KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ ĐẾN QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN MÀNG RUỘT HEO BẰNG ENZYME PROTAMEX VÀ ALCALASE 2.4L FG

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ ĐẾN QUÁ
TRÌNH THỦY PHÂN MÀNG RUỘT HEO BẰNG ENZYME
PROTAMEX VÀ ALCALASE 2.4L FG

Họ và tên sinh viên: NGUYỄN THỊ THÚY DIỄM
Ngành: BẢO QUẢN VÀ CHẾ BIẾN NÔNG SẢN THỰC PHẨM
Niên khóa: 2007 - 2011

Tháng 08/2011


KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ ĐẾN QUÁ
TRÌNH THỦY PHÂN MÀNG RUỘT HEO BẰNG ENZYME
PROTAMEX VÀ ALCALASE 2.4L FG

Tác giả

NGUYỄN THỊ THÚY DIỄM

Khóa luận được đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp bằng Kỹ sư ngành
Bảo quản và chế biến nông sản thực phẩm

Giáo viên hướng dẫn:
TS. Phan Tại Huân

Tháng 08 năm 2011

i


LỜI CẢM ƠN
Con xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Ba Mẹ và các thành viên trong gia đình,
những người đã nuôi dưỡng, dạy dỗ con nên người, cho con nghị lực, niềm tin, luôn
khuyên nhủ, động viên và chia sẻ cùng con những vui buồn trong cuộc sống.
Em ghi nhớ công ơn của các Thầy Cô Khoa Công Nghệ Thực Phẩm Trường Đại
Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh đã truyền đạt cho em những kiến thức quý báu về
công nghệ thực phẩm và những vốn kinh nghiệm vô giá trong cuộc sống.
Đặc biệt em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Thầy Phan Tại Huân là người trực
tiếp hướng dẫn và giúp đỡ tận tình để em hoàn thành luận văn này.
Tôi xin gửi lời cảm ơn đến tất cả bạn bè tôi, các bạn lớp DH07BQ, DH07DD và
DH07VT đã động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện đề tài này.
Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn.
Nguyễn Thị Thúy Diễm

ii


TÓM TẮT
Đề tài nghiên cứu “Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố đến quá trình thủy
phân màng ruột heo bằng enzyme Protamex và Alcalase 2.4L FG” được tiến hành tại
phòng thí nghiệm Hóa sinh Khoa Công Nghệ Thực Phẩm, trường Đại học Nông Lâm TP.
HCM, thời gian từ ngày 01/04/2011 đến ngày 31/07/2011.
Đề tài này nhằm mục đích khảo sát ảnh hưởng của từng yếu tố riêng lẻ như nồng độ
enzyme, nhiệt độ, pH lên hoạt động của enzyme Protamex và enzyme Alcalase 2.4L FG
và khảo sát thời gian thủy phân của hai loại enzyme trên. Kết quả thí nghiệm được đánh
giá qua hoạt độ của enzyme (hàm lượng amino acid được thủy phân trên một đơn vị khối

lượng enzyme trong một đơn vị thời gian).
Kết quả thí nghiệm cho thấy enzyme Protamex hoạt động tốt ở vùng nồng độ
enzyme 0,1%, nhiệt độ 60oC, pH 7 – 8, quá trình thủy phân đạt được 6,47 oBx sau 6 giờ
và hàm lượng amino acid được tạo thành 1941,35 mg aa /ml dd . Enzyme Alcalase 2.4L FG
hoạt động tốt ở vùng nồng độ enzyme 0,1%, nhiệt độ 60oC, pH = 8, quá trình thủy phân
đạt được 5,43 oBx sau 6 giờ và hàm lượng amino acid được tạo thành 1889,76 mg aa /ml dd .

iii


MỤC LỤC
Trang
Trang tựa.......................................................................................................................... i
Lời cảm ơn ...................................................................................................................... ii
Tóm tắt ...........................................................................................................................iii
Mục lục .......................................................................................................................... iv
Danh sách các chữ viết tắt ............................................................................................ vii
Danh sách các hình ......................................................................................................viii
Chương 1 MỞ ĐẦU ...................................................................................................... 1
1.1 Đặt vấn đề ................................................................................................................. 1
1.2 Mục đích ................................................................................................................... 1
1.3 Yêu cầu ..................................................................................................................... 2
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................................... 3
2.1 Tổng quan về ruột heo .............................................................................................. 3
2.1.1 Cấu tạo của ruột heo ......................................................................................... 3
2.1.2 Thành phần dinh dưỡng của màng ruột ............................................................ 4
2.1.3 Quy trình sản xuất vỏ bọc tự nhiên từ ruột heo ................................................ 4
2.2 Tổng quan về enzyme protease ................................................................................ 6
2.2.1 Giới thiệu chung về enzyme protease .............................................................. 6
2.2.2 Phân loại protease ............................................................................................. 6

