NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT βGLUCAN TỪ BÃ MEN BIA VÀ CHẾ TẠO OLIGOβGLUCAN BẰNG PHƢƠNG PHÁP CHIẾU XẠ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT β-GLUCAN TỪ BÃ MEN BIA
VÀ CHẾ TẠO OLIGO-β-GLUCAN BẰNG
PHƢƠNG PHÁP CHIẾU XẠ

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Sinh viên thực hiện: VÕ THỊ MỸ LỢI
Niên khóa: 2008 – 2012

Tháng 07/2012


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT β-GLUCAN TỪ BÃ MEN BIA
VÀ CHẾ TẠO OLIGO-β-GLUCAN BẰNG
PHƢƠNG PHÁP CHIẾU XẠ

Hƣớng dẫn khoa học

Sinh viên thực hiện

TS. LÊ QUANG LUÂN

VÕ THỊ MỸ LỢI

Tháng 07/2012


LỜI CẢM ƠN
Sau hơn 6 tháng thực tập tại phòng Sinh học, Trung tâm Hạt nhân Tp. Hồ Chí
Minh, tôi nhận thấy mình trƣởng thành rất nhiều. Tôi có thể tự tin về vốn kiến thức đã
đƣợc củng cố, khả năng thực hành đƣợc nâng cao. Ngoài sự cố gắng, nỗ lực của bản
thân, tôi còn nhận đƣợc sự quan tâm, giúp đỡ từ nhiều phía. Tôi xin gửi lời cảm ơn
chân thành đến:
Ba mẹ - ngƣời đã sinh thành và nuôi dƣỡng con cho đến hôm nay. Cảm ơn ba
mẹ luôn yêu thƣơng và động viên để con có thêm niềm tin, nghị lực vƣợt qua những
thời điểm khó khăn trong cuộc sống.
Thầy Lê Đình Đôn - trƣởng bộ môn Công nghệ Sinh học cùng các thầy cô đã
hết lòng dạy dỗ, truyền đạt cho chúng em không chỉ là kiến thức mà còn là những kinh
nghiệm sống quý báu.
Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến thầy Lê Quang Luân. Cảm ơn thầy đã nhận
và tạo điều kiện cho em hoàn thành khóa luận của mình. Cảm ơn thầy đã luôn tận tình
giúp đỡ, chỉ bảo và truyền đạt cho em kiến thức, kinh nghiệm quý báu trong quá trình
thực tập tại trung tâm.
Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám đốc và nhân viên Công ty Cổ phần Sài
Gòn Thủy Canh đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em trong thời gian thực tập tại
công ty.
Đặc biệt em xin gửi lời cảm ơn đến chị Uyên, chị Trang, chị Hạnh đã giúp đỡ
và chia sẻ cho em những kinh nghiệm hay trong quá trình thực tập.
Cuối cùng, tôi xin cảm ơn tất cả những ngƣời bạn mà tôi yêu thƣơng đã luôn
giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian làm đề tài.
Tp. Hồ Chí Minh, ngày 10 tháng 7 năm 2012
Võ Thị Mỹ Lợi

i


TÓM TẮT
Bã men bia chứa một lƣợng lớn chất rắn thô là tế bào nấm men S. cerevisiae.
Thành tế bào nấm men S. cerevisiae đƣợc cấu thành chủ yếu từ β-glucan – hợp chất có
khả năng điều hòa miễn dịch không đặc hiệu và kháng khối u mạnh. Đề tài đƣợc thực
hiện với mục đích tách chiết β-glucan từ nguồn phế thải bã men bia để tạo chế phẩm
tăng trƣởng thực vật oligo-β-glucan bằng phƣơng pháp chiếu xạ nhằm gia tăng hiệu
quả kinh tế của nguồn nấm men phế thải và bƣớc đầu thử nghiệm hiệu ứng tăng trƣởng
trên rau thủy canh.
β-glucan thu đƣợc sau khi xử lý thành tế bào nấm men với NaOH nồng độ 3%,
tỉ lệ mẫu/ dung môi là 1/5, tại 900C trong 9 giờ có hàm lƣợng protein thấp, khoảng
1,4% và hiệu suất thu nhận là 16,13%. β-glucan tách chiết từ thành tế bào nấm men
đƣợc chiếu xạ bằng tia gamma Co-60 ở các liều 100, 150, 200, 250 và 300 kGy dƣới
dạng hỗn hợp huyền phù 10, 15 và 20%. Chế phẩm oligo-β-glucan đƣợc chế tạo từ hỗn
hợp β-glucan 10% sau chiếu xạ có hàm lƣợng β-glucan tan lên đến 41,36% (liều 300
kGy) và có khối lƣợng phân tử khoảng 3,51 - 9,38 kDa.
Chế phẩm oligo-β-glucan đƣợc chế tạo ở liều xạ 250 kGy có khối lƣợng phân
tử khoảng 4,5 kDa cho hiệu ứng tăng trƣởng thích hợp nhất đối với cây rau cải bẹ
xanh, xà lách Nato và cải dún. Nồng độ của chế phẩm xác định tối ƣu cho hiệu ứng
tăng trƣởng của cải bẹ xanh là 75ppm.
Chế phẩm oligo-β-glucan chế tạo đƣợc hứa hẹn là chất tăng trƣởng thực vật an
toàn, hiệu quả cao và có tiềm năng ứng dụng trong nông nghiệp công nghệ cao để sản
xuất rau quả và nông phẩm sạch.

ii

SUMMARY
VO THI MY LOI, July 2012, Nong Lam University, Ho Chi Minh City.
“STUDY ON THE EXTRACTION OF β-GLUCAN FROM BREWER’S YEAST
SLUGE AND OLIGO-β-GLUCAN PREPARATION BY RADIATION METHOD”
SUPERVISIORS: DR. LE QUANG LUAN
The study was carried out at Biological Department, Center for Nuclear
Technique, Ho Chi Minh City
The discard waste from beer production industry contents a large amount of
S.cerevisiae cells in its dried matter content. The cell wall is conducted mainly by βglucan, a compound has ability of non-specific immunomodulatory and strong antitumor. The aim of this study is to extract β-glucan from the discard waste of beer
production industry for preparation of plant growth promoter oligo β-glucan in order to
increase the economic efficiency of the discard waste of beer production industry and
initially test the plant growth promotion effect of oligo-β-glucan on vegetables grown
in hydroponics system.
About 16,13% of β-glucan with low protein content (~1.4%) was obtained by
treated the mixture including 1 part yeast cell walls per 5 part of 3% NaOH solution at
90oC for 9 hours. The extracted β-glucan was irradiated by gamma-rays from a Co-60
source at doses of 100, 150, 200, 250 and 300 kGy in paste condition of 10, 15 and
20% β-glucan. The β-glucan prepared by irradiation of the mixture of 10% β-glucan
has 41,36 water soluble content (at irradiation dose of 300 kGy) and the molecular
weights of oligo-β-glucan were determined from 3,51 to 9,38 kDa.
The oligo-β-glucan with Mw ~ 4,5 kDa prepared at the dose of 250 kGy
displayed a high promotion effect on the growth of Brassica juncea var. rugosa,
Brassica oleracea var. sabauda and Lactuca sativa spp. The concentration of oligoβ-glucan were determined at 75 ppm for Brassica juncea var. rugosa.
The oligo-β-glucan prepared by radiation techniques showed as a promising,
safety and high effective plant growth promoter. This product has good potential for
application in high-technological agriculture for production of clean vegetables and
agro-products
Keywords: β-glucan, oligo-β-glucan, extraction, hydroponics, radiation.
iii

