XÂY DỰNG QUY TRÌNH SÀNG LỌC THỰC PHẨM CÓ NGUỒN GỐC BIẾN ĐỔI GEN (GMF – GENETICALLY MODIFIED FOOD) BẰNG KỸ THUẬT DUPLEX REAL – TIME PCR

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
XÂY DỰNG QUY TRÌNH SÀNG LỌC THỰC PHẨM CÓ NGUỒN
GỐC BIẾN ĐỔI GEN (GMF – GENETICALLY MODIFIED FOOD)
BẰNG KỸ THUẬT DUPLEX REAL – TIME PCR

Ngành học

: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện

: NGUYỄN QUỐC HUY

Niên khóa

: 2008 – 2012

Tháng 07/2012


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
XÂY DỰNG QUY TRÌNH SÀNG LỌC THỰC PHẨM CÓ NGUỒN
GỐC BIẾN ĐỔI GEN (GMF – GENETICALLY MODIFIED FOOD)

BẰNG KỸ THUẬT DUPLEX REAL – TIME PCR

Hướng dẫn khoa học

Sinh viên thực hiện

TS. HUỲNH VĂN BIẾT

NGUYỄN QUỐC HUY

ThS. TRẦN THỊ ÁNH NGUYỆT

Tháng 07/2012


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu Trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố
Hồ Chí Minh, Ban Chủ Nhiệm Bộ môn Công nghệ Sinh học, Ban Lãnh Đạo Trung Tâm
Kỹ Thuật Tiêu Chuẩn Đo Lường Chất Lượng 3, Phòng thử nghiệm Vi sinh – GMO đã tạo
mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành tốt đề tài và luận văn tốt nghiệp.
Đặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Huỳnh Văn Biết, ThS. Phạm
Vân An, ThS. Trần Thị Ánh Nguyệt, CN. Chu Nguyên Thanh cùng các chị trong phòng
thử nghiệm Vi sinh – GMO đã tận tình giúp đỡ, hướng dẫn tôi chu đáo trong suốt thời
gian thực hiện đề tài và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp.
Bên cạnh đó, tôi xin cảm ơn các quý Thầy, Cô đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong
suốt quá trình học tại trường, cảm ơn tập thể lớp DH08SH đã luôn chia sẻ, động viên tôi
trong suốt thời gian học tập cũng như thực hiện đề tài tốt nghiệp.
Và sau cùng, con xin cảm ơn Ba, Mẹ đã luôn khuyến khích, tạo mọi điều kiện cho
con được học tập. Cám ơn gia đình thân yêu đã luôn là chỗ dựa vững chắc cho con vững
bước qua mọi khó khăn.

Xin chân thành cảm ơn
Tp. Hồ Chí Minh, ngày 01 tháng 07 năm 2012

Nguyễn Quốc Huy

i


TÓM TẮT
Ngày nay, các sản phẩm có nguồn gốc từ sinh vật biến đổi gen đang được thương
mại hóa ngày càng nhiều trên thị trường, trong khi những lợi ích và tác hại của chúng vẫn
chưa được xác định rõ. Do đó, vấn đề quản lý và kiểm soát đối với các sản phẩm này trở
nên rất cần thiết. Xuất phát từ thực tế đó, tôi thực hiện đề tài “Xây dựng quy trình sàng
lọc thực phẩm có nguồn gốc biến đổi gen bằng kỹ thuật Duplex Real-time PCR”, nhằm
thiết lập một quy trình thử nghiệm phát hiện đồng thời các trình tự promoter 35S và
terminator nos trên một phản ứng, có khả năng áp dụng tại các phòng thí nghiệm về GMO
ở Việt Nam.
Đề tài gồm ba nội dung chính, khảo sát các phương pháp tách chiết DNA trên các
loại nền mẫu khác nhau, tối ưu hóa phương pháp Duplex Real-time PCR và đánh giá khả
năng hoạt động của phương pháp này thông qua việc xác định độ đặc hiệu và độ nhạy.
Các kết quả ghi nhận cho thấy phương pháp tách chiết DNA sử dụng CTAB cho
hiệu quả tốt hơn nhiều so với phương pháp phenol/chloroform căn bản, tuy nhiên cũng
không phát hiện DNA trong các mẫu nước tương, dầu ăn. Trong một phản ứng Duplex
Real-time PCR, nồng độ primer tối ưu để khuếch đại vùng promoter 35S và terminator
nos là 0,3 µM; nồng độ probe tối ưu để phát hiện vùng promoter 35S và terminator nos
lần lượt là 0,1 µM và 0,3 µM; nồng độ MgCl2 tối ưu là 1,5 mM. Phương pháp Duplex
Real-time PCR đã xây dựng có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, giá trị LOD thu được ≤
0,05%, không xuất hiện hiện tượng dương tính giả hay âm tính giả.

ii

SUMMARY
Thesis title “Establishing a screening process for GMF (genetically modified
foods) by Duplex Real-time PCR method”.
Today, the products derived from genetically modified organisms have been
increasingly commercialized on the market, while their benefits and harms have not been
clearly defined. Therefore, control and management issues for these products are very
necessary. For this fact, the thesis “Establishing a screening process for GMF (genetically
modified foods) by Duplex Real-time PCR method” was performed, with the purpose of
establishing a testing process to detect simultanously nos terminator and 35S promoter
sequences in only one reaction, so that the results of the research can be applied in
laboratories for testing GMO in Vietnam.
The thesis includes three main contents, which are survey of the different DNA
extraction methods on many sample matrices, optimization of the Duplex Real-time PCR
condition and evaluation of the performance of this method through determining the
sensitivity and specifictity.
The results indicated that the DNA extraction method using CTAB was better than
the phenol/chloroform basis method, but it also could not detect DNA in samples of soy
sauce and cooking oil. For one optimized Duplex Real-time PCR reaction, the primer
concentrations were 0.3 µM for amplification of 35S promoter and nos terminator
sequences; the probe concentrations were 0.1 µM and 0.3 µM respectively for detection of
35S promoter and nos terminator sequences; and the MgCl2 concentration was 1.5 mM.
The designed Duplex Real-time PCR method showed good sensitivity and specificity,
LOD value was less than or equal to 0.05%, and there was no case of the false positive as
well as false negative result.
Key words: DNA extraction, Duplex Real-time PCR, GMF, GMO, 35S promoter,
nos terminator.

iii

MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM ƠN ...................................................................................................................i
TÓM TẮT ....................................................................................................................... ii
SUMMARY ................................................................................................................... iii
MỤC LỤC ....................................................................................................................... iv
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT .......................................................................... viii
DANH SÁCH CÁC BẢNG .............................................................................................. x
DANH SÁCH CÁC HÌNH .............................................................................................. xi
Chương 1 MỞ ĐẦU ......................................................................................................... 1
1.1.

