Nghiên cứu quá trình tạo màng biocellulose trên môi trường bổ sung tảo xoắn arthrospira platensis (spirulina)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
************
VŨ THỊ LOAN

NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH TẠO MÀNG
BIOCELLULOSE TRÊN MÔI TRƯỜNG
BỔ SUNG TẢO XOẮN ARTHROSPIRA
PLATENSIS (SPIRULINA)
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
Chuyên ngành: Sinh thái học
Mã số: 60 42 01 20
Người hướng dẫn khoa học:

PGS.TS ĐINH THỊ KIM NHUNG

HÀ NỘI, 2017


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS. Đinh Thị Kim Nhung,
người đã tận tình hướng dẫn giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này.
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu trường Đại học Sư phạm Hà
Nội 2 và Ban chủ nhiệm khoa Sinh – KTNN đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi
hoàn thành đề tài nghiên cứu.
Cuối cùng tôi xin được cảm ơn gia đình, bạn bè và người thân đã quan
tâm giúp đỡ, động viên tôi trong suốt thời gian tôi thực hiện đề tài.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 15 tháng 10 năm 2017
Học viên

Vũ Thị Loan


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan luận văn Thạc sỹ: “Nghiên cứu quá trình tạo màng
Biocellulose trên môi trường bổ sung tảo xoắn Arthrospira platensis (Spirulina)”.

Kết quả nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn của PGS.TS. Đinh Thị Kim
Nhung. Nội dung khóa luận này không trùng với các bài viết, công trình

nghiên cứu của các tác giả khác.
Hà Nội, ngày 15 tháng 10 năm 2017
Học viên

Vũ Thị Loan


MỤC LỤC

MỞ ĐẦU .....................................................................................................................1
1. Lí do chọn đề tài ......................................................................................................1
2. Mục đích nghiên cứu ...............................................................................................2
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn.....................................................................................2
4. Điểm mới của đề tài ................................................................................................2
5. Bố cục luận văn .......................................................................................................3
Chương 1 .....................................................................................................................4
TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...........................................................................................4
1.1. Giới thiệu về tảo xoắn Spirulina ..........................................................................4
1.1.1. Lịch sử...........................................................................................................4
1.1.2. Đặc điểm hình thái của tảo Spirulina ...........................................................4

1.1.3. Thành phần hóa học của tảo xoắn Spirulina ................................................6
1.2. Đặc điểm phân loại của chi Gluconacetobacter .................................................7
1.2.1. Danh pháp và vị trí phân loại .......................................................................7
1.2.2. Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa ..........................................................7
1.3. Ảnh hưởng dinh dưỡng đến chủng vi khuẩn Gluconacetobacter ........................9
1.3.1. Ảnh hưởng nguồn cacbon .............................................................................9
1.3.2. Ảnh hưởng nguồn Nitơ..................................................................................9
1.3.3. Ảnh hưởng photpho ......................................................................................9
1.4. Điều kiện nuôi cấy .............................................................................................10
1.4.1. Nhiệt độ .......................................................................................................10
1.4.2. Độ pH ..........................................................................................................10
1.4.3. Độ thông khí................................................................................................10
1.4.4. Thời gian nuôi cấy ......................................................................................10
1.5. Biocellulose ........................................................................................................10
1.5.1. Cấu trúc ......................................................................................................10
1.5.2. Một số tính chất ..........................................................................................11


1.5.3. Cơ chế tổng hợp ..........................................................................................12
1.5.4. Chức năng của cellulose đối với vi khuẩn Gluconacetobacter ..................14
1.6. Ứng dụng của màng Biocellulose ......................................................................15
1.6.1. Ứng dụng của màng Biocellulose trong một số lĩnh vực............................15
1.6.2. Ứng dụng màng Biocellulose vào mặt nạ dưỡng da .................................16
1.7. Tình hình nghiên cứu và sản xuất hiện nay.......................................................17
1.7.1. Trên thế giới ................................................................................................17
1.7.2. Tại Việt Nam ...............................................................................................19
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............................21
2.1. Đối tượng và thiết bị nghiên cứu .......................................................................21
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu .................................................................................21
2.1.2. Thiết bị và hóa chất ....................................................................................21

2.1.3. Môi trường ..................................................................................................22
2.2. Phạm vi nghiên cứu ............................................................................................22
2.3.Thời gian nghiên cứu: .........................................................................................22

2.4. Nội dung nghiên cứu ................................................................................ 22
2.5. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................... 23
2.5.1. Phương pháp vi sinh ......................................................................... 23
2.5.2. Phương pháp hóa sinh ..................................................................... 26
2.5.3. Phương pháp vật lý (xác định độ bền cơ học) ................................. 28
2.5.4. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của dinh dưỡng đến khả năng
tạo màng ......................................................................................................... 29
2.5.5. Phương pháp xác định trọng lượng tươi của màng ......................... 30
2.5.6. Phương pháp thống kê và xử lý số liệu ............................................ 30
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .......................................32
3.1. Phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng tạo màng trên môi trường bổ
sung tảo xoắn Spirulina .............................................................................................32
3.1.1. Phân lập vi khuẩn giấm từ môi trường tảo xoắn Spirulina ........................32


3.1.2. Tuyển chọn vi khuẩn giấm có khả năng tạo màng Biocellulose .................37
3.2. Nghiên cứu động thái sinh trưởng của chủng vi khuẩn G. xylinus AG7 ........... 40
3.3. Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng tới khả năng tạo màng của chủng vi khuẩn
G. xylinus AG7 ..........................................................................................................43
3.3.1. Ảnh hưởng của cacbon ...............................................................................43
3.3.2. Ảnh hưởng của nitơ ....................................................................................45
3.3.3. Ảnh hưởng của KH2PO4 .............................................................................47
3.3.4. Ảnh hưởng của MgSO4.7H2O .....................................................................48
3.4. Ảnh hưởng của điều kiện môi trường tới khả năng tạo màng Biocellulose từ
chủng vi khuẩn G. xylinus AG7 ................................................................................49
3.4.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ ..............................................................................49