MỤC LỤC
Trang
Lời cảm ơn ........................................................................................................................ i
Tóm tắt ............................................................................................................................. ii
Summary......................................................................................................................... iii
Mục lục ........................................................................................................................... iv
Danh sách các chữ viết tắt ............................................................................................ viii
Danh sách các bảng ........................................................................................................ ix
Danh sách các hình .......................................................................................................... x
Chƣơng 1 MỞ ĐẦU ........................................................................................................ 1
1.1. Đặt vấn đề ................................................................................................................. 1
1.2. Yêu cầu của đề tài..................................................................................................... 2
1.3. Nội dung thực hiện ................................................................................................... 2
Chƣơng 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................... 3
2.1. Giới thiệu về β-glucan .............................................................................................. 3
2.1.1. Nguồn thu nhận β-glucan ...................................................................................... 3
2.1.1.1. Nguồn thu nhận chung ................................................................................ 3
2.1.1.2. Thành tế bào nấm men S. cerevisiae ........................................................... 3
2.1.2. Cấu trúc của β-glucan ............................................................................................ 4
2.1.3. Hoạt tính của β-glucan........................................................................................... 5
2.1.4. Ứng dụng của β-glucan ......................................................................................... 8
2.2. Giới thiệu về bã men bia......................................................................................... 10
2.2.1. Tình hình sản xuất bia ở Việt Nam...................................................................... 10
2.2.2. Bã men bia ........................................................................................................... 10
2.3. Phƣơng pháp tách chiết β-glucan ........................................................................... 11
iv


2.3.1. Phƣơng pháp phá vỡ tế bào ................................................................................. 11

2.3.1.1. Phƣơng pháp vật lý ................................................................................... 11
2.3.1.2. Phƣơng pháp hóa học ............................................................................... 12
2.3.1.3. Phƣơng pháp sinh học .............................................................................. 13
2.3.2 Phƣơng pháp tách chiết β-glucan từ thành tế bào nấm men S. cerevisiae ........... 13
2.4. Giới thiệu về oligo-β-glucan................................................................................... 15
2.4.1. Oligosaccharide ................................................................................................... 15
2.4.2. Oligo-β-glucan ..................................................................................................... 16
2.4.3. Các phƣơng pháp cắt mạch β-glucan .................................................................. 17
2.4.3.1. Phƣơng pháp hóa học ............................................................................... 17
2.4.3.2. Phƣơng pháp sinh học .............................................................................. 17
2.4.3.3. Phƣơng pháp chiếu xạ .............................................................................. 17
2.5. Kỹ thuật thủy canh .................................................................................................. 19
2.5.1. Khái niệm thủy canh ............................................................................................ 19
2.5.2. Phân loại .............................................................................................................. 19
2.5.2.1. Kỹ thuật thủy canh dịch lỏng .................................................................... 19
2.5.2.2. Thủy canh có sử dụng giá thể rắn ............................................................. 20
2.5.3. Ý nghĩa thực tiễn của phƣơng pháp thủy canh .................................................... 21
Chƣơng 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ................................................................ 23
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu .......................................................................... 23
3.2. Vật liệu và hóa chất ................................................................................................ 23
3.2.1. Vật liệu ................................................................................................................ 23
3.2.2. Hóa chất ............................................................................................................... 23
3.2.3. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm ............................................................................ 23
3.2.4. Điều kiện thí nghiệm ........................................................................................... 24
v


3.3. Phƣơng pháp thực hiện ........................................................................................... 24
3.3.1. Thu nhận thành tế bào nấm men S. cerevisiae .................................................... 24
3.3.2. Thu nhận β-glucan từ thành tế bào nấm men S. cerevisiae ................................. 25

3.3.2.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ NaOH ............................ 26
3.3.2.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hƣởng của thời gian thủy phân ..................... 27
3.3.2.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ xử lý .............................. 28
3.3.2.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hƣởng của tỉ lệ mẫu/ dung môi thủy phân ..................... 29
3.3.3. Chế tạo oligo-β-glucan ........................................................................................ 30
3.3.3.1. Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hƣởng của liều xạ lên hiệu suất thu
nhận β-glucan tan và khối lƣợng phân tử của oligo-β-glucan ............................ 30
3.3.3.2. Xác định đặc trƣng của β-glucan sau khi chiếu xạ .................................... 31
3.3.4. Xác định hiệu ứng tăng trƣởng thực vật của oligo-β-glucan ............................... 32
3.3.4.1. Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hƣởng oligo-β-glucan chế tạo
theo liều xạ ............................................................................................... 32
3.3.4.2. Thí nghiệm 7: Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ chế phẩm
oligo-β-glucan trên rau cải bẹ xanh .......................................................... 33
Chƣơng 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................................... 35
4.1. Hoàn thiện quy trình tách chiết β-glucan từ bã nấm men bia................................. 35
4.1.1. Tách và thu nhận thành tế bào nấm men S. cerevisiae ........................................ 35
4.1.2. Tách chiết β-glucan từ thành tế bào nấm men S. cerevisiae ............................... 35
4.1.2.1. Ảnh hƣởng của nồng độ NaOH đến hiệu suất tách chiết β-glucan........................... 35
4.1.2.2. Ảnh hƣởng của thời gian đến hiệu suất tách chiết β-glucan ...................... 37
4.1.2.3. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hiệu suất tách chiết β-glucan ....................... 38
4.1.2.4. Ảnh hƣởng của tỉ lệ mẫu/ dung môi đến hiệu suất tách chiết β-glucan...................... 39
4.2. Chế tạo oligo-β-glucan bằng phƣơng pháp chiếu xạ .............................................. 43
4.2.1. Hiệu suất thu nhận β-glucan tan bằng phƣơng pháp chiếu xạ ............................. 44
vi


4.2.2. Khối lƣợng phân tử của oligo-β-glucan .............................................................. 46
4.3. Hiệu ứng tăng trƣởng của oligo-β-glucan đƣợc chế tạo bằng
phƣơng pháp chiếu xạ lên rau thủy canh ............................................................ 48
4.3.1. Hiệu ứng tăng trƣởng của oligo-β-glucan chế tạo ở các liều xạ khác

nhau lên rau thủy canh........................................................................................ 48
4.3.1.1. Hiệu ứng tăng trƣởng của oligo-β-glucan chế tạo ở các
liều xạ khác nhau lên rau cải bẹ xanh ....................................................... 48
4.3.1.2. Hiệu ứng tăng trƣởng của oligo-β-glucan chế tạo ở các
liều xạ khác nhau lên rau xà lách Nato ..................................................... 50
4.3.1.3. Hiệu ứng tăng trƣởng của oligo-β-glucan chế tạo ở các
liều xạ khác nhau lên rau cải dún.............................................................. 52
4.3.2. Hiệu ứng tăng trƣởng của oligo-β-glucan có Mw tối ƣu lên rau cải bẹ
xanh ở các nồng độ khác nhau ........................................................................... 53
Chƣơng 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .......................................................................... 56
5.1. Kết luận................................................................................................................... 56
5.2. Đề nghị ................................................................................................................... 56
Tài liỆu tham khẢo ....................................................................................................... 57
Phụ lục

vii


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
CNBX

Công nghệ bức xạ

ctv

Cộng tác viên

Dp

Degree of polymezation (độ polymer hóa)

