NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG in vitro TỪ LÁ CÂY HÀ THỦ Ô ĐỎ (Polygonum multiflorum Thunb)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG in vitro
TỪ LÁ CÂY HÀ THỦ Ô ĐỎ
(Polygonum multiflorum Thunb)

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Sinh viên thực hiện: PHẠM MINH TÂM
Niên khóa: 2008 – 2012

Tháng 07 năm 2012


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG in vitro
TỪ LÁ CÂY HÀ THỦ Ô ĐỎ
(Polygonum multiflorum Thunb)

Hƣớng dẫn khoa học

Sinh viên thực hiện

ThS. TRỊNH THỊ THANH HUYỀN

PHẠM MINH TÂM

Tháng 07 năm 2012


LỜI CẢM ƠN

Em xin gửi lời cảm ơn đến quý thầy cô bộ môn Công nghệ sinh học trường đại
học Nông Lâm, là những người đã truyền đạt cho em những kiến thức quý báu trong
suốt bốn năm ngồi giảng đường Đại Học và đã tạo nhiều điều kiện học tập cho em.
Em xin chân thành cảm ơn ThS. Trịnh Thị Thanh Huyền đã hướng dẫn và tạo
điều kiện cho em thực tập và hoàn thành tốt đề tài tốt nghiệp và em cũng rất biết ơn
anh Ngô Quang Hưởng, chị Phí Thị Thu Hiền, Ngô Ngọc Tú, cùng toàn thể nhân viên
của trung tâm và các bạn cùng thực tập ở trung tâm.
Em chân thành cám ơn tất cả các bạn lớp Công Nghệ Sinh Học khoá 34 đã giúp
đỡ em rất nhiều trong qua trình học tập và trong thời gian làm đề tài tốt nghiệp.
Em rất chân thành cảm ơn thầy Lê Đình Đôn, thầy Nguyễn Tiến Thắng vì đã
truyền cảm hứng và nhiệt huyết cho em khi theo đuổi con đường công nghệ sinh học.
Con xin chân thành gia đình đã tạo điều kiện giúp đỡ, luôn động viên và ủng hộ
con hoàn thành tốt công việc học tập.
Tháng 7 năm 2012
Phạm Minh Tâm

i


TÓM TẮT

Hà thủ ô đỏ (Polygonum multiflorum Thunb) là một thảo dược quý chứa các
thành phần: emodin, chrysophanol, rhein, physcion, protid, tinh bột, lipid, lecitin,
rhaponticin (rhapontin, ponticin). 2,3,5,4 tetrahydroxytibene -2-O-b-D-glucoside,
Tanin…là một loại thuốc truyền thống ở Việt Nam, Trung Quốc. Nhân giống hà thủ ô
đỏ in vitro tạo ra số lượng lớn cây trong thời gian ngắn giúp đáp ứng cho nhu cầu
trồng trọt và các mục đích sử dụng khác.
Nội dung của nghiên cứu này bao gồm sự tái sinh chồi từ lá và tạo cây hoàn
chỉnh để nuôi trồng ngoài vườn ươm.
Lá cây hà thủ ô đỏ được cấy vào môi trường MS bổ sung alphanaphthaleneacetic acid (NAA), andbenzyladenine (BA) thidiazuron (TDZ) 2,4dichlorophenoxyacetic acid (2,4D). 93% mẫu cho cảm ứng trong môi trường chứa
0,75 mg/l TDZ, 2,0 mg/l BA và 0,5 mg/l 2,4D tạo mô sẹo nặng trung bình 0,419 g.
Sau đó mô sẹo được cấy chuyền sang môi trường MS chứa 4mg/l BA and 1.5mg/l
Kinitin để tạo chồi với trung bình 3,933 chồi tái sinh trên mẫu. Chồi sẽ được nhân cụm
chồi trong môi trường MS bổ sung 4 mg/l 6-benzylaminopurine (BAP), 0,25 mg/l
NAA với trung bình 7,44 chồi trên một cụm chồi và tạo rễ trong môi trường MS bổ
sung 0,5 mg/l NAA. Cuối cùng, cây hoàn chỉnh được trồng ngoài vườn ươm trên giá
thể chứa 50% xơ dừa và 50 % tro trấu cho tỷ lệ sống 57%, chiều cao cây trung bình
đạt 5.27 cm và số lá trung binh 4,41 lá trên mổi cây.

ii


SUMMARY

The title of thesis “Regenerate shoots form leaf Polygonum multiflorum
Thunb.”
Polygonum multiflorum Thunb is valuable herb containing components:
emodin, chrysophanol, rhein, physcion, proteins, starch, lipid, lecitin, rhaponticin
(rhapontin, ponticin). 2,3,5,4 tetrahydroxytibene -2-O-b-D-glucoside, Tanin…It is also
known as tradition medicine of China and VietNam. Micropropagation of Polygonum
multiflorum Thunb in vitro produce large amounts of plants in a short time to respond

cultivation and other purposes.
Contents of the study include shoot regeneration form leaf and the creation of
whole trees for growing in nursery.
Leaf of Polygonum multiflorum Thunb were grown in vitro on Murashige and
Skoog's

(MS)

basal

medium

containing

different

concentrations

of alpha-

naphthaleneacetic acid (NAA), andbenzyladenine (BA), thidiazuron (TDZ), 2,4dichlorophenoxyacetic acid (2,4D). The leaf explants (93%) produced callus (0,419g)
on MS basal medium supplemented with 0,75 mg/l TDZ, 2.0 mg/l BA and 2,4D
0,5mg/l. Therefor, the callus regenerated shoots on MS supplemented BA 4mg/l and
Kinitin 1.5mg/l. After four weeks, multiple shoots developed from the calli culture
with average of 3,93 shoots per sample.The single shoots were propagated on MS
supplemented 4 mg/l 6-benzylaminopurine (BAP), 0,25 mg/l NAA with average of
7,44 shoots per sample and rooted on MS supplemented with 0,5 mg/l NAA. Finally,
whole trees were grown in greenhouses on substrates (containing 50% coconut fiber
and 50% rice husk ash) with 57% survive, average height of 5.27 cm and 4.41 is the
average number of leaves on each plant.