3.4.2. Ảnh hưởng của pH .....................................................................................51
3.5. Khảo sát khả năng tạo màng trên môi trường bổ sung tảo xoắn Spirulina ........53
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...................................................................................55
1. Kết luận .................................................................................................................55
2. Kiến nghị ...............................................................................................................55
TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................56


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
CFU

: Colony Forming Unit (đơn vị hình thành khuẩn lạc)

g/l

: gam trên lít

G. xylinus

: Gluconacetobacter xylinus

Spirunina

: Arthrospira platensis

OD

: aptical density

mm

: milimet

STT

: số thứ tự

AG2

: Gluconacetobacter xylinus AG2

AG4

: Gluconacetobacter xylinus AG4

AG6

: Gluconacetobacter xylinus AG6

AG7

: Gluconacetobacter xylinus AG7

UV

: Ultraviolet


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Đặc điểm sinh hoá của chủng vi khuẩn Gluconacetobacter ................ 8

Bảng 1.2. Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến năng sự tạo màng Biocellulose ...... 9
Bảng 3.1. Đặc điểm hình thái của vi khuẩn giấm phân lập ................................ 33
Bảng 3.2. Đặc điểm hình thành màng cellulose của 4 chủng
Gluconacetobacter ........................................................................... 38
Bảng 3.3. Hàm lượng axit axetic tạo thành của 4 chủng Gluconacetobacter ..... 38
Bảng 3.4. Kết quả đo độ bền cơ học của màng Biocellulose ............................. 39
Bảng 3.5. Quá trình sinh trưởng của chủng G.xylinus AG7 (x106 tế bào/ml) .... 41
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến khả năng tạo màng
Biocellulose của chủng G. xylinus AG7 ............................................ 44
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của hàm lượng glucose đến quá trình tạo màng
Biocellulose của chủng vi khuẩn G. xylinus AG7 ............................. 45
Bảng 3.8. Ảnh hưởng của hàm lượng (NH 4)2SO4 đến quá trình tạo màng
Biocellulose ...................................................................................... 46
Bảng 3.9. Ảnh hưởng của hàm lượng KH 2PO4 đến quá trình tạo màng
Biocellulose ...................................................................................... 47
Bảng 3.10. Ảnh hưởng của hàm lượng MgSO4.7H2O đến khả năng tạo
màng Biocellulose của chủng G. xylinus AG7 .................................. 48
Bảng 3.11. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới sự hình thành màng Biocellulose
của chủng G. xylinus AG7 ................................................................ 49
Bảng 3.12. Ảnh hưởng của pH tới quá trình lên men tạo màng của chủng G.
xylinus AG7 ..................................................................................... 51
Bảng 3.13. Khảo sát khả năng tạo màng trên môi trường bổ sung tảo xoắn
Spirulina........................................................................................... 53
Bảng 3.14. Các bước xử lý màng Biocellulose .................................................. 54


DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình 1.1. Hình dạng tảo Spirulina quan sát dưới kính hiển vi. ........................................ 5
Hình 1.2. Sợi cellulose của thực vật ..................................................................................11
Hình 1.3. Sợi cellulose của màng Biocellulose đã qua xử lí vi khuẩn ............................11

Hình 1.4. Con đường chuyển hóa cacbon trong vi khuẩn Gluconacetobacter ..............14
Hình 3.1. Dịch tảo xoắn lên men .......................................................................................32
Hình 3.2. Khuẩn lạc vi khuẩn giấm của mẫu phân lập ....................................................32
Hình 3.3. Hoạt tính catalase của khuẩn Gluconacetobacter ............................................36
Hình 3.4. Màng thu được ở 320C ......................................................................................50
Hình 3.5. Màng thu được ở pH: 5 .....................................................................................52
Đồ thị 2.1. Tương quan giữa giá trị OD610 với số lượng tế bào vi khuẩn G.xylinus
AG7..........................................................................................................26
Đồ thị 3.1. Động thái sinh trưởng phát triển của chủng G.xylinus AG7 ..................41


1

MỞ ĐẦU
1. Lí do chọn đề tài
Ngày nay, đối với các quốc gia trên thế giới công nghệ sinh học không còn là
một ngành mới mẻ mà nó đã trở thành một ngành kinh tế chủ đạo trong sự phát
triển khoa học kĩ thuật và công nghệ. Là một bộ phận của công nghệ sinh học, công
nghệ vi sinh đã và đang phát triển mạnh mẽ, ngày càng có nhiều ứng dụng thiết thực
vào cuộc sống.
Như chúng ta đã biết, tảo xoắn Spirulina là một loại vi sinh vật có hình xoắn
sống trong nước mà người ta quen gọi là Tảo xoắn với tên khoa học là Spirulina
platensis, sinh khối của chúng rất giàu dinh dưỡng và có nhiều tác dụng chữa bệnh
nên đã được nuôi trồng ở quy mô công nghiệp và được sản xuất dưới dạng viên để
phòng chống nhiều loại bệnh tật. Đặc biệt thành phần dinh dưỡng của sinh khối Tảo
xoắn khá giàu dinh dưỡng, đáng chú ý là ở chỗ sinh khối này chứa tới 50- 62 %
protein với đủ các loại axít amin cần thiết cho nhu cầu dinh dưỡng của cơ thể.
Ngoài ra còn chứa phong phú vitamin B12, Beta-carotene, xanthophyll và nhiều
nguyên tố khoáng. Chính vì vậy có thể xem tảo xoắn như một nguồn dinh dưỡng
cao có thể sử dụng làm mặt nạ dưỡng da.

