điểm của một tế bào độc lập, không
tuân theo quy luật của mô và của cơ thể đa bào. Việc nuôi cấy tế bào động vật được
thực hiện trên cơ sở điều khiển quá trình tổng hợp enzyme và các hoạt động của
enzyme, đây cũng là hai yếu tố quyết định khả năng phát triển của tế bào, khả năng
tạo ra những sản phẩm trao đổi chất của tế bào, cũng như khả năng phân chia tế bào.
Trong quá trình phát triển của tế bào, có hai vấn đề ảnh hưởng quyết định đến kết
quả:
- Bản chất tự nhiên của tế bào, hay nói cách khác là nguồn gốc của tế bào.
- Những yếu tố môi trường quyết định đặc trưng riêng biệt của tế bào.
Sự hiểu biết nguồn gốc của tế bào giúp ta định hướng sản phẩm cuối, còn sự hiểu
biết về đặc trưng riêng biệt giúp ta điều chỉnh để tính trạng đó được biểu hiện ra trong
quá trình nuôi cấy.
Trong nuôi cấy tế bào in vitro có những yếu tố hoàn toàn khác với sự phát triển
của chính tế bào đó trong cơ thể. Mọi yếu tố tác động lên tế bào nuôi cấy in vitro là
những tác động trực tiếp. Còn khi phát triển trong cơ thể, các tế bào này không chỉ
chịu tác động trực tiếp mà còn chịu những tác động gián tiếp. Do đó, mọi tác động của
môi trường đến tế bào nuôi in vitro xảy ra rất nhanh và mãnh liệt, cần tạo ra sự hài hòa
trong mọi tác động đến sự trao đổi chất của tế bào được nuôi cấy.
2.3.2 Tính chất cơ học yếu
Tế bào động vật không có thành tế bào, chúng chỉ được bao bọc bởi một màng tế
bào – thành phần duy nhất ngăn cách giữa tế bào với các tế bào khác trong mô. Mặt
khác, kích thước tế bào động vật thường rất lớn, trung bình khoảng 10 µm, lại không
có vách nên tế bào động vật có tính chất cơ học yếu. Do đó, trong quá trình nuôi cấy
cần nhẹ nhàng, tránh sự phá vỡ tế bào (Phan Kim Ngọc và Phạm Văn Phúc, 2007).

4


2.3.3 Khả năng phân chia và tốc độ tăng trưởng chậm
Do đặc điểm di truyền ở tế bào động vật và thực vật, một chu kỳ tế bào thường kéo
dài 20-70 giờ (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2003). Nếu trong một điều
kiện nào đó, một loại tế bào trong cơ thể đa bào lại tăng số lượng một cách bất thường
thì cơ thể đó sẽ chuyển sang trạng thái bệnh lý.
Sau một số lần cấy truyền nhất định, vài dòng tế bào sẽ ngừng phân chia và biểu
hiện sự hóa già. Những dòng tế bào này được gọi là dòng tế bào có hạn (finite cell
line); tế bào CEF là một dòng tế bào có hạn và số lần phân chia của tế bào CEF là từ
16-18 lần (Christman, et al., 2006). Những dòng tế bào khác có thể phân chia không
giới hạn (hoặc trở thành bất tử như tế bào ung thư) được gọi là dòng tế bào liên tục
(continued cell line). Chúng có thể xảy ra tự phát, do sử dụng thuốc, bức xạ hay virus
có chủ định.
2.3.4 Cần giá đỡ trong quá trình phát triển, nhân đôi
Trừ tế bào máu và một số giai đoạn của tế bào sinh dục, hầu hết các mô và tế bào
động vật cần bám vào giá đỡ để có thể sống và phân chia. Tế bào sẽ ngừng phân chia
khi đã hình thành một lớp đơn liên tục trên bề mặt của dụng cụ nuôi. Tuy vậy, một số
dòng tế bào như tế bào ung thư hoặc dòng tế bào liên tục từ mô bình thường (sau khi
được thuần hóa) có thể sinh trưởng và phân chia trong trạng thái lơ lửng, không cần
bám vào giá đỡ (Phan Kim Ngọc và Phạm Văn Phúc, 2007).
2.3.5 Chịu ảnh hưởng rất mạnh bởi sản phẩm trao đổi chất của chúng
Đây là cơ chế kìm hãm ngược bởi sản phẩm cuối (Negative feed – back), là cơ chế
ức chế sự tổng hợp và tiết ra ngoài môi trường của một chất nào đó, được thực hiện
bởi chính sự gia tăng của nồng độ chất này trong môi trường. Do đó, việc thay mới
môi trường sau một thời gian nuôi cấy là cần thiết. Trong phòng thí nghiệm, cơ chế
kìm hãm ngược còn có thể gây tổn thương tế bào, thậm chí chết hàng loạt. (Phan Kim
Ngọc và Phạm Văn Phúc, 2007).
2.3.6 Khả năng tiếp nhận gen lạ