Key words: Polygonum multiflorum Thunb, in vitro, micropropagation…

iii


MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM ƠN ................................................................................................................. i
TÓM TẮT ......................................................................................................................ii
SUMMARY .................................................................................................................. iii
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ........................................................................ vi
DANH SÁCH CÁC BẢNG .........................................................................................vii
DANH SÁCH CÁC HÌNH ........................................................................................ viii
Chƣơng 1 MỞ ĐẦU ....................................................................................................... 1
1.1 Đặt vấn đề .................................................................................................................. 1
1.2 Yêu cầu của đề tài ...................................................................................................... 1
1.3 Nội dung thực hiện .................................................................................................... 1
Chƣơng 2 TỔNG QUAN ............................................................................................... 2
2.1Giới thiệu chung về hà thủ ô đỏ ................................................................................. 2
2.1.1Phân loại .................................................................................................................. 2
2.1.2 Đặc điểm hình thái .................................................................................................. 2
2.1.3 Phân bố .................................................................................................................... 2
2.1.4 Tác dụng dược lý ..................................................................................................... 2
2.2Khái niệm nuôi cấy mô tế bào .................................................................................... 3
2.2.2 Sự tạo mẫu cấy in vitro vô trùng ............................................................................ 3
2.2.2 Sự tăng sinh tế bào có định hướng và tái sinh cây hoàn chỉnh .............................. 4
2.2.3 Nuôi trồng ngoài vườn ươm ................................................................................... 4
2.2.4 Auxin và Cytokinin ................................................................................................ 5
2.2.4.1 Auxin ................................................................................................................... 5
2.2.4.2Cytokinin .............................................................................................................. 6

2.2.5 Môi trường dinh dưỡng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật ................................... 7
2.2.5.1 Các chất khoáng .................................................................................................. 8
2.2.5.2 Nguồn Carbon (C) ............................................................................................... 8
2.2.5.3 Các vitamin .......................................................................................................... 9
2.2.5.4 Các điều kiện vật lý trong nuôi cấy mô tế bào thực vật ...................................... 9
2.2.6 Những vấn đề trong nuôi cấy mô ......................................................................... 10
iv


2.2.6.1 Sự tạp nhiễm ...................................................................................................... 10
2.2.6.2 Tính bất định về mặt di truyền .......................................................................... 10
2.2.6.3 Sự phát sinh các chất độc trong quá trình nuôi cấy ........................................... 11
2.2.6.4 Hiện tượng thủy tinh thể .................................................................................... 11
2.3 Sự tạo sẹo từ mẫu lá và tái sinh chồi từ sẹo ............................................................ 12
2.3.1 Cấu tạo của lá ....................................................................................................... 12
2.3.2 Khái niệm mô sẹo ................................................................................................. 12
2.3.3 Sự phát sinh chồi từ mô sẹo.................................................................................. 12
2.4 Các công trình nghiên cứu liên quan ....................................................................... 13
Chƣơng 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ............................................................ 14
3.1 Thời gian và địa điểm .............................................................................................. 14
3.2 Vật liệu .................................................................................................................... 14
3.2.1 Trang thiết bị và dụng cụ ...................................................................................... 14
3.2.2 Dung dịch khử trùng mẫu và môi trường cấy ...................................................... 14
3.3 Nội dung nghiên cứu ............................................................................................... 14
3.4 Phương pháp ............................................................................................................ 15
3.4.1 Quy trình khử trùng mẫu lá .................................................................................. 15
3.4.2 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ Cytokinin và Auxin lên sự tạo mô sẹo .................. 16
3.4.3 Tái sinh chồi từ mô sẹo lá ..................................................................................... 17
3.4.4 Sự nhân cụm chồi ................................................................................................. 17
3.4.5 Sự tạo rễ ................................................................................................................ 18

3.4.6 Nuôi trồng ngoài vườn ươm ................................................................................. 18
Chƣơng 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................... 20
4.1 Thời gian và nồng độ javel thích hợp để khử trùng mẫu cấy .................................. 20
4.2 Sự tạo mô sẹo .......................................................................................................... 20
4.3 Sự tái sinh chồi từ sẹo.............................................................................................. 22
4.4 Sự nhân cụm chồi .................................................................................................... 24
4.5 Sự tạo rễ ................................................................................................................... 26
4.6 Nuôi trồng ngoài vườn ươm .................................................................................... 27
Chƣơng 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ....................................................................... 29
TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................................... 30
PHỤ LỤC
v


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

BA:N6 – benzyladenine
BAP:6-Benzylaminopurine
ĐC: đối chứng
MS:môi trường Murashige and Skoog (1962)
NAA:α – napthylacetic acid
TDZ:Thidiazuron ( N-phenyl-N-1,2,3-thiadiazol-5-ylurea)
NT: Nghiệm thức
2,4D: 2,4-dichlorophenoxyacetic acid

vi


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Trang

Bảng 3.1 Nghiệm thức khảo sát ảnh hưởng của nồng độ và thời gian khử trùng javel
đến tỷ lệ sống của mẫu lá hà thủ ô đỏ.......................................................................... 15
Bảng 3.2 Nghiệm thức khảo sát ảnh hưởng của cytokinin và auxin lên khả năng tạo mô
sẹo từ mẫu lá cây hà thủ ô ........................................................................................... 16
Bảng 3.3 Nghiệm thức khảo sát ảnh hưởng của BA và Kinitin lên khả năng tạo mô sẹo
từ mẫu lá cây hà thủ ô .................................................................................................. 17
Bảng 3.4 Nghiệm thức khảo sát ảnh hưởng của BAP và NAA lên khả năng tạo mô sẹo
từ mẫu lá cây hà thủ ô .................................................................................................. 18
Bảng 3.5 Nghiệm thức khảo sát ảnh hưởng NAA lên sự tạo rễ .................................. 18
Bảng 3.6 Nghiệm thức khảo sát ảnh hưởng của giá thể cây lên sự sinh trưởng và phát
triển của cây hà thủ ô đỏ .............................................................................................. 19
Bảng 4.1 Kết quả khử trùng ........................................................................................ 20
Bảng 4.2 Tỷ lệ phát sinh mô sẹo và khối lượng mô sẹo sau 40 ngày ......................... 21
Bảng 4.3 Kết quả tái sinh chồi từ mô sẹo sau 30 ngày nuôi cấy ................................. 23
Bảng 4.4 Kết quả nhân cụm chồi sau 25 ngày nuôi cấy.............................................. 25
Bảng 4.5 Kết quả ảnh hưởng của NAA lên sự tạo rễ của cây sau 30 ngày nuôi cấy .. 26
Bảng 4.6 Kết quả khảo sát sự sinh trưởng trên các loại giá thể sau 15 ngày .............. 27

vii


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Trang
Hình 2.1 Hà thủ ô đỏ ..................................................................................................... 2
Hình 2.2 Mô tả ảnh hưởng của cytokinin và auxin lên tế bào thực vật nuôi cấy của
Mauseth ......................................................................................................................... 7
Hình 2.3 Cấu tạo của lá ............................................................................................... 12
Hình 3.1 Quy trình khử trùng ...................................................................................... 15
Hình 4.1 Mô sẹo sau 50 ngày nuôi cấy môi trường N19 ............................................ 22
Hình 4.2 Mô sẹo sau 50 ngày nuôi cấy môi trường N13 ............................................ 22