Một trong các chủng vi khuẩn được sử dụng khá rộng rãi trong công nghệ lên
men vi sinh là vi khuẩn Gluconacetobacter. Vi khuẩn Gluconacetobacter khi nuôi
cấy trên môi trường dịch lỏng trong điều kiện nuôi cấy tĩnh, tạo nên một lớp màng
trên bề mặt dung dịch, màng này có bản chất từ cellulose kết hợp với tế bào vi
khuẩn Gluconacetobacter – gọi là màng sinh học. Màng có nhiều lợi điểm vượt trội
như: độ tinh sạch, độ kết tinh, độ bền sức căng, độ đàn hồi, độ co giãn, khả năng giữ
hình dạng ban đầu, khả năng giữ nước và hút nước cao. Màng có các ứng dụng đa
dạng trong nhiều lĩnh vực như y học, thực phẩm, mỹ phẩm, bảo vệ môi trường,
công nghiệp [2], [3].
Ở Việt Nam, từ năm 2000 nhóm nghiên cứu của tác giả Nguyễn Văn Thanh
và cộng sự đã có một số công trình nghiên cứu về màng Biocellulose từ
Gluconacetobacter và bước đầu nghiên cứu về các đặc tính màng thu được là cơ sở
để chế tạo màng sinh học dùng trong trị bỏng ở Việt Nam [10].


2

Nguyên liệu dùng để nuôi Gluconacetobacter rất đa dạng: nước dừa, rỉ
đường, nước mía, nước vo gạo. Các loại môi trường này đã bước đầu được nghiên
cứu. Nghiên cứu của Nguyễn Thị Kim Ngoan (2016) trên môi trường bổ sung tảo
xoắn đã tạo được sản phẩm màng từ dịch tảo xoắn nhưng màng được tạo ra còn dày
và chưa được khảo sát đặc tính vật lý [14] . Vì vậy tôi tiến hành tuyển chọn chủng
có màng mỏng và dai, sau khi tuyển chọn chủng cần nghiên cứu quá trình bổ sung
tảo xoắn của chủng vi khuẩn tuyển chọn. Chính vì vậy tôi quyết định chọn đề tài
“Nghiên cứu quá trình tạo màng Biocellulose trên môi trường bổ sung tảo xoắn
Arthrospira platensis (Spirulina)”.
2. Mục đích nghiên cứu
Tuyển chọn được chủng vi khuẩn có khả năng tạo màng Biocellulose trên
môi trường bổ sung tảo xoắn Spirulina. Xác định được động thái sinh trưởng của
chủng vi khuẩn tuyển chọn. Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng, điều

kiện môi trường cho quá trình tạo màng Biocellulose trên môi trường bổ sung tảo
xoắn Spirulina cho chủng vi khuẩn tuyển chọn.
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
- Ý nghĩa khoa học
Kết quả nghiên cứu là dữ liệu bổ sung cho các nghiên cứu và ứng dụng trong
quá trình lên men tạo màng
- Ý nghĩa thực tiễn
Tạo màng Biocellulose ( mặt nạ lụa sinh học) giàu dinh dưỡng có thể sử
dụng làm mặt nạ dưỡng da
4. Điểm mới của đề tài
Tuyển chọn được chủng vi khuẩn G. xylinus AG7 có khả năng tạo màng
mỏng và dai trên môi trường bổ sung tảo xoắn Spirulina. Nghiên cứu động thái sinh
trưởng phát triển của chủng vi khuẩn G. xylinus AG7 tuyển chọn. Tìm được môi
trường dinh dưỡng và điều kiện lên men thích hợp cho chủng vi khuẩn G. xylinus
AG7 là (g/l) gồm glucose:12; (NH4)2SO4:1,5; KH2PO4:1,0; MgSO4.7H2O : 0,8; pH:
5- 5,5 và nhiệt độ 32 ± 10C.


3

5. Bố cục luận văn
Gồm 55 trang, 9 hình, 16 bảng, 2 đồ thị, được chia thành các phần chính như
sau: Mở đầu (2 trang), chương 1 (Tổng quan tài liệu: 16 trang), chương 2 ( Đối
tượng, phạm vi, thời gian, nội dung và phương pháp nghiên cứu: 11 trang), chương
3 ( Kết quả nghiên cứu: 24 trang), Kết luận và kiến nghị (1 trang), Tài liệu tham
khảo: 48 tài liệu.


4

Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu về tảo xoắn Spirulina
1.1.1. Lịch sử
Spirulina do nhà tảo học Turpin và Grmont, 1892 dựa trên hình thái của tảo
là dạng sợi xoắn ốc (spiralis). Cũng vào năm 1892 Turpin lần đầu tiên phân lập
được tảo Spirulina từ nguồn nước tự nhiên.
Năm 1963, giáo sư Clement (người Pháp) đã nghiên cứu thành công việc
nuôi Spirulina ở qui mô công nghiệp. Do hình dạng “lò xo xoắn” với khoảng 5-7
vòng đều nhau không phân nhánh dưới kính hiển vi nên được gọi là Spirulina với
tên khoa học là tảo Spirulina platensis (bắt nguồn từ chữ spire, spiral có nghĩa là
“xoắn ốc”) và trước đây được coi là thuộc chi Spirulina. Thực ra đây không phải là
sinh vật thuộc tảo (algae) vì tảo thuộc sinh vật có nhân thật (Eukaryota). Spirulina
thuộc vi khuẩn lam (Cyanobacteria) nên chúng thuộc sinh vật nhân sơ hay nhân
nguyên thủy (Prokaryote) [47].
Vào năm 1973, Tổ chức Nông lương Quốc tế (FAO) và Tổ chức Y tế Thế
giới (WHO) đã chính thức công nhận tảo xoắn Spirulina là nguồn dinh dưỡng và
dược liệu quý, đặc biệt trong chống suy dinh dưỡng và chống lão hóa. Năm 1977,
Viện sinh vật học là nơi tiên phong trong việc nuôi trồng Spirulina ở Việt Nam theo
mô hình ngoài trời, không mái che, có sục khí CO2 [47].
1.1.2. Đặc điểm hình thái của tảo Spirulina
Tảo Spirulina có dạng xoắn lò xo khoảng 5-7 vòng đều nhau không phân
nhánh. Đường kính xoắn khoảng 35-50 micromet, bước xoắn 60 micromet, chiều
dài thay đổi có thể đạt 0,25mm. Nhiều trường hợp tảo xoắn Spirulina có kích thước
lớn hơn [6],[11].

