Hóa phân tích sắc ký lớp mỏng

Sắc Ký Lớp Mỏng

(Thin Layer Chromatography)
PGS.TS. Nguyễn Đức Tuấn

Bộ môn Hóa Phân Tích – Kiểm Nghiệm
Khoa Dược – Đại học Y Dược TPHCM

Nguyễn Đức Tuấn

Đại học Y Dược TPHCM


Sắc Ký Lớp Mỏng (SKLM)
Mục tiêu: Trình bày được
 Cơ chế chính trong SKLM
 Pha tónh và pha động trong SKLM
 Trang thiết bò dùng trong SKLM
 Các bước tiến hành trong SKLM
 Ứng dụng của SKLM trong ngành Dược

Nguyễn Đức Tuấn

Đại học Y Dược TPHCM


Sắc Ký Lớp Mỏng (SKLM)
Dàn bài


Giới thiệu - Đònh nghóa



Các cơ chế tách trong SKLM



Pha tónh



Pha động



Trang thiết bò



Các bước tiến hành khi thực hiện SKLM



Phát hiện các vết trên bản mỏng



Vài thông số đặc trưng của SKLM



Ứng dụng của SKLM



Đánh giá SKLM

Nguyễn Đức Tuấn

Đại học Y Dược TPHCM


Giới thiệu – Đònh nghóa
 1938: Izmailov & Schraiber dùng bột oxyd nhôm để phân
tích dòch chiết alcaloid thực vật

 Cơ chế: hấp phụ chiếm phần lớn
 Pha tónh: trương nở theo cả chiều dọc và chiều ngang
 Đònh nghóa: SKLM là một phương pháp sắc ký dùng chất
hấp phụ làm pha tónh trải thành lớp mỏng trên tấm kính, nhựa
hay kim loại. Quá trình tách các hợp chất xảy ra khi cho pha

động là dung môi di chuyển qua pha tónh. Do đó SKLM
thuộc sắc ký lỏng - rắn.
 SKLM có thể dùng để tìm các điều kiện tối ưu cho sự tách
bằng sắc ký lỏng trên cột.
Nguyễn Đức Tuấn

Đại học Y Dược TPHCM

Pha tónh
 Silicagel (Kieselgel – gel của acid silicic)
 Sử dụng rộng rải nhất
 Kích thước hạt 10 ‟ 60 m, diện tích bề mặt 200 ‟ 400 m2/g
 Hoạt tính hấp phụ do ‟OH trên bề mặt quyết đònh

 Hàm ẩm tăng sẽ làm giảm hoạt độ
 Hoạt hóa 120oC/1 giờ trước khi sử dụng

HO

OH HO
Si

Si
O

Nguyễn Đức Tuấn

OH HO

OH
Si

O
Đại học Y Dược TPHCM


Pha tónh

 Nhôm oxyd
 Oxyd nhôm trung tính, acid, base
 Hoạt tính tùy thuộc lượng nước
 Hoạt hóa 120oC/1 giờ trước khi sử dụng
 Theo Brockman: 5 bậc oxyd nhôm

Bậc hoạt tính
% nước

Nguyễn Đức Tuấn

I
0

II
3

III
6

IV
10

V
15

Đại học Y Dược TPHCM


Pha tónh

 Xác đònh bậc hoạt tính của nhôm oxyd: dựa vào Rf của màu chuẩn
„Bậc hoạt tính của oxyd nhôm theo Brockman
„Chất màu

„II

„III

„IV

„V

„Giá trò Rf

„Aminoazobenzen

„0,59

„0,74

„0,85

„0,95

„Sudan đỏ

„0,00

„0,10

„0,33

„0,56

„Sudan vàng

„0,01

„0,25

„0,57

„0,78

Nguyễn Đức Tuấn

Đại học Y Dược TPHCM


Pha tónh
 Kieselguhr
 Bột nhẹ, vàng xám chứa 70 ‟ 95% SiO2
 Chất hấp phụ yếu
 Tách các chất phân cực: cetoacid, lacton,…

 Chất mang pha tónh trong sắc ký phân bố
 Kieselguhr ‟ silicagel hay kieselguhr ‟ thạch cao (1:1)
 Thạch cao
 Cellulose: không cần chất kết dính, tách các chất thân nước
 Polyamid: tách các phenol

 Nhựa trao đổi ion: silicagel sulfon hóa
Nguyễn Đức Tuấn

Đại học Y Dược TPHCM


Pha tónh
 Chất hấp phụ đã được tiêu chuẩn hóa
 Chất hấp phụ có chất kết dính: silicagel G (Gypseum), kieselguhr