Hình 4.3 Mô sẹo cảm ứng tái sinh chồi sau 10 ngày môi trường K6 .......................... 23
Hình 4.4 Mô sẹo cảm ứng tái sinh chồi sau 10 ngày môi trường K4 .......................... 23
Hình 4.5 Mô sẹo sau 30 ngày nuôi cấy trên môi trường K2 ....................................... 24
Hình 4.6 Mô sẹo sau 30 ngày nuôi cấy trên môi trường K5 ....................................... 24
Hình 4.7 Mô sẹo sau 30 ngày nuôi cấy trên môi trường K6 ....................................... 24
Hình 4.8 Mô sẹo sau 30 ngày nuôi cấy trên môi trường K3 ....................................... 24
Hình 4.9 Chồi sau cấy 25 ngày................................................................................... 25
Hình 4.10 Cụm chồi sau cấy 25 ngày trên môi trường V6 ......................................... 25
Hình 4.11 Rễ sau cấy 30 ngày .................................................................................... 27
Hình 4.12 Cây con trồng trong 15 ngày……………………………………………..28
Hình 4.13 Cây con sau 15 ngày trồng trong H2 ......................................................... 28

viii


Chƣơng 1 GIỚI THIỆU
1.1 Đặt vấn đề
Hà thủ ô đỏ (Polygonum multiflorum Thunb.) từ xa xưa đã được mệnh danh là
một loại thần dược với các sự tích và các câu tục ngữ do tính dược liệu quý của nó. Do
đặc điểm dược liệu quý nên hà thủ ô đỏ bị khai thác quá mức và nằm trong sách đỏ
(Trần Ngọc Ninh, 2006), cần được bảo vệ. Hiện nay hà thủ ô đỏ đang được quan tâm
và bảo vệ bởi nhiều cơ quan (Sở Khoa học Công nghệ Đồng Nai, Phú Yên …) và tiềm
năng trên thị trường rộng mở do tính dược liệu quý của nó giúp làm giảm nguy cơ tim
mạch, làm đen tóc, mọc tóc, có tính an thần, diệt khuẩn... (Fnimh, 2001)
Trong tự nhiên, hà thủ ô đỏ được nhân giống bằng cách giâm cành, trồng bằng
hạt (Đỗ Tất Lợi, 2005).Vấn đề gặp phải với phương pháp nhân giống truyền thống đối
cây hà thủ ô đỏ là khả năng nảy mầm hạt chậm, tỷ lệ sống thấp còn phương pháp giâm
cành tạo ra cây con có tuổi thọ ngắn. Theo Lin (2003), các cây hà thủ ô đỏ nguồn gốc
in vitro cho tỉ lệ các chất emodin và physcion cao hơn so với cây ngoài tự nhiên.
Từ những nhận định trên, được sự đồng ý của bộ môn Công nghệ sinh học Đại

học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh, tôi thực hiện đề tài: Phát sinh chồi từ lá cây hà thủ ô
đỏ (Polygonum multiflorum Thunb.).
1.2 Yêu cầu của đề tài
Xác định phương pháp khử trùng mẫu lá hiệu quả.
Theo dõi và ghi nhận sự xuất hiện mô sẹo và trọng lượng tươi mô sẹo.
Theo dõi số mẫu phát sinh chồi và số chồi tái sinh.
Theo dõi số chồi trong nhân cụm chồi.
Theo dõi số rễ và chiều dài rễ.
Theo dõi chiều cao và số lá phát triển khi trồng ngoài vườn ươm.
1.3 Nội dung thực hiện
Khảo sát ảnh hưởng nồng độ, thời gian sửdung javel lên quá trình khử trùng.
Khảo sát ảnh hưởng của cytokinin và auxin lên quá trình tạo sẹo.
Khảo sát ảnh hưởng của cytokinin, auxin lên quá trình tái sinh chồi.
Khảo sát ảnh hưởng của cytokinin và Auxin lên sự nhân cụm chồi.
Khảo sát ảnh hưởng của auxin lên quá trình tạo rễ.
Khảo sát ảnh hưởng của giá thể khi nuôi trồng cây ngoài vườn ươm.
1


Chƣơng 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Giới thiệu chung về hà thủ ô đỏ
2.1.1.Phân loại
Hà thủ ô đỏ (Polygonum multiflorum Thunb, đồng nghĩa: Fallopia multiflora)
Ngành (Division)

: Magnoliophyta

Lớp (Class) :Eudicots
Bộ (Ordo)

:Caryophyllales

Họ (Familia) :Polygonaceae
Chi (Genus) : Fallopia
Loài (Species): Fallopia multiflora
Tên gọi khác: Giao đằng, dạ hợp.
Hình 2.1: Hà thủ ô đỏ.
2.1.2. Đặc điểm hình thái
Hà thủ ô đỏ là cây dây leo, sống nhiều năm. Thân rễ phồng thành củ.Thân quấn,
mọc xoắn vào nhau, mặt ngoài thân có màu xanh tía, nhẵn, có vân. Lá mọc so le,
cuống dài. Phiến lá hình tim, dài 4-8cm, rộng 2,5-5cm, đầu nhọn, mép nguyên hoặc
hơi lượn sóng, cả hạị mặt đều nhẵn. Bẹ chìa mỏng, màu nâu nhạt, ôm lấy thân. Hoa tự
chùm nhiều nhánh. Hoa nhỏ, đường kính 2mm, mọc cách xa nhau ở kẽ những lá bắc
ngắn, mỏng. Bao hoa màu trắng, 8 nhụy (trong số đó có 3 nhụy hơi dài hơn). Bầu hoa
có 3 cạnh, 3 vòi ngắn rời nhau. Đầu nhụy hình mào gà rủ xuống. Quả 3 góc, nhẵn
bóng, đựng trong bao hoa còn lại, 3 bộ phận ngoài của bao hoa phát triển thành cánh
rộng, mỏng, nguyên. (Đỗ Tất Lợi, 2005).
2.1.3. Phân bố
Trên thế giới Hà thủ ô đỏ phân bố nhiều ở Trung Quốc, Ấn Độ, Đài Loan, bắc
Lào. Ở Việt Nam chúng phân bố ở vùng có điều kiện khí hậu ẩm mát: Hà Giang, Lai
Châu, Lào Cai, Sơn La, Hòa Bình, Thanh Hóa, Nghệ An…(Đỗ Tất Lợi, 2005).
2.2.5 Tác dụng dƣợc lý
Hà thủ ô có tác dụng hạ cholesterol huyết thanh, được chứng minh rõ trên mô
hình gây cholesterol cao ở thỏ nhà, thuốc còn có tác dụng làm giảm hấp thu cholesterol
của ruột thỏ, theo tác giả, thuốc có thành phần hữu hiệu kết hợp với cholesterol.Thuốc
2


có tác dụng phòng chống và giảm nhẹ xơ cứng động mạch.Tác dụng giảm xơ cứng
động mạch và do thuốc có thành phần Lecithin (Fnimh, 2001)