Xét về cấu trúc tế bào, tế bào động vật được xem như một loại tế bào trần tự nhiên.
Chúng được bao bọc chỉ bởi một lớp màng. Do đó, trong trường hợp chúng tồn tại ở
trạng thái tự do, chúng có khả năng nhận dòng thông tin di truyền lạ từ virus hoặc khi
những tế bào động vật có thông tin di truyền khác nhau ở gần nhau, sẽ xảy ra hiện
tượng trao đổi vật chất di truyền tạo ra các tế bào lai (như tế bào Hybridoma, được lai
giữa tế bào bình thường có khả năng sản xuất kháng thể (a normal antibody-producing
cell) và tế bào ung thư tủy (a myeloma cell).
2.3.7 Khả năng bảo quản trong điều kiện nhân tạo
Khác với tế bào vi sinh vật và tế bào thực vật, tế bào động vật cần phải được bảo
quản trong những điều kiện hết sức đặc biệt mới có thể giữ được những đặc tính riêng
của nó.

5


Bằng cách sử dụng nitơ lỏng (-1960C) để trữ , tế bào động vật vẫn duy trì được đặc
tính của chúng trong thời gian rất dài. Phương pháp này được áp dụng nhiều ở các
ngân hàng giống động vật trên thế giới.
Khi sử dụng, tế bào động vật được tiến hành giải đông và được hoạt hóa để phục
hồi khả năng tăng trưởng và phân chia như trước khi đem bảo quản.
Ngoài ra, tế bào động vật rất kém thích nghi với điều kiện môi trường, nhạy cảm
với kim loại. Trong quá trình phát triển ở môi trường nhân tạo, chúng rất cần huyết
thanh, hormone.
2.4 Tổng quan về nuôi cấy tế bào động vật
2.4.1 Các hình thức nuôi cấy tế bào động vật
Nuôi cấy sơ cấp (Primary culture)
Nuôi cấy sơ cấp là giai đoạn nuôi cấy đầu tiên những tế bào vừa được tách ra từ
mô hay cơ quan (Phan Kim Ngọc, 2002). Việc nuôi cấy bắt đầu khi các tế bào được
tách ra từ mô bằng phương pháp cơ học hay bằng phương pháp xử lý enzyme, và có
thể tăng trưởng trong môi trường thích hợp.