.
.

5

Hình 1.1. Hình dạng tảo Spirulina quan sát dưới kính hiển vi [45].
1.1.2.1. Đặc điểm cấu tạo tế bào của tảo Spilurina
Là vi khuẩn lam đa bào dạng sợi, gồm nhiều hình trụ xếp không phân nhánh.
Mỗi tế bào của sợi có chiều rộng 5 micromet, dài 2 mm. Không có lục lạp mà chỉ
chứa thylacoid phân bố đều trong tế bào. Không có không bào. Không có nhân điển
hình, vùng nhân không rõ, trong đó có chứa DNA (Hedeskog và Hifsten A.1980).
Thành tế bào tảo gồm các lớp lipopolysaccharide, các sợi nhỏ protein và các phân
tử peptidoglucan. Màng tế bào nằm sát ngay dưới thành tế bào và nối với màng
quang hợp thylacoid tại một vài điểm.
Bộ

máy

quang

hợp

của tảo

xoắn

Spirulina:

Phycobilisome

chứa

phycobilinprotein và protein liên kết được gắn vào bề mặt ngoài của thylacoid.

Phycobilisome có khối lượng khoảng 7 triệu dalton và có thể tách nguyên vẹn để
nghiên cứu. Đối với phycobilisome có cả phycoerythin và phycocyanin thì lớp
ngoài cùng là phycoerythin, tiếp theo là phycocyanin và phần trong cùng là
allophycocyanin. Phycobilisome hoạt động như một anten thu nhận năng lượng mặt
trời để chuyển vào PS II. Con đường truyền năng lượng bắt đầu từ phycoerythin
sang phycocyanin và cuối cùng đến allophycocyanin trước khi đạt tới PS II. Có
khoảng 50% năng lượng ánh sáng mặt trời Spirulina nhận được nhờ phycobilisome.


6

Các sắc tố quang hợp gồm chlorophylla, carotenoid, phycocyanin,
allophycocyanin và thường có carotenoid-glycoside như myxoxanthophyll,
oscillaxanthin. Spirulina có chứa 3 nhóm sắc tố chính: Chlorophyll hấp thụ ánh
sáng lam và đỏ. Carotenoid hấp thụ ánh sáng lam và lục. Phycobillin hấp thụ ánh
sáng lục, vàng và da cam [29].
1.1.2.2. Sinh sản của tảo Spirulina
Tảo Spirulina có phương thức sinh sản vô tính, từ một cơ thể mẹ trưởng
thành (gọi là trichome), tự phân chia thành nhiều mảnh, mỗi mảnh gồm một số vòng
xoắn (2 - 4 tế bào, gọi là hormogonia). Để tạo thành các hormogonia, sợi Spirulina
sẽ hình thành các tế bào chuyên biệt cho sự sinh sản (gọi là đoạn necridia). Các
necridia hình thành các đĩa lõm ở hai mặt và tạo ra hormogonia bởi sự chia cắt tại vị
trí các đĩa. Khi đã phát triển, dần dần phần đầu hormogonia bị tiêu giảm và trở nên
tròn nhưng vách tế bào vẫn có chiều dày không đổi. Các hormogonia phát triển,
trưởng thành và chu kì sinh sản lặp lại để đảm bảo vòng đời của Spirulina.
Thông thường, Spirulina sinh sản bằng cách gãy ra từng khúc. Trong trường
hợp gặp điều kiện không thuận lợi, Spirulina cũng có khả năng tạo bào tử giống như
ở vi khuẩn. Chu kì phát triển của Spirulina rất ngắn. Chu kì này thường diễn ra
trong 24 giờ như của tảo Chlorella [11]
1.1.3. Thành phần hóa học của tảo xoắn Spirulina

Hàm lượng protein trong Spirulina thuộc vào loại cao nhất trong các thực
phẩm hiện nay, 56% - 77%, cao hơn 3 lần thịt bò, cao hơn 2 lần trong đậu tương.
Hàm lượng vitamin rất cao. Cứ 1kg tảo xoắn Spirulina chứa 55mg vitamin
B1, 40mg vitamin B2, 3mg vitamin B6, 2mg vitamin B12, 113mg vitamin PP,
190mg vitamin E, 4000mg carotene trong đó β-Carotene khoảng 1700mg (1000%
so với cà rốt) 0,5mg axit folic, Inosite 500-1000mg.
So sánh Protein của Spirulina với một số thực phẩm khác. Hàm lượng
khoáng chất có thể thay đổi theo điều kiện nuôi trồng, thông thường sắt là 580- 646
mg/kg ( 5000% so với rau chân vịt), mangan là 23 - 25 mg/kg , Mg là 2915 - 3811
mg/kg, selen là 0,4 mg/kg, canxi, kali, photpho đều khoảng 1000 – 3000 mg/kg
hoặc cao hơn (hàm lượng Canxi tăng hơn sữa 500%) [48].


7

Phần lớn chất béo trong Spirulina là axit béo không no, trong đó a.Linoleic
13784 mg/kg , γ-linoleic 11980 mg/kg. Đây là điều hiếm thấy trong các thực phẩm
tự nhiên khác.
Hàm lượng Cacbon Hydrate khoảng 16,5%, hiện nay có những thông tin
dùng glucose chiết xuất từ tảo Spirulina để tiến hành những nghiên cứu chống ung
thư [48].
1.2. Đặc điểm phân loại của chi Gluconacetobacter
1.2.1. Danh pháp và vị trí phân loại
Theo hệ thống phân loại của nhà khoa học Bergey thì chi Gluconacetobacter
thuộc

họ

Acetobacteraceae,

bộ

Pseudomonadales,

lớp

Schizommycetes.