2.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự hoạt động của của enzyme protease ................. 7
2.2.4 Đặc tính của enzyme Protamex và Alcalase 2.4L FG ...................................... 9
2.2.4.1 Enzyme Protamex ................................................................................... 9
2.2.4.2 Enzyme Alcalase® 2.4L FG .................................................................. 10
2.3 Tổng quan về protein .............................................................................................. 11
2.3.1 Khái niệm ....................................................................................................... 11
2.3.2 Giá trị dinh dưỡng của protein ....................................................................... 12
2.4 Sự thủy phân protein............................................................................................... 12
iv


2.5 Giới thiệu về amino acid ........................................................................................ 12
Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................ 14
3.1 Thời gian và địa điểm ............................................................................................. 14
3.2 Đối tượng nghiên cứu ............................................................................................. 14
3.3 Một số dụng cụ, thiết bị và hóa chất sử dụng ......................................................... 14
3.3.1 Một số dụng cụ và thiết bị .............................................................................. 14
3.3.2 Một số hóa chất sử dụng ................................................................................. 15
3.4 Phương pháp nghiên cứu ........................................................................................ 15
3.4.1 Bố trí thí nghiệm ............................................................................................. 15
3.4.1.1 Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố đến quá trình thủy
phân màng ruột heo bằng enzyme Protamex .................................................... 15
3.4.2.2 Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố đến quá trình thủy
phân màng ruột heo bằng enzyme Alcalase 2.4L FG ....................................... 18
3.4.3 Phương pháp phân tích ................................................................................... 21
3.4.3.1 Phương pháp xác định hàm lượng amino acid ..................................... 21
3.4.3.2 Phương pháp xác định hàm lượng protein hòa tan ............................... 21
3.4.3.3 Cách tính hoạt độ enzyme .................................................................... 22
3.4.4 Phương pháp xử lý số liệu .............................................................................. 23
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................................. 24

4.1 Kết quả xây dựng đường chuẩn .............................................................................. 24
4.1.1 Kết quả xây dựng đường chuẩn amino acid ................................................... 24
4.1.2 Kết quả xây dựng đường chuẩn protein hòa tan............................................. 24
4.2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố đến quá trình thủy phân màng
ruột heo bằng enzyme Protamex…. ............................................................................. 25
4.2.1 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme Protamex đến quá trình thủy phân ............ 26
4.2.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình thủy phân .......................................... 27
4.2.3 Ảnh hưởng của pH đến quá trình thủy phân .................................................. 28
4.2.4 Ảnh hưởng của thời gian đến quá trình thủy phân ......................................... 29
v


4.3 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố đến quá trình thủy phân màng
ruột heo bằng enzyme Alcalase® 2.4L FG ................................................................... 32
4.3.1 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme Alcalase® 2.4L FG đến quá trình thủy
phân ......................................................................................................................... 32
4.3.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình thủy phân .......................................... 34
4.3.3 Ảnh hưởng của pH đến quá trình thủy phân .................................................. 35
4.3.4 Ảnh hưởng của thời gian đến quá trình thủy phân ........................................ .36
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ...................................................................... 39
5.1 Kết luận................................................................................................................... 39
5.2 Đề nghị ................................................................................................................... 39
TÀI LIỆU THAM KHẢO.......................................................................................... 41
PHỤ LỤC .................................................................................................................... 44

vi


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
HĐE

Hoạt độ enzyme

NT

Nghiệm thức

TN

Thí nghiệm

BSA

Bovine serum albumin

EDTA

Ethylen diamin tetraacetic acid

FAO

Food and Agriculture Organization

FCC

Food Chemicals Codex

FDA

Food and Drug Administration

JECFA

Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives

OD

Densité optique

UV

Ultraviolet

WHO

World Trade Organization

vii


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Trang
Hình 2.1 Cấu tạo của ruột heo ....................................................................................... 3
Hình 2.2 Quy trình sản xuất vỏ bọc xúc xích từ ruột heo .............................................. 5
Hình 2.3 Enzyme Protamex ......................................................................................... 10
Hình 2.4 Enzyme Alcalase 2.4L FG ............................................................................ 11
Hình 4.1 Đường chuẩn amino acid .............................................................................. 24
Hình 4.2 Đường chuẩn protein hòa tan ........................................................................ 25
Hình 4.3 Màng ruột heo trước khi thủy phân .............................................................. 25
Hình 4.4 Màng ruột heo sau khi thủy phân.................................................................. 26