ĐC

Đối chứng

FTIR

Fourier Transform Infrared Spectroscopy

GPC

Gel Permeation Chromatography (sắc ký lọc gel)

IL - 1

Interleukin 1

IL - 6

Interleukin 6

IL - 8

Interleukin 8

IPM

Intergrated Pest Managerment (phòng trừ tổng hợp)

Mw

Khối lƣợng phân tử

NMR

Nuclear Magnetic Resonance

NT

Nghiệm thức

SEM

Scaning Electron Microscope

SVĐC

So với đối chứng

TNF

Tumor Necrosis Factor

viii


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Trang
Bảng 2.1 Cấu trúc, nguồn thu nhận và hoạt tính của β-glucan .......................................7
Bảng 3.1 Các nghiệm thức khảo sát ở thí nghiệm 6 .....................................................32

Bảng 3.2 Các nghiệm thức khảo sát ở thí nghiệm 7 .....................................................33
Bảng 4.1 Ảnh hƣởng của oligo-β-glucan chế tạo ở các liều xạ
khác nhau lên sự tăng trƣởng của cây rau cải bẹ xanh. .................................. 48
Bảng 4.2 Ảnh hƣởng của oligo-β-glucan chế tạo ở các liều xạ
khác nhau lên sự tăng trƣởng của cây rau xà lách Nato. ................................ 50
Bảng 4.3 Ảnh hƣởng của oligo-β-glucan chế tạo ở các liều xạ
khác nhau lên sự tăng trƣởng của cây rau cải dún ......................................... 52
Bảng 4.4 Ảnh hƣởng của nồng độ chế phẩm oligo-β-glucan lên
sự tăng trƣởng của cây rau cải bẹ xanh. ......................................................... 54

ix


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Trang
Hình 2.1 Cấu trúc và thành phần thành tế bào S. cerevisiae. .........................................4
Hình 2.2 Cấu trúc của β-glucan. .....................................................................................5
Hình 2.3 Kỹ thuật thủy canh của phƣơng pháp hồi lƣu ................................................19
Hình 2.4 Kỹ thuật thủy canh của phƣơng pháp không hồi lƣu. ....................................20
Hình 2.5 Kỹ thuật thủy canh có sử dụng giá thể rắn ....................................................21
Hình 3.1 Quy trình thu nhận β-glucan từ thành tế bào nấm men. ................................25
Hình 3.2 Mô hình nuôi trồng thủy canh tĩnh sử dụng trong nghiên cứu. .....................32
Hình 4.1 Hiệu suất tách chiết β-glucan khảo sát theo nồng độ NaOH .........................36
Hình 4.2 Hiệu suất tách chiết β-glucan theo thời gian..................................................37
Hình 4.3 Hiệu suất tách chiết β-glucan theo nhiệt độ. ..................................................38
Hình 4.4 Hiệu suất tách chiết β-glucan theo tỉ lệ mẫu/ dung môi ................................40
Hình 4.5 Sơ đồ quy trình tách chiết β-glucan từ bã men bia ........................................41
Hình 4.6 Sản phẩm β-glucan thành phẩm. ....................................................................43
Hình 4.7 Hàm lƣợng β-glucan tan sau chiếu xạ ...........................................................44
Hình 4.8 Sự suy giảm Mw của oligo-β-glucan theo liều xạ. ........................................46

Hình 4.9 Cải bẹ xanh sau 28 ngày trồng bằng phƣơng pháp thủy canh .......................49
Hình 4.10 Xà lách Nato sau 28 ngày trồng bằng phƣơng pháp thủy canh ...................51
Hình 4.11 Cải dún sau 21 ngày trồng bằng phƣơng pháp thủy canh ............................52
Hình 4.12 Cải bẹ xanh sau 21 ngày trồng bằng phƣơng pháp thủy canh .....................54

x


Chƣơng 1 MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Trong những năm gần đây, cùng với quá trình hội nhập, ngành sản xuất bia phát
triển nhanh về quy mô, trình độ công nghệ và trở thành một ngành công nghiệp có thế
mạnh. Với tốc độ phát triển nhƣ hiện nay, dự kiến đến năm 2015 cả nƣớc sẽ tiêu thụ
khoảng 4 tỷ lít bia. Lƣợng nấm men thừa sau quá trình lên men bia khoảng 20 - 40
kg/1000 lít bia. Do đó, ngành này hàng năm thải ra môi trƣờng một lƣợng bã thải
khổng lồ, ƣớt tính khoảng 100 nghìn tấn/ năm. Nếu lƣợng bã thải này không đƣợc xử
lý thỏa đáng sẽ gây ô nhiễm đáng kể đến môi trƣờng.
Hiện nay, bã nấm men chủ yếu đƣợc sử dụng làm thức ăn cho chăn nuôi, làm
phân bón cải tạo đất hay đƣợc dùng nhƣ nguồn nguyên liệu rẻ tiền để sản xuất bột
chiết nấm men. Trong bã men có một lƣợng chất rắn thô (50 - 60%) gồm chủ yếu là
thành tế bào nấm men (Suphantharika và ctv, 2003), nếu chỉ ứng dụng vào các mục
đích trên, tuy giải quyết đƣợc nguồn rác thải nhƣng lợi nhuận đem lại là không cao.
β-glucan là một trong những hợp chất chính cấu thành nên thành tế bào nấm
men. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh β-glucan có vai trò nhƣ là chất điều hòa miễn
dịch không đặc hiệu, có khả năng tăng cƣờng miễn dịch giúp vật chủ có sức đề kháng
chống lại phần lớn các bệnh nhiễm khuẩn, nấm và virus. Không chỉ vậy, β-glucan còn
là chất chống oxi hóa, có đặc điểm kháng khối u mạnh. Chính vì thế, việc tận dụng bã
men bia để sản xuất các chế phẩm β-glucan có giá trị kinh tế cao, đem lại lợi nhuận
đáng kể cho các nhà máy, đồng thời giảm thiểu tác động đối với môi trƣờng.
Nhiều nƣớc trên thế giới nhƣ Nhật Bản, Hoa Kỳ, Hàn Quốc, v.v. đã tiến hành

nghiên cứu tách chiết và thử nghiệm β-glucan từ lâu. Quy trình công nghệ tách chiết
và tinh sạch β-glucan cũng đã đƣợc cải tiến nhằm thu nhận sản phẩm β-glucan sạch,
ứng dụng trong nhiều lĩnh vực nhƣ y học, thực phẩm và mỹ phẩm.
Ở Việt Nam, các công trình nghiên cứu tách chiết và ứng dụng β-glucan còn rất
hạn chế. Sản phẩm β-glucan thu nhận đƣợc đa phần có khối lƣợng phân tử lớn, khả
năng hòa tan rất thấp (hầu nhƣ không tan) do đó ảnh hƣởng rất lớn đến khả năng ứng
dụng cũng nhƣ hoạt tính của β-glucan. Nhiều nghiên cứu cho thấy, β-glucan khối
lƣợng phân tử thấp dễ hòa tan, không chỉ hoạt tính cao gấp nhiều lần so với loại không
1