Đặt vấn đề ............................................................................................................... 1

1.2.

Yêu cầu................................................................................................................... 2

1.3.

Nội dung thực hiện ................................................................................................. 2

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................................. 3
2.1. Định nghĩa thực phẩm có nguồn gốc biến đổi gen ................................................ 3
2.1.1.

Định nghĩa sinh vật biến đổi gen ...................................................................... 3

2.1.2.

Định nghĩa thực phẩm có nguồn gốc biến đổi gen ............................................ 4

2.2.

Quá trình tạo sinh vật biến đổi gen .......................................................................... 4

2.2.1.

Quá trình cơ bản ............................................................................................... 4

2.2.2.

Cấu trúc cơ bản của một gen chuyển vào thực vật ............................................ 5

2.2.2.1

Promoter .......................................................................................................... 5

2.2.2.2

Terminator ....................................................................................................... 5

2.2.2.3

Marker chọn lọc ............................................................................................... 6

2.2.2.4

Gen mục tiêu chuyển vào thực vật .................................................................... 6

2.2.3.

Thành tựu chuyển nạp gen vào cây trồng ........................................................... 7

2.2.3.1

Các đặc tính nông nghiệp của cây trồng biến đổi gen ......................................... 7

2.2.3.2

Các đặc tính chất lượng của cây trồng biến đổi gen ............................................ 8

2.3.
2.3.1.

Lợi ích và tác hại của cây trồng biến đổi gen........................................................... 9
Lợi ích của cây trồng biến đổi gen .................................................................... 9
iv


2.3.2.

Tác hại của cây trồng biến đổi gen.................................................................... 9

2.3.2.1.

Các rủi ro có thể gặp......................................................................................... 9

2.3.2.2.

Tác hại đối với môi trường ............................................................................. 10

2.3.2.3.

Tác hại đối với sức khỏe người tiêu dùng ....................................................... 10

2.3.2.4.

Các nghiên cứu và dẫn chứng cụ thể............................................................... 11

2.4.

Hiện trạng cây trồng biến đổi gen ......................................................................... 12

2.4.1.

Hiện trạng cây trồng biến đổi gen trên thế giới ............................................... 12

2.4.2.

Hiện trạng cây trồng biến đổi gen ở Việt Nam ................................................ 13

2.5.

Dư luận xã hội đối với cây trồng biến đổi gen ....................................................... 14

2.6.

Vấn đề quản lý sản phẩm biến đổi gen .................................................................. 15

2.6.1.

Vấn đề quản lý sản phẩm biến đổi gen trên thế giới ........................................ 15

2.6.2.

Vấn đề quản lý sản phẩm biến đổi gen ở Việt Nam ........................................ 16

2.7.

Các phương pháp kiểm định sinh vật biến đổi gen ................................................ 16

2.7.1.

Phương pháp kiểm định dựa vào protein......................................................... 17

2.7.1.1.

Phương pháp ELISA ...................................................................................... 17

2.7.1.2.

Phương pháp Western Blot ............................................................................. 17

2.7.1.3.

Phương pháp Lateral flow strip ...................................................................... 18

2.7.2.

Phương pháp kiểm định dựa vào DNA ............................................................ 18

2.7.2.1.

Phương pháp PCR căn bản .............................................................................. 19

2.7.2.2.

Phương pháp PCR đa thành phần .................................................................... 19

2.7.2.3.

Phương pháp PCR định lượng cạnh tranh .................................................... 19

2.7.2.4.

Phương pháp Real-time PCR........................................................................... 19

2.7.3.

Mức độ chuyên biệt trong kiểm định sinh vật biến đổi gen ............................. 21

2.7.3.1.

Phương pháp sàng lọc (Screening methods) ................................................... 21

2.7.3.2.

Phương pháp chuyên biệt gen (Gene-specific methods) .................................. 22

2.7.3.3.

Phương pháp chuyên biệt cấu trúc (construct-specific methods) ..................... 22

2.7.3.4.

Phương pháp chuyên biệt sự kiện (event-specific methods) ............................ 22

2.8.
2.8.1.

Các nghiên cứu trong và ngoài nước về kiểm định GMO bằng kỹ thuật PCR ........ 23
Các nghiên cứu ngoài nước về kiểm định GMO bằng kỹ thuật PCR ............... 23
v


Các nghiên cứu trong nước về kiểm định GMO bằng Real-time PCR ............. 23

2.8.2.

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................................... 24
3.1.

Thời gian và địa điểm nghiên cứu ......................................................................... 24

3.2.

Vật liệu thí nghiệm ............................................................................................... 24

3.2.1.

Hóa chất ......................................................................................................... 24

3.2.1.1.

Hóa chất dùng trong tách chiết DNA .............................................................. 24

3.2.1.2.

Hóa chất dùng trong điện di............................................................................ 24

3.2.1.3.

Hóa chất dùng trong phản ứng Real-time PCR ............................................... 25

3.2.2.

Dụng cụ và thiết bị ......................................................................................... 25

3.2.3.

Mẫu thí nghiệm .............................................................................................. 25

3.3.

Phương pháp nghiên cứu ....................................................................................... 26

3.3.1.

Khảo sát các phương pháp tách chiết DNA..................................................... 26

3.3.1.1.

Chuẩn bị mẫu ................................................................................................. 26

3.3.1.2.

Khảo sát các phương pháp tách chiết DNA..................................................... 27

3.3.1.3.

Phân tích sản phẩm DNA sau tách chiết ......................................................... 29

3.3.2.

Tối ưu phương pháp Duplex Real-time PCR .................................................. 29

3.3.2.1.

Tối ưu nồng độ primer .................................................................................... 30

3.3.2.2.

Tối ưu nồng độ probe ..................................................................................... 31

3.3.2.3.

Tối ưu nồng độ MgCl2 .................................................................................... 32

3.3.3.

Đánh giá phương pháp Duplex Real-time PCR ............................................... 32

3.3.3.1.

Xác định độ đặc hiệu của phương pháp .......................................................... 32

3.3.3.2.

Xác định độ nhạy của phương pháp ................................................................ 34

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................................ 35
4.1.

Khảo sát các phương pháp tách chiết DNA ........................................................... 35

4.2.

Tối ưu hóa phương pháp Duplex Real-time PCR .................................................. 37

4.2.1.