Hình 4.5 Hoạt độ của enzyme Protamex ở các nồng độ enzyme khác nhau ............... 27
Hình 4.6 Hoạt độ của enzyme Protamex ở các mức nhiệt độ ...................................... 28
Hình 4.7 Hoạt độ của enzyme Protamex ở các mức pH .............................................. 29
Hình 4.8 Đồ thị biểu diễn đường cong thủy phân niêm mạc ruột heo của
enzyme Protamex. ........................................................................................................ 30
Hình 4.9 Đồ thị biểu diễn hàm lượng protein hòa tan tạo thành của quá trình thủy
phân màng ruột heo bằng enzyme Protamex ................................................................ 31
Hình 4.10 Đồ thị biểu diễn hàm lượng chất tan tạo thành của quá trình thủy phân
màng ruột heo bằng enzyme Protamex ........................................................................ 32
Hình 4.11 Hoạt độ của enzyme Alcalase 2.4L FG ở các nồng độ khác nhau ............. 33
Hình 4.12 Hoạt độ của enzyme Alcalase 2.4L FG ở các mức nhiệt độ ....................... 34
Hình 4.13 Hoạt độ của enzyme Alcalase 2.4L FG ở các mức pH ............................... 35
Hình 4.14 Đồ thị biểu diễn đường cong thủy phân của màng ruột heo của
enzyme Alcalase 2.4L FG ............................................................................................ 36
Hình 4.15 Đồ thị biểu diễn hàm lượng protein hòa tan tạo thành của quá trình
thủy phân màng ruột heo bằng enzyme Alcalase 2.4L FG .......................................... 37
Hình 4.16 Đồ thị biểu diễn hàm lượng chất tan tạo thành của quá trình thủy
phân màng ruột heo bằng enzyme Alcalase 2.4L FG................................................... 38
viii


Chương 1
MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề.
Hiện nay các công ty, xí nghiệp chế biến thực phẩm từ gia súc ngày càng tăng và
hằng ngày sản xuất ra một lượng lớn ruột heo như công ty Vissan, xí nghiệp Nam Phong,
nhà máy D&F… Đặc biệt trong những năm gần đây ruột heo được sử dụng phổ biến để
làm vỏ bọc các loại thực phẩm chế biến sẵn như xúc xích, lạp xưởng thay thế các vỏ bọc
nhân tạo như collagen, cellulose, plastic... hoặc làm thức ăn cho vật nuôi. Trong quá trình
sản xuất vỏ bọc xúc xích, lạp xưởng thì người ta chỉ sử dụng màng dưới nhầy do độ dai

chắc của nó, hỗn hợp còn lại gồm có màng nhầy, lớp cơ, màng niêm gọi chung là màng
ruột sẽ bị loại bỏ, gây ô nhiễm môi trường. Hiện nay có nhiều phương pháp để xử lý
màng ruột này, một trong các phương pháp xử lý có hiệu quả kinh tế lại không gây ô
nhiễm môi trường là sử dụng enzyme để thủy phân tạo ra dung dịch giàu đạm vừa tận
dụng được nguồn nguyên liệu có sẵn, vừa nâng cao giá trị sử dụng của nó và giảm chi phí
xử lý chất thải.
Với mục đích góp phần tạo cho sản phẩm mới giàu acid amin và protein hòa tan để
có thể tận dụng bổ sung các sản phẩm thực phẩm, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài
“Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố đến quá trình thủy phân màng ruột heo
bằng enzyme Protamex và Alcalase 2.4L FG”.
1.2 Mục đích
Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố đến quá trình thủy phân màng ruột heo bằng
enzyme Protamex và Alcalase 2.4L FG tạo ra dịch amino acid bổ sung vào các sản phẩm
thực phẩm, làm tăng giá trị dinh dưỡng.

1


1.3 Yêu cầu
-

Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến quá trình thủy phân

-

Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình thủy phân

-

Khảo sát ảnh hưởng của pH đến quá trình thủy phân

-

Khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến quá trình thủy phân

2


Chương 2
TỔNG QUAN
2.1 Tổng quan về ruột heo
2.1.1 Cấu tạo của ruột heo
Ruột non của heo gồm có 4 lớp: màng nhầy, màng dưới nhầy, lớp cơ ruột non (cơ
vòng, cơ thẳng) và màng niêm.