tan mà còn dễ triển khai ứng dụng trong lĩnh vực thực phẩm, y dƣợc, đặc biệt là lĩnh
vực nông nghiệp. Mặt khác, việc ứng dụng công nghệ bức xạ để cắt mạch
polysaccharide đã đƣợc chứng minh là rất hiệu quả nhƣ hiệu suất cắt mạch cao, tạo
đƣợc sản phẩm tinh khiết, có giá thành thấp, không gây ô nhiễm môi trƣờng và dễ
dàng triển khai ở quy mô lớn. Chính vì những lý do trên, đề tài “Nghiên cứu tách chiết
β-glucan từ bã men bia và chế tạo oligo-β-glucan bằng phƣơng pháp chiếu xạ” đƣợc
thực hiện với mục tiêu xây dựng quy trình tách chiết β-glucan hiệu quả từ bã men bia,
tạo đƣợc β-glucan có khối lƣợng phân tử thấp và bƣớc đầu thử nghiệm hiệu ứng tăng
trƣởng của oligo-β-glucan trên rau thủy canh.
1.2. Yêu cầu của đề tài
- Hoàn thiện quy trình tách chiết β-glucan từ bã men bia.
- Ứng dụng công nghệ bức xạ cắt mạch β-glucan để tạo β-glucan có khối lƣợng
phân tử thấp.
- Xác định liều chiếu xạ để chế tạo oligo-β-glucan và nồng độ của chế phẩm
oligo-β-glucan thích hợp với rau trồng bằng phƣơng pháp thủy canh.
1.3. Nội dung thực hiện
- Tách chiết β-glucan từ nấm men thu đƣợc từ bã men bia.
- Chiếu xạ β-glucan tách chiết đƣợc để tạo oligo-β-glucan.
- Xác định hiệu suất thu nhận β-glucan tan bằng phƣơng pháp chiếu xạ và khối

lƣợng phân tử của β-glucan tan.
- Xác định hiệu ứng tăng trƣởng thực vật của oligo-β-glucan trên rau cải bẹ
xanh, xà lách Nato và cải dún trồng bằng phƣơng pháp thủy canh.

2


Chƣơng 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Giới thiệu về β-glucan
2.1.1. Nguồn thu nhận β-glucan
2.1.1.1. Nguồn thu nhận chung
Trong tự nhiên, β-glucan đƣợc thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau nhƣ: lúa
mạch, yến mạch, tế bào nấm men, nấm, v.v. Theo Mantovani và ctv (2008), β-glucan
thu nhận từ các nguồn khác nhau có cấu trúc và chức năng khác nhau. Cụ thể là: βglucan thu nhận trong ngũ cốc có rất ít hoặc không có hoạt tính. Tuy nhiên, một số βglucan trong nƣớc yến mạch có thể làm giảm nguy cơ bệnh tim. β-glucan tìm thấy
trong một số nấm lớn phân nhánh yếu và chỉ có khả năng tăng cƣờng miễn dịch đến
một mức nào đó. β-glucan tách chiết từ nấm men phân nhánh nhiều và là nguồn cung
cấp β-glucan dồi dào với khả năng tăng hoạt tính miễn dịch cao, giúp cho vết thƣơng
mau lành và có đặc điểm kháng khối u mạnh (Phạm Việt Cƣờng, 2005).
2.1.1.2. Thành tế bào nấm men S. cerevisiae
Thành tế bào nấm men S. cerevisiae là lớp ngoài cùng của tế bào nấm men. Các
nghiên cứu gần đây cho thấy β-glucan chủ yếu đƣợc tách chiết từ thành tế bào của nấm
men S. cerevisiae. Trong S. cerevisiae, thành tế bào chiếm khoảng 10 - 25% trọng
lƣợng khô của tế bào (Klis và ctv, 2006). Thành tế bào nấm men đƣợc cấu thành chủ
yếu từ mannoprotein và β-glucan (chiếm 85 - 90% trọng lƣợng khô của thành tế bào),
một phần nhỏ chitin (1 - 3%) và lipid (2 - 5%) (Dallies và ctv, 1998). Tuy nhiên, cấu
trúc, độ dày của thành tế bào nấm men cũng nhƣ thành phần và tỷ lệ các hợp chất cấu
thành nên thành tế bào nấm men thay đổi rất lớn, tùy thuộc vào chủng nấm men và
điều kiện nuôi cấy (McMurrough và ctv, 1967).
Thành tế bào nấm men S. cerevisiae đƣợc chia thành 3 lớp. Phức hợp (13)βglucan – chitin tạo nên lớp trong của thành tế bào. (16)β-glucan nằm giữa, liên kết
với lớp trong và lớp ngoài của thành tế bào. Bề mặt ngoài cùng của thành tế bào là lớp

mannaprotein (Lipke và Ovalle, 1998). Các hợp chất này liên kết với nhau một cách
chặt chẽ, giúp duy trì hình dạng của tế bào nấm men và giúp tế bào chống lại các tác
động vật lý. Bên cạnh đó, chúng còn đóng vai trò nhƣ một bộ khung bám của protein,
duy trì tính thấm chọn lọc, giới hạn tính thấm của thành tế bào (Morris và ctv, 1986).

3


Hình 2.1 Cấu trúc và thành phần thành tế bào S. cerevisiae (Lipke và Ovalle, 1998).

2.1.2. Cấu trúc của β-glucan
β-glucan là hợp chất cấu thành chủ yếu của thành tế bào nấm men. Trong đó,
(13)/(16)β-glucan chiếm khoảng 50 - 60% thành tế bào nấm men
(Suphantharika và ctv, 2003). β-glucan nằm ở lớp giữa của thành tế bào, gần với
màng tế bào, có chức năng duy trì và ổn định hình dạng của tế bào. Chúng là một
loại polysaccharide đƣợc hình thành từ các đơn vị D-glucose nối với nhau bằng liên
kết glycoside. Mạch thẳng của β-glucan là polymer của D-glucose nối với nhau
bằng liên kết β(13)-glucoside và các nhánh đƣợc tạo bởi các liên kết β(16)glycoside. Một số β-glucan đƣợc tách từ ngũ cốc là polymer của D-glucose liên kết
β(13)-D-glucoside và nhánh β(14)-D-glucoside (Tohamy và ctv, 2003).
Khả năng tan của β-glucan phụ thuộc vào mức độ polymer hóa (Dp). Dp
trung bình của β-glucan là khoảng 1500, tƣơng đƣơng với khối lƣợng phân tử (Mw)
khoảng 240 kDa (Lipke và Ovalle, 1998). β-glucan không tan trong nƣớc khi Dp lớn
hơn 100. Khả năng tan của β-glucan tăng khi Dp giảm. Dựa vào tính tan của βglucan, ngƣời ta chia ra thành 3 loại: (13)β-glucan không tan trong kiềm và acid,
(13)β-glucan tan trong kiềm và (16)β-glucan (Zekovic và ctv, 2005).