Tối ưu hóa nồng độ primer ............................................................................. 37

4.2.1.1.

Tối ưu hóa nồng độ primer cho promoter 35S ................................................ 37

4.2.1.2.

Tối ưu hóa nồng độ primer cho terminator nos ............................................... 38

4.2.2.

Tối ưu hóa nồng độ probe ............................................................................... 39
vi


4.2.2.1.

Tối ưu hóa nồng độ probe cho promoter 35S .................................................. 39

4.2.2.2.

Tối ưu hóa nồng độ probe cho terminator nos ................................................. 40

4.2.3.

Tối ưu hóa nồng độ MgCl2 ............................................................................. 41

4.3.

Đánh giá phản ứng Duplex Real-time PCR ........................................................... 42

4.3.1.

Xác định độ đặc hiệu của phương pháp .......................................................... 43

4.3.2.

Xác định độ nhạy của phương pháp ................................................................ 44

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................................ 47
5.1.

Kết luận ................................................................................................................ 47

5.2.

Đề nghị ................................................................................................................. 47

TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................................... 48
PHỤ LỤC ....................................................................................................................... 53

vii


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ABI:

Applied Biosystem

Bt:

Bacillus thuringiensis

CaMV:

Cauliflower mosaic virus (virus khảm súp lơ)

CP:

Coat protein (protein vỏ)

CRM:

Certified reference material (Vật liệu chuẩn chứng nhận)

Ct:

Threshold cycle (Chu kỳ ngưỡng)

CTAB:

Cetyl-trimetyl-ammonium-bromide

ctv:

Cộng tác viên

DNA:

Deoxyribonucleic acid

dNTPs:

Deoxyribonucleotide triphosphates

EC:

European Community (Cộng đồng châu Âu)

EDTA:

Ethylendiamin Tetraacetic Acid

EEA:

European Environment Agency (Cơ quan môi trường châu Âu)

ELISA:

Enzyme linked immunosorbent assay

EU:

European Union (Liên minh châu Âu)

FN:

False negative (Âm tính giả)

FP:

False positive (Dương tính giả)

GMC:

Genetically modified crop (Cây trồng biến đổi gen)

GMF:

Genetically modified food (Thực phẩm biến đổi gen)

GMO:

Genetically modified organism (Sinh vật biến đổi gen)

ISO:

International Organization for Standardization (Tổ chức tiêu

chuẩn hóa quốc tế)
LOD:

Limit of detection (Giới hạn phát hiện)

No.:

Number (số)

Nos:

Nopaline synthetase

NT:

Nghiệm thức

viii


OD:

Optical density (mật độ quang)

PCR:

Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp)

Plasmid Ti:

Tumor-inducing plasmid (plasmid gây khối u)

PPT:

Phosphinothricin

ppt:

Parts per thousand (phần nghìn)

PR:

Pathogenesis–related protein (protein liên quan mầm bệnh)

PRSV:

Papaya Ring Spot Virus

QC-PCR:

Quantitative competitive PCR (PCR cạnh tranh định lượng)

Rn:

Normalized reporter

RNA:

Ribonucleic acid

RRS:

Roundup Ready Soya

SD:

Standard Deviation (độ lệnh chuẩn)

SDS:

Sodium dodecyl sulfate

SDS-PAGE:

Sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis

SSU:

Small subunit

Taq:

Thermus aquaticus

TBE:

Tris-HCl, acid boric, EDTA

TE:

Tris EDTA

TN:

True negative (Âm tính thật)

TP:

True positive (Dương tính thật)

ix


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Trang
Bảng 3.1 Các loại nền mẫu sử dụng trong thí nghiệm ..................................................... 26
Bảng 3.2 Các yếu tố khảo sát ảnh hưởng đến phản ứng Duplex Real-time PCR ............. 30

Bảng 3.3 Thành phần phản ứng Single Real-time PCR ................................................... 30
Bảng 3.4 Chương trình nhiệt của phản ứng Single và Duplex Real-time PCR ................ 31
Bảng 3.5 Thành phần phản ứng Single Real-time PCR ................................................... 31
Bảng 3.6 Thành phần phản ứng Duplex Real-time PCR ................................................. 32
Bảng 3.7 Thành phần phản ứng Duplex Real-time PCR tối ưu ....................................... 33
Bảng 3.8 Phân tích kết quả xác định độ nhạy của phương pháp ...................................... 33
Bảng 3.9 Pha loãng chuẩn GMO xác định giá trị LOD..................................................... 34
Bảng 4.1 Kết quả đo DNA các mẫu ly trích của 2 phương pháp tách chiết ..................... 35
Bảng 4.2 Kết quả tối ưu hóa nồng độ primer cho promoter 35S ...................................... 38
Bảng 4.3 Kết quả tối ưu hóa nồng độ primer cho terminator nos .................................... 39
Bảng 4.4 Kết quả tối ưu hóa nồng độ probe cho promoter 35S ....................................... 40
Bảng 4.5 Kết quả tối ưu hóa nồng độ probe cho terminator nos ...................................... 41
Bảng 4.6 Kết quả tối ưu hóa nồng độ MgCl2 .................................................................. 42
Bảng 4.7 Danh sách các mẫu chuẩn chứng nhận ............................................................. 42
Bảng 4.8 Kết quả phân tích các mẫu CRM ..................................................................... 43
Bảng 4.9 Kết quả phân tích các nồng độ phần trăm GMO khác nhau.............................. 45

x


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Trang
Hình 2.1 Quy trình chuyển gen......................................................................................... 4
Hình 2.2 Cấu trúc cơ bản của gen chuyển vào thực vật..................................................... 5
Hình 2.3 Diện tích cây trồng chuyển gen toàn cầu. ......................................................... 13
Hình 2.4 Thử nghiệm Lateral flow strip ......................................................................... 18
Hình 2.5 Đồ thị phản ứng Real-time PCR........................................................................ 20
Hình 2.6 Mức độ chuyên biệt trong kiểm định GMO bằng phương pháp PCR ............... 21
Hình 4.1 Kết quả điện di DNA các mẫu ly trích. .............................................................. 36
Hình 4.2 Đồ thị khuếch đại ở các nồng độ primer khác nhau cho promoter 35S. ............ 37

Hình 4.3 Kết quả tối ưu hóa nồng độ primer cho terminator nos ....................................... 38
Hình 4.4 Đồ thị khuếch đại ở các nồng độ probe khác nhau cho promoter 35S. .............. 39
Hình 4.5 Đồ thị khuếch đại ở các nồng độ probe khác nhau cho terminator nos. ............ 40
Hình 4.6 Đồ thị khuếch đại ở các nồng độ MgCl2 khác nhau .......................................... 41
Hình 4.7 Đồ thị khuếch đại của các mẫu CRM ............................................................... 43
Hình 4.8 Đồ thị khuếch đại ở các nồng độ phần trăm GMO khác nhau........................... 44

xi


Chương 1 MỞ ĐẦU
1.1.