Các tế bào nuôi cấy sơ cấp không đồng nhất với nhau do chúng là thế hệ con của
nhiều loại tế bào ban đầu khác nhau. Ở giai đoạn này, tế bào có hình thái gần mô cha
mẹ nhất.
Nuôi cấy thứ cấp (Secondary culture)
Đây là hình thức cấy truyền từ tế bào sơ cấp. Tách rời các tế bào từ bình nuôi cấy
bằng enzyme (tương tự enzyme dùng khi tách tế bào để nuôi cấy sơ cấp, thường sử
dụng trypsine), enzyme này phá hủy cấu trúc protein gắn kết tế bào với bề mặt cơ
chất. Ngay khi tế bào được tách rời, enzyme được bất hoạt nhờ môi trường nuôi cấy
(có chứa huyết thanh), huyền phù tế bào được chia nhỏ ra và cho vào bình nuôi cấy
mới.
2.4.2 Các dòng tế bào nuôi cấy (Cell line)
Dòng tế bào liên tục (Continued cell line, established cell line): là dòng tế bào
nuôi cấy qua nhiều thế hệ trong điều kiện in vitro và có thể duy trì khả năng phân bào
trong một thời gian dài mà không thay đổi đặc tính. Ví dụ: tế bào Hela (tế bào ung thư
cổ tử cung người), tế bào Vero (tế bào thận khỉ xanh Châu Phi)…
Dòng tế bào giới hạn (Finite cell line, temporary cell line): là dòng tế bào chỉ có
khả năng sống trong điều kiện nuôi cấy ở một thời gian giới hạn. Đây là các dòng tế
bào bình thường (không phải tế bào ung thư). Ví dụ: tế bào CEF (tế bào xơ phôi gà).
2.4.3 Dụng cụ nuôi cấy tế bào
Nuôi cấy lớp đơn (Monolayer culture): thường sử dụng các đĩa microplate, đĩa
petri, bình Roux (flask). Các dụng cụ được chọn tùy vào số lượng tế bào, bản chất môi
trường nuôi cấy, giá thành và thói quen của người sử dụng.

6


Các loại đĩa microplate

Bình Roux (T-flask)

Hình 2.3: Các loại dụng cụ nuôi cấy lớp đơn tế bào

Nuôi cấy huyền phù (Suspension culture): nuôi trong bình có cánh quạt xoay từ
(Spinner flask) hoặc bình lắc Erlenmeyer. Trong đó tế bào được giữ trạng thái huyền
phù trong môi trường.

Bình Erlenmeyer

Spinner flask

Hình 2.4: Các loại dụng cụ nuôi cấy huyền phù tế bào
( />
2.4.4 Một số môi trường nuôi cấy tế bào xơ phôi gà
Môi trường MEM (Minimum Essential Medium): là môi trường cơ bản được bổ
sung muối Earle, các thành phần khác như amino acid không thiết yếu, L-Glutamine,
vitamine đảm bảo cho sự phát triển của tế bào, cần bổ sung 5 – 10 % huyết thanh vào
môi trường.
Môi trường E’MEM (Eagle Minimum Essential Medium): còn gọi là môi
trường tối thiểu do H.Eagle thiết lập, là môi trường chứa nồng độ cao các amino acid
(không có L-Glutamine) và vitamine, chứa kháng sinh Kanamycin, cần bổ sung thêm
5 – 10 % huyết thanh khi nuôi cấy tế bào.

7


Môi trường D’MEM (Dulbecco – Modified Eagle Medium): là môi trường
E’MEM do Dulbecco cải tiến với thành phần một số amino acid cao gấp hai lần và
một số vitamine cao gấp 4 lần, bổ sung thêm glucose để nuôi được nhiều loại tế bào
hơn.