Hình 2.1: Cấu tạo của ruột heo
(Theo McPherson và ctv, 2000)
-

Màng nhầy (mucosa): còn gọi là màng niêm mạc, là lớp màng liên tục của đường

ruột từ miệng xuống hậu môn. Màng niêm mạc là màng chất nhờn bên trong ruột
heo, được lấy ra bằng cách ép của máy cạo niêm mạc hoặc máy nghiền. Niêm mạc được
sử dụng bởi các ngành công nghiệp dược phẩm để sản xuất heparin, sử dụng trong y
học như là một thuốc kháng đông (Ockerman và Hansen, 1988). Niêm mạc còn sử dụng
để chế biến thức ăn cho vật nuôi.
-

Màng dưới nhầy (submucosa): chứa các mô liên kết có độ dai chắc nên sử dụng

làm vỏ bọc tự nhiên trong sản xuất các sản phẩm như xúc xích, lạp xưởng.
-

Lớp cơ (muscle layers)

-

Màng niêm (serosa)
3


Màng dưới nhầy chứa các mô liên kết có độ dai chắc nên sử dụng làm vỏ bọc tự nhiên
bằng cách loại bỏ các phần còn lại. Phần còn lại là một hỗn hợp gồm màng nhầy, lớp cơ,
màng niêm ở dạng sệt gọi là màng ruột.
2.1.2 Thành phần dinh dưỡng của màng ruột.
Màng ruột thường bao gồm acid nucleic, polysaccharides, Chondroitin A,
chondroitin sulfate, dermatin sulfate, heparin sulfate, heparin hoặc hỗn hợp của
polysaccharides trong đó bao gồm các hợp chất này. Theo Van De Ligt và ctv (2003),
thành phần của màng ruột bao gồm ít nhất khoảng 10% khối lượng acid nucleic,
nucleotide, nucleoside; 20% khối lượng polysaccharides; 10% khối lượng acid amin,
protein và các polypeptide. Trong màng ruột ban đầu đã có acid amin nên trước khi tiến
hành thủy phân phải xác định hàm lượng amino acid ban đầu.
2.1.3 Quy trình sản xuất vỏ bọc tự nhiên từ ruột heo.
Ruột heo sau khi được làm sạch và rửa sạch cho vào máy cạo ra ba lớp trong cấu
trúc ruột, lớp còn lại là submucosa được làm sạch, ướp muối, phơi khô hoặc lưu giữ dưới
điều kiện làm lạnh để bảo quản. Quy trình sản xuất vỏ bọc xúc xích trình bày qua Hình
2.1.

4

Hình 2.2: Quy trình sản xuất vỏ bọc xúc xích từ ruột heo.
(Theo Trương văn Thông và ctv, 2005)
5


2.2 Tổng quan về enzyme protease
2.2.1 Giới thiệu chung về enzyme protease
Nhóm enzyme protease (peptide – hydrolase 3.4) xúc tác quá trình thuỷ phân liên
kết peptide (-CO-NH-) n trong phân tử protein, polypeptide đến sản phẩm cuối cùng là các
acid amin. Ngoài ra, một số protease thu nhận từ thực vật còn có khả năng thuỷ phân liên
kết amide và liên kết ester (Nguyễn Minh Hải, 2007).
Protease cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng về chức năng từ mức độ tế
bào, cơ quan đến cơ thể nên được phân bố rất rộng rãi trên nhiều đối tượng từ vi sinh vật
(vi khuẩn, nấm và virus) đến thực vật (đu đủ, dứa...) và động vật (gan, dạ dày bê...). So
với protease động vật và thực vật, protease vi sinh vật có những đặc điểm khác biệt.
Trước hết hệ protease vi sinh vật là một hệ thống rất phức tạp bao gồm nhiều enzyme rất
giống nhau về cấu trúc, khối lượng và hình dạng phân tử nên rất khó tách ra dưới dạng
tinh thể đồng nhất. Cũng do là phức hệ gồm nhiều enzyme khác nhau nên protease vi sinh
vật thường có tính đặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm thuỷ phân triệt để và đa dạng.
2.2.2 Phân loại protease
Protease được phân chia thành hai loại: endopeptidase và exopeptidase.
– Exopeptidase thủy phân liên kết peptide ở hai đầu tận cùng của mạch polypeptide.
Dựa vào vị trí tác động trên mạch polypeptide, exopeptidase được phân chia thành hai
loại:
+ Aminopeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu N tự do của chuỗi
polypeptide để giải phóng ra một amino acid, một dipeptide hoặc một tripeptide (Trịnh
Ngọc Hân, 2007).
+ Carboxypeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu C của chuỗi
polypeptide và giải phóng ra một amino acid hoặc một dipeptide (Trịnh Ngọc Hân, 2007).