Đặt vấn đề
Theo thống kê của Quỹ Hannover năm 2010, dân số trên thế giới vào khoảng 6,89

tỷ người và dự kiến sẽ vượt quá 12 tỷ người sau 50 năm tới. Vấn đề cung cấp đủ lương
thực, thực phẩm cho nhân loại là một vấn đề rất lớn. Do đó, việc mở rộng nghiên cứu và
triển khai các loại thực phẩm có nguồn gốc biến đổi gen là giải pháp được nhiều nước
quan tâm.
Thực phẩm có nguồn gốc biến đổi gen (Genetically modified foods – GMF) là
những thực phẩm có chứa sinh vật biến đổi gen (Genetically modified organisms – GMO)
hoặc được sản xuất từ chúng. Theo Cục Quản lý Dược phẩm và Thực phẩm Mỹ (FDA) và
Bộ Nông nghiệp Mỹ, hiện có hơn 40 loại GMF được công nhận thoả mãn tiêu chuẩn thực
phẩm và y tế. Đó là các giống cà chua biến đổi gen điều khiển độ chín; giống đậu tương
chống cỏ dại; giống bông và ngô chống sâu bệnh… Những lợi ích từ GMF có thể được
thể hiện ở nhiều khía cạch khác nhau như giàu dưỡng chất; dược phẩm. Tuy nhiên, các
nhà bảo vệ môi trường, các nhà khoa học và chính phủ bày tỏ lo ngại đối với GMO vì cho
rằng chúng có thể đem đến những hiểm họa tiềm tàng. Vì vậy việc kiểm soát GMF trên
thị trường hiện nay là việc làm cấp thiết.

Theo một điều tra mới đây của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, hầu hết các
mẫu thức ăn chăn nuôi trên thị trường Việt Nam hiện đều chứa sản phẩm biến đổi gen (như
ngô và đậu tương) với một tỷ lệ nhất định. Đa số các sản phẩm này (kể cả 1 số loại cây
giống, con giống) được nhập khẩu chính thức qua các Công ty liên doanh với nước ngoài.
Việc này hầu như chưa được kiểm soát và vẫn còn khá nhiều ý kiến chưa thống nhất từ phía
cơ quan chuyên môn. Hơn nữa tại Việt Nam số lượng các cơ quan chuyên môn có khả
năng phân tích GMO tương đối ít, chỉ có một số cơ quan như Trung tâm kỹ thuật 3, Viện
Di truyền Nông nghiệp Việt Nam, Đại học Nông Lâm Tp HCM.
Nhiều nghiên cứu khảo sát đã chỉ ra rằng nếu có sự hiện diện của promoter 35SCaMV và terminator nos trong sản phẩm thì 95% đó là sản phẩm chuyển gen. Do đó, việc
tầm soát GMF là phải tầm soát promoter 35S-CaMV và terminator nos. Hiện nay có rất
1


nhiều phương pháp kiểm tra, sàng lọc GMF, tuy nhiên chủ yếu là phương pháp singlePCR. Phương pháp này tốn nhiều thời gian, chi phí và công sức do phải sử dụng hai
chương trình luân nhiệt riêng biệt cho hai phản ứng. Do đó, nghiên cứu để xây dựng một
quy trình sàng lọc GMF khắc phục những hạn chế trên là việc làm rất cần thiết. Trên cơ
sở đó tôi thực hiện đề tài “Xây dựng quy trình sàng lọc thực phẩm biến đổi gen bằng kỹ
thuật Duplex Real-time PCR” nhằm đưa ra quy trình phát hiện GMF thông qua việc phát
hiện đồng thời hai gen mục tiêu promoter 35S và terminator nos trên cùng một phản ứng.
1.2.

Yêu cầu
Xây dựng một quy trình thử nghiệm bằng kỹ thuật Duplex Real-time PCR phát

hiện đồng thời promoter 35S và terminator nos trên một phản ứng, có khả năng áp dụng
tại phòng thí nghiệm.
1.3.

Nội dung thực hiện
Tiến hành khảo sát các phương pháp tách chiết DNA, tối ưu hóa phương pháp

Duplex Real-time PCR và đánh giá khả năng hoạt động của phương pháp này.

2


Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1.

Định nghĩa thực phẩm có nguồn gốc biến đổi gen (Genetically Modified
Food – GMF)

2.1.1. Định nghĩa sinh vật biến đổi gen (Genetically Modified Organisms – GMO)
Các kỹ thuật công nghệ sinh học thông thường (lai chéo, tái tổ hợp tự nhiên…) đã
được sử dụng hàng trăm năm qua để tạo ra những sản phẩm có đặc tính riêng biệt. Tuy
nhiên, chúng đòi hỏi trải qua nhiều thời gian, nhiều thế hệ mới có được những tính trạng
mong muốn và loại bỏ những đặc tính không cần thiết. Vào thế kỷ 20, sinh học đã có
những bước tiến vượt bậc trong việc nghiên cứu sinh học phân tử ở mức độ DNA và
protein. Các tiến bộ này đã được ứng dụng vào thực tiễn và phát triển thành một công
nghệ mới, đó là công nghệ gen, bao gồm các kỹ thuật tái tổ hợp DNA và chuyển nạp gen.
Chúng thật sự là những bước đột phá của nhân loại trong lĩnh vực sinh học hiện đại, mở
ra những chân trời mới với những khám phá và ứng dụng vô tận cho cuộc sống và lợi ích
của con người.
Một trong những ứng dụng đó chính là việc tạo ra các sinh vật biến đổi gen, đặc
biệt là cây trồng biến đổi gen (Genetically Modified Crops – GMC). Với các ưu điểm nổi
bật, các giống thực vật này khi ra đời đã góp phần nâng cao chất lượng và sản lượng
lương thực, thực phẩm, một vấn đề cấp bách của nhân loại.
Hiện nay, trên thế giới có nhiều định nghĩa khác nhau về sinh vật biến đổi gen. Theo
European Union (2001), sinh vật biến đổi gen là một sinh vật, ngoại trừ con người, mà vật
liệu di truyền của nó được thay đổi theo một cách nào đó mà điều này không xảy ra trong

điều kiện tự nhiên do quá trình lai truyền thống hoặc tái tổ hợp tự nhiên hoặc cả hai. Đối
với thực vật, thuật ngữ này được dùng để chỉ các loại cây trồng mà bộ gen của chúng đã
được chuyển nạp ổn định những gen hữu ích mới bằng các kỹ thuật chuyển nạp gen và
trong đa số trường hợp các gen này được biểu hiện và tổng hợp ra các sản phẩm của chúng
(protein) (Nguyễn Hữu Trưởng, 2005).