Môi trường EMEM

Môi trường MEM

Hình 2.5: Các môi trường nuôi cấy tế bào xơ phôi gà

2.5 Một số điều kiện thích hợp cho nuôi cấy tế bào động vật
Một điều kiện thích hợp là điều kiện tốt hơn so với điều kiện cho phép tế bào tồn
tại trong nuôi cấy. Nó cho phép các tế bào ở số lượng ít tăng số lượng thông qua sự
phân chia cũng như mang các chức năng sinh lý, sinh hóa quan trọng như trong cơ
thể. Để có điều kiện sống này, cần cung cấp cho tế bào nhiệt độ thích hợp, chất bám
tốt và điều kiện nuôi cấy chuẩn xác.
2.5.1 Nhiệt độ ủ ấm
Nhiệt độ thích hợp là nhiệt độ gần với nhiệt độ cơ thể vật chủ mà tế bào được tách
ra. Với động vật máu lạnh, nhiệt độ thường thay đổi từ 18-250C, hầu hết động vật hữu
nhũ đòi hỏi nhiệt độ từ 36-370C. Phạm vi nhiệt độ này được đảm bảo bằng nhiệt kế và
tủ ấm phải được kiểm tra thường xuyên.
2.5.2 Chỗ bám (giá đỡ)
Những tế bào phụ thuộc chỗ bám cũng đòi hỏi một chất nền tốt để bám và phát
triển. Thủy tinh và plastic (được xử lý đặc biệt) thường được sử dụng nhất. Những yếu
tố bám khác như collagen, gelatin, fibronectin có thể được sử dụng phủ bề mặt cho tác
dụng bám tốt hơn. Những tế bào sẽ có chức năng tốt nếu chúng được phát triển trên
một chất nền xốp hay có dạng tổ ong.
2.5.3 Môi trường nuôi cấy
Môi trường nuôi cấy là yếu tố phức tạp và quan trọng nhất để kiểm soát khả năng
phát triển của tế bào. Môi trường nuôi cấy chia làm hai loại:
- Môi trường tự nhiên: gồm huyết thanh động vật, nước ép bào thai và dung dịch
muối đệm (như dung dịch Hanks).

8

- Môi trường tổng hợp: tổng hợp nhiều thành phần, tương đối đầy đủ dưỡng chất
cho sự sống và phát triển của tế bào (như các môi trường MEM, EMEM, D’MEM).
Bên cạnh những đòi hỏi dinh dưỡng cơ bản, môi trường nuôi cấy phải có nhiều
yếu tố phát triển cần thiết, điều chỉnh pH, áp suất, các khí thiết yếu (O2 và CO2).
Thành phần dinh dưỡng của môi trường nuôi cấy gồm amino acid (cung cấp N),
carbohydrate (cung cấp C), khoáng (tạo hệ đệm và duy trì áp suất thẩm thấu),
vitamine (yếu tố vi lượng quan trọng trong hoạt động sống của tế bào) và protein
(quan trọng nhất là các yếu tố tăng trưởng hiện diện trong huyết thanh có vai trò kích
thích sự phân bào).
2.5.4 Các thành phần khác trong môi trường nuôi cấy
- L-Glutamine: cần thiết cho hầu hết các dòng tế bào. Glutamine được sử dụng
trong môi trường nuôi cấy tế bào như nguồn cung cấp năng lượng và carbon (Reitzer,
et al., 1979).
- Huyết thanh: các loại môi trường tăng trưởng (MTTT) để nuôi cấy tế bào đều cần
đến huyết thanh vì nó có vai trò quan trọng sau (Phan Kim Ngọc, 2002):
+ Cung cấp chất dinh dưỡng quan trọng cho tế bào như các amino acid thiết yếu,
tiền chất của nucleic acid, các nguyên tố vi lượng…
+ Cung cấp nhân tố tăng trưởng kích thích tế bào tăng trưởng và phân chia.
+ Kích thích sự phục hồi do các tổn thương tế bào khi cấy truyền và các protein
trong huyết thanh làm bất hoạt trypsine tránh các enzyme gây tổn thương tế bào.
+ Cải thiện tính tan của các chất dinh dưỡng.
+ Cải thiện tính dính của tế bào lên bề mặt nuôi nhờ các yếu tố làm tăng độ dính
của tế bào lên giá đỡ.
Huyết thanh được sử dụng trong môi trường nuôi cấy là huyết thanh bê (sử dụng
nhiều nhất), huyết thanh phôi bò, huyết thanh ngựa và huyết thanh người (sử dụng
trong nuôi cấy một số dòng tế bào của người). Tuy nhiên, huyết thanh làm tăng giá
thành nuôi lên rất nhiều. Ngoài ra, huyết thanh còn dễ bị nhiễm virus, mycoplasma và
khó ổn định chất lượng của những lô môi trường khác nhau cũng như chứa những