4


(a)

(b)
Hình 2.2 Cấu trúc của β-glucan. (a) (13)β-glucan với nhánh β(16);
(b) (13)β-glucan với nhánh β(14) (Mantovani và ctv, 2008).
2.1.3. Hoạt tính của β-glucan
Từ lâu, β-glucan đƣợc xem là hợp chất có khả năng kích thích miễn dịch tế bào.
β-glucan hoạt động kích thích hệ thống miễn dịch chống lại các tác nhân gây bệnh nhƣ
vi khuẩn, nấm và virus. Hoạt tính này có đƣợc là do trên các tế bào đại thực bào, tế
bào bạch cầu trung tính, các tế bào giết tự nhiên có các thụ thể liên kết với β-glucan.
Đặc biệt đối với tế bào đại thực bào, β-glucan liên kết với những thụ thể đặc hiệu trên
đại thực bào để hoạt hóa chúng nhƣ CR3 và Dectin - 1. Sự hoạt động của β-glucan
trong cơ thể liên quan đến hoạt động tăng quá trình hóa hƣớng động, sự di trú của đại
thực bào đến vùng bị nhiễm bệnh, β-glucan vừa liên kết với những thụ thể có trên bề
mặt tác nhân gây bệnh vừa liên kết với đại thực bào, do đó tạo điều kiện cho quá trình
thực bào xảy ra dễ dàng hơn. Ngoài ra, β-glucan cũng có tác dụng tăng cƣờng hoạt
động ly giải và tổng hợp các enzyme, tăng tín hiệu hoạt hóa các tế bào thực bào khác,
tiết cytokines và những hợp chất của tiền phản ứng viêm nhƣ IL - 1, IL - 9 và TNF - α,
giúp tăng cƣờng hoạt động hệ miễn dịch của cơ thể nhằm tiêu diệt mầm bệnh (Brown
và Gordon, 2003). Vì vậy, β-glucan có thể đƣợc xem là một nhân tố kích thích đáp ứng
miễn dịch đối với những bệnh nhân bị tổn thƣơng hệ thống miễn dịch hoặc những
ngƣời bị nhiễm bệnh do vi khuẩn có khả năng kháng nhiều loại thuốc gây ra. Theo
Chae và ctv (2006), (13)β-glucan tách chiết từ nấm có thể là nhân tố kích thích đáp
ứng miễn dịch có vai trò tƣơng tự interleukin. β-glucan tách chiết từ ngũ cốc cũng đã
cho thấy khả năng kháng các vi khuẩn nhƣ E. coli và B. subtilis (Shin và ctv, 2005).
β-glucan thu nhận từ S. cerevisae có khả năng kháng khuẩn giúp chuột chống lại vi
khuẩn S. aureus (Liang và ctv, 1998).

5


Hiệu quả điều biến miễn dịch của β-glucan phụ thuộc nhiều vào mức độ phân

nhánh, chiều dài của đoạn polymer và cấu trúc bậc 3 của β-glucan. Tuy nhiên, các nhà
khoa học vẫn chƣa có sự thống nhất về yêu cầu cấu trúc cơ bản của β-glucan phù hợp
với hoạt tính sinh học của nó. Nhìn chung, những nghiên cứu in vivo cho thấy β-glucan
có khối lƣợng phân tử lớn hoặc trung bình nhƣ zymosan có thể hoạt hóa trực tiếp các
tế bào bạch cầu, kích thích đại thực bào, ngăn sự phân chia tế bào và có hoạt tính
kháng khuẩn. Ngoài ra, các cacbonhydrate này còn kích thích cơ thể tạo ra các chất
hóa học trung gian tiền phản ứng viêm, cytokines và chemokines nhƣ IL - 8, IL - 1β,
IL - 6 và TNF - α. Sự kích thích của β-glucan cũng nâng cao khả năng nhận biết và
làm sạch tế bào chết một cách chọn lọc (Williams và ctv, 1996). β-glucan có khối
lƣợng phân tử trung bình hoặc thấp nhƣ glucan phosphate có hoạt tính sinh học in vivo
nhƣng hiệu quả trên tế bào của chúng thì chƣa biểu hiện rõ. Trong một vài nghiên cứu,
những glucan này cũng biểu hiện khả năng hoạt hóa các tế bào bạch cầu in vitro, tăng
cƣờng đáp ứng của tế bào thực bào nếu cơ thể bị nhiễm mầm bệnh lần 2. Mặc dù
những glucan này không kích thích tạo ra cytokines nhƣ TNF - α, IL - 1β, nhƣng trong
một vài báo cáo đã chỉ ra rằng có sự kích thích cơ thể tạo ra IL - 8 và IL - 6 (trích dẫn
bởi Brown và Gordon, 2003).
Bên cạnh khả năng tăng cƣờng miễn dịch, β-glucan còn có hoạt tính chống ung
thƣ. Từ những nghiên cứu đầu tiên cho đến nay, hoạt tính chống ung thƣ của β-glucan
ngày càng đƣợc làm rõ. Hoạt tính này của β-glucan thực hiện dựa trên sự liên kết chặt
chẽ giữa nó với kháng thể chống khối u. Kháng thể sẽ bám vào bề mặt của tế bào ung
thƣ nhờ liên kết với mảnh C3 - hợp chất cấu thành nên vỏ của tế bào ung thƣ. Đồng
thời, β-glucan liên kết với các tế bào thực bào nhƣ bạch cầu trung tính, đại thực bào và
tế bào giết tự nhiên, sau đó gắn vào phức hợp kháng thể liên kết với cấu thành vỏ của
tế bào ung thƣ, tạo điều kiện cho hiện tƣợng thực bào xảy ra để tiêu diệt phần vỏ của tế
bào ung thƣ (Vetvicka, 2011).
Một vài nghiên cứu trên động vật cho thấy rằng β-glucan khi đƣợc bổ sung vào
thành phần dinh dƣỡng sẽ giúp điều chỉnh sự phát triển, tăng cƣờng sự duy trì chất
dinh dƣỡng và chức năng của hệ thống miễn dịch. Glucan tự nhiên rất sạch, có khả
năng giữ nƣớc cao và hầu nhƣ không bị phá hủy bởi các enzyme ở ngƣời, do đó chúng
còn đƣợc cung cấp nhƣ là nguồn xơ dinh dƣỡng (Zekovic và ctv, 2005). Điều đáng

quan tâm đối với dạng xơ này là chúng có khả năng giảm cholesterol trong máu, giảm
6


nguy cơ mắc một số bệnh mãn tính. Sự tiêu hóa β-glucan làm tăng tính dẻo của ruột và
giảm sự tích lũy cholesterol. Ngoài ra, ở ruột già, β-glucan bị phân hủy một phần nhờ
hệ vi khuẩn trong ruột kết. Quá trình lên men của các vi khuẩn này tạo ra các chuỗi
acid béo ngắn (chủ yếu là acetate, propionate và butirate) có lợi giúp cải thiện tiêu hóa
và có ích cho các tế bào ruột (Phạm Việt Cƣờng, 2005).
Đối với thực vật, β-glucan có vai trò nhƣ một chất dẫn truyền, kích thích cơ thể
thực vật tạo ra phytoalexin hay tăng cƣờng tổng hợp các enzyme nhƣ kitinase, βglucanase để tiêu diệt nấm bệnh. Theo Aziz và ctv (2003), phản ứng bảo vệ của
(13)β-glucan laminarin trong cây nho đƣợc thực hiện bởi sự tăng cƣờng dòng ion
Ca2+, tăng độ kiềm của môi trƣờng ngoài tế bào, tăng cƣờng phản ứng oxi hóa, hoạt
hóa enzyme kinases và 10 gen liên quan làm tăng quá trình tổng hợp các enyme
chitinase và glucanase. Bên cạnh đó, nó còn thúc đẩy sản xuất ra hai loại phytoalexin
để tiêu diệt nấm bệnh (B. cinerea và P. vititcola) trên cây nho là resveratrol và ε-viniferin.
Bảng 2.1 Cấu trúc, nguồn thu nhận và hoạt tính của β-glucan
Cấu trúc

