XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN ACID KHÔNG BAY HƠI BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ GIẤY

Sắc Ký Giấy

XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN
ACID KHÔNG BAY HƠI
BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ GIẤY
I.

MỤC ĐÍCH THÍ NGHIỆM :

- Tìm hiểu về phương pháp sắc ký giấy.
- Xác định thành phần acid không bay hơi trong dịch quả chanh và nem bằng phương
pháp sắc ký giấy.

II.

CƠ SỞ LÝ THUYẾT CỦA PHƯƠNG PHÁP :

1. Nguyên tắc :
- Sắc kí là phương pháp phân tích các cấu tử có trong hỗn hợp dựa vào khả năng hấp
phụ hay phân bố khác nhau của các cấu tử giữa 2 pha: pha động và pha tĩnh.

- Có 2 loại sắc ký tương ứng là sắc ký hấp phụ và sắc ký phân bố.
- Sắc ký giấy thuộc loại sắc kí phân bố. Phương pháp sắc ký giấy dùng để phân tích
các chất dựa trên sự phân bố khác nhau giữa các cấu tử giữa 2 pha: pha động và pha
tĩnh.
- Khi đặt băng giấy có chấm mẫu phân tích vào bình chứa dung môi thì dưới tác dụng
của lực mao dẫn dung môi sẽ dịch chuyển theo chiều dọc giấy kéo theo các thành
phần phân bố khác nhau đồng thời tách chúng ra từng thành phần.
2. Hệ sắc ký giấy :
a. Pha tĩnh:
- Có thể là nước hay dung môi hữu cơ tẩm trên chất mang rắn là giấy sắc ký.

- Giấy sắc ký cấu tạo bằng cellulose có những đặc điểm:
+ Tinh khiết về mặt hóa học.
+ Cấu tạo đồng đều về độ dày và kích thước các lỗ hổng.
+ Có cấu tạo đồng nhất.
+ Không hấp phụ và không phản ứng hóa học với mẫu.
1


Sắc Ký Giấy

+ Có khả năng giữ trên bề mặt một lượng lớn chất lỏng.
- Giấy sắc ký thường thuộc loại hydrophyl ưa nước nên nếu pha tĩnh là nước, không
cần làm ẩm giấy trước. Nếu pha tĩnh lỏng là chất hữu cơ, giấy có tính ưa nước sẽ trở
nên kỵ dung môi, do đó phải tẩm giấy bằng các chất kỵ nước như parafin, dầu thực
vật.
b. Pha động:
- Thường là dung môi hữu cơ có độ hòa tan nhỏ và cố định như buthanol, benzen,
alcol… di chuyển qua giấy.
- Thường pha tĩnh và pha động được trộn lẫn vào nhau tạo thành hệ dung môi chạy
sắc ký. Tỉ lệ của hệ dung môi này ảnh hưởng đến vận tốc di chuyển của các cấu tử.
- Các dung môi trong sắc ký giấy cần đáp ứng những yêu cầu sau:
+ Dung môi động và dung môi tĩnh không được trộn lẫn.
+ Thành phần của dung môi trong quá trình sắc ký phải không thay đổi.
+ Dung môi phải đuổi được ra khỏi giấy một cách dễ dàng, dễ tìm và không độc
hại.
c. Bình chạy sắc ký (bình tiêu bản)
Nhằm tạo bầu không khí bão hòa hệ dung môi, dung môi chạy sắc ký được chứa
trong bình thủy tinh có đậy nắp kín.
Nguyên tắc: Khi đặt băng giấy có chấm mẫu phân tích vào bình chứa dung môi, do
giấy có chứa những lỗ xốp nhỏ, dung môi sẽ di chuyển theo chiều dọc giấy kéo theo các

thành phần phân bố khác nhau đồng thời tách chúng ra thành từng phần.