thành phần gây ức chế sự phân bào của một số tế bào đặc biệt. Do đó, cần chọn loại
huyết thanh phù hợp.
- Các chất đệm: góp phần kiểm soát và tránh sự thay đổi pH đột ngột. Tùy vào
từng loại tế bào, khi chúng phát triển càng nhanh thì càng sinh nhiều lactic acid làm
pH môi trường giảm, do đó cần bổ sung chất đệm. Có 2 hệ đệm thường dùng: hệ đệm
CO32-/HCO3- (NaHCO3) và hệ đệm hữu cơ như HEPES (Hydroxy – Ethyl – Piperazine
– Ethane – Sulphonic acid). Đệm NaHCO3 điều chỉnh lượng CO2 hòa tan trong môi
trường, thường được sử dụng khi dùng tủ ấm kiểm soát CO2 cung cấp từ 2-10 % CO2.
Đệm HEPES là loại đệm lưỡng cực, có khả năng điều chỉnh pH môi trường nuôi
cấy theo cả hai hướng acid và bazơ, do đó giữ pH môi trường trong khoảng 7.0 – 7.4.

9


Đệm không nhạy cảm với CO2, chúng cung cấp một hệ thống tốt để các tế bào có thể
chuyển hóa mạnh (sản xuất nhiều CO2) giữ ổn định pH.
2.6 Đánh giá tình trạng tế bào nuôi cấy
Để đánh giá trạng thái sức khỏe của tế bào nuôi cấy thường dựa trên 4 đặc điểm:
hình thái, tỷ lệ phát triển, năng suất che phủ và thực hiện chức năng đặc biệt.
- Dựa vào hình thái học (hình dạng tế bào) dễ xác định nhưng ít sử dụng do khó
đưa ra kết luận từ những quan sát trực tiếp (xem tươi), nó không thể hiện một số lượng
hay đo lường chính xác nào. Do đó, để xác định trạng thái tế bào, có thể nhuộm tế bào
bằng các loại thuốc nhuộm để xác định vấn đề bất thường. Các loại thuốc nhuộm tế
bào: Neutral red, Crystal violet được sử dụng. Chúng bắt màu các tế bào sống, Neutral
red bắt màu lysosome (Finter,1969), Crystal violet bắt màu DNA, protein và các mảng
tế bào (Renault, et al., 1991).
- Đếm tế bào để ước lượng số lượng tế bào, cho phép xác định tỷ lệ phát triển, tỷ lệ
này nhạy cảm với những thay đổi cơ bản của điều kiện nuôi cấy. Dựa vào đó có thể
thiết lập các thí nghiệm xác định điều kiện (môi trường, chất nền, huyết thanh…) tốt
hơn cho tế bào.

- Năng suất che phủ là đặc điểm dựa trên phương pháp ước lượng phần trăm tạo
lớp tế bào từ các tế bào đã phát triển bám vào cơ chất che phủ diện tích nuôi cấy. Số
lượng các tế bào phát triển đặc trưng cho khả năng tồn tại và tỷ lệ phát triển, kích
thước lớp tế bào đặc trưng cho năng suất che phủ.
- Đặc điểm cuối cùng là sự biểu hiện chức năng đặc biệt: thường khó quan sát và
đo lường nhất, được xác định bằng các xét nghiệm hóa sinh và miễn dịch.
2.7 Sự tạp nhiễm khi nuôi cấy tế bào động vật
Sự tạp nhiễm trong nuôi cấy tế bào có hai loại chính là nhiễm hóa học và nhiễm
sinh học.
- Nhiễm hóa học: khó phát hiện, nó gây ra bởi nhiều tác nhân như: endotoxin, ion
kim loại hoặc thuốc tẩy hóa học, những chất này không thể nhìn thấy được.
- Nhiễm sinh học: nấm, vi khuẩn phát triển nhanh, có thể thấy biểu hiện trong môi
trường tế bào, thay đổi pH hoặc làm đục mờ môi trường nuôi cấy. Tuy nhiên hai dạng
khác của nhiễm sinh học là mycoplasma và virus thì không dễ phát hiện và đòi hỏi
những phương pháp xác định đặc biệt.
- Ngoài ra trong môi trường tế bào nuôi cấy còn lẫn các loại tế bào khác, làm dòng
tế bào không đồng nhất do trong quá trình tách và xử lý mô lẫn các mô khác trên cùng
cơ thể.