Nguồn thu nhận

Hoạt tính
Kháng khuẩn, nấm, virus, ký sinh trung

Saccharomyces cerevisiae Kháng khối u, kích thích tạo máu
Tác nhân gây phân bào

β(13)(16)

Candida albicans

Kích thích hệ thống miễn dịch

Poria cocus

Kháng khối u
Cảm ứng cytokine
Ức chế isoenzyme CYP450

Agaricus blazei

Kháng khối u
Ức chế isoenzyme CYP450

Lantinus edodes

β(13)(14)

Kháng khối u

Schizophyllum commune

Kháng khối u

Coriolus versicolor

Kháng khối u
Kháng khuẩn, chống ký sinh trùng

Yến mạch

Giảm cholesterol, chống đông máu
Giảm tỷ lệ đột biến

Lúa mạch

(Mantovani và ctv, 2008)

7


2.1.4. Ứng dụng của β-glucan
Trong thực phẩm, β-glucan đƣợc sử dụng nhƣ một chất phụ gia. Khả năng giữ
nƣớc của β-glucan tách chiết từ thành tế bào nấm men lớn hơn rất nhiều so với các loại
chất xơ hiện có nhƣ polysaccharide đậu tƣơng, các loại sợi thực vật và hạt. Hiện nay,
với những phƣơng pháp tách chiết và tinh sạch đặc biệt, β-glucan đƣợc tách từ thành tế
bào nấm men S. cerevisiae rất an toàn, có thể đƣợc sử dụng nhƣ nguồn sợi thực phẩm
cho ngƣời và động vật (Zeckovic và ctv, 2005).
Trong y dƣợc và mỹ phẩm, β-glucan đƣợc sử dụng nhƣ một dƣợc chất. Với
những hoạt tính sinh học nhƣ tăng khả năng kích thích miễn dịch, giúp vật chủ có sức
đề kháng chống lại các bệnh nhiễm khuẩn, nấm và virus, β-glucan đã đƣợc bổ sung
vào nhiều loại thuốc. Từ những nghiên cứu đầu tiên cách đây 40 năm, một hợp chất
thô có hoạt tính kháng khối u của β-glucan đã đƣợc công nhận, gọi là zymosan và
đƣợc bán rất lâu ở Mỹ nhƣ thuốc chống khối u của hãng Sigma Chemical (Phạm Việt
Cƣờng, 2005). Nhiều thử nghiệm trên động vật và ngƣời đã cho thấy β-glucan có khả
năng kháng đƣợc nhiều loại khối u nhƣ u vú, u phổi và u đƣờng ruột. Từ những năm
1980, β-glucan đã đƣợc sử dụng rất thành công nhƣ một loại dƣợc phẩm truyền thống
để điều trị ung thƣ ở Nhật Bản. β-glucan còn có khả năng kích thích sự tạo máu. βglucan ở dạng hạt hay dạng tan đều có khả năng phục hồi đáng kể một lƣợng máu sau
khi xạ trị. Điều này cho thấy rằng, β-glucan có thể đẩy lùi đƣợc chứng suy tủy sau hóa
trị liệu (Vetvicka, 2011). Ngoài ra, β-glucan còn có khả năng cảm ứng hoạt tính của tế

bào Langerhans khi bôi lên da. Tế bào Langerhans là một loại tế bào đại thực bào
chuyên hóa nằm trên da, hoạt động tƣơng tự nhƣ đại thực bào. (13)β-glucan làm se
lỗ chân lông, giảm sự khô của da, chống oxi hóa và làm mờ nếp nhăn nên có thể bổ
sung vào nhiều loại mỹ phẩm. (Jamas và ctv, 1994).
Trong chăn nuôi thủy hải sản, β-glucan đƣợc bổ sung vào khẩu phần ăn của
tôm, cá giúp kích thích ăn và tăng khả năng kháng bệnh. Khi sử dụng (13)β-glucan
và (16)β-glucan chiết xuất từ nấm men, Sung (1998) đã chứng minh đƣợc tính
kháng bệnh của P. monodon đối với Vibrio và sự nhiễm virus gây bệnh đốm trắng đã
giảm đi (trích dẫn bởi Nguyễn Văn Muôn, 2006). Theo Rostad Gunnar và ctv (1995),
khi bổ sung glucan vào thức ăn hàng ngày của cá hồi (Salmo salar) với hàm lƣợng
1g/kg thức ăn trong 12 tuần trƣớc khi cho nhiễm bệnh, lƣợng cá còn sống sót tăng lên
đáng kể (trích dẫn bởi Phạm Việt Cƣờng, 2005).
8


2.1.5. Tình hình nghiên cứu β-glucan trên thế giới và ở Việt Nam
Từ những năm 1960, β-glucan đã thu hút sự chú ý của nhiều nhà khoa học bởi
những hoạt tính sinh học nổi bật. Mỹ và châu Âu là nơi nghiên cứu β-glucan đứng
hàng đầu, sau đó là Nhật. Năm 1941, tiến sĩ Pillemer Louis và ctv đã phát hiện và công
nhận hiệu ứng kháng khối u của hợp chất tách chiết từ thành tế bào nấm men
S. cerevisiae đƣợc gọi là zymosan. Zymosan là chất thô vì nó liên kết với protein, lipid
và các hợp chất khác có trong thành tế bào. Trong nhiều năm, các nhà khoa học vẫn
không làm rõ đƣợc hợp chất đóng vai trò quyết định hoạt tính của Zymosan. Chỉ khi
đầu tƣ nghiên cứu kỹ, họ mới phát hiện ra β-glucan chính là chất đóng vai trò tiên
quyết trong các hiệu ứng của zymosan. Kể từ đó, β-glucan đƣợc tách chiết và hoạt tính
điều biến miễn dịch của nó đƣợc nghiên cứu nhiều hơn.
Ở Nhật, β-glucan lại đƣợc nghiên cứu theo một hƣớng khác. Trong y học
phƣơng Đông, các dƣợc chất đƣợc tách từ nấm lớn đã đƣợc sử dụng trong một thời
gian dài. Do đó, từ đầu những năm 1970, một số viện nghiên cứu ở Nhật thử tách chiết
β-glucan từ nấm lớn và nó trở thành hƣớng nghiên cứu chính ở Nhật. Kết quả thu đƣợc