2


Sắc Ký Giấy

Hình 1: Bình tiêu bản dạng trụ tròn.
3. Các phương pháp triển khai sắc ký giấy :
Tùy theo mục đích và điều kiện phân tách có thể dùng các kỹ thuật khác nhau sau
đây:
a. Sắc ký một chiều:
Dùng một hệ dung môi và cho di chuyển theo một chiều, có thể là:
- Sắc ký đi lên: thích hợp với mẫu đơn giản và thường dùng định tính. Giấy đã thấm
mẫu, được treo thẳng đứng trong bình tiêu bản được bão hòa hơi dung môi nhằm tạo
áp suất cố định và đồng đều trên bề mặt giấy. Mép dưới giấy được nhúng vào hệ
dung môi. Dung môi di chuyển lên do lực mao dẫn, kéo theo những cấu tử trong
mẫu.
- Sắc ký đi xuống: tương tự sắc ký giấy đi lên nhưng dung môi di chuyển từ trên
xuống do lực mao dẫn và trọng lực, do đó giảm được thời gian phân tách.
b. Sắc ký 2 chiều:
Được áp dụng cho mẫu có những cấu tử không thể tách được bằng một hệ dung
môi. Sau khi cho chạy một chiều với hệ dung môi 1, xoay giấy 90 o và chạy với hệ dung
môi 2, tách rời các cấu tử còn lại.
c. Sắc ký nằm ngang hay sắc ký vòng:
3


Sắc Ký Giấy

Được áp dụng khi cần tách một lượng lớn mẫu. Giấy sắc ký tròn được cắt một phần
nhỏ và chấm mẫu theo vòng tròn. Góc giấy cắt được chấm vào hệ dung môi.
 Trong bài thí nghiệm này dùng phương pháp chạy sắc ký từ dưới lên.
 Chú ý: khi đặt giấy sắc kí vào bình chạy sắc kí thì phải đặt thẳng không
chỉnh sửa sau khi đã để giấy sắc kí chạm vào dung môi.

III.
-

-

HÓA CHẤT VÀ DỤNG CỤ THÍ NGHIỆM :

1. Hóa chất:
Hệ dung môi chạy sắc ký: n - buthanol : formaline : nước (10 : 2 : 5).
Pha dung môi: dùng ống đong lấy 50ml n – buthanol, 10ml formaline và 25 ml nước
(tỉ lệ thể tích 10 : 2 : 5) cho vào phễu chiết, lắc kỹ. Để yên 3h, tách lớp nước ở dưới
đặt vào một cốc đặt vào giữa bình sắc ký để làm bão hòa hơi nước ở bình trong khi
chạy sắc ký. Tách lớp trên dùng làm pha động chạy sắc ký. Lớp dưới là nước bão
hòa buthanol, lớp trên là buthanol bão hoà nước và formaline.
Thuốc hiện màu sắc ký: dung dịch Bromphenol blue.
Dung dịch acid chuẩn: acid lactic, acid citric, acid oxalic, acid tactric và hỗn hợp
acid.
2. Dụng cụ:
1. Ống mao quản
2. Becher 100
3. Becher 250
4. Bình xịt nước cất
5. Ống bóp cao su
6. Bình xịt thuốc hiện màu

7. Phễu thủy tinh
8. Pipette 5ml
9. Bình tiêu bản có nắp
10. Giấy chạy sắc kí
11. Máy sấy tay
12. Giấy lọc
13. Erlen 250ml
14. Đũa khuấy
15. Ống đong
4


Sắc Ký Giấy

16. Muỗng inox
17. Bếp điện

IV.

TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM :

1. Xử lý mẫu :
Mẫu là thực phẩm có hàm lượng acid không bay hơi thấp (Ở bài thí nghiệm này
mẫu sử dụng là chanh và nem).
a. Đối với mẫu rắn:
- Cân khoảng 20g thực phẩm đã nghiền nhỏ, cho vào cốc dung tích 250ml.
- Thêm 50ml nước cất đã đun nóng, khuấy kỹ, để yên 20 phút để hòa tan hết acid.
- Đem lọc, thu lấy dịch lọc, chú ý tráng bã lọc nhiều lần bằng nước cất ấm, thử giấy đo
pH để kiểm tra trích ly hết acid.
- Đem cô cạn dung dịch sau khi lọc trên bếp đun cách thủy, cô cho đến cạn.