Thuốc làm chậm nhịp tim. Làm tăng nhẹ lưu lượng máu động mạch vành và
bảo vệ được cơ tim thiếu máu. Thuốc giữ được tuyến ức của chuột nhắt già không bị
teo mà giữ được mức như lúc chuột còn non, tác dụng này có ý nghĩa chống lão hóa
nhưng cơ chế còn cần nghiên cứu thêm. Thuốc có tác dụng nhuận tràng do dẫn chất
oxymethylanthraquinone làm tăng nhu động ruột. Hà thủ ô sống có tác dụng nhuận
tràng mạnh hơn hà thủ ô chín. (Trần Văn Kỳ, 2008)
Tác dụng kháng khuẩn và virus: thuốc có tác dụng ức chế đối với trực khuẩn
lao ở người và trực khuẩn lỵ Flexner. Thuốc có tác dụng ức chế virus cúm.
Ngoài ra sử dụng hà thủ ô đỏ lâu năm còn có tác dụng làm đen râu tóc đối với
người bạc tóc sớm, làm tóc đỡ khô và đỡ rụng (Đoàn Thị Nhu, 2011).
Thành phần hoá học: Thân rễ hà thủ ô chứa antranoid, trong đó có emodin,
chrysophanol, rhein, physcion, protid, tinh bột, lipid, lecitin, rhaponticin (rhapontin,
ponticin). 2,3,5,4 tetrahydroxytibene -2-O-b-D-glucoside. Tanin…(Fnimh, 2001)
2.2. Khái niệm nuôi cấy mô tế bào thực vật
Kỹ thuật nuôi cấy in vitro tế bào thực vật là quá trình điều khiển sự phát sinh
hình thái tế bào thực vật (khi nuôi cấy tách rời trong điều kiện nhân tạo vô trùng) một
cách có định hướng dựa vào tính toàn năng của tế bào thực vật (Trần Thị Dung,
2003).Kỹ thuật nuôi cấy mô bao gồm 3 bước cơ bản:
Tạo mẫu cấy in vitro vô trùng.
Tăng sinh số lượng tế bào có định hướng và tạo cây hoàn chỉnh.
Nuôi trồng thực nghiệm ngoài vườn ươm với điều kiện có kiểm soát.
2.1.5 Sự tạo mẫu cấy in vitro vô trùng
Môi trường để nuôi cấy mô và tế bào thực vật có chứa đường, muối khoáng,
vitamin…rất thích hợp cho các loại nấm và vi khuẩn phát triển. Do tốc độ phân bào
của nấm và vi khuẩn lớn hơn nhiều so với các tế bào thực vật, nếu trong môi trường
nuôi cấy bị nhiễm bào tử nấm hoặc vi khuẩn thì sau vài ngày sẽ phủ đầy vi khuẩn hoặc
nấm, khi đó mô nuôi cấy sẽ chết dần thí nghiệm phải bỏ đi.
Khử trùng mẫu cấy là việc làm khó vì mẫu sống không thể khử bằng nhiệt độ
cao mà phải giữ được bản chất sinh học của nó. Do đó mẫu cấy thực vật phải được khử
trùng bằng các dung dịch khử trùng. Các dung dịch khử trùng thường dùng là

3


hypoclorit calcium, hypoclorit sodium, chlorua thủy ngân, javel… Tỉ lệ vô trùng thành
công phụ thuộc thời gian khử trùng và nồng độ các chất khử trùng và khả năng xâm
nhập của chúng vào các kẽ lách lồi lõm trên bề mặt mô nuôi cấy, khả năng đẩy hết các
bọt khí bám trên bề mặt mô nuôi cấy. Các dung dịch dùng để khử trùng mẫu phải bảo
vệ được mô thực vật nhưng thời gian khử trùng phải đủ để tiêu diệt nguồn gây nhiễm
là nấm và vi khuẩn (Dương Công Kiên, 2002).
2.2.2. Sự tăng sinh tế bào có định hƣớng và tái sinh cây hoàn chỉnh
Mục đích của giai đoạn này là nuôi cấy một cách định hướng các mô, tế bào, cơ
quan sau khi được khử trùng tạo ra cây hoàn chỉnh gồm các bước: tái sinh mẫu nuôi
cấy thành chồi, nhân chồi, tạo cây hoàn chỉnh (Đặng Thị Thanh Thúy, 2006).
Tái sinh mẫu nuôi cấy thành chồi: là giai đoạn tái sinh nguồn mẫu vật liệu nuôi
cấy mô ban đầu như: đỉnh sinh trưởng, đốt thân, lá, hạt, tế bào đơn…một cách có định
hướng, phát sinh trực tiếp hoặc gián tiếp ra chồi. Quá trình này phụ thuộc vào đặc
điểm di truyền của mổi loài thực vật khác nhau mà lựa chọn phương pháp xử lý phù
hợp nhưng mục đích cuối cùng đều là tạo chồi. Các phương pháp xử lý được điều
khiển chủ yếu dựa vào tỷ lệ hai chất điều hòa sinh trưởng là auxin và cytokinin có thể
trực tiếp tạo thành chồi hoặc gián tiếp thông qua giai đoạn mô sẹo, phôi.
Nhân chồi: là giai đoạn then chốt của quá trình nuôi cấy mô vì quyết định năng
suất bởi hệ số nhân chồi. Hệ số nhân chồi là số chồi phát triển từ một chồi ban đầu sau
một thời gian nuôi cấy. Tùy thuộc vào từng đối tượng nuôi cấy, để tăng hệ số nhân
chồi, ta thường bổ sung vào môi trường dinh dưỡng các chất điều hòa sinh trưởng
(auxin, cytokinin, gibberellins), nước dừa, dịch chiết nấm men…
Tạo cây hoàn chỉnh: là giai đoạn phát sinh rễ cho chồi. Khi đạt được kích thước
nhất định, chồi sẽ được cấy sang môi trường tạo rễ và trở thành cây hoàn chỉnh. Ở gian
đoạn này, ta có thể bổ sung vào môi trường dinh dưỡng các chất điều hòa sinh trưởng
thuộc nhóm auxin là nhóm hormone thực vật có chức năng tạo rễ.
2.2.3. Nuôi trồng ngoài vƣờn ƣơm

Sau khi hình hành rễ, cây con sẽ được chuyển sang môi trường nuôi trồng ngoài
vườn ươm. Giai đoạn này bao gồm sự di chuyển từ đặc điểm dị dưỡng (cần cung cấp
đường) sang đặc điểm tự dưỡng (có khả năng quang hợp) và sự thích nghi của cây con
mới tái sinh với môi trường ngoài ống nghiệm. Giữ cho số cây con tiếp tục sinh trưởng

4


vô cùng quan trọng vì sự thích nghi với khí hậu và phát triển trong điều kiện tự dưỡng
là một sự thay đổi ngột có thể gây chết cây dẫn đến năng suất cả quá trình sẽ giảm.
Những chồi non trong nuôi cấy in vitro có hình thái rất đặc biệt. Kích thước lá
và số tế bào lá thấp hơn đáng kể so với cây ngoài tự nhiên. Do độ ẩm cao trong ống
nghiệm không phát triển lớp sáp bảo vệ với số lượng và chất lượng cần thiết. Kết quả
là lá in vitro trong nuôi cấy khô rất nhanh khi chuyển ra môi trường tự nhiên.
Xử lý vấn đề này bằng cách làm giảm từ từ độ ẩm trong môi trường nuôi cấy
mô dần dần đến mức độ ẩm môi trường nhà kính. (Mai Xuân Lương, 2005)
2.2.4. Auxin và Cytokinin (Davies, 1995)
2.2.4.1. Auxin
Đây là loại phytohocmon đầu tiên và quan trọng nhất trong cây được phát hiện
năm 1934. Con người đã tổng hợp được nhiều chất có bản chất rất khác nhau có hoạt
tính sinh lý tương tự như auxin tự nhiên quan trọng nhất của thực vật là indole-3-acetic
acid (IAA). Các auxin nhân tạo thường được sử dụng như: IBA; NAA; 2,4-D; 2,4,5-T.
Các dạng auxin trong cây:
Auxin tự do: là dạng có hoạt tính sinh học. Chúng tồn tại chủ yếu ở đỉnh ngọn
giảm dần nồng độ ở chồi bên đến đầu rễ và các cơ quan còn non. Càng xa đỉnh sinh
trưởng nồng độ auxin tự do càng giảm dần.
Auxin liên kết: là dạng auxin chủ yếu trong cây. Hàm lượng có thể lên đến 90%
lượng auxin có trong cây. IAA có thể liên kết với rất nhiều các hợp chất nên chúng
không có hoạt tính sinh học hoặc có nhưng rất thấp. Nó có thể liên kết với các đường,
với các axit amin và amit tạo nên auxin liên kết như: IAA-glucosid; IAA-glucan; indol

