Tìm hiểu về HPLC và ứng dụng

TÌM HIỂU VỀ HPLC
VÀ ỨNG DỤNG


NỘI DUNG
2. Giới thiệu qua về
HPLC
1. Kiến thức cơ bản về
sắc ký


PHẦN I: KIẾN THỨC CƠ BẢN
1

1.1. Định nghĩa về sắc ký

1.2. Một số đại lượng đặc trưng
1.3. Độ phân giải
1.4. Các tham số trong sắc ký
1.5. Phương trình đường cong Van Deemter


1.1. KHÁI NIỆM CƠ BẢN
- Sắc ký là kỹ thuật tách các cấu tử ra khỏi hỗn hợp dựa trên ái lực khác nhau của mỗi cấu tử
đối pha tĩnh và pha động. Một pha nằm cố định tại một chỗ, gọi là pha tĩnh, Pha di chuyển
theo một hướng xác định gọi là pha động, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra
khỏi nhau.


1.2. CÁC ĐẠI LƯỢNG ĐẶC TRƯNG

1.2.1. THỜI GIAN LƯU

tr2
tr1
t’r1
to

To : Thời gian lưu chết
t’r1 : Thời gian lưu thực chất A
t’r2 : Thời gian lưu thực chất B

t’r2

TR1 : Thời gian lưu chất A
TR2 : Thời gian lưu chất B


Thời gian lưu của một chất là thời gian tính từ khi bơm mẫu vào cột cho đến khi
chất đó ra khỏi cột đạt giá trị cực đại.


1.2. Hệ số phân bố K (tỉ số phân bố khối lượng )
Hệ số phân bố của một chất cho biết khả năng phân bố của chất đó trong
hai pha cộng với sức chứa cột tức là tỷ số giữa lượng chất tan trong pha
tĩnh và lượng chất tan trong pha động ở trong thời điểm cân bằng

Nếu K nhỏ thì tR cũng nhỏ và sự tách kém. Nếu K lớn thì
Peak bị doãng .
Trong thực tế K’ từ 1- 8 là tối ưu

1.3. Độ chọn lọc α
Độ chọn lọc cho biết hiệu quả tách của hệ thống sắc ký ,khi 02 chất A ,B có K’ A
va K’B khác nhau thì mới có khả năng tách, mức độ tách biểu thị ở độ chọn lọc .
α = K’B / K’A

Với điều kiện K’B > K’A

với  càng khác 1 thì khả năng tách càng rõ ràng

α: phụ thuộc vào pha tĩnh, pha động và bản chất của chất tan

= 1.02

= 1.16

= 1.20


1.4. Số đĩa lý thuyết N
Đại lượng đặc trưng cho hệ thống tách là số đĩa lý thuyết N. Đĩa lý
thuyết được định nghĩa là miền mà cân bằng động của nồng độ cấu
tử trong pha tĩnh và pha động được thiết lập.

Chiều cao của một đĩa lý thuyết
H= L/N.
L: chiều dài cột
N: số đĩa lý thuyết

1.4. Số đĩa lý thuyết N
Số đĩa lý thuyết và bề dày đĩa phụ thuộc vào nhiều yếu tố như:
- đường kính của hạt pha tĩnh, hình dạng và kiểu hạt
- Điều kiện chế tạo, độ xốp, kích thước lỗ xốp của hạt pha tĩnh
- Bản chất, cấu trúc phân tử của chất tan
- Loại, tốc độ và thành phần của pha động trong quá trình sắc
ký
- Độ nhớt, pH của pha động….


1.2.4. Hệ số không đối xứng T (Tailing factor)
Hệ số không đối xứng T cho biết mức độ không đối xứng của Peak
trên sắc ký đồ thu được. T được tính bằng tỷ số độ rộng của 02 nửa
Peak tại điểm 1/10 chiều cao Peak :

T = a/b
a

b

Peak dạng đối xứng hình Gauss trên thực tế khó đạt được vì vậy
phải quan tâm đến hệ số không đối xứng T,
 Khi T < 2.5 thì phép định lượng được chấp nhận
 Khi T > 2.5 thì điểm cuối của Peak rất khó xác định .



1.3. Hệ số phân giải giữa 2 peak
Độ phân giải là đại lượng biểu thị độ tách của các chất ra khỏi nhau
trên một điều kiện sắc ký đã cho.

(t R 2  t R1 ) 1,177(t R 2  t R1 )
R

Wh1  Wh 2
W0,51  W0,52
2
Trong thực tế nếu các Peak cân đối ( Gass) thì độ phân giải tối thiểu để
02 Peak tách là R =1.0 .Trong phép định lượng R=1,5 là phù hợp.
Độ phân giải phụ thuộc vào hệ số chọn lọc α, số đĩa lý thuyết N, và hệ
số lưu k:

N �
  1 �� K '2 �
Rs 
�
�
�
�
�
�
4 �  ��
1  K '2 �


1.3. Hệ số phân giải giữa 2 peak


1.4. Reduced Parameters ( Các tham số)
 Chiều cao đĩa lý thuyết

 Tốc độ dòng chảy

 Lực cản của dòng chảy, ϕ

Lc
H
h

dp
N .d p

 



u.d p
Dm

p.d p2
Lc . .u





Lc .d p
t o .Dm
p.d p2 .t o
L2c .

1.4. Đường cong Van Deemter


2.Tìm hiểu về HPLC


MỤC LỤC
19

Phần 1: Tổng quan về sắc ký

Phần 2: Những khó khăn và nguồn gốc phát
sinh lỗi

1.1. Hệ thống HPLC

2.1. Qúa trình trộn pha động

1.2. Giới hạn của detector

2.2. PH của pha động

1.3. Độ nhiễu

2.3. Đệm PH của pha động

1.4. Sơ đồ biểu diễn nguyên nhân sai số

2.4. Ảnh hưởng của bản chất acid và nồng
độ


20

What is HPLC ?

HPLC ( High performance liquid chromatography): Là phương
pháp tách trong đó pha động là một chất lỏng, còn pha tĩnh- chứa trong
cột là một chất rắn được phân chia dưới dạng tiểu phân. Quá trình SKL
dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay loại trừ theo kích cỡ.
Sắc ký lỏng hiệu năng cao là kĩ thuật tách, nhận biết, định lượng từng
thành phần trong hỗn hợp.
Ưu điểm của HPLC:
- Thể tích tiêm lượng mẫu nhỏ
- Pha tĩnh gồm các hạt nhỏ kích cỡ từ (3-5µm)
- Mẫu và chất lỏng đi qua cột thông qua áp lực được cung cấp bởi một
máy bơm.



22

1.16. Hệ thống HPLC


23

24


25