từ những nghiên cứu cho thấy β-glucan có thể là nguyên nhân chính gây ra sự điều
biến miễn dịch không đặc hiệu dẫn đến hiệu ứng kháng khối u. Trên 50 năm qua, rất
nhiều nhà khoa học và viện nghiên cứu đã góp phần to lớn vào việc định loại, tách
chiết và định tính các thành phần khác nhau của β-glucan. Hiện nay, β-glucan từ nấm,
nấm men và rong biển đã đƣợc biết rõ là có khả năng điều hòa miễn dịch chống lại tác
nhân gây bệnh và trị đƣợc các bệnh ung thƣ (Borchers và ctv, 1999; Brown và ctv,
2003). Không giống nhƣ nhiều sản phẩm tự nhiên khác, β-glucan có độ tinh sạch cao
có thể duy trì hoạt tính của chúng ở cấp độ tế bào và phân tử (Vetvicka, 2011). Tuy
nhiên, β-glucan tách chiết đƣợc thƣờng có khối lƣợng phân tử lớn, độ nhớt cao và khả
năng tan thấp nên khó ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm, dƣợc phẩm
(Byun và ctv, 2008). Hiện nay, các nhà khoa học đang nghiên cứu phƣơng pháp cắt
mạch β-glucan để tăng khả năng tan cũng nhƣ hoạt tính của nó.
Trong nƣớc, β-glucan chƣa đƣợc quan tâm nhiều, chỉ mới có một vài nghiên
cứu đơn lẻ về tách chiết glucan từ nguồn nguyên liệu nấm lớn nhƣng cũng chƣa đem
lại kết quả khả quan. Một số nghiên cứu tách chiết β-glucan thực hiện trên nấm men
S. cerevisia nhƣng hiệu suất chƣa cao và sinh khối nấm men sử dụng tách chiết đòi hỏi
phải nuôi cấy, chƣa tận dụng nguồn bã thải nấm men sẵn có. Năm 2005, nhóm nghiên
9


cứu Phạm Việt Cƣờng thuộc Viện Công nghệ Sinh học - Viện Khoa học Công nghệ
Việt Nam đã xây dựng quy trình tách chiết β-glucan từ chủng nấm men đột biến phân
lập từ bã men bia. Tuy hàm lƣợng protein trong sản phẩm thấp, nhƣng quy trình tách
chiết tốn thời gian, khối lƣợng phân tử của β-glucan lớn và hầu nhƣ không tan, do đó
hoạt tính sinh học thấp và khó ứng dụng.
2.2. Giới thiệu về bã men bia
2.2.1. Tình hình sản xuất bia ở Việt Nam
Ngành công nghiệp sản xuất bia Việt Nam có lịch sử hơn 100 năm. Trong quá
trình hình thành và phát triển, ngành sản xuất bia đã đạt mức tăng trƣởng cao vào
những năm của thời kỳ mở cửa. Cùng với quá trình hội nhập, ngành sản xuất bia phát

triển nhanh về quy mô và trình độ công nghệ, góp phần lớn vào sự phát triển kinh tế và
trở thành một ngành công nghiệp có thế mạnh khi Việt Nam gia nhập tổ chức WTO.
Từ năm 1990 trở lại đây, việc đầu tƣ xây dựng các nhà máy bia đƣợc triển khai
rất mạnh mẽ. Năm 1998, số nhà máy đƣợc xây dựng đã lên tới 469 nhà máy với các
quy mô khác nhau từ 100000 - 100 triệu lít/năm. Mức tiêu thụ bình quân đầu ngƣời
tăng lên nhanh chóng trong vòng 10 năm qua từ mức dƣới 10 lít/ngƣời/năm vào năm
1997 đã đạt mức 18 lít/ngƣời/năm vào năm 2006.
Theo lộ trình phát triển dự kiến năm 2015, cả nƣớc sẽ tiêu thụ khoảng 4 tỷ lít
bia. Với tốc độ phát triển nhanh nhƣ vậy, nhiều nhà máy bia quy mô lớn đang đƣợc
đầu tƣ và cũng kéo theo nhiều vấn đề nảy sinh nhƣ tiêu tốn tài nguyên và gây ô nhiễm
môi trƣờng. Lƣợng nấm men thừa sau quá trình lên men khoảng 20 - 40 kg/1000 lít
bia. Trong bã nấm men còn chứa bia, có tải lƣợng BOD khoảng 120000 - 140000
mg/l. Điều này sẽ gây ảnh hƣởng lớn đến môi trƣờng nếu nhƣ lƣợng bã thải này không
đƣợc xử lý thỏa đáng. Vì vậy, bên cạnh đẩy mạnh sản xuất, các nhà máy phải chú ý
đến vấn đề xử lý nguồn phế phẩm để sản xuất đạt hiệu quả mà không gây hại đến môi
trƣờng (Nhóm biên soạn, 2008).
2.2.2. Bã men bia
Bã men bia là phế phẩm của ngành công nghiệp sản xuất bia. Bã men bia chứa
chủ yếu là sinh khối của nấm men còn nằm lại trong các thùng lên men và hầm chứa
sau khi lên men chính và lên men phụ. Men bia chứa nhiều thành phần nhƣ hàm lƣợng
protein có tỷ lệ khá cao, carbohydrate, khoảng hơn 20 axit amin (lysine, valine,

10


cystine, tyrosine, glycine, v.v.), các vitamin (nhất là các vitamin nhóm B), và một số
khoáng chất, v.v. Do đó, nấm men bia là chất bổ sung dinh dƣỡng có giá trị đặc biệt.
Từ lâu, bã men bia đƣợc sử dụng làm nguồn thực phẩm bổ sung vào khẩu phần
ăn của gia súc, gia cầm hay đƣợc xử lý làm phân bón, môi trƣờng nuôi cấy một số nấm
men. Bên cạnh đó, nấm men bia còn đƣợc dùng làm thuốc chữa bệnh và thuốc bồi

dƣỡng. Hiện nay có hai phƣơng pháp xử lý phế liệu nấm men bia là chế biến men khô
và men chiết xuất. Khi dùng để chế biến thức ăn gia súc hay thức ăn cho nông thủy
sản, nấm men có thể không cần phải tinh chế mà chỉ cần để nguyên men tƣơi và sấy
khô. Nhƣng khi dùng chế biến sản phẩm dinh dƣỡng cho ngƣời, nấm men cần phải
tinh chế trƣớc để đảm bảo an toàn và tăng thêm hƣơng vị.
Bên cạnh đó, nấm men dùng trong sản xuất bia chủ yếu là chủng S. cerevisiae.
Theo nhiều nghiên cứu, thành tế bào nấm men S. cerevisiae đƣợc cấu thành chủ yếu là
β-glucan - hợp chất có khả năng điều hòa miễn dịch không đặc hiệu. Do đó, nghiên
cứu tách chiết β-glucan từ nấm men bia tạo các chế phẩm có giá trị cao chính là hƣớng
nghiên cứu mới nhằm góp phần giảm ô nhiễm môi trƣờng và tăng giá trị kinh tế của
nguồn phế phẩm bã men bia.
2.3. Phƣơng pháp tách chiết β-glucan
2.3.1. Phƣơng pháp phá vỡ tế bào
Có nhiều phƣơng pháp phá vỡ tế bào. Tuy nhiên, tùy trƣờng hợp và đối tƣợng
mà lựa chọn phƣơng pháp thích hợp. Việc phá vỡ tế bào động vật và thực vật không
mấy khó khăn, nhƣng phá vỡ tế bào vi sinh vật rất phức tạp vì tế bào vừa có kích
thƣớc rất nhỏ vừa có thành tế bào có cấu trúc khá đặc trƣng. Khi lựa chọn một phƣơng
pháp để phá vỡ tế bào cần chú ý một số yếu tố sau:
-

Độ bền của sản phẩm

-

Khả năng tách các thành phần cặn trong sản phẩm (protein, DNA, lipid, v.v)

-

Thời gian thực hiện

-

Chi phí

2.3.1.1. Phƣơng pháp vật lý
a. Sóng siêu âm: Phƣơng pháp này có hiệu quả cao ở quy mô phòng thí nghiệm
nhƣng lại hạn chế ở quy mô lớn. Phá vỡ tế bào bằng sóng siêu âm đòi hỏi mức năng
lƣợng lớn, thiết bị gây ồn, vấn đề truyền tải nhiệt và không thực hiện đƣợc liên tục.