G, oxyd nhôm G trộn sẳn 5% thạch cao
 Chất hấp phụ không kết dính: silicagel H, oxyd nhôm H
 Chất hấp phụ có thêm chất chỉ thò huỳnh quang: silicagel GF254,
silicagel HF254,…
 Bản sắc ký tráng sẳn với giá đở: thủy tinh, giấy nhôm, polymer

 Ưu điểm bản mỏng tráng sẳn
 Độ ổn đònh cơ học cao, thao tác đơn giản và dễ dàng hơn
 Tính đồng nhất cao: thích hợp để bán đònh lượng, đònh lượng
 Hiệu lực tách cao hơn bản mỏng tráng thủ công
Nguyễn Đức Tuấn

Đại học Y Dược TPHCM


Trang thiết bò – Pha tónh
Tính chất

Các chất được

Pha tónh

Độ acid

Hoạt tính

Tác dụng
phân chia

dùng để phân tách

Silicagel

Acid

Có hoạt tính

Hấp phụ

Hầu hết tất cả

Phân bố

Các chất ít phân cực

Hấp phụ

Hydrocarbon, alcaloid, chất màu thực
phẩm, lipid

Phân bố

Đường, acid béo

Không có hoạt tính

Phân bố

Đường, các triglycerid, các acid béo
bậc cao

Magie diphosphat

Hoạt tính yếu

Hấp phụ

Carotinoic, tocopherol

Magie trisilicat

Hoạt tính yếu

Hấp phụ

Carotinoic, tocopherol

Dẫn chất siloxan
Oxyd nhôm

Base

Có hoạt tính

Cát biển
Kieselguhr

Trung tính

Calci hydroxid

Base

Hoạt tính yếu

Hấp phụ

Carotinoic, tocopherol

Calci phosphat

Base yếu

Hoạt tính yếu

Hấp phụ

Carotinoic, tocopherol

Hoạt tính yếu

Hấp phụ

Carotinoic, tocopherol, các acid béo
glycerid kỵ nước

Có hoạt tính

Hấp phụ

Các chất màu, các acid barbituric

Sắt hydroxid

Có hoạt tính

Hấp phụ

Các chất phân cực

Than

Có hoạt tính

Hấp phụ

Các chất không phân cực

Calci sulfat

Silicagel + oxyd nhôm (1:1)

Acid + base

Cellulose

Thực tế
trung tính

Không có hoạt tính

Phân bố

Acid amin, carbohydrat, nucleotid

Polyamid

Trung tính

Không có hoạt tính

(Trao đổi ?)

Các flavon

Polyacrylonitril

Trung tính

Không có hoạt tính

(Trao đổi, phân bố ?)

Các antoxyan

Nhựa trao đổi ion

Acid + base

Không có hoạt tính

Trao đổi

Acid nucleic, nucleotid, ion kim loại,
halogenic

Rây phân tử

Polymer, protein, phức kim loại

Gel sephadex

Nguyễn Đức Tuấn

Đại học Y Dược TPHCM


Pha động
 Thay đổi tùy theo cơ chế tách
 Tăng cường sức rửa giải: thường kết hợp 2 dung môi

 Không có qui tắc cụ thể để lựa chọn dung môi

 Sắc ký sơ bộ để thăm dò hệ dung môi
 Nên chọn hệ dung môi đơn giản và dùng loại tinh khiết
 Hướng dẫn lựa chọn pha tónh và pha động:
 Tính chất của mẫu phân tích: độ hòa tan, độ phân cực, số lượng và đặc tính
các nhóm chức
 Cơ chế sắc ký của pha tónh
 Dung môi: độ bay hơi, độ nhớt, độ tinh khiết, sự phân lớp

 Chất phân tích ion hay phân cực: dung môi phân cực như butanol ‟ nước,
thêm acid acetic hoặc amoniac
 Pha tónh silicagel hoặc các chất hấp phụ phân cực khác: độ phân cực pha
động quyết đònh tốc độ di chuyển và Rf
 Điều chỉnh sức rửa giải của pha động để Rf: 0,2 ‟ 0,8 đạt độ phân giải cực trò
Nguyễn Đức Tuấn

Đại học Y Dược TPHCM


Pha động
 Một số nhóm chức có khả năng hấp phụ tăng dần:
CH=CH < OCH3 < COOR < C=O < CHO < SH < NH2 < OH < COOH

 Dung môi với sức rửa giải (sức dung môi) tăng dần:
Dung môi
Ether dầu hỏa
Hexan
Heptan
Cyclohexan

Carbon tetraclorid
Ether isopropylic
Toluen
Benzen

Nguyễn Đức Tuấn

0
0,01
0,01
0,01
0,04
0,18
0,28
0,29
0,32

Dung môi
Ether etylic
Cloroform
Methylen clorid
Dicloroetan
Aceton
Dioxan
Butanol
Ethyl acetat