Gluconacetobacter thuộc nhóm vi khuẩn axetic, là loài vi khuẩn tạo được nhiều
Biocellulose nhất trong tự nhiên. Mỗi tế bào Gluconacetobacter có thể chuyển hóa
108 phân tử glucose thành cellulose trong 1 giờ [34].
Ngày nay, việc phân loại vi khuẩn axetic nói chung và vi khuẩn
Gluconacetobacter nói riêng còn tồn tại nhiều quan điểm khác nhau. Vì vậy, vấn đề
này vẫn đang gây nhiều tranh cãi, đòi hỏi cần có nhiều hơn những nghiên cứu tiếp theo.
1.2.2. Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa
1.2.2.1. Đặc điểm hình thái tế bào học
Gluconacetobacter là trực khuẩn hình que, thẳng hay hơi cong, kích thước
khoảng 2 µm, tế bào đứng riêng lẻ hoặc xếp thành từng chuỗi, không có khả năng di
động, không sinh bào tử [16]. Các tế bào được bao bọc bởi màng nhày có bản chất
là hemicellulose, màng này bắt màu xanh khi nhuộm axit H2SO4, bắt màu hồng khi
nhuộm fucshin. Gluconacetobacter có khả năng tích lũy 4,5 % axit axetic trong
môi trường, khi nồng độ axit trong môi trường khá cao sẽ ức chế hoạt động của vi
khuẩn [3], [35].
1.2.2.2. Đặc điểm sinh lí, sinh hóa
+ Đặc điểm sinh lí:
Vi khuẩn Gluconacetobacter phát triển ở nhiệt độ 25 - 35oC, pH: 4 - 6.
Nhiệt độ và pH tối ưu tùy thuộc vào giống. Ở 37oC, tế bào sẽ suy thoái hoàn toàn


8

ngay cả trong môi trường tối ưu. Gluconacetobacter có khả năng chịu được pH
thấp nên người ta thường bổ sung thêm axit axetic vào môi trường nuôi cấy để hạn
chế sự nhiễm khuẩn lạ [44].
+ Đặc điểm sinh hóa:
Năm 1950, Frateur đã chính thức đưa ra một khóa phân loại mới căn cứ vào
các tiêu chuẩn: khả năng oxy hóa axit axetic thành CO2 và H2O; hoạt tính catalase;
khả năng sinh trưởng trên môi trường Hoyer... [38]. Theo quan điểm này
Gluconacetobacter là chủng thuộc chi Acetobacter, họ Pseudomonadaceae, bộ
Pseudomonadales, lớp Schizommycetes. Đặc điểm phân biệt với các chủng khác
trong cùng một chi được trình bày ở bảng 1.1 dưới đây.
Bảng 1.1. Đặc điểm sinh hoá của chủng vi khuẩn Gluconacetobacter
Đặc điểm

STT

1

2
3

4

5

6

7

Oxy hoá ethanol thành

axit axetic

Chuyển

hoá

môi

trường

quả
chứa

Bromphenol Blue 0,04% từ màu

+

xanh sang màu vàng

Hoạt tính catalase
Sinh trưởng

trên

môi

trường Hoyer
Chuyển

Kết

Hiện tượng

hoá

+

Sinh khối không phát triển

_

glycerol Tạo kết tủa đỏ gạch trong dịch sau

thành dihydroxyaceton
Chuyển hoá glucose thành
axit
Kiểm tra khả năng sinh
sắc tố nâu

Hiện tượng sủi bọt khí

lên men
Vòng sáng xuất hiện xung quanh
khuẩn lạc trên môi trường chứa

+

CaCO3
Không hình thành sắc tố nâu

Kiểm tra khả năng tổng Váng vi khuẩn xuất hiện màu lam
hợp cellulose

+

khi thử với H2SO4

_

+


9

1.3. Ảnh hưởng dinh dưỡng đến chủng vi khuẩn Gluconacetobacter
1.3.1. Ảnh hưởng nguồn cacbon
Theo nghiên cứu của Nguyễn Thị Nguyệt trên chủng A.xylium HN5 thì nguồn
cacbon có ảnh hưởng lớn đến sự hình thành màng của Gluconacetobacter [15].
Cacbon có trong tế bào chất, thành tế bào, trong tất cả các phân tử enzyme,
axit nucleic và các sản phẩm trao đổi chất. Chính vì vậy, những hợp chất hữu cơ có
chứa cacbon có ý nghĩa hàng đầu trong đời sống của vi sinh vật. Ảnh hưởng của
nguồn cacbon đến năng suất màng được thể hiện ở bảng 1.2
Bảng 1.2. Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến năng suất tạo màng Biocellulose
Nguồn cacbon

Năng suất tổng

Nguồn cacbon

Năng suất tổng

Monosaccharide

hợp cellulose

Disaccharide

hợp cellulose

D- Glucose

100

Lactose

16

D-Fructose

92

Maltose

7

D-Galactose

15

Sucrose

33

D-Xylose

11

Cellobiose

D-Arabinos

14

D-Sorbose

11

7 – 11

1.3.2. Ảnh hưởng nguồn Nitơ
Vi sinh vật và tất cả các thể sống đều cần Nitơ trong quá trình sống để xây
dựng tế bào. Vì vậy nếu nguồn Nitơ trong mối trường quá ít sẽ ảnh hưởng đến hoạt
động sống của tế bào. Ở nồng độ 2,0g cho hiệu suất màng Biocellulose cao nhất.
Khi nuôi cấy vi khuẩn Gluconacetobacter người ta thường sử dụng nguồn nitơ vô
cơ là (NH4)2SO4, NH4NO3, nguồn nitơ hữu cơ là pepton, cao thịt, cao nấm men [2].
1.3.3. Ảnh hưởng photpho
Ngoài vai trò tham gia cấu trúc của tế bào, Photpho còn đóng vai trò hết sức
quan trọng trong tổng hợp cellulose ở chủng vi khuẩn Gluconacetobacter. Để đảm
bảo nguồn dinh dưỡng photpho, người ta sử dụng các loại photpho vô cơ như :
KH2PO4, K2HPO4, KNO3.... Việc bổ sung photphat (nhất là photphat kali) vào các