axetatamit …Chức năng auxin liên kết: Là nguồn dự trữ auxin cho cây, liên kết các
đường, axit amin và các chất khác làm tăng độ bền cho auxin.
Sự biến đổi thuận nghịch của IAA tự do và IAA liên kết bị ảnh hưởng dưới tác
nhân kích thích của môi trường, góp phần điều khiển sự cân bằng auxin trong cây và
do đó điều chỉnh quá trình sinh trưởng của cây.
Sự vận chuyển auxin trong cây:
Auxin được tổng hợp ở đỉnh ngọn và được vận chuyển xuống các cơ quan phía
dưới với tốc độ vận chuyển khoảng 1cm/giờ ở rễ và thân.
Sự tổng hợp auxin trong cây:

5


Cơ quan tổng hợp auxin là đỉnh sinh trưởng ngọn. Sau đó auxin được vận
chuyển xuống phía dưới. Ngoài ra còn có 1 lượng ít auxin được tổng hợp ở: lá non,
chồi non, quả đang lớn, rễ non. Chất tiền thân tổng hợp auxin là amin tryptophan.
Sự phân hủy auxin:
Sự phân hủy auxin xảy ra khi có sự dư thừa do tổng hợp quá nhiều auxin trong
cây bằng con đường oxi hóa bằng enzym IAA-oxidaza có nhiều ở rễ, ngoài ra sự mất
hoạt tính của auxin do ánh sáng tử ngoại.
Ảnh hưỡng sinh lý của auxin đối với thực vật:
Sự phát triển phôi (development of embryo).
Sự hình thành lá (leaf formation).
Hướng động ánh sáng (phototropism).
Hướng động với lực hút của trái đất (gravitropism).
Hiện tượng ưu thế ngọn(apical dominace).
Sự phát triển trái (fruit development).
Sự rụng lá và trái (abscission).
Kích hoạt tạo và phát triển rể (root initiation and development).
Hiệu ứng tránh bóng (the shade-avoidance effect).

2.2.4.2. Cytokinin
Là loại phytohormon quan trọng và xuất hiện trong tất cả các loài thực vật trên
thế giới. Một số cytokinin quan trọng: Adenin, Kinetin, Zeatin riboside, Isopentenyl
adenosine (IPA), Benzyl adenine, Zeatin.
Các dạng cytokinin:
Cytokinin có thể tồn tại dưới dạng tự do có hoạt tính sinh học và dạng liên kết
có hoạt tính hay có hoạt tính yếu hơn và chúng cũng có thế chuyển hóa thuận nghịch
cho nhau. Chúng có thể liên kết với các đường để tạo nên các glucosid. Ngoài ra
cytokinin có mặt trong ARNvận chuyển cho: xerin, phenyl alanin…
Cytokinin có thể bị phân hủy sau khi biểu hiện hoạt tính của mình cũng như cần
thiết phải giảm nồng độ trong cây khi hàm lượng của chúng quá cao. Sự phân hủy chủ
yếu nhờ hệ thống enzym đặc hiệu và sản phẩm cuối cùng là urê.
Sự tổng hợp cytokinin:Cơ quan tổng hợp cytokinin trong cây là hệ thống rễ. Từ
rễ, cytokinin được vận chuyển lên các bộ phận trên mặt đất.
Ảnh hưỡng sinh lý của cytokinin đến thực vật:
6


Cytokinin và sự phân chia tế bào: Hiệu quả đặc trưng của cytokinin là hoạt hóa
sự phân chia tế bào (stilmulate cell division).
Cytokinin và sự giãn của tế bào: Khi có sự tác động tương hỗ với IAA và GA
thì cytokinin có khả năng làm tăng kích thước tế bào (cell enlargement).
Cytokinin có vai trò rất quan trọng trong sự phân hóa chồi và điều chỉnh ưu thế
ngọn, cytokinin giải phóng chồi bên khỏi trạng thái ức chế của chồi ngọn (Stimulates
the growth of lateral buds-release of apical dominance).
Kích thích tạo chồi (shoot initiation/bud formation).
Có thể tăng sự mở khí khổng ở một số loài (enhance stomatal opening).
Thúc đẩy sự chuyển hóa lạp thể ớm (etioplast) thành lục lạp.
Cytokinin cũng ảnh hưởng lên sự nảy mầm của hạt, trong một số trường hợp
nhất định cytokinin có tác dụng kích thích sự nảy mầm, phá sự ngủ nghỉ như GA.

2.
Hình2.2 Mô tả sự ảnh hưởng của cytokinin va auxin lên tế bào thực vật nuôi cấy của
Mauseth 1995.
2.2.5. Môi trƣờng dinh dƣỡng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật
Sự thành công hay thất bại nuôi cấy mô tế bào thực vật phụ thuộc nhiều vào
thành phần môi trường nuôi cấy có hoặc không có hormone thực vật.
Các môi trường khoáng cơ bản được sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy là MS
(Murashige và Skoog,1962), B5 (Gamborg cs. 1968), hoặc White (1963).
7