3


2.1.2. Định nghĩa thực phẩm có nguồn gốc biến đổi gen
Thực phẩm có nguồn gốc biến đổi gen là thực phẩm mà bản thân chúng hoặc chế
biến từ các cơ thể động, thực vật mang các gen tái tổ hợp được chuyển vào một cách nhân
tạo nhằm phục vụ các lợi ích kinh tế (Nguyễn Lân Dũng, 2008). Hay nói đơn giản hơn,
thực phẩm có nguồn gốc biến đổi gen là những thực phẩm được sinh ra hay chế biến từ các
sinh vật biến đổi gen.
2.2.

Quá trình tạo sinh vật biến đổi gen

2.2.1. Quá trình cơ bản
Sinh vật biến đổi gen là sản phẩm của những tiến bộ khoa học kỹ thuật tiên tiến
nhất của con người trong công nghệ sinh học thực vật. Mặc dù các kỹ thuật tạo ra chúng
khá đa dạng và phức tạp, quá trình vẫn có những bước tiến hành chung để đạt được kết
quả cuối cùng. Để thực hiện quá trình này, những vấn đề quan trọng về cơ chế sinh lý,
sinh hóa, sự điều hòa và biểu hiện gen cũng như những sản phẩm do gen đó tạo ra cần
phải được chú ý và nghiên cứu nhằm đảm bảo cho sự thành công của quá trình.

Hình 2.1 Quy trình chuyển gen (Choi và Cheong, 2004).
Các bước cơ bản bao gồm: Ly trích acid nucleic (DNA/RNA), dòng hóa gen, thiết
kế gen cho quá trình chuyển gen, chuyển gen và lai backcross .

4


Đây thật sự là một quá trình khá phức tạp và tốn kém. Thời gian cần thiết cho việc
phát triển một giống cây trồng biến đổi gen mới phụ thuộc vào gen mong muốn, giống
thực vật, nguồn gen và sự phê chuẩn của cơ quan quản lý. Nó kéo dài khoảng từ 6 – 15
năm trước khi một dòng lai chuyển gen mới được phép thương mại hóa trên thị trường
(Choi và Cheong, 2004).
2.2.2. Cấu trúc cơ bản của một gen chuyển vào thực vật
Marker
chọn lọc

2.2.2.1

Promoter

Gen mục tiêu

Terminator

Hình 2.2 Cấu trúc cơ bản của gen chuyển vào thực vật
(Hoàng Thị Bích Thủy, 2010).
Promoter
Promoter là vùng điều khiển sự biểu hiện gen, nơi nhận dạng và kéo dài của RNA

polymerase II trong phiên mã. Do đó, để tạo cây chuyển gen có hiệu quả cao trong sản
xuất và thương mại, các gen chuyển vào thực vật phải mang một promoter tương ứng.
Hiện nay, có rất nhiều promoter được sử dụng như promoter 35S (Cauliflower Mosaic
Virus promoter), promoter FBP1 (Floral Binding Protein 1), promoter SSU (small
subunit)… Trong đó, promoter 35S được sử dụng phổ biến và khai thác một cách có hiệu

quả do có khả năng chuyển mã ở mức độ cao trong mô của nhiều loài cây khác nhau, đặc
biệt ở cây hai lá mầm (Anklam và ctv, 2002; Rodríguez, 2003). Tuy nhiên, nó kém hiệu
quả trong cây một lá mầm, đặc biệt là trong ngũ cốc. Sự khác biệt này có thể do những
khác biệt về chất lượng hoặc số lượng các yếu tố điều hòa hoặc cả hai. Nhằm khắc phục
khuyết điểm này, promoter 35S đã được cải tiến, nâng cao hiệu quả hoạt động bằng cách
thêm vào các trình tự enhancer. Các nghiên cứu cho thấy hiệu quả hoạt động phiên mã gia
tăng từ 3 đến 6 lần trên cây một lá mầm được chuyển nạp nhiều bản sao vùng enhancer
(Rodríguez, 2003).
2.2.2.2

Terminator
Terminator là vùng đóng vai trò dấu hiệu dừng của quá trình phiên mã, điểm nhận

dạng và ngưng hoạt động của RNA polymerase II. Các terminator hiện nay được sử dụng
như terminator PinII (potato proteinase inhibitor II), terminator 35S (terminator CaMV),
5


terminator ORF25PolyA (Agrobacterium tumefaciens pTi15955), terminator OCSt (the
octopine synthase gene), terminator nos (Agrobacterium tumefaciens nopaline synthase
terminator). Trong đó, terminator nos từ plasmid Ti trong Agrobacterium tumefaciens là
terminator phổ biến nhất (Brandner, 2002).
Theo GS. TS. Phạm Thị Anh Thư, tại hội thảo “Giới thiệu về sinh vật chuyển đổi
gen” do hội các phòng thí nghiệm Việt Nam (VINATEST) tổ chức ngày 05/05/2005, cho
biết 95% cây chuyển gen ở Châu Âu mang promoter 35S và/hoặc terminator nos kiểm
soát trình tự gen được chuyển vào cây trồng biến đổi gen. Khi mẫu phân tích có một trong
hai trình tự này thì mẫu đó 95% là có chuyển gen, ngược lại khi kết quả mẫu phân tích
không có cả hai trình tự này thì ta cũng có thể kết luận mẫu 95% không có chuyển gen.
2.2.2.3

Marker chọn lọc
Các plasmid sử dụng trong chuyển nạp gen chứa gen thông báo và những gen

mang mã di truyền của các marker có tính chọn lọc nhằm xác định những tế bào đã
chuyển nạp trên cơ sở tăng trưởng của chúng trong môi trường chọn lọc. Marker có tính
chọn lọc thông dụng là tính kháng kháng sinh như gen hph (kháng hygromycin), aadA
(kháng streptomycin, spectinomycin), nptII (kháng kanamycin, neomycin), nptIII (kháng
kanamycin, neomycin, amikacin) và kháng thuốc diệt cỏ như bar (kháng phosphinothricin
(PPT)). Các gen này thường được kiểm soát bởi các yếu tố điều hòa như promoter 35S và
terminator nos (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2000).
2.2.2.4