11


b. Đồng hóa bằng áp lực cao: Đây là phƣơng pháp đƣợc ứng dụng rộng rãi nhất
để phá vỡ tế bào quy mô công nghiệp. Theo phƣơng pháp này, huyền phù tế bào sẽ
đƣợc nén với một áp suất cao, chúng va chạm rất mạnh vào vành ống. Tế bào bị phá
vỡ bởi lực cắt và sức nén. Tùy thuộc vào tính chất, cấu tạo của tế bào đòi hỏi áp lực
khác nhau. Phƣơng pháp này thƣờng đƣợc áp dụng cho việc phá vỡ tế bào vi khuẩn.
Sự khác biệt giữa các thiết bị là rất lớn nên cần lựa chọn thiết bị phù hợp khi chuyển từ
quy mô nhỏ sang quy mô lớn (Nguyễn Đức Lƣợng và ctv, 2010).
c. Phá tế bào bằng bi thủy tinh: Khi phá vỡ tế bào bằng bi thủy tinh cần lƣu ý
các thông số kỹ thuật sau: tốc độ quay và kích thƣớc bi. Với máy dùng trong phòng thí
nghiệm, bi thủy tinh có kích thƣớc khoảng 0,2 mm có thể đƣợc sử dụng nhƣng với quy
mô sản xuất thì kích thƣớc hạt nên lớn hơn hay bằng 0,4 mm. Kinh nghiệm cho thấy
kích thƣớc tối ƣu của hạt phụ thuộc vào kích thƣớc của sinh vật:
-

Vi khuẩn: 0,2 - 0,45 mm

-

Nấm men: 0,5 - 0,75 mm

-

Nấm: > 0,85 mm

Lƣợng hạt dùng phụ thuộc vào phần trăm thể tích trống của buồng nghiền và
khoảng trống cho hạt giãn nở khi gia nhiệt (Nguyễn Tiến Thắng, 2009).
2.3.1.2. Phƣơng pháp hóa học
Là phƣơng pháp dựa trên khả năng tạo ra áp suất thẩm thấu mạnh hoặc khả
năng oxi hóa mạnh của các chất hóa học để phá vỡ thành tế bào. Ƣu điểm của phƣơng
pháp này là không đòi hỏi áp suất cao nên chi phí thấp và dễ thực hiện ở các quy mô.
Tuy nhiên, quá trình thực hiện sử dụng hóa chất nên chúng thƣờng lẫn vào sản phẩm
đòi hỏi quá trình tách phức tạp.
Phƣơng pháp hóa học thƣờng sử dụng nhất là dùng acid để thủy phân các thành
phần tế bào. Tuy nhiên, hàm lƣợng acid quá nhiều có thể dẫn đến những thay đổi về
bản chất hóa học hoặc tính chất vật lý của các sản phẩm có trong tế bào. Cũng có thể
sử dụng kiềm (NaOH, KOH) để thủy phân. Phƣơng pháp này đảm bảo sẽ không còn tế
bào sống sau khi phá vỡ tế bào. Nồng độ NaOH cao thƣờng phân hủy protein và các
thành phần khác trong tế bào (lipid, acid nucleic, v.v.) tạo điều kiện thu nhận thành tế
bào và tinh sạch sản phẩm dễ dàng hơn (Phạm Việt Cƣờng và ctv, 2005).
Các dung môi nhƣ cacbon tetrachloride, toluene, isopropanol và ethanol có thể
làm thủng vách tế bào. Phƣơng pháp này dễ xảy ra hiện tƣợng biến tính protein nhƣng
12


lại làm giảm khả năng hòa tan. Cần đề phòng nguy hiểm vì phần lớn là các chất dễ gây
cháy nổ (Nguyễn Tiến Thắng, 2009).
2.3.1.3. Phƣơng pháp sinh học
Hai phƣơng pháp hiện đang đƣợc sử dụng rộng rãi là phƣơng pháp tự phân và

phƣơng pháp thủy phân bằng enzyme đƣa từ bên ngoài vào.
Phƣơng pháp tự phân là phƣơng pháp tạo điều kiện tối ƣu cho một số enzyme
có khả năng phân giải một số thành phần của thành tế bào. Đây là các enzyme sẵn có
trong tế bào. Bình thƣờng các enzyme này không hoạt động mạnh, nhƣng nếu điều
kiện nhiệt độ, pH, nƣớc ở bên ngoài tế bào trùng với mức hoạt động tối ƣu của chúng
thì chúng sẽ hoạt động mạnh, thủy phân thành tế bào và làm chết tế bào. Phƣơng pháp
này thƣờng đƣợc áp dụng trong việc phá vỡ thành tế bào nấm men.
Một phƣơng pháp khác là sử dụng enzyme từ ngoài tế bào. Sử dụng các enzyme
tƣơng ứng với các cơ chất có trong thành phần tế bào, enzyme thủy phân cơ chất và
phá vỡ thành tế bào. Ngƣời ta thƣờng sử dụng hệ enzyme cellulose để phá vỡ thành tế
bào nấm men và thành tế bào thực vật (Nguyễn Đức Lƣợng và ctv, 2010).
2.3.2 Phƣơng pháp tách chiết β-glucan từ thành tế bào nấm men S. cerevisiae
Sau khi thu nhận thành tế bào, phƣơng pháp thƣờng dùng để tách chiết β-glucan
từ thành tế bào nấm men S. cerevisiae là xử lý với kiềm (NaOH, KOH) (Fleet và ctv,
1976; Williams và ctv, 1991; Jamas và ctv, 1997; Lee và ctv, 2001). Phƣơng pháp này
chỉ dùng để tách chiết β-glucan không tan trong kiềm. Khi xử lý với kiềm, protein
trong tế bào, acid nucleic, mannans, β-glucan tan và lipids có cực sẽ bị thủy phân và
tan trong kiềm. Khi ly tâm, các thành phần này sẽ nằm trên phần dịch nổi còn β-glucan
không tan trong kiềm nằm trong phần cặn tạo điều kiện thu hồi và tinh sạch β-glucan
dễ dàng. Sau đó, β-glucan thô thƣờng đƣợc xử lý với acid và rửa với dung môi
(ethanol, aceton, isopropanol, v.v.) để loại bỏ các thành phần tạp còn lại nhƣ chitin,
chitosan, glycogen và một phần protein nhằm thu đƣợc sản phẩm tinh khiết. Tách chiết
β-glucan bằng kiềm bên cạnh nồng độ dung dịch kiềm, quy trình tách chiết còn phụ
thuộc nhiều vào nhiệt độ, thời gian xử lý mẫu, pH, v.v. (Suphantharika và ctv, 2003).
Hiệu quả điều biến miễn dịch của β-glucan phụ thuộc nhiều vào khối lƣợng phân tử,
mức độ phân nhánh và cấu trúc bậc 3 của nó. Vì vậy cần lựa chọn phƣơng pháp và
điều kiện tách chiết thích hợp để hiệu suất tách chiết β-glucan cao mà vẫn giữ đƣợc
hoạt tính sinh học của β-glucan.
13