0
0,38
0,40

0,42
0,49
0,56
0,56
0,56
0,58

Dung môi
Acetonitril
Pyridin
Dimethyl sulfoxid
Isopropanol
Ethanol
Methanol
Nước

0
0,65
0,71
0,76
0,82
0,88
0,95
1,00

Đại học Y Dược TPHCM


Trang thiết bò – Bản mỏng
 Bản mỏng dính chắc: chất hấp phụ được trộn

thêm 5 ‟ 15% chất kết dính (thạch cao, tinh bột,
dextrin)
 Bản mỏng không dính chắc

5 x 20
Nguyễn Đức Tuấn

10 x 20

20 x 20

(cm)
Đại học Y Dược TPHCM


Trang thiết bò – Bình sắc ký
 Bình đáy tròn, vuông hoặc chữ nhật

Các loại bình sắc ký
Nguyễn Đức Tuấn

Đại học Y Dược TPHCM


Các bước tiến hành khi thực hiện SKLMù
 Chuẩn bò bản mỏng, bình sắc ký thích hợp, pha động

F

 Chấm dung dòch lên bản mỏng: 1-10g

X

 Khai triển sắc ký

A

 Phát hiện các vết trên bản mỏng
 Màu sắc tự nhiên của vết

O

 Phun thuốc thử hiện màu

x

x

x

 Soi dưới đèn UV 254 hoặc 365 nm: thêm chất
phát huỳnh quang không tan vào pha tónh
 Dùng máy đo mật độ quang (densitometer): đo

Mẫu

cường độ tia phản xạ từ bề mặt bản mỏng khi soi
dưới đèn UV. Chất phân tích hấp thụ bức xạ được
ghi lại thành pic sắc ký
Nguyễn Đức Tuấn

Triển khai sắc ký
Đại học Y Dược TPHCM


Thuốc thử hiện màu
Thuốc thử

Màu của vết

Ứng dụng phân tích

Acid phosphomolypdic

Xanh tối

Nhiều chất hữu cơ

Acid sulfuric đặc

Nâu ‟ đen

Tất cả các chất hữu cơ

Hơi iod

Nâu

Nhiều chất hữu cơ

Ninhydrin

Hồng ‟ tím

Acid amin, các nhóm chức amin

2,4-dinitrophenylhydrazon

Da cam, đỏ

Các hợp chất carbonyl

Xanh hoặc lục
bromocresol

Vàng

Các acid hữu cơ

2,7 fluorescein

Vàng ‟ lục

Nhiều chất hữu cơ

Vanilin/acid sulfuric

Xanh ‟ lục ‟ hồng

Alcol, ceton

Rhodamin B

Huỳnh quang đỏ

Các chất lipid

Anisaldehyd/SbCl3

Nhiều màu

Các chất steroid

Diphenylamin/Zn2+

Nhiều màu

Các chất bảo vệ thực vật

Thuốc thử chung

Thuốc thử chọn lọc

Nguyễn Đức Tuấn

Đại học Y Dược TPHCM


Thông số đặc trưng của SKLM: Hệ số lưu giữ Rf (Retardation factor)

dR V
Rf 

d M V0

===>

- Rf = 0: chất tan hoàn toàn không di chuyển,
nằm tại điểm xuất phát
- Rf = 1: chất tan di chuyển cùng với vận tốc của
dung môi
- dR: khoảng di chuyển được của chất cần tách
- dM: khoảng di chuyển được của dung môi
- v: vận tốc di chuyển của chất cần tách
- V0: vận tốc di chuyển của dung môi

Nguyễn Đức Tuấn

Đường
dung
môi

0  Rf  1

dM

dR
x x
1 2

Đại học Y Dược TPHCM


Thông số đặc trưng của SKLM: Hệ số lưu giữ Rf (Retardation factor)

- Các yếu tố ảnh hưởng đến Rf
 Chất lượng và hoạt tính của chất hấp phụ
 Chiều dày của lớp mỏng, quảng đường sắc ký,
lượng chất chấm
 Vò trí và số lượng chất cần tách trên bản mỏng
 Thành phần và độ tinh khiết của pha động
 Phương pháp khai triển sắc ký
 Độ bão hòa của dung môi trong bình sắc ký
(hiện tượng “bờ”)
 nh hưởng của các cấu tử khác có trong thành
phần hỗn hợp cần tách
 Độ ẩm, nhiệt độ và pH...