Gen mục tiêu chuyển vào thực vật
Gen Bt được phân lập từ tế bào vi khuẩn Bacillus thuringiensis, được cải biến lại

trước khi sử dụng cho cây trồng. Cây chuyển nạp gen Bt có thể tạo ra protein độc dạng
tinh thể trong thân cây. Những protein này được sản xuất liên tục, ít bị phân giải và có
mặt ở các mô cần thiết (Vaeck và ctv, 1987; Steward và ctv, 1996; trích dẫn bởi Bùi Minh
Trí, 2011). Gen gna: hợp chất lectin có nguồn gốc từ thực vật có thể gây độc đối với các
côn trùng thuộc bộ cánh nửa Homoptera, trong đó nhóm lectin có tên “snowdrop lectin”
(Galantus nivalis agglutinin) có độc tính mạnh nhất (Powel và ctv, 1993; trích dẫn bởi Bùi
Minh Trí, 2011). Nhóm gen PR: khi có sự xâm nhiễm của nấm, vi khuẩn, virus, thực vật sẽ
sản sinh ra một protein mới giúp chúng tự bảo vệ là pathogenesis–related protein (PR). Các
6


nhóm protein đã được ghi nhận gồm PR–1, PR–2 (β–1,3 glucunase), PR–3 (chitinase), PR–
4, PR–5 (thaumatine–like protein) và PR–6 (ức chế protease). Gen Xa–21 được tìm thấy ở
loài lúa hoang châu Phi Oryza longistaminata có phổ kháng rất rộng đối với nhiều nòi vi
khuẩn gây bệnh (Linhorse, 1991; trích dẫn bởi Bùi Minh Trí, 2011). Gen CP: tính kháng

virus của “coat protein” (CP) đã được đề cập rất sớm và từ đó người ta muốn đưa tính
trạng này vào cây trồng để giúp cây kháng lại các bệnh do virus gây ra (Powell và ctv,
1986 ; trích dẫn bởi Bùi Minh Trí, 2011).
Các gen kháng thuốc diệt cỏ phổ biến là gen bxn có nguồn gốc từ vi khuẩn
Klebsiella pneumoniae mã hóa enzyme Bromoxynil nitrilase có khả năng làm mất hoạt
tính của bromoxynil. Cơ chế kháng bromoxynil là do khả năng chuyển hóa nhanh
bromoxynil sang dạng 3,5–dibromo–4–hydroxybenzoic acid không độc (Eberlein và ctv,
2000; trích dẫn bởi Bùi Minh Trí, 2011); gen bar có nguồn gốc từ vi khuẩn Streptomyces
hygroscopicus có khả năng sản sinh ra một loại hợp chất thứ cấp là tripeptide bialaphos.
Bialaphos có chứa phosphinothricin, là một đồng dạng của glutamate. Glutamate là chất
gây ức chế enzyme glutamine synthetase. Khi enzyme này bị ức chế cây trồng sẽ không
thể tổng hợp được glutamine dẫn đến sự tích lũy ammonia trong cây làm cây chết nhanh
chóng (Thompson và ctv, 1987; trích dẫn bởi Bùi Minh Trí, 2011).
2.2.3. Thành tựu chuyển nạp gen vào cây trồng
Các ứng dụng ban đầu của cây trồng biến đổi gen chủ yếu tập trung vào các đặc tính
phù hợp với quá trình sản xuất nông nghiệp như kháng thuốc diệt cỏ, kháng bệnh do côn
trùng. Về sau, các kỹ thuật di truyền chú trọng hơn vào các đặc tính chất lượng cây trồng
biến đổi gen, tạo nên sự đa dạng trong thành tựu chuyển nạp gen vào cây trồng.
2.2.3.1

Các đặc tính nông nghiệp của cây trồng biến đổi gen
Đặc tính kháng thuốc diệt cỏ là đặc tính phổ biến nhất, giúp giảm lượng thuốc diệt

cỏ sử dụng và tồn dư thuốc trong cây và môi trường với các gen kháng như gen CP4
EPSPS (kháng glyphosate), gen bar hoặc pat (kháng glufosinate ammonium) được chuyển
vào thực vật như bắp, đậu nành, bông vải và cải dầu (Gianessi và Carpenter, 2000; Funk và
ctv, 2006; Trích dẫn bởi Hoàng Thị Bích Thủy, 2010).

7

Cây trồng có thể tạo ra các độc tố giết côn trùng nhờ gen tạo độc tố Bt (cryIAb,
cryIAc, cry1F, cry3A, cry9C…) từ vi khuẩn Bacillus thuringiensis. Gen cry được chuyển
vào thực vật chủ yếu ở bắp, bông vải (Purcell và Perlak, 2004; Trích dẫn bởi Hoàng Thị
Bích Thủy, 2010).
Ngoài kháng bệnh do côn trùng, cây trồng biến đổi gen còn ngăn chặn sự phát sinh
bệnh do virus, nấm, vi khuẩn trên cây trồng như gen CP (coat protein) chống virus gây
bệnh đốm ở đu đủ - PRSV (Papaya Ring Spot Virus) (Bau và ctv, 2002; Trích dẫn bởi
Hoàng Thị Bích Thủy, 2010), yếu tố Nod Bj-V ở đậu tương kháng nấm gây bệnh mốc
sương (Prithiviraj và ctv, 2003; Trích dẫn bởi Hoàng Thị Bích Thủy, 2010), gen Xa-21
chống bệnh bạc lá lúa do vi khuẩn gây ra (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2000).
Cây trồng kháng các yếu tố môi trường: cây trồng kháng các tác nhân gây stress của
môi trường như: chịu lạnh, chịu hạn, chịu muối và các ion kim loại nặng như gen CSb
(bacterial citrate synthase) tiết ra citrate nối aluminum, là kim loại độc gây dị hình rễ, giảm
năng suất (James và ctv, 2003; Trích dẫn bởi Hoàng Thị Bích Thủy, 2010).
2.2.3.2