môi trường dinh dưỡng còn có tác dụng tạo ra tính đệm của môi trường. Đối với vi


10

khuẩn Gluconacetobacter, nguyên liệu chủ yếu hiện nay được dùng là dịch hoa quả,
rỉ đường... khi nuôi cấy không cần bổ sung các nguyên tố vi lượng nữa [2].
1.4. Điều kiện nuôi cấy
1.4.1. Nhiệt độ
Theo Beygey nhiệt độ thích hợp cho vi khuẩn Gluconacetobacter vào
khoảng 25 – 350C. Ở nhiệt độ cao sẽ ức chế hoạt động và đến một mức nào đó sẽ
đình chỉ sự sinh sản của tế bào và hiệu suất lên men sẽ giảm [34].
1.4.2. Độ pH
Vi khuẩn Gluconacetobacter phát triển thuận lợi trên môi trường có pH
thấp. Do đó trong môi trường nuôi cấy cần bổ sung thêm axit axetic nhằm axit hóa
môi trường, đồng thời axit axetic còn có tác dụng sát khuẩn, giúp ngăn chặn sự phát
triển của các vi sinh vật có hại [35], [36].
1.4.3. Độ thông khí
Vi khuẩn Gluconacetobacter là vi khuẩn hiếu khí bắt buộc. Do đó, điều kiện
tiên quyết khi lên men tạo sinh khối là điều kiện thông khí. Trong thực tế độ thông
khí quyết định đến năng suất tổng hợp Biocellulose [29 ].
1.4.4. Thời gian nuôi cấy
Theo Thesis Holemes (2004), hàm lượng glucose trong môi trường giảm
nhất sau 150 giờ nuôi cấy. Sau khi glucose trong môi trường hết thì vi khuẩn bắt
đầu sử dụng axit gluconic và 5 - keto axit gluconic trong quá trình trao đổi chất. Tác
giả cho rằng sau 6 ngày độ kết tinh của màng đạt trạng thái tốt nhất thường bổ sung
thêm axit axetic vào môi trường nuôi cấy để hạn chế sự nhiễm khuẩn lạ.
1.5. Biocellulose
1.5.1. Cấu trúc
Biocellulose có đường kính bằng 1/100 đường kính của cellulose thực vật

(PC-Plant Cellulose). Màng Biocellulose được cấu tạo bởi chuỗi polyme β - 1,4
glucopyranose mạch thẳng, có thành phần hóa học đồng nhất với cellulose thực vật
nhưng cấu trúc và đặc tính lại khác xa nhau [27].
Chuỗi polyme β-1,4 glucopyranose mới hình thành liên kết với nhau tạo thành
sợi nhỏ (subfibril) có kích thước 1,5 nm. Những sợi nhỏ kết tinh tạo sợi lớn hơn - sợi


11

vĩ mô (microfibril) (Jonas and Farah, 1998), những sợi này kết hợp với nhau tạo
thành bó và cuối cùng tạo dải ribbon (Yamanaka et.al 2000). Dải ribbol có chiều dài
trong khoảng từ 1 - 9 nm. Những dải ribbol được kéo ra từ tế bào này sẽ liên kết với
những dải ribbol của tế bào khác bằng liên kết hiđro hoặc lực Van Der Waals tạo
thành cấu trúc mạng lưới hay một lớp màng mỏng trên bề mặt môi trường nuôi cấy.
Kích thước bên của màng tăng lên khi quần thể vi khuẩn sinh trưởng [4], [10].

Hình 1.2. Sợi cellulose của thực vật

Hình 1.3. Sợi cellulose của màng
Biocellulose đã qua xử lí vi khuẩn

1.5.2. Một số tính chất
Màng Biocellulose có cơ chế kết tinh khác hẳn cellulose của thực vật ở chỗ
chúng không có sự kết hợp hemixellulose, lignin hay những thành phần phụ khác
mà được cấu tạo từ các sợi microfibil tạo nên những bó sợi song song cấu thành
mạng lưới cellulose. Do đó màng có độ bền cơ học cao, độ tinh khiết cao, khả năng
thấm hút nước lớn… hơn hẳn cellulose của thực vật [33]. Cụ thể:
+ Độ tinh sạch: Màng Biocellulose có độ tinh sạch tốt hơn rất nhiều so với
các cellulose khác, có thể phân hủy sinh học, tái chế hay phục hồi hoàn toàn.
+ Độ bền cơ học: Màng Biocellulose màng có độ bền tinh thể cao, sức căng

lớn, trọng lượng lớn, ổn định về kích thước.
+ Tính hút nước: Màng Biocellulose có khả năng giữ nước đáng kể (lên đến
99%), có tính tơi xốp, độ ẩm cao.