– Endopeptidase cắt các liên kết peptide nằm sâu trong mạch polypeptide. Dựa vào
động học của cơ chế xúc tác, endopeptidase được chia thành bốn nhóm:
+ Serin proteinase: là những proteinase chứa nhóm –OH của gốc serine trong trung
tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác của enzyme.
Nhóm này bao gồm hai nhóm nhỏ: chymotrypsin và subtilisin. Nhóm chymotrypsin bao
6


gồm các enzyme động vật như chymotrypsin, trypsin, elastase. Nhóm subtilisin bao gồm
hai loại enzyme vi khuẩn như subtilisin Carlsberg, subtilisin BPN. Các serine proteinase
này có tính đặc hiệu cơ chất và khoảng hoạt động xúc tác rộng từ pH 4,5 – 10 (Nguyễn
Thị Đan Thùy, 2010).
+ Cysteine proteinase: các proteinase chứa nhóm –SH trong trung tâm hoạt động.
Cystein proteinase bao gồm các proteinase thực vật như papain, bromelin, một vài protein
động vật và proteinase ký sinh trùng. Các cystein proteinase thường hoạt động ở vùng pH
trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất rộng.
+ Aspartic proteinase: hầu hết các aspartic proteinase thuộc nhóm pepsin. Nhóm
pepsin bao gồm các enzyme tiêu hóa như: pepsin, chymosin, cathepsin, renin. Các
aspartic proteinase có chứa nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt động và thường hoạt
động mạnh ở pH trung tính.
+ Metallo proteinase: là nhóm proteinase được tìm thấy ở vi khuẩn, nấm mốc cũng
như các vi sinh vật bậc cao hơn. Các metallo proteinase thường hoạt động vùng pH trung
tính và hoạt độ giảm mạnh dưới tác dụng của EDTA.
Dựa vào pH hoạt động, protease được phân loại thành ba nhóm:
– Protease acid: pH 2 – 4
– Protease trung tính: pH 7 – 8
– Protease kiềm: pH 9 – 11
2.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự hoạt động của của enzyme protease
– Ảnh hưởng của nhiệt độ
Mỗi enzyme có một nhiệt độ tối thích mà tại đó thể hiện hoạt tính xúc tác cao nhất.

Nhiệt độ tối thích này phụ thuộc vào loại enzyme, nguồn thu enzyme, pH… Các enzyme
ở động vật có nhiệt độ thích hợp khoảng 40oC, ở các nòi vi sinh vật chịu nhiệt độ cao,
enzyme của chúng có nhiệt độ thích hợp cao (Nguyễn Hữu Chấn, 1983). Nhiệt độ hoạt
động của các protease vi khuẩn không cố định mà có thể thay đổi tùy thuộc cơ chất và
thời gian.

7


Hoạt động của protease sẽ giảm ở nhiệt độ cao, do bị phá vỡ cấu trúc enzyme. Ở
nhiệt độ quá cao enzyme sẽ mất hoạt độ, ngược lại ở nhiệt độ quá thấp thì enzyme ngưng
hoạt động nhưng không mất hoạt độ.
– Ảnh hưởng của pH
pH ảnh hưởng rất lớn đến hoạt động xúc tác của enzyme. pH ảnh hưởng đến trạng
thái ion hóa của enzyme và cả cơ chất. pH thích hợp cho enzyme hoạt động là giá trị pH
mà tại đó enzyme và cơ chất tích điện trái dấu do đó mà kết hợp với nhau dễ dàng.
Đại đa số enzyme thích hợp với pH từ 5 đến 9 (Phạm Thị Trân Châu, Phan Tuấn
Nghĩa, 2006). Mỗi enzyme chỉ hoạt động mạnh nhất ở một vùng pH xác định gọi là pH
tối thích, pH tối thích của mỗi loại enzyme không cố định có thể thay đổi tùy theo tính
chất và nồng độ cơ chất, nhiệt độ...
– Ảnh hưởng của nồng độ enzyme.
Nồng độ enzyme ảnh hưởng lớn đến phản ứng enzyme. Khi cơ chất còn thừa, nếu
nồng độ enzyme tăng thì vận tốc phản ứng enzyme tăng. Khi hết cơ chất, nếu tăng nồng
độ enzyme vận tốc phản ứng vẫn không tăng.
– Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất
Khi nồng độ cơ chất giảm thì mức độ tiếp xúc giữa enzyme và cơ chất giảm nên
phản ứng enzyme cũng giảm.
– Thời gian hoạt động
Theo một số nghiên cứu thì tốc độ thủy phân tăng vọt trong thời gian đầu, sau đó
tốc độ phản ứng chậm lại. Thời gian hoạt động của protease vi khuẩn phụ thuộc độ bền