Các đặc tính chất lượng của cây trồng biến đổi gen
Đặc tính bất thụ đực giúp sản xuất các giống nông sản lai năng suất cao; đặc tính

ngăn chặn sự chín sớm của quả giúp kéo dài thời gian tồn trữ và phù hợp cho sản xuất
thực phẩm; đặc tính thay đổi hàm lượng chất béo nhằm tăng hàm lượng các loại acid béo
không bão hòa đơn và giảm acid béo không bão hòa đa trong các loại cây lấy dầu như đậu
nành, hoa hướng dương; đặc tính nâng cao giá trị dinh dưỡng nhằm chuyển nạp các gen
mã hóa các protein có chứa hàm lượng cao các amino acid thiết yếu như lysine, tyrosine,
tryptophan vào cây trồng. Ngoài ra, một hướng nghiên cứu tuy còn khá mới mẻ nhưng đã
hứa hẹn thành công rực rỡ trong tương lai đó là đặc tính thực phẩm chức năng nhằm
chuyển nạp gen biểu hiện các protein kháng nguyên chống lại một số bệnh như bệnh tiêu
chảy (Diarrhea), bệnh sởi (Measles), viêm gan B (Hepatitis B) tạo ra các loại vaccine ăn
được (edible vaccine) ở thực vật như chuối, khoai tây hoặc gen sinh tổng hợp các hợp

chất thứ cấp quý như dược phẩm, chất dẻo. Một ví dụ nổi tiếng của thực phẩm chức năng
đó là gạo vàng (Golden rice). Đây là loại gạo có hàm lượng vitamin A được tăng cao bằng
cách chuyển nạp 3 gen mã hóa quá trình sinh tổng hợp carotene. Các nhà khoa học hy
8


vọng gạo vàng sẽ góp phần xoá bỏ các chứng bệnh mù do thiếu vitamin A gây ra tại các
nước đang phát triển (Choi và Cheong, 2004).
2.3.

Lợi ích và tác hại của cây trồng biến đổi gen

2.3.1. Lợi ích của cây trồng biến đổi gen
Với những ưu điểm nổi bật và ứng dụng khá đa dạng, cây trồng biến đổi gen đã
đem lại một số lợi ích đối với nông nghiệp và đời sống con người.
Đối với kinh tế, cây trồng biến đổi gen giúp nâng cao hiệu quả lao động, giảm chi
phí trong việc phun xịt các loại thuốc diệt cỏ, trừ sâu và cày cấy; nâng cao năng suất nhờ
giảm được thất thoát do côn trùng và bệnh tật, giảm áp lực cho đất trồng; tạo ra các đặc
tính biến đổi phù hợp với quá trình sản xuất, ví dụ: cà chua không bị mềm quá sớm, do đó
giảm lượng nước cần trong quá trình sản xuất thực phẩm; làm chủ năng suất như nâng cao
độ tinh sạch của hạt giống giúp nâng cao năng suất; cho phép canh tác trên những vùng đất
trước đây không thể sử dụng; tăng sản lượng và lợi nhuận nông nghiệp.
Đối với môi trường, cây trồng biến đổi gen giúp giảm dư lượng phân bón nhờ cố
định đạm, giảm áp lực đất trồng, giảm sử dụng thuốc trừ sâu, diệt cỏ.
Đối với sức khỏe con người, cây trồng biến đổi gen giúp giảm các tác động độc hại
do thuốc diệt côn trùng gây ra với sức khỏe, tạo ra được các loại thực phẩm mới có chất
lượng tốt hơn, có khả năng chữa bệnh phục vụ cho người và nâng cao dinh dưỡng cho con
người. Những tác động có lợi này giúp cây trồng biến đổi gen được sản xuất và thương
mại hóa ngày càng rộng rãi trên khắp thế giới (Choi và Cheong, 2004).
2.3.2. Tác hại của cây trồng biến đổi gen

2.3.2.1. Các rủi ro có thể gặp
Việc trồng và thương mại hóa cây trồng biến đổi gen ngày càng tăng tại nhiều quốc
gia trên thế giới không có nghĩa là cây trồng biến đổi gen hoàn toàn không có rủi ro hay
tác hại nào đối với môi trường và sức khỏe con người. Theo nhiều nhà khoa học trên thế
giới, những rủi ro và tác hại này có thể do nhiều nguyên nhân: (1) gen chuyển nạp chèn
vào vị trí ngẫu nhiên, phá vỡ trình tự gen hiện hữu; (2) thiếu kiểm soát thông thường đối
với gen chuyển nạp dẫn đến các gen chuyển nạp thường biểu hiện liên tục trong mọi tế
bào, kể cả sau khi được mua bán và tiêu dùng; (3) hầu hết gen có nhiều chức năng và
9


tương tác chặt chẽ. Vì vậy, làm sao có thể kiểm soát hết tất cả các tác dụng do gen chuyển
nạp tạo ra; (4) sự chuyển gen ngang, nghĩa là các gen hữu ích chuyển nạp vào cây trồng
thường kèm với các vật liệu di truyền có nguồn gốc từ vi khuẩn hay virus: vector,
promoter, marker. Điều này gây lo ngại, khi các gen thoát khỏi sinh vật biến đổi gen vào
các vi sinh vật, thậm chí tế bào động vật có vú thì tác hại như thế nào, đặc biệt đối với sức
khỏe con người (Querci và Mazzara, 2004).
2.3.2.2. Tác hại đối với môi trường
Sự chuyển gen từ thực vật biến đổi gen cho các loài thực vật tự nhiên khác gây ra
các biến đổi di truyền bất thường trên các loài này. Thực vật chuyển gen kháng côn trùng
có thể tác động xấu đến các loài sinh vật và côn trùng có lợi khác. Cây trồng biến đổi gen
gia tăng việc sử dụng thuốc hóa học trong nông nghiệp. Báo cáo năm 1999 tại Mỹ cho thấy
nông dân trồng đậu nành biến đổi gen Roudup Ready gia tăng sử dụng thuốc hóa học từ 2
đến 5 lần so với nông dân trồng đậu nành thông thường. Trong năm 2001-2002, lượng
thuốc hóa học sử dụng đã tăng 70 tỷ pound tại Mỹ. Điều này gây ra lo ngại về dư lượng
thuốc hóa học trong các sản phẩm nông nghiệp (Benbrook, 2003).
Các gen kháng thuốc diệt cỏ có thể phóng thích khỏi cây trồng biến đổi gen và chuyển
vào các loại cây trồng, cỏ dại khác tạo nên loại “siêu cỏ dại” có khả năng kháng một hay
nhiều loại thuốc diệt cỏ. Điều này sẽ gây nhiều khó khăn trong việc phòng trừ cỏ dại trong
thời gian tới (Querci và ctv, 2004).

Sự hình thành “siêu côn trùng” kháng lại các tác nhân gây độc Bt gây khó khăn
trong việc phòng trừ sâu hại (EEA, 1999).
2.3.2.3.