12

1.5.3. Cơ chế tổng hợp
Nuôi cấy vi khuẩn Gluconacetobacter trong môi trường có nguồn dinh dưỡng
đầy đủ (chủ yếu là carbohydrate, vitamin B1, B2, B12… và các chất kích thích sinh
trưởng), chúng sẽ thực hiện quá trình trao đổi chất của mình bằng cách hấp thụ dinh
dưỡng từ môi trường bên ngoài vào cơ thể, một phần để cơ thể sinh trưởng và phát
triển, một phần để tổng hợp cellulose và thải ra môi trường. Ta thấy các sợi tơ nhỏ
phát triển ngày càng dài hướng từ đáy lên bề mặt trong môi trường nuôi cấy. Thiaman
(1962) đã giải thích cách tạo thành cellulose như sau: Các tế bào Gluconacetobacter
khi sống trong môi trường lỏng sẽ thực hiện quá trình trao đổi chất của mình bằng
cách hấp thụ đường glucose, kết hợp đường với axit béo để tạo thành tiền chất nằm ở
màng tế bào. Tiền chất này được tiết ra ngoài nhờ hệ thống lỗ nằm ở trên màng tế bào
cùng với một enzyme có thể polymer hóa glucose thành cellulose.
Quá trình tổng hợp Biocellulose là một tiến trình bao gồm nhiều bước được
điều hòa một cách chuyên biệt và chính xác bằng một hệ thống chứa nhiều loại
enzyme, phức hợp xúc tác các loại protein điều hòa [18], [23].
Theo Alaban C.A và cộng sự (1967) [26] các enzyme tham gia vào quá trình
sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn gồm:
1PKF : Fructose -1- photphate kinase

PGI: Phosphoglucoisomerase

PMG : Phosphoglucomutase

PTS: Hệ thống phosphotransferrase

UGP: UPD – glucose pyrophosphate

Fru-bi-P:Fructose-1,6-biphosphate

Fru-6-P: Glucose-1-phosphate

Glc-6-P: Glucose-6-phosphate

Glc-1-P: Glucose-1-phosphate

PGA: Phosphogluconic acid acid

UDPGlc:Uridine diphosphoglucose

CS: Cellulose synthase

GK: glucokinase

FK: fructokinase

FBP: fructose-1,6-biphosphate phosphatase

G6PDH:
glucose-6-phosphate
dehydrogenase

Mỗi enzyme có một vai trò khác nhau lên quá trình hợp màng Biocellulose
nhưng trong đó đặc biệt phải kể tới 4 enzyme “chìa khóa" trong quá trình tổng hợp

cellulose của A. xylinum [26] .
- Glucokinase (GK): Phosphoryl hóa C6 của glucose.


13

- Phosphoglucomutase (PGM): Xúc tác quá trình chuyển hóa Glucose-6phosphate thành Glucose-1-phosphate.
- Glucose-1-phosphate uridylyltransferase (UDPG pyrophosphorylase hay
UGP): Xúc tác tổng hợp UDP-glucose.

- Cellulose synthase (CS): Xúc tác tổng hợp cellulose từ UDP-glucose.
 Hai giai đoạn chính sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn
 Giai đoạn polymer hóa
Đầu tiên enzyme glucokinase (GK) xúc tác phản ứng phosphoryl hóa chuyển
glucose thành glucose - 6- phosphate. Enzyme phosphoglucomutase tiếp tục chuyển
hóa glucose - 6 - phosphate thành glucose - 1 - phosphate thông qua phản ứng
isome hóa. Glucose - 1- phosphate nhờ enzyme UDP - glucose pyrophosphorylase
chuyển hóa thành UDP - glucose. Cuối cùng, UDP - glucose được tổng hợp nên sẽ
được chuyển hóa thành cellulose và cellulose được tiết ra môi trường ngoại bào nhờ
một phức hợp protein màng là cellulose synthase. Enzym này được hoạt hóa nhờ
một nucleotide vòng là cyclic-di-GMP.
Một số chủng vi khuẩn Gluconacetobacter có khả năng sử dụng đường
fructose hiệu quả hơn. Hệ thống enzyme phosphotransferase sẽ chuyển fructose
thành fructose-1-phosphate. Sau đó fructose-1-phosphate sẽ chuyển hóa thành
fructose-bi-phosphate

nhờ

enzyme

fructose-1-phosphatekinase.

Enzyme

phosphoglucose isomerase có hoạt tính cao, sẽ giúp chuyển hóa fructose-6phosphate thành Glucose-6-phosphate. Glucose-6-phosphate lại tham gia vào quá
trình chuyển hóa tương tự như trên để tạo ra cellulose.
 Giai đoạn kết tinh
Các chuỗi glucan được nối với nhau nhờ liên kết -1,4-glucan. Trong đó các
chuỗi glucan kết hợp tạo thành chuỗi glucan nhờ lực liên kết yếu Van Der Waals.
Lớp chuỗi glucan này chỉ tồn tại trong một thời gian ngắn, sau đó chúng kết hợp với
nhau bằng liên kết hidro tạo thành các sợi cơ bản gồm 16 chuỗi glucan. Các sợi cơ
bản tiếp tục kết hợp với nhau tạo thành các vi sợi, sau đó các vi sợi lại tiếp tục kết
hợp với nhau tạo thành các bó sợi.


14

Hình 1.4. Con đường chuyển hóa cacbon trong vi khuẩn Gluconacetobacter
1.5.4. Chức năng của cellulose đối với vi khuẩn Gluconacetobacter
Lớp màng cellulose do vi khuẩn Gluconacetobacter tạo ra bao xung quanh
môi trường hạn chế nguồn oxy từ bên ngoài vào môi trường, điều này ngăn cản sự
cung cấp oxy cho các vi khuẩn hiếu khác, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình cạnh
tranh sinh tồn của vi khuẩn Gluconacetobacter. Màng cellulose có khả năng giữ
nước nên nên giúp cho vi khuẩn phân hủy các chất dinh dưỡng để sử dụng và giúp
tế bào chống lại ảnh hưởng của tia UV (tia tử ngoại). Nhờ tính dẻo dai và tính thấm
nước của các lớp cellulose mà các tế bào vi khuẩn kháng lại được những thay đổi
không thuận lợi trong môi trường sống như: giảm độ ẩm, thay đổi pH, xuất hiện các
chất độc hại. Các vi khuẩn Gluconacetobacter có thể tăng trưởng và phát triển bên
trong lớp vỏ bao.
Thực nghiệm chỉ ra rằng cellulose bao quanh tế bào vi khuẩn bảo vệ chúng

khỏi tia cực tím. Khoảng 23% số tế bào Gluconacetobacter được bao bọc sống sót
sau 1 giờ xử lý bởi tia cực tím. Khi tách ra khỏi tế bào, khả năng sống sót của tế bào
giảm chỉ còn khoảng 3% [42].
Ngoài ra, màng là giá thể chống đỡ cho vi khuẩn Gluconacetobacter luôn ở
bề mặt tiếp giáp giữa môi trường lỏng và không khí. Chính mạng lưới này làm cho