10


Môi trường tế bào bị mờ do nhiễm khuẩn

Môi trường tế bào nhiễm nấm

Hình 2.6: Sự tạp nhiễm trong môi trường tế bào
(Hình ảnh được chụp tại phòng thí nghiệm virus học, Bộ môn Thú y, Khoa Nông nghiệp và
sinh học ứng dụng, Trường Đại học Cần thơ)

Hai yêu cầu chính để tránh tạp nhiễm: 1) Đảm bảo vô trùng tốt trong phòng thí
nghiệm khu vực làm việc: hạn chế ra vào vấy nhiễm, bật tia UV (Ultraviolet light) khử
trùng dụng cụ và tủ nuôi cấy, 2) Môi trường, dụng cụ phải được tiệt trùng, cất giữ và
sắp xếp hợp lý: môi trường nuôi cấy được lọc qua màng lọc 0,22 µm milipore filter,
dụng cụ nuôi cấy phải hấp vô trùng (autoclave) trước khi sử dụng. Sử dụng kháng sinh
và kháng nấm cẩn thận và có giới hạn trong nuôi cấy tế bào có thể hạn chế phần nào
vi khuẩn, nấm.
2.8 Các pha trong nuôi cấy tế bào động vật

Hình 2.7: Đường cong tăng trưởng của nguyên bào sợi người qua 3 lần cấy truyền
( />
2.8.1 Pha thích nghi (Lag phage)
Đây là pha đầu tiên, nó phụ thuộc rất nhiều yếu tố như thành phần, mật độ, trạng
thái ban đầu của tế bào…Pha này xảy ra sớm, không tăng về số lượng tế bào (số lượng
tế bào có thể giảm).
11


Nếu mật độ và khả năng sống của tế bào nuôi cấy thấp thì pha này sẽ kéo dài hơn.
2.8.2 Pha phát triển (Log phage)
Sau khoảng thời gian nuôi cấy, số lượng tế bào sẽ bắt đầu tăng lên nhanh chóng.
Trong chẩn đoán, thường sử dụng bình tế bào đã phủ 80% bề mặt bình (ở pha phát
triển).
2.8.3 Pha ổn định (Stationary phage)
Mật độ tế bào không tăng, số tế bào chết bằng tế bào sinh trưởng. Sự sinh trưởng
của tế bào hạn chế do: 1) Hết dưỡng chất trong môi trường nuôi cấy, 2) Các sản phẩm
của quá trình trao đổi chất có thể ức chế sự phát triển của tế bào, 3) Tế bào đã phủ kín
trên chất nền nên không còn chỗ bám và không thể sinh sản được nữa.
2.8.4 Pha suy giảm (Decline phage)
Số lượng tế bào chết tăng, mật độ tế bào sống giảm.

2.9 Ứng dụng của kỹ thuật nuôi cấy tế bào
- Phục vụ cho các nghiên cứu về tế bào động vật: sinh lý và sinh hóa tế bào, tương
tác giữa tác nhân gây bệnh và tế bào, tác dụng của thuốc đối với tế bào, tiến trình và
sự hóa già và những nghiên cứu về dinh dưỡng.
- Nghiên cứu virus học: đây là ứng dụng cơ bản và sớm nhất của nuôi cấy tế bào.
Nuôi cấy tế bào được sử dụng rộng rãi trong định danh và phân lập virus (Isolation),
cách thức virus xâm nhập và phát triển trong cơ thể.
- Khả năng nhân lên của virus trong môi trường tế bào động vật được sử dụng
trong điều chế vaccine, bao gồm vaccine bại liệt, dại, viêm gan siêu vi B, sởi…đối với
ngành chăn nuôi, sản xuất vaccine Gumboro, đậu gà, dịch tả vịt... Các chủng virus
cường độc được nuôi cấy, nhân lên và cấy truyền nhiều lần trên môi trường lớp đơn tế
bào phôi gà, các chủng virus trở nên nhược độc với cơ thể ký chủ, sử dụng môi trường
tế bào chứa virus nhược độc này để điều chế vaccine. Vaccine sản xuất từ tế bào có ưu
điểm là độ tinh khiết và đơn vị kháng nguyên cao vì thế cho đáp ứng miễn dịch sớm
và hiệu giá kháng thể đạt được cao.