hoạt tính của protease. Thông thường hoạt tính protease có thể giữ được trong 60 – 82 giờ
tuy nhiên hoạt tính của protease sẽ giảm dần.
Ngoài ra còn ảnh hưởng của các yếu tố khác như bản chất của protease, diện tích tiếp
xúc giữa enzyme và cơ chất, chất hoạt hóa và chất ức chế, nồng độ sản phẩm sinh ra…
Tóm lại quá trình thủy phân protease chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố. Vì vậy muốn
quá trình thủy phân có hiệu quả cao phải tối ưu hóa các yếu tố này.

8


2.2.4 Đặc tính của enzyme Protamex và Alcalase 2.4L FG
2.2.4.1 Enzyme Protamex
Đặc tính của sản phẩm:
− Tên thương mại: Protamex®
− Loại enzyme: serine protease thuộc nhóm subtilisin
− Sản phẩm có màu nâu sáng. Tuy nhiên màu có thể thay đổi tùy từng lô. Cường độ
màu không phải là một chỉ tiêu để đánh giá hoạt động của enzyme.
− Dạng vật lý: hạt nhỏ
− Được sản xuất bởi vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus licheniformis
− Liều lượng khuyến cáo sử dụng: 1 – 2 kg/tấn
− Nhiệt độ tồn trữ: 0 – 25oC (32 - 77oF).
− Điều kiện bảo quản: bao gói và bảo quản trong điều kiện khô ráo và tránh ánh sáng
mặt trời. Thời gian bảo quản kéo dài hoặc điều kiện bảo quản không không thích hợp như
nhiệt độ cao hoặc độ ẩm cao có thể làm giảm hoạt động xúc tác của enzyme.
− Điều kiện hoạt động tối ưu của Protamex®
+ pH: 7 – 8
+ Nhiệt độ: 40 – 60°C
− Hạn sử dụng: sử dụng tốt nhất trong 6 tháng kể từ ngày phân phối.
− Enzyme này bất hoạt khi xử lý nhiệt ở 95°C trong 5 phút (hoặc 85°C trong 10
phút).

Đây là sản phẩm enzyme được FAO/WHO, JECFA và FCC công bố đạt tiêu chuẩn
dùng cho thực phẩm.

9


Hình 2.3: Enzyme Protamex
2.2.4.2 Enzyme Alcalase® 2.4L FG
Đặc tính của sản phẩm:
−

Tên thương mại: Alcalase®

− Loại enzyme: protease thuộc nhóm serine proteinase
− Enzyme Alcalase® còn có tên khác là Subtilisin A (Subtilisin Carlsberg) được sản
xuất bởi vi khuẩn Bacillus licheniformis.
− Sản phẩm có màu nâu. Tuy nhiên màu có thể thay đổi tùy từng lô. Cường độ màu
không phải là một chỉ tiêu để đánh giá hoạt động của enzyme.
− Dạng vật lý: thể lỏng
− Độ hòa tan: dễ dàng hòa tan trong nước.
− Liều lượng khuyến cáo sử dụng: 1 – 2 kg/tấn
− Nhiệt độ bảo quản: 0 – 10°C
− Điều kiện bảo quản: bao gói và bảo quản trong điều kiện khô ráo và tránh ánh sáng
mặt trời. Thời gian bảo quản kéo dài hoặc điều kiện bảo quản không không thích hợp như
nhiệt độ cao hoặc độ ẩm cao có thể làm giảm hoạt động xúc tác của enzyme, enzyme hoạt
động tốt trong 24 tháng kể từ ngày sản xuất.

10

− Điều kiện hoạt động tối ưu của chế phẩm Alcalase® 2.4L FG:
+ pH: 6,5 – 8
+ Nhiệt độ: 40 – 60°C.
Enzyme này bất hoạt khi xử lý nhiệt ở 85°C trong vòng 10 – 15 phút.
Đây là sản phẩm enzyme được FAO/WHO, JECFA và FCC công bố đạt tiêu chuẩn
dùng cho thực phẩm. Sản phẩm này đã được công bố chất lượng với BYT Việt Nam số
4580/2006/YT – CNTC.