- Hòa tan cặn bằng 2ml nước cất, ta thu được dung dịch mẫu M để chấm sắc ký.
b. Đối với mẫu lỏng:
- Lấy 50ml sản phẩm lỏng. Cô cạn tới 2ml.
- Lọc và loại kết tủa nếu có, phần còn lại đem chấm sắc ký.
* Mẫu là thực phẩm có hàm lượng acid không bay hơi cao:
Đối với thực phẩm có hàm lượng acid không bay hơi cao như sữa chua, rau quả, tùy
hàm lượng, chỉ cần lấy 5-10g và tiến hành xử lý như trên.
c. Mẫu trong bài thí nghiệm:
Mẫu thực phẩm: quả chanh và nem.
Cách tiến hành:
- Nem: nghiền trong cối thật nhỏ sau đó cho nước cất vào, dùng muỗng inox trộn đều
để yên khoảng 10 phút, vắt bỏ bớt xác nem. Còn phần dịch nem ta đem lọc bằng
giấy lọc.
- Chanh: dùng dao cắt chanh ra rồi vắt lấy nước đem lọc trên giấy lọc.
- Dịch sau khi lọc ( nem và chanh) cho vào tủ sấy cho bốc hơi nước một phần, ta thu
được mẫu đem phân tích.
2. Chuẩn bị giấy sắc ký:
- Giấy có kích thước 28.5 x 23 cm.
- Dùng bút chì kẻ đường xuất phát cách mép giấy theo chiều dài 2,5cm và trên đó có
đánh dấu các điểm chấm dung dịch chuẩn và mẫu, mỗi chấm cách nhau 3 cm và
cách mép 2cm.
5


Sắc Ký Giấy

- Ghi tên mẫu chấm sắc ký gồm các acid chuẩn, hỗn hợp chuẩn và mẫu:
1. Oxalic
2. Lactic
3. Nem

4. Hỗn hợp
5. Citric
6. Chanh
7. Tatric
3. Chấm mẫu và chạy sắc ký:
- Dùng ặc ống mao quản chấm lên giấy sắc ký vào các điểm xác định 10 lần, tổng
cộng khoảng 0,1ml dung dịch từng acid chuẩn, hỗn hợp chuẩn và mẫu.
Chú ý: vệt chấm càng gọn thì kết quả phân tích càng tốt, tốt nhất là khoảng 1mm.
Muốn vậy sau mỗi lần chấm phải đợi thật khô mới chấm tiếp lần sau.
- Sau khi chấm xong, sấy khô giấy, cuộn 2 mép chiều rộng, mặt có nét vẽ đường nền ở
phía trong, dùng kim đính lại thành một ống hình trụ rồi đặt ống giấy vào bình sắc
ký đã có chứa dung môi sao cho dung môi nằm dưới vạch xuất phát, không ngập
các điểm chấm sắc ký.
- Để dung môi chạy lên cho tới mép trong vòng 2-3h.
- Sau đó lấy giấy ra, để khô trong không khí thoáng để đuổi hết hơi dung môi.
- Sấy khô.
- Phun dung dịch thuốc hiện màu bromphenol blue lên giấy.
Trên giấy sẽ xuất hiện các vệt màu vàng của acid hữu cơ trên nền xanh của thuốc hiện
màu.

V.

XỬ LÝ KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM:

Hệ số phân bố Rf của các acid có trong mẫu được tính theo công thức:

Rf 

l
lo

Trong đó:
- l là khoảng cách từ tâm các vệt màu tới đường xuất phát (cm).
- lo là khoảng cách từ đường đích của dung môi tới đường xuất phát (cm).

6


Sắc Ký Giấy

Kết quả thu được ở bảng sau:
Vệt
chấm
Oxalic
Lactic
Nem
Hỗn hợp
Citric
Chanh
Tartaric

VI.

l (cm)
8,8
6.5
6.5
6.9
6.6
6.7

8.9

l0 (cm)
11,8
11.5
11.5
11.3
11.5
11.4
11.5

Rf
0.74576
0.56522
0.56522
0.61062
0.57391
0.58772
0.75274

BÀN LUẬN:
7


Sắc Ký Giấy

 Tính phân cực của các acid
Tính phân cực của các acid thì phụ thuộc vào số nhóm – COOH và - OH có trong
công thức cấu tạo của các acid đó. Chất nào càng có nhiều nhóm – COOH và - OH
trong công thức cấu tạo thì tính phân cực của chất đó càng mạnh.