2.2.5.1. Các chất khoáng
Đối với cây trồng, các chất vô cơ đóng vai trò rất quan trọng.Ví dụ, Mg là một
phần của phân tử diệp lục, Ca là thành phần của màng tế bào, N là thành phần quan
trọng của amino acid, vitamin, protein và các acid nucleic.
Các môi trường khác nhau có hàm lượng và thành phần các chất khoáng khác
nhau, ví dụ thành phần và nồng độ khoáng của môi trường White hoặc Knop khá
nghèo nàn, nhưng lại rất giàu ở môi trường MS và B5.
Muối khoáng là thành phần không thể thiếu trong các môi trường nuôi cấy mô
và tế bào thực vật. Nitơ, lưu huỳnh, phospho là các thành phần không thể thiếu của các
phân tử protein, các acid nucleic và nhiều chất hữu cơ khác.Canxi và acid boric được
tìm thấy chủ yếu ở thành tế bào, đặc biệt là canxi có nhiệm vụ quan trọng giúp ổn định
màng sinh học. Muối khoáng còn đóng vai trò quan trọng ổn định áp suất thẩm thấu
của môi trường và tế bào, duy trì thế điện hoá của thực vật. (Mai Xuân Lương, 2005)
Trong môi trường, các muối khoáng chia thành nhóm vi lượng và đa lượng:
- Các nguyên tố đa lượng gồm 6 nguyên tố: Mg, Ca, P, S, N và K.
- Các nguyên tố vi lượng gồm: Fe, Mn, Zn, Cu, Mo, Co, B, I, Ni, Cl, Al.
Nhu cầu của cây đối với các nguyên tố vi lượng là rất thấp. Do vậy những
nguyên tố này cũng có mặt trong môi trường ở các nồng độ tương ứng. Một số các

nguyên tố vi lượng có nhu cầu nhỏ hơn có thể thay thế dễ dàng bằng sự lẫn tạp ngẫu
nhiên của chúng trong các thành phần của môi trường như: agar, các chất bổ sung như
nước dừa, các muối và nước. Hầu hết các nguyên tố vi lượng chỉ có phần khoáng của
muối (cation) là quan trọng, còn vai trò của các anion có thể là không cần thiết. Ion
SO4 dư thừa trong môi trường và chủ yếu phát sinh từ các muối MgSO4, K2SO4.
Nhu cầu của thực vật đối với các nguyên tố đa lượng lớn hơn. Nguyên tố đa
lượng có nồng độ cao nhất trong các môi trường nuôi cấy mô và tế bào thực vật. Nhìn
chung cả phần anion và cation của các nguyên tố đa lượng đều quan trọng đối với tế
bào thực vật. Ví dụ như KNO3, cả K+ và NO3 là cần thiết trong nhóm các nguyên tố
đa lượng, các muối có chứa nitơ chủ yếu ở dạng kali nitrat, amonium hoặc calxi nitrat.
2.2.5.2. Nguồn carbon (C)
Đường sucrose (saccharose) là nguồn carbon chủ yếu và được sử dụng trong
hầu hết các môi trường nuôi cấy mô, kể cả khi mẫu nuôi cấy là các chồi xanh có khả
năng quang hợp. Khi hấp khử trùng, đường sucrose bị thuỷ phân một phần, thuận lợi
8


hơn cho cây hấp thụ. Trong một số trường hợp, như nuôi cấy mô cây một lá mầm,
đường glucose tỏ ra tốt hơn so với sucrose. Mô thực vật có khả năng hấp thu một số
đường khác như maltose, galatose, lactose, mannose, thậm chí tinh bột, nhưng các loài
đường này hầu như rất ít được sử dụng trong nuôi cấy tế bào và mô thực vật.
2.2.5.3. Các vitamin
Tất cả các tế bào được nuôi cấy đều có khả năng tổng hợp tất cả các loại
vitamin cơ bản nhưng thường là với số lượng dưới mức yêu cầu. Để mô có sức sinh
trưởng tốt phải bổ sung thêm vào môi trường một hay nhiều loại vitamin.
Các vitamin sau đây được sử dụng phổ biến: inositol, thiamine HCl (B1),
pyridoxin HCl (B6), nicotinic acid, trong đó vitamin B1 là không thể thiếu và được sử
dụng trong hầu hết những môi trường nuôi cấy mô và tế bào thực vật. Linsmaier và
Skoog đã khẳng định vitamin B1 là cần thiết cho sự sinh trưởng của cây sau khi
nghiên cứu kỹ lưỡng về sự có mặt của nó trong môi trường MS. Các tác giả khác cũng

khẳng định vai trò rất quan trọng của B1 trong nuôi cấy mô. Inositol thường được nói
đến như là một vitamin kích thích một cách tích cực đối với sự sinh trưởng và phát
triển của thực vật, mặc dù nó không phải là vitamin cần thiết trong mọi trường hợp.
Các vitamin khác, đặc biệt là nicotinic acid (vitamin B3), canxi pantothenate (vitamin
B6) và biotin cũng được sử dụng để nâng cao sức sinh trưởng của mô nuôi cấy.
Vitamin ảnh hưởng lên sự phát triển của tế bào nuôi cấy in vitro ở các loài khác
nhau là khác nhau hoặc thậm chí còn có hại (gây độc). (Mai Xuân Lương, 2005)
2.2.5.4.Các điều kiện vật lý trong nuôi cấy mô tế bào thực vật
Ánh sáng: cần thiết cho sự phát sinh hình thái của mô cấy. Trong tạo chồi ban
đầu và nhân chồi tiếp theo, cường độ ánh sáng chỉ cần trong khoảng 1000 lux. Nhưng
trong giai đoạn tạo rễ, cây cần chiếu sáng ở cường độ cao từ 3000 - 10000 lux để kích
thích cây chuyển từ giai đoạn dị dưỡng sang tự dưỡng có khả năng quang hợp. Có
nhiều nghiên cứu về nguồn ánh sáng nhân tạo mới trong hệ thống nuôi cấy in vitro đã
chỉ ra nguồn ánh sáng và cường độ ánh sáng thích hợp cho cây in vitro phát triển tốt.
Kết quả sau 3 tuần nuôi cấy và 6 tuần tập cho cây con quen với điều kiện trong
nhà lưới đã cho thấy cây in vitro được nuôi cấy với hệ thống đèn Compact 3U thì có
biểu hiện sinh trưởng và phát triển tốt hơn so với cây dưới hệ thống đèn neon (Dương
Tấn Nhựt, Mai Thị Ngọc Hương, 2006). Bên cạnh đó, việc thay thế đèn Neon bằng

9


đèn Compact 3U trong phòng nuôi cấy mô đã giảm giá thành cây giống và chi phí sản
xuất đồng thời tiết kiệm được điện năng.
Ngoài ra, để mô cấy phát triển tốt thì môi trường nuôi cấy phải thông thoáng và
có nhiệt độ thích hợp, nhiệt độ trong phòng nuôi cấy thường giữ ở 25 – 280 C.
Độ pH môi trường: pH của môi trường thường ở khoảng 5,7 - 5,8. pH thấp hơn
4,5 hoặc cao hơn 7 đều ức chế sự phát triển của mô (Nguyễn Văn Uyển, 1993).
Agar: Đối với nuôi cấy tĩnh, nếu sử dụng môi trường lỏng, mô có thể bị chìm
và sẽchết vì thiếu oxy. Để tránh tình trạng này, môi trường nuôi cấy được làm đặc lại