Tác hại đối với sức khỏe người tiêu dùng

Cây trồng biến đổi gen tạo ra các tác nhân dị ứng mới: công nghệ gen cho phép
biểu hiện gen chuyển nạp bắt nguồn từ nhiều loại sinh vật khác loài như virus, vi khuẩn.
Các loại protein mới này có thể gây ra triệu chứng dị ứng trên người.
Dư lượng thuốc bảo vệ thực vật: việc tạo ra cây trồng kháng thuốc diệt cỏ cho phép
sử dụng thuốc diệt cỏ trên cây đang trong giai đoạn phát triển. Điều này vốn bị cấm trước
đây do người tiêu dùng có thể bị ảnh hưởng bởi dư lượng thuốc diệt cỏ trong thực phẩm
họ sử dụng. Ngoài ra, các gen kháng kháng sinh làm marker trong thực phẩm có nguồn
10


gốc biến đổi gen có thể chuyển nạp vào vi khuẩn đường ruột gây ra tính kháng kháng
sinh. Cây biến đổi gen cũng có thể tạo ra chất độc mới do tương tác không kiểm soát giữa
sản phẩm biến đổi gen và các phần tử khác (Eyquem, 2004).
2.3.2.4.

Các nghiên cứu và dẫn chứng cụ thể

Cà chua Flavr Savr gây ra nhiều thương tổn cho chuột (7 trong số 40 con chuột thí
nghiệm đã chết sau 15 ngày), đã bị cấm bán trên thị trường (Soil Association, 2004).
Trong thí nghiệm của tiến sĩ Arpad Pusztai (Viện nghiên cứu Rowett) cho thấy thương
tổn trong hệ tiêu hóa chuột khi ăn khoai tây biến đổi gen chứa gen sản xuất lectin. Các
con chuột này không bị ảnh hưởng khi chỉ ăn khoai tây không biến đổi gen hay ăn lectin
(Soil Association, 2004).
Nghiên cứu của Đại học Newcastle về chuyển nạp gen cho thấy khi ăn thực phẩm

chứa đậu nành biến đổi gen có hiện tượng gen chuyển nạp thoát ra và chuyển nạp vào vi
khuẩn đường ruột (Soil Association, 2004).
Nghiên cứu của Anh về sự chuyển gen ở cừu cho thấy sau khi cừu ăn bắp chuyển
gen khoảng 8 phút, một số gen chuyển đã di chuyển khỏi bắp và “chuyển gen ngang” vào
vi khuẩn ở miệng. Một trong số các gen được chèn mã hóa cho sự đề kháng đối với kháng
sinh kanamycin. Sau đó, vi khuẩn E. coli được tìm thấy có tính kháng đối với kháng sinh,
chứng tỏ gen chuyển đã cài nhập vào DNA của vi khuẩn. Điều này chứng minh sự “chuyển
gen ngang” của gen chèn có thể xảy ra tương đối dễ dàng (Duggan và ctv, 2003).
Thực phẩm có nguồn gốc biến đổi gen bổ sung L-tryptophan đã gây ra 37 trường
hợp tử vong và ít nhất 1500 trường hợp tàn tật tại Mỹ do một chất độc không xác định.
Công ty đã bồi thường 2 tỷ USD cho trên 2000 nạn nhân (Soil Association, 2003 và 2004).
Nhóm các nhà khoa học Anh, do tiến sĩ Anh David Bohan (2005) đứng đầu, khẳng
định cây trồng biến đổi gen gây hại cho môi trường. Kết quả từ cuộc nghiên cứu lớn nhất
thế giới (trong bốn năm với kinh phí lên tới 9,5 triệu USD) cho thấy các cánh đồng trồng
GMO có rất ít chim, ong, bướm và các côn trùng khác, so với các cánh đồng trồng cây
bình thường. Các GMO kiềm chế quá trình ra hoa và kết quả của cây hoang dại có lợi cho
môi trường và đời sống hoang dã, trong khi lại kích thích phát triển các cây hoang dại có
hại cho môi trường. Do đó GMO không chỉ tác động trực tiếp mà còn tác động gián tiếp
11


đến môi trường. Nghiên cứu cũng cảnh báo rằng GMO sẽ tạo ra thế độc canh trong nông
nghiệp và gây hại cho sự đa dạng sinh học. Nhóm nghiên cứu đề nghị các nước phải thật
thận trọng khi cho phép phát triển các loại GMO (Trích dẫn bởi Viện Chăn Nuôi, 2005).
2.4.

Hiện trạng cây trồng biến đổi gen

2.4.1. Hiện trạng cây trồng biến đổi gen trên thế giới
Theo số liệu mới nhất năm 2011, diện tích trồng cây chuyển gen trên thế giới đạt

khoảng 160 triệu ha, tăng 12 triệu ha tương đương 8% so với năm 2010. Với mức tăng
trên 94 lần từ 1,7 triệu ha năm 1996 lên 160 triệu ha năm 2011, cây chuyển gen đã trở
thành công nghệ cây trồng được đưa vào ứng dụng nhanh nhất trong lịch sử nền nông
nghiệp hiện đại (James, 2011).
Năm 2011 đã xác lập mức kỷ lục với 16,7 triệu nông dân ở 29 quốc gia trồng cây
chuyển gen. Trong số đó, có 19 nước đang phát triển và 10 nước công nghiệp, với diện
tích trồng cây chuyển gen ở các nước đang phát triển chiếm khoảng 50% diện tích trồng
cây chuyển gen trên toàn cầu trong năm 2011 và dự kiến sẽ vượt diện tích trồng của các
nước công nghiệp vào năm 2012. Năm 2011, tốc độ trồng cây chuyển gen ở các nước
đang phát triển nhanh gấp đôi và lớn gấp hai lần so với các nước công nghiệp, ở mức 11%
hay 8,2 triệu ha, so với 5% hoặc 3,8 triệu ha ở các nước công nghiệp (James, 2011).
Năm nước đang phát triển đứng đầu về diện tích trồng cây chuyển gen là Ấn Độ và
Trung Quốc ở châu Á, Brazil và Argentina ở châu Mỹ Latinh và Nam Phi trên lục địa
châu Phi, cùng đại diện cho 40% dân số toàn cầu. Hoa Kỳ tiếp tục là nước có diện tích
trồng cây chuyển gen lớn nhất trên toàn cầu với 69 triệu ha, chiếm hơn 43 % diện tích trồng
cây chuyển gen toàn cầu, tiếp theo là Brazil (30,3 triệu ha), Argentina (23,7 triệu ha), Ấn độ
(10,6 triệu ha) và Canada (10,4 triệu ha) (James, 2011).

12