Nguyễn Đức Tuấn

Hiện tượng “bờ”

Đại học Y Dược TPHCM


Thông số đặc trưng của SKLM: Hệ số lưu giữ Rf (Retardation factor)

- Sử dụng chất đối chiếu

OX

R f ( X ) OF OX
Rs ( X ) 


OA OA
R f ( A)
OF
* Hai chất giống nhau lần lượt phải có Rf và
Rs bằng nhau.

* Hai chất phải có cùng lượng chấm như nhau
và được triển khai trong cùng điều kiện sắc ký

Nguyễn Đức Tuấn

F
X
A

O

x

x

x

Sắc ký đồ sắc
ký đối chứng

Đại học Y Dược TPHCM


Thông số đặc trưng của SKLM

Hệ số dung lượng

Số đĩa lý thuyết biểu kiến

Độ phân giải

dM  dR 1 R f
k'

dR
Rf

 dR 
N  16 
W 

2[d B  d A ]
Rs 
WA  WB

Đường
dung
môi

2

dB

WB

dM

dA

dR

W

WA

x x
1 2

Nguyễn Đức Tuấn

Đại học Y Dược TPHCM


Các kỹ thuật khai triển SKLM
 Sắc ký một chiều
 Sắc ký hai chiều
 Mẫu phân tích nhiều chất
 Sắc ký một chiều không đủ độ tin cậy

Kỹ thuật sắc ký hai chiều

Nguyễn Đức Tuấn

Đại học Y Dược TPHCM


Các kỹ thuật khai triển SKLM
Đường dung môi

Đường chấm mẫu

Dung môi B

Dung môi A
Sắc ký đồ SKLM hai chiều của một vài acid amin.
Dung môi A: toluen/2-chloroetanol/pyridine.
Dung môi B: Chloroform/benzyl alcohol/acid
acetic.
1. acid aspartic, 2. acid glutamic, 3. serine, 4. alanine, 5. glycine, 6. alanine, 7. methionine, 8.
valine, 9. isoleucine, 10. cysteine.
Nguyễn Đức Tuấn

Sắc ký đồ các dẫn chất xanthin trên bản
mỏng pha đão C-18.
Pha động: metanol/K2HPO4 0,1 M (55:45
tt/tt). Phát hiện: hơi iod. Thời gian khai
triển: 1 giờ. Các giá trò Rf: theobromin 0,68;
theophylin 0,56; cafein: 0,44; 3-isobutylmetyl xanthin 0,21.
Đại học Y Dược TPHCM

Các kỹ thuật khai triển SKLM
Sắc ký chế hóa
 Tách các chất với lượng nhỏ trong trường hợp không thể tách bằng các
phương pháp khác

Kỹ thuật sắc
ký chế hóa
(đánh dấu và
cạo riêng từng
vùng)

Dung môi

Dung môi

CHP
chứa B

CHP
chứa A

phản hấp phụ

Nguyễn Đức Tuấn

Đại học Y Dược TPHCM


Ứng dụng của SKLM
 Đònh tính và thử tinh khiết

 Dựa vào Rf
 Sắc ký so sánh chất thử X với chất đối chiếu A trên cùng một sắc đồ
 Điều kiện X là A: Rf(X) = Rf(A) với các hệ dung môi khác nhau
 Chất thử được coi là tinh khiết khi trên sắc ký đồ không có vết lạ

 Bán đònh lượng – đònh lượng
 Tách chiết chất phân tích trong vết sắc ký bằng dung môi thích hợp, làm sạch
dòch chiết, đònh lượng bằng kỹ thuật thích hợp: ít dùng, tốn thời gian
 Đònh lượng trực tiếp trên bản mỏng: đo diện tích hay cường độ màu vết sắc
ký
 Dùng máy đo mật độ quang (Densitometer): chiếu chùm tia vào vết sắc
ký và đo cường độ hấp thụ hoặc huỳnh quang
 Xử lý ảnh với camera kỹ thuật số độ phân giải cao: quét bản mỏng với
hệ thống phân tích thu nhận hình ảnh của vết sắc ký. Xử lý dữ liệu ảnh bằng
máy tính
Nguyễn Đức Tuấn

Đại học Y Dược TPHCM


SKLM hiệu năng cao
(High Performance Thin Layer Chromatography, HPTLC)
 Sử dụng bản mỏng tráng sẵn có bề dày 0,1 mm
 Pha tónh silica và pha liên kết siloxan 5 m
 Tăng độ tin cậy của kết quả phân tích
 Tăng độ phân giải và độ nhạy:

 Vết sắc ký nhỏ hơn
 Thời gian sắc ký ngắn hơn
 Lượng dung môi dùng ít hơn



Sai số của phương pháp: 5 ‟ 10% chủ yếu do đưa mẫu lên bản
mỏng

Nguyễn Đức Tuấn

Đại học Y Dược TPHCM