Hình 2.4: Enzyme Alcalase 2.4L FG
2.3 Tổng quan về protein
2.3.1 Khái niệm
Từ ngữ protein bắt đầu từ chữ Hi lạp “protos” nghĩa là chủ yếu, đầu tiên, do các
công trình của Berzelius đến Mulder áp dụng vào năm 1838 cho các hợp chất hữu cơ có
chứa nitrogen, đó là các polymer sinh học được xây dựng từ các gốc α-amino acid.
Theo quan điểm hóa học thì protein là một hợp chất hữu cơ rất lớn, có hai đặc
điểm quan trọng (Nguyễn Phước Nhuận và ctv, 2007).
-

Trong thành phần cấu tạo luôn chứa nitrogen (N) với tỉ lệ tương đối ổn định
khoảng 16%.

-

Có trọng lượng phân tử rất cao nên gọi là đại phân tử protein.
Protein là thành phần rất quan trọng của cơ thể, nó có mặt trong nhân, nguyên sinh

chất, màng tế bào, là hợp chất bắt buộc, thường trực. Quá trình sống là sự trao đổi chất,

11

đổi mới của protein. Vì vậy, protein là thành phần không thể thiếu được trong khẩu phần
ăn hằng ngày của cả con người và động vật.
2.3.2 Giá trị dinh dưỡng của protein
Theo Đàm Sao Mai và ctv (2009), giá trị dinh dưỡng của protein:
− Hàm lượng protein quyết định chất lượng của khẩu phần thức ăn.
− Nếu thiếu protein cơ thể sẽ suy dinh dưỡng, chậm lớn, giảm khả năng miễn dịch,
gây ảnh hưởng xấu đến một số cơ quan chức năng (gan, tuyến nội tuyết, hệ thần kinh).
− Ngoài ra nếu thiếu protein xương sẽ bị thay đổi thành phần hóa học, cấu tạo.
2.4 Sự thủy phân protein
Quá trình thủy phân là quá trình phân cắt một hợp chất cao phân tử thành các phần
tử đơn giản hơn dưới tác dụng của các chất xúc tác và có sự tham gia của nước (Trần
Minh Tâm, 1998). Trong quá trình thủy phân protein, các phân tử protein hút nước và các
liên kết peptide bị phá hủy. Trong giai đoạn đầu các peptide có phân tử thấp, các phân tử
này lại tiếp tục được phân giải đến các amino acid (amino acid là sản phẩm cuối cùng của
sự thủy phân protein). Trong môi trường kiềm, arginin, acid amin chứa lưu huỳnh bị phân
hủy. Xảy ra hiện tượng racemic hóa (acid amin chuyển sang dạng D dẫn đến không còn
giá trị dinh dưỡng). Chính vì vậy trong sản xuất, thường hay dùng phương pháp thủy phân
bằng acid hoặc bằng enzyme (Đàm Sao Mai và ctv, 2009).
Thực chất của quá trình thủy phân protein là chuyển nitơ hữu cơ ở dạng không hòa
tan (protein) sang nitơ hữu cơ hòa tan (peptide và acid amin). Hỗn hợp acid amin và
peptide hòa tan này rất có ý nghĩa trong sản xuất thực phẩm và thức ăn gia súc.
Phản ứng thủy phân là phản ứng quan trọng và rất phổ biến trong chế biến thực
phẩm. Nhờ phản ứng thủy phân mà chất lượng thành phẩm tăng lên. Phản ứng thủy phân
thường là mở đầu cho một loạt các phản ứng tiếp diễn. Các phản ứng khác có thể xảy ra
khi phản ứng thủy phân kết thúc (Trần Thị Long Biên, 2009).
2.5 Giới thiệu về amino acid
Amino acid là đơn vị cấu trúc cơ bản của protein. Trong thực tế ta thường gặp 20
amino acid căn bản, ngoài ra còn chứa một số amino acid cải biến. Các amino acid đều có
12

cấu tạo chung giống nhau: có nhóm carboxyl (-COOH) và nhóm amine (-NH 2 ) gắn vào
nguyên tử C∞, Các amino acid khác nhau ở vị trí mạch bên (-R). Tính chất của từng
amino acid phụ thuộc vào cấu tạo, kích thước và diện tích của (-R). Tại pH = 7 nhóm
carboxyl của amino acid nằm ở dạng bazơ tương ứng (-COOH-) và nhóm amino nằm ở
dạng acid (-NH 3 +). Do đó amino acid mang cả tính bazơ lẫn tính acid. Trong dung dịch
các amino acid thường ở dạng ion lưỡng tính do cùng một lúc mang cả hai nhóm điện tích
dương và âm. Các nhóm này có khả năng hấp phụ ánh sáng khá mạnh. Do đó người ta
thường dùng phương pháp đo độ hấp phụ màu để đo xác định nồng độ protein hòa tan
trong dung dịch (Đàm Sao Mai và ctv, 2009).