Hình 2.8: Vaccine Gumboro, vaccine dịch tả vịt được sản xuất từ nuôi cấy virus
nhược độc trên môi trường tế bào CEF
( />12


- Xét nghiệm hiệu quả sử dụng của các loại thuốc: các tế bào nuôi cấy được sử
dụng riêng hay kết hợp với các xét nghiệm trên cơ thể động vật để nghiên cứu hiệu
quả của dược phẩm, hóa chất mới đối với sự tồn tại và phát triển của các loại tế bào
khác nhau.
- Nghiên cứu ung thư: các tế bào ung thư có thể phát triển trong điều kiện nuôi
cấy. Người ta sử dụng hóa chất, virus và phóng xạ làm biến đổi các tế bào nuôi cấy
bình thường thành các tế bào ung thư, từ đó nghiên cứu những nhân tố gây ra sự biến
đổi. Nghiên cứu tế bào ung thư cung cấp các hệ thống xét nghiệm để xác định phương
pháp và thuốc điều trị thích hợp cho từng bệnh ung thư khác nhau.

- Sử dụng tế bào ở dạng mô và cơ quan thay thế.
- Sản xuất các chất thứ cấp từ tế bào nuôi cấy:
+ Sản xuất interferon (IFN) từ tế bào động vật. Interferon do tế bào tiết ra khi bị
virus tấn công có tính chất kháng virus và kháng khối u.
+ Sản xuất các protein có giá trị trong y học và thương mại, bao gồm kháng thể
đơn dòng, hormone, insulin…
Ngoài ra, công nghệ nuôi cấy tế bào còn ứng dụng cho các lĩnh vực chẩn đoán di
truyền, kỹ thuật di truyền và liệu pháp gen.
2.10 Nuôi cấy và thu nhận virus trên tổ chức tế bào
2.10.1 Lịch sử nuôi cấy và thu nhận virus
Năm 1913, ba nhà khoa học là Steinhardt, Israeli và Lambert đã chỉ ra rằng virus
vaccine có thể tồn tại vài tuần trong giác mạc thỏ.
Đến năm 1925, Parker và Nye cấy virus vaccine vào những mẫu thỏ thí nghiệm,
sau đó nuôi chúng trong nguyên sinh chất.
Kỹ thuật màng đệm cũng đã được dùng để nghiên cứu virus gây bệnh đậu mùa từ
gia cầm vào năm 1931.
Năm 1946, Beverrige và Burnet đã mô tả được quá trình nuôi cấy virus và những
ký sinh nội bào bắt buộc trong phôi gà.
Vào năm 1947, Enders, Weller và Robbins đã làm thí nghiệm về sự tăng trưởng
của virus quai bị trên mô gà và bắt đầu sử dụng penicillin trong môi trường nuôi cấy
để ngăn sự nhiễm khuẩn.
Một năm sau đó (1948), Enders, Weller và Robbins chỉ ra rằng virus bại liệt có thể
được nuôi cấy in vitro mà không cần sự có mặt của mô thần kinh.
2.10.2 Định nghĩa và đặc tính chung của virus
Định nghĩa: Lwoff (nhà virus học nhận giải Nobel năm 1965) đã định nghĩa: “A
virus is a virus“ (Virus là virus), để nhấn mạnh tính chất đặc biệt của virus, nó khác
hẳn với bất kỳ một loại cơ thể sống nào đã biết trong giới động vật, thực vật và vi sinh
vật: virus có kích thước hiển vi, ký sinh nội bào và có khả năng gây bệnh. (trích dẫn
Phạm Văn Kim, 2000).

13