Trong 4 loại acid chúng ta khảo sát thì tính phân cực của acid tartaric mạnh nhất,
sau đó đến acid citric, acid oxalic và acid lactic
Vì dung môi pha động mà chúng ta sử dụng là dung môi không phân cực mạnh nên
nó tương tác mạnh nhất với acid lactic, sau đó đến acid oxalic rồi đến acid citric và cuối
cùng là tartaric. Do đó, nếu xét theo tính phân cực thì pha động sẽ kéo acid lactic lên
trước ở vị trí cao nhất sau đó đến acid oxalic, acid citric và cuối cùng là acid tartaric.
 Nhận xét kết quả thí nghiệm
Trong kết quả thí nghiệm mà nhóm thu nhận được thì:
- Acid lactic, acid oxalic, acid citric và acid tartaric đều lên tốt.
- Các vệt màu acid chuẩn thu được: acid lactic và nem lên bằng nhau (6.5cm), chanh
và acid citric thì cũng gần bằng nhau( 6.7 – 6.6).
Vệt chấm
Oxalic
Lactic
Nem
Hỗn hợp
Citric
Chanh
Tartaric

l (cm)
8,8
6.5
6.5
6.9
6.6
6.7
8.3

- Mẫu của chúng ta có Rfchanh = 0.58772 và Rfcitric =0.57391. Hai mẫu này có Rf xấp xỉ

bằng nhau. Do đó ta có thể kết luận trong mẫu dịch nước chanh có acid citric. Điều
này là hoàn toàn phù hợp với thực tế vì thành phần acid trong chanh chủ yếu là acid
citric.
- Mẫu nem có Rf bằng với mẫu lactic  trong nem có chứa acid lactic.
- Việc xác định Rf chỉ có khả năng định tính các chất mà không có khả năng định
lượng.
8


Sắc Ký Giấy

 Các sai số trong quá trình thí nghiệm
Trong khi tiến hành thí nghiệm, kết quả phân tích có thể không chính xác hoặc
không cho kết quả do những nguyên nhân sau:
- Chấm mẫu quá ít.
- Chấm mẫu quá nhiều, vết chấm không gọn, vết sắc kí cho ra sẽ bị loang và lẫn vào
các vết sắc kí khác.
- Không rửa sạch ống mao quản sau khi chấm, lấy tiếp chấm mẫu khác.
- Giấy sắc kí bị nhăn.
- Trước khi chạy sắc kí, khi tiến hành không cẩn thận để cho acid nhỏ vào giấy, kết
quả bị sai lệch. Hoặc cũng có thể làm giấy bị dơ do tay không sạch đè lên giấy.
- Khi cuộn giấy lại, dùng chỉ khâu lại không chắc có thể làm cuộn giấy sắc kí bị
phồng, khi đó các chất chạy sẽ không chính xác.
- Khi đặt cuộn giấy vào trong bình chạy sắc ký không cân xứng hoặc bình chạy sắc ký
đặt có thể bị nghiêng.
- Giấy sau khi đã chạy sắc kí không được sấy khô kỹ, khi phun màu sẽ làm loang acid
ra, không cho kết quả là các vệt sắc kí rõ ràng mà là các vệt loang lổ không thể xác
định.
Khi tiến hành phương pháp sắc kí giấy để phân tích một chất ta có thể gặp phải vấn
đề sau: Mẫu tách không tốt trong khi thao tác tiến hành thí nghiệm là đúng và chính xác

thì nguyên nhân duy nhất có thể là pha động không thích hợp, phải tiến hành sử dụng
dung môi pha động khác hay cùng những dung môi đó mà tỉ lệ khác nhau.
 Ưu và nhược điểm của phương pháp sắc ký giấy
- Ưu điểm:
+ Thiết bị đơn giản
+ Thao tác tiến hành đơn giản
+ Thời gian phân tích không kéo dài
+ Khả năng nhận biết (định tính) các cấu tử khá tốt.
- Nhược điểm:
Chỉ thích hợp cho phân tích định tính vì nếu phân tích định lượng phải phối hơp với
các phương pháp khác và kết quả cho ra cũng kém chính xác hơn nếu sử dụng các
phương pháp khác ngay từ đầu.

9