bằng agar, một loại tinh bột được chế biến từ rong biển và mô được cấy trên bề mặt
của môi trường. Agar thường được sử dụng ở nồng độ 0,6 - 1%.
2.2.6. Những vấn đề trong nuôi cấy mô
2.2.6.1. Sự tạp nhiễm
Nhiễm là vấn đề rất được quan tâm và dễ xảy ra trong nuôi cấy mô thực vật,
gây ảnh huởng nghiêm trọng đến hiệu suất nuôi cấy. Một số nguồn gây tạp nhiễm như
từ mẫu cấy, thao tác trong quá trình cấy, từ môi trường, dụng cụ và các máy móc thiết
bị như màng lọc của tủ cấy, hệ thống thông khí trong phòng cấy.
Môi trường không khí phòng sáng, phòng cấy gây nhiễm nghiêm trọng nếu
không được xử lý kịp thời, nấm thường là nguyên nhân gây nhiễm chính trong trường
hợp này. Nấm thường tồn tại dạng bào tử lơ lửng trong không khí, khi phòng nuôi có
nhiều người ra vào tạo điều kiện tích lũy vi sinh vật càng nhiều.
Nếu màng lọc tủ cấy không tốt sẽ gây nhiễm mẫu hàng loạt ngay trong quá
trình cấy.Ngoài ra, bào tử nấm còn tấn công gây nhiễm những chai môi trường chưa sử
dụng hoặc những bình đã được nuôi 2 - 3 tháng. Các loài nấm thường
gặp: Aspergillus, Candida, Cladosporium, Microsprium và Phialophra.
2.2.6.2. Tính bất định về mặt di truyền
Kỹ thuật nhân giống vô tính áp dụng với mục đích tạo quần thể cây trồng đồng
nhất với số lượng lớn nhưng phương pháp cũng tạo những biến dị tế bào qua nuôi cấy
mô sẹo.Những biến dị này là cơ sở nghiên cứu ứng dụng vào cải thiện giống cây trồng
có rất ít biến dị có lợi được báo cáo.Tần số biến dị thì hoàn toàn khác nhau và không
lặp lại (Creissen và Karp 1985; Fish và Karp 1986). Nuôi cấy mô sẹo cho biến dị nhiều
hơn nuôi cấy chồi đỉnh. Đến nay việc gây ra biến dị chưa được làm sáng tỏ nhưng
được đồng ý nhất là do thay đổi vị trí DNA. Nhân tố thường gây ra biến dị tế bào là số
10


lần cấy chuyền. Số lần cấy chuyền càng nhiều càng cho độ biến dị cao. Biến dị nhiễm
sắc thể nhiều hơn khi nuôi cấy kéo dài (Amstrong và Phillips, 1988).Số lần cấy chuyền
ít và thời gian giữa hai lần cấy chuyền ngắn làm giảm sự biến dị.

2.2.6.3. Sự phát sinh các chất độc trong quá trình nuôi cấy
Trong quá trình nuôi cấy mô, hiện tượng hóa nâu hay hoá đen mẫu thường làm
sinh trưởng của mẫu bị ngăn chặn hay hư mẫu. Hiện tượng này là do mẫu nuôi cấy có
chứa các hợp chất Tannin và Hydroxyphenol, có nhiều trong mô già hơn trong mô
non. Có vài phương pháp làm giảm sự hóa nâu mẫu:
Than hoạt tính đưa vào môi trường giúp ngăn cản quá trình hóa nâu hay đen,
đặc biệt có hiệu quả trên các loài phong lan Phalaenopsis, Cattleya và Aeridesvới
nồng độ thường dùng 0,1-0,3%. Tuy nhiên than hoạt tính cũng làm chậm quá trình
phát triển của mô do hấp thu các chất kích thích tăng trưởng và các chất khác.
Polyvinylpyrolidone (PVP), một chất thuộc loại polyamide hấp thu phenol qua
vòng hydrogen ngăn chặn sự hóa nâu ở nhiều loại cây trồng khác nhau.
Giảm sự hóa nâu bằng cách cho các chất khử quá trình oxy hóa vào môi trường
ngăn chặn quá trình oxy hóa phenol, chất khử thường được dùng như ascorbic acid,
citric acid, L-cystein hydrochloride, ditheithreitol, glutathione và mecaptoethanol.
Để hạn chế ảnh hưởng phenol cómột số kỹ thuật khi thao tác trên mẫu:
-Sử dụng mẫu nuôi cấy nhỏ từ mô non.
-Gây vết thương trên mẫu nhỏ nhất khi khử trùng.
-Ngâm mẫu vào dung dịch ascorbic acid, citric acid vài giờ trước khi cấy.
-Nuôi cấy mẫu trong môi trường lỏng, oxy thấp, không có đèn 1-2 tuần.
2.2.6.4. Hiện tƣợng thủy tinh thể
Trong nuôi cấy mô cũng thường gặp hiện tượng thủy tinh thể mẫu nuôi cấy.
Khi chuyển ra khỏi bình nuôi cấy, cây con dễ bị mất nước và tỷ lệ sống sót thấp. Dạng
này thường thấy khi nuôi cấy trên môi trường lỏng hay môi trường bán rắn, đặc biệt
khi sự trao đổi khí thấp, quá trình thoát hơi nước tập trung trong cây.
Để hạn chế quá trình thủy tinh thể, ta sẽ sử dụng phương pháp: làm giảm ảnh
hưởng của hàm lượng nước trong môi trường nuôi cấy, tăng nồng độ đường và tạo
điều kiện môi trường nuôi (nhiệt độ, ánh sáng, trao đổi khí) thích hợp.

11

2.3. Sự tạo sẹo từ mẫu lá và tái sinh chồi từ sẹo
2.3.1. Cấu tạo của lá

Hình 2.3 Cấu tạo của lá
Khi vô mẫu lá từ tự nhiên được cắt 4 cạnh để cảm ứng với auxin và cytokinin.
Lá khi được cấy vào môi trường chứa auxin và cytokinin được đặt úp xuống
(mặt chứa khí khổng ở trên) nuôi cấy trong điều kiện tối. Dưới tác dụng auxin và
cytokinin, tế bào lá sẽ phản phân hóa và cho ra khối tế bào không tổ chức (mô sẹo).
2.3.2. Khái niệm về mô sẹo (callus)
Mô sẹo là một khối tế bào không tổ chức, hình thành từ các mô hoặc cơ quan đã
phân hóa dưới điều kiện đặc biệt. Các tế bào thuộc các mô hoặc cơ quan đã phân hóa
của các cây song tử diệp thường phản phân hóa dưới tác động của auxin và cytokinin
cho ra mô sẹo. Mô sẹo được tạo ra ngoài nguyên nhân do các tế bào nhu mô chịu sự
phản phân hóa còn do sự phân chia các tế bào thượng tầng, sự xáo trộn trong các mô
phân sinh sơ khởi hay sự xáo trộn trong quá trình tạo cơ quan (Bùi Trang Việt, 2000).
2.3.3. Sự phát sinh chồi từ mô sẹo