13


Chương 3
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Thời gian và địa điểm
Thời gian: Đề tài được thực hiện từ ngày 01/04/2011 đến 31/07/2011
Địa điểm: Tại phòng thí nghiệm Hóa sinh, khoa Công Nghệ Thực Phẩm, Trường Đại học
Nông Lâm, TP. Hồ Chí Minh.
3.2 Đối tượng nghiên cứu
Màng ruột heo được cung cấp bởi Công ty Vissan
3.3 Một số dụng cụ, thiết bị và hóa chất sử dụng
3.3.1 Một số dụng cụ và thiết bị
-

Cân điện tử 2 số lẻ: model ARB120, hãng sản xuất Ohaus – Mỹ

-

Cân điện tử 4 số lẻ hãng sản xuất Sartorius – Đức

-

Máy đo quang phổ UV: model UV – 2502, hãng sản xuất Labomed – Mỹ

-

Bể ổn định nhiệt độ của hãng Memmert – Đức

-

Máy đo pH model pH211, hãng sản xuất Hanna – Ý

-

Khúc xạ kế 0 – 32 độ Brix của hãng Atago – Nhật

-

Bếp điện của hãng sản xuất Hữu Hghị

Và các dụng cụ thủy tinh như:
Ống nghiệm
Cốc đong 100 ml, 250 ml, 400 ml
Bình tam giác 100 ml
Pipet 1 ml, 5 ml, 10 ml
Bình định mức 10 ml, 25 ml, 50 ml, 100 ml
Nhiệt kế

Đũa khuấy…
14


3.3.2 Một số hóa chất sử dụng
-

Enzyme Protamex của hãng Novozymes.

-

Enzyme Alcalase® 2.4L FG của hãng Novozymes.

-

Alanine

-

Dung dịch ethanol 50%

-

Dung dịch ninhydrin 0,5%

-

Dung dịch đệm citrat 0,4 M, pH = 5

-

Tinh thể albumin huyết thanh bò (BSA – bovine serum albumin)

-

Thuốc thử folin pha loãng với nước theo tỉ lệ 1:2

-

Dung dịch A: Na 2 CO 3 hòa tan trong NaOH 1 N

-

Dung dịch B: CuSO 4 .6H 2 O hòa tan trong citrate 1%

-

Dung dịch C: trộn A và B theo tỷ lệ A/B = 49/1(khi dùng mới pha)

-

Nước cất

3.4 Phương pháp nghiên cứu
3.4.1 Bố trí thí nghiệm
Đối với mỗi loại enzyme chúng tôi tiến hành bố trí 4 thí nghiệm riêng lẻ để khảo sát
các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân bao gồm: nồng độ enzyme, nhiệt độ, pH,
thời gian thủy phân. Màng ruột heo sau khi mang về, phân ra từng mẫu nhỏ đem đông
lạnh để bảo quản. Với mỗi lần thủy phân, chúng tôi lấy ra rã đông rồi làm thí nghiệm thủy
phân.

3.4.1.1 Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố đến quá trình thủy
phân màng ruột heo bằng enzyme Protamex.
Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ enzyme Protamex đến quá trình thủy
phân.
Mục đích: Tìm ra nồng độ enzyme thích hợp cho quá trình thủy phân
Chỉ tiêu theo dõi: Hoạt độ enzyme
Điều kiện tiến hành thí nghiệm:
Khối lượng màng ruột: 100 g
15


Nhiệt độ: 50oC
pH = 7
Thời gian thủy phân: sau 1 giờ, sau 3 giờ và sau 5 giờ.
Chúng tôi tiến hành khảo sát 3 nồng độ enzyme Protamex lần lượt là 0,1%, 0,15%,
0,2% tương ứng với các nghiệm thức từ A1 đến nghiệm thức A3, mỗi nghiệm thức được
lặp lại 3 lần.
Thí nghiệm được bố trí gồm 3 nghiệm thức (NT) khác nhau, cụ thể như sau:

Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên quá trình thủy phân
Mục đích: Tìm ra nhiệt độ thủy phân thích hợp
Chỉ tiêu theo dõi: Hoạt độ enzyme
Điều kiện tiến hành thí nghiệm:
Khối lượng màng ruột: 100 g
Nồng độ enzyme: 0,15%
pH = 7
Thời gian thủy phân: sau 1 giờ, sau 3 giờ và sau 5 giờ.
Chúng tôi tiến hành khảo sát nhiệt độ thủy phân lần lượt là 40oC, 50oC, 60oC tương ứng
với các nghiệm thức từ B1 đến B3, mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần.

16