15

các tế bào có thể bám chặt trên bề mặt môi trường và làm tế bào thu nhận chất dinh
dưỡng một cách dễ dàng hơn so với khi tế bào ở trong môi trường lỏng không có
mạng lưới cellulose. Trong môi trường tự nhiên, đa số vi khuẩn tổng hợp các
polysaccharide ngoại bào để hình thành nên lớp vỏ bao quanh tế bào và màng là
một điển hình.
Một vài nghiên cứu còn cho thấy, cellulose được tổng hợp bởi
Gluconacetobacter còn đóng vai trò tích trữ và có thể sử dụng khi vi sinh vật này bị
thiếu dinh dưỡng. Sự phân hủy cellulose được xúc tác bởi enzyme exo gluconase
hay endo glucanase
1.6. Ứng dụng của màng Biocellulose
1.6.1. Ứng dụng của màng Biocellulose trong một số lĩnh vực
Màng Biocellulose có nhiều lợi điểm vượt trội như : độ tinh sạch, độ kết tinh,
độ bền sức căng, độ đàn hồi, độ căng, độ đàn hồi, độ co giãn, khả năng giữ hình
dạng ban đầu, khả năng giữ nước và hút nước cao, bề mặt tiếp xúc lớn hơn bột gỗ
thường, bề dày của vi sợi dưới 100 nm, bị phân hủy sinh học, có tính tương thích
sinh học, tính trơ chuyển hóa, không độc và không gây dị ứng. Màng có ứng dụng
trong nhiều lĩnh vực [4], [17].
1.6.1.1. Thực phẩm
Sản phẩm cellulose được sử dụng trong nước ép trái cây và những thức uống
khác, trong mứt kẹo, trong kem, salad, thức ăn tráng miệng có tác dụng như chất
làm đặc, vật liệu ổn định dịch huyền phù, vật liệu làm vỏ bọc thực phẩm. Các sản

phẩm ứng dụng cellulose vi khuẩn trong lĩnh vực thực phẩm: Món tráng miệng
(thạch dừa, thức ăn nhanh, kẹo), chất nhũ hóa trong nước ép trái cây và những thức
uống khác, màng bao thực phẩm… [20], [40], [41].
1.6.1.2. Y học
Màng trị bỏng: Màng Biocellulose do vi khuẩn Gluconacetobacter tẩm dầu
mủ u có tác dụng tương tự màng sinh học trị bỏng [9], [14].
Màng băng vết thương, điều trị tổn thương da, trong ghép mô, cơ quan nội tạng.
Da nhân tạo: ở Brazil, màng ướt tinh sạch được sản xuất và bán ra thị trường
như một loại da nhân tạo dùng để đắp vết thương.


16

1.6.1.3. Mỹ phẩm
Màng Biocellulose vừa có khả năng giữ ẩm cao mà không bám lại lên làn da
sau khi rửa và cũng không gây các tác dụng phụ như các chất giữ ẩm khác, do đó
được ứng dụng: Kem dưỡng da, chất làm nền cho móng nhân tạo, chất tăng độ dày
và bền cho nước làm bóng móng tay [9], [15], [21].
1.6.1.4. Bảo vệ môi trường
Miếng xốp làm sạch những vết dầu tràn.
Làm chất hấp thu trong các vật liệu loại bỏ chất độc hại (làm sạch nước cống
ở thành thị).
Thu hồi dầu và khoáng sản: Các nhà khoa học đã nhận thấy cấu trúc mạng và
sự cản trở cơ học của các sợi nhỏ đã ngăn không cho các giọt dầu nhỏ dính lại với
nhau khi để yên huyền phù dầu. Tính ổn định của dịch huyền phù không bị ảnh
hưởng khi thêm muối, thay đổi nhiệt độ hay pH. Sự ổn định này là do sự ổn định
trong cấu trúc tinh thể của các sợi cellulose [30].
1.6.1.5. Công nghiệp
- Vật liệu làm quần áo và giày dép, vải da nhân tạo, lều lắp ráp (lều xếp gọn
nhẹ) cho cắm trại, quần áo thể thao.

- Màng rung chuyển đổi âm thanh : Màng có khả năng chịu lực rất tốt, tốc độ
truyền âm khá cao 5000m/s. Mức tạo tạp âm của nó rất ít, tương đương các loại
giấy làm màng rung truyền thống. Công ty SONY đã áp dụng làm màng rung
chuyển đổi âm thanh trong headphone.
Công nghiệp giấy: các loại giấy đặc biệt như giấy dùng để lưu trữ tài liệu,
giấy có thời gian sử dụng lâu dài, trong vẽ, in, chất dính và chất xơ trên trang vẽ
như giấy phủ làm bề mặt láng trong công nghệ in.
Công nghiệp máy: là thành phần thân tàu, máy bay, xe, vỏ bọc tên lửa [12]. [33].
1.6.2. Ứng dụng màng Biocellulose vào mặt nạ dưỡng da
Trên thế giới xu hướng làm đẹp từ các sản phẩm tự nhiên không chứa chất
hóa học đang rất thịnh hành. Hàng loạt các hãng mĩ phẩm lớn đều tập trung nghiên
cứu cho ra những sản phẩm làm đẹp có nguồn gốc tự nhiên không có hoặc rất ít
tác dụng phụ trong đó có mặt nạ dưỡng da (mask), mask được sản xuất bằng