12


Quá trình hình thành cơ quan trong mô xảy ra qua 2 giai đoạn: Giai đoạn thứ
nhất là tái phân hóa hình thành mô sẹo. Giai đoạn thứ 2 hình thành thành các mầm
mống cơ quan, tế bào có hiện tượng tổng hợp DNA và protein xảy ra mạnh, hàm lượng
đường tăng, các mô sẹo không có tổ chức hình thành các cấu trúc hình thái dẫn đến
việc tạo chồi, rễ. Quá trình phân hóa này được thực hiện bằng cách bổ sung các chất
điều hòa sinh trưởng auxin và cytokinin. Trong đó cytokinin có đặc tính sinh lý kích
thích tạo chồi nên thường được sử dụng riêng lẽ hoặc có thể kết hợp với auxin nồng độ
thấp hơn để bổ sung vào môi trường cấy chuyền sẹo. (Mai Xuân Hương, 2005).
Khả năng tạo chồi cũng bị ảnh hưỡng bởi tính chất của mô sẹo. Loại mô sẹo

cho khả năng tái sinh cơ quan tốt là mô sẹo cứng, nhân to, tế bào chất đậm đặc, không
bào nhỏ (Vũ Văn Vụ, 1999). Ngoài ra, khi mô sẹo cấy chuyền nhiều lần sẽ làm giảm
xu thế tạo cơ quan vì cấy chuyền nhiều lần mô sẹo hình thành các tế bào đa bội, lệch
bội và có thể mất các yếu tố di truyền.
2.4. Các công trình nghiên cứu liên quan
Trên thế giới, năm 2003 Li Chang Lin và cộng tác viên đã xây dựng một quy
trình nhân giống hà thủ ô đỏ và đánh giá hàm lượng emodin và physcion trong cây
được nhân giống với cây trồng tự nhiên. Đây là nghiên cứu có giá trị quan trọng đối
với các công ty dược muốn chiết xuất hai chất này cho mục đích thương mại.
Ở trong nước, năm 2004 Trần Thị Liên đã nghiên cứu quy trình nhân giống cây
hà thủ ô đỏ bằng kỹ thuật in vitro và tiếp đó là các công trình nghiên cứu liên quan
như: sự phát sinh phôi soma từ mô sẹo lá cây hà thủ ô đỏ của Huỳnh Thị Đan San và
Võ Thị Bạch Mai vào năm 2009. Ngoài ra các nghiên cứu trong nước khác cũng
nghiên cứu về về nhân giống in vitro của Trần Thị Kim Thu năm 2008 hay Hoàng Thị
Kim Hồng vào năm 2011. Tất cả nghiên cứu trên đều có đóng góp quan trọng cho việc
nhân nhanh cây hà thủ ô đỏ cho mục đích thương mại, bảo tồn cây hà thủ ô đỏ.

13


Chƣơng 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
3.1. Thời gian và địa điểm
Thí nghiệm đuợc thực hiện từ tháng 1- 2012 đến tháng 7- 2012 tại Trung tâm
ứng dụng Công nghệ sinh học Sở khoa học công nghệ tỉnh Đồng Nai.
3.2. Vật liệu
Mẫu nuôi cấy được lấy tại vườn của Trung tâm ứng dụng Công nghệ sinh học Sở
khoa học công nghệ Đồng Nai.
3.2.1. Trang thiết bị và dụng cụ
Các thiết bị sử dụng bao gồm: Nồi hấp khử trùng, tủ cấy, máy cất nước, máy đo
pH, cân tiểu ly, máy lạnh, máy điều hòa, máy lắc.

Dụng cụ sử dụng: Chai thủy tinh, ống nghiệm, ben, kẹp, đèn cồn, pipet, ống
đong, ống hút, bình tam giác, cốc thủy tinh, đũa khuấy.
Ngoài ra để có một cơ sở nuôi cấy mô hoàn chỉnh cần có các phòng riêng biệt:
Hệ thống phòng cấy là phòng nuôi cấy có kiểm sóat luồng không khí, không để
sự tạp nhiễm xảy ra. Phòng phải kín và trang bị máy lạnh để tránh nhiệt độ nóng ảnh
huỡng đến năng suất làm việc của con người.
Hệ thống phòng nuôi: là hệ thống phòng có kểm soát nhiệt độ và độ chiếu sáng
ổn định, và có nhiều kệ để tăng diện tích. Ánh sáng đuợc kiểm soát theo quang kì của
cây và tắt theo hệ thống điện tự động.
Hệ thống phòng rữa chai lọ cách biệt là hệ thống phòng dùng để rữa chai lọ và
pha môi truờng và làm các việc lặt vặt. Do công việc pha môi truờng thuờng làm
vuơng vãi dung dịch dinh duỡng nên nồng độ vi sinh vật trong không khí rất cao, cần
được lau chùi, khử trùng thường xuyên.
Hệ thống nhà kính sẽ đuợc giảm cuờng độ ánh sáng bằng luới lan và cách ly
côn trùng, sâu hại, và được trang bị hệ thống tưới phun sương.
3.2.2. Dung dịch khử trùng mẫu và môi trƣờng cấy
Dung dịch khử trùng mẫu: Cồn 700, javel, thuốc diệt nấm, kháng sinh.
Môi trường nuôi cấy cơ bản là môi trường MS của Murashige và Skoog (1962).
Các chất điều hòa sinh trưởng Auxin và Cytokinin.
3.3. Nội dung nghiên cứu
Khảo sát ảnh hưởng nồng độ, thời gian sử dung của javel lên quá trình khử trùng.
14


Khảo sát ảnh hưởng của cytokinin và auxin lên quá trình tạo sẹo.
Khảo sát ảnh hưởng của cytokinin, auxin lên quá trình tái sinh chồi.
Khảo sát ảnh hưởng của cytokinin và Auxin lên sự nhân cụm chồi.
Khảo sát ảnh hưởng của auxin lên quá trình tạo rễ.
Khảo sát ảnh hưởng của giá thể khi nuôi trồng cây ngoài vườn ươm.
3.4. Phƣơng pháp

3.4.1. Quy trình khử trùng mẫu lá
Thí nghiệm khử trùng mẫu lá sẽ được xây dựng từ một quy trình khử trùngdo
Trung tâm ứng dụng Công nghệ sinh học Đồng Nai cung cấp.
Mẫu sau khi lấy tại vườn của trung tâm được rửa với xà phòng và nước sạch
trước khi đưa vào tủ cấy với các bước khử trùng tiếp theo:
Lắc thuốc diệt
nấm 30 phút

Lắc kháng
sinh 1 giờ

Lắc javel

Lắc cồn 70o 1
phút

Hình 3.1 Quy trình khử trùng (Thuốc diệt nấm 10 ml/l; kháng sinh 500mg/l)
Để tối ưu hóa quy trình mẫu lá sẽ được khử trùng với các nồng độ javel và thời
gian thay đổi như bảng 3.1
Bảng 3.1 Nghiệm thức khảo sát ảnh hưởng của nồng độ và thời gian khử trùng
javel đến tỷ lệ sống của mẫu lá hà thủ ô đỏ
Nghiệm thức

Nồng độ javel

Thời gian khử trùng
(phút):

NT1

20%

5

NT2

20%

10

NT3

20%

15

NT4

25%

10

NT5

25%

15

Thời gian khử trùng với cồn và kháng sinh, thuốc diệt nấm là không thay đổi.
Số nghiệm thức: 5, số mẫu: 750,

Chỉ tiêu theo dõi: Số mẫu sống trên tổng số mẫu.
Thí nghiệm 2 yếu tố được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên gồm 5 nghiệm
thức với 3 lần lặp lại.
15