KHẢO SÁT SỰ SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CỦA NẤM Cordyceps sinensis TRONG CÁC GIÁ THỂ NUÔI CẤY KHÁC NHAU
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (837.62 KB, 36 trang )
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
KHẢO SÁT SỰ SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN
CỦA NẤM Cordyceps sinensis TRONG CÁC
GIÁ THỂ NUÔI CẤY KHÁC NHAU
Ngành học:
CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Sinh viên thực hiện:
ĐẶNG THANH DUYÊN
Niên khóa:
2007 - 2011
Tháng 07/2011
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
KHẢO SÁT SỰ SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN
CỦA NẤM Cordyceps sinensis TRONG CÁC
GIÁ THỂ NUÔI CẤY KHÁC NHAU
Hướng dẫn khoa học
Sinh viên thực hiện
TS. LÊ THỊ DIỆU TRANG
ĐẶNG THANH DUYÊN
Tháng 07/2011
LỜI CẢM ƠN
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Cha me, cha mẹ là người đã tạo mọi điều kiện tốt nhất cho con được học hành.Cha
mẹ đã luôn bên cạnh con là chỗ dựa vững chắc cho con trong cuộc sống.
TS. Lê Thị Diệu Trang đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ em trong quá
trình thực hiện đề tài. Cô đã truyền đạt nhiều kiến thức và kinh nghiệm trong quá trình
nghiên cứu khoa học.
Quý thầy cô trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh đã giảng dạy em
trong suốt quá trình học tập tại trường. Thầy cô đã dạy cho em nhiều kiến thức bổ ích.
Các thầy cô, cán bộ Viện CNSH và Môi Trường đã tạo điều kiện cho tôi thực hiện
đề tài này.
Các bạn lớp DH07SH đã cùng tôi trải qua 4 năm đại học tại trường và những người
bạn đã luôn bên tôi cùng tôi chia sẻ những niềm vui và nỗi buồn.
Long An, Ngày 11 tháng 7 năm 2011
Sinh viên thực hiện
Đặng Thanh Duyên
i
TÓM TẮT
C.sinensis hay đông trùng hạ thảo là một trong những loại dược liệu quý được
biết đến từ rất lâu trong lịch sử đông y. C.sinensis được sử dụng chữa các bệnh về phổi,
thận từ hàng trăm năm nay trong y học cổ truyền Trung Quốc. Gần đây nhiều công
trình nghiên cứu cho thấy Cordyceps còn có hoạt tính tăng cường miễn dịch, kháng
ung thư và chống oxy hóa. Do sản phẩm tự nhiên thường có rất ít và năng suất ngày
càng giảm trong khi nhu cầu sử dụng tăng cao, người ta nghiên cứu tìm mọi cách thay
thế các sản phẩm Cordyceps tự nhiên bằng các sản phẩm Cordyceps được sản xuất
trong môi trường nhân tạo.
Mục đích của nghiên cứu nhằm góp phần tìm kiếm các điều kiện môi trường tối
ưu cho việc nuôi cấy nhân tạo sợi nấm đông trùng hạ thảo. Sợi nấm được trồng trong
túi nhựa chứa một số loại hạt ngũ cốc được khử trùng như hạt bắp, kê có hoặc không
có bổ sung bột nhộng tằm . Sau đó tiến hành khảo sát sinh trưởng và phát triển của
nấm C.sinensis trên những hạt ngũ cốc này.
Kết quả: Ghi nhận được các đặc điểm hình thái cũng như đặc điểm, tốc độ sinh
trưởng của C.sinensis nuôi cấy trên các giá thể khác nhau. Trong 4 giá thể được sử
dụng trong nuôi cấy, giá thể bắp - nhộng cho hiệu quả cao nhất trong quá trình phát
triển sinh khối của nấm C.sinensis.
Kết luận: giá thể bắp - nhộng có thể là lựa chọn tối ưu trong thành phần môi
trường nuôi cấy C.sinensis để đạt được sinh khối cao nhất.
ii
SUMMARY
The title of thesis: ‘‘Investigation growth and development of C.sinensis in
different culture mediums’’.
C.sinensis or winter worm summer grass is a valuable traditional medicine for
long time ago. It was used to treat diseases related to kidney and lung for hundreds of
years in China. Recently, many studies indicated that extracts of C.sinensis help
improving immune response, anti-tumor and anti-oxidation. Since natural product of
C.sinensis is limited and yield has been declining through years while the demand for
healthy foods and medicine is increasing, the search for substitutes of the natural
products by products cultured in an available media is considered.
The purpose of this study is to contribute to finding proper substrate for a solid
media. The mycelium is grown in plastic bags full of sterilized medium, which is
almost always some kinds of cereal grain. This grain is corn or millet with or without
supplementation with Bombyx mori pupal powder. Then we examined growth and
development of C.sinensis in this grain.
Results: Morphological characters were observed and growth speed was
recorded. For 4 different media showed high effect in producing high biomass of the
fungus.
Conclusion and suggestion: The corn-silkworm pupal powder media can be
considered as the best components for culture media to obtain highest fungal biomass.
Keywords: C.sinensis, solid culture media.
iii
MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN .................................................................................................................. i
TÓM TẮT....................................................................................................................... ii
SUMMARY................................................................................................................... iii
MỤC LỤC ..................................................................................................................... iv
DANH SÁCH CÁC BẢNG .......................................................................................... vi
DANH SÁCH CÁC HÌNH ............................................................................................ vi
Chương 1 MỞ ĐẦU ........................................................................................................1
1.1. Đặt vấn đề .................................................................................................................1
1.2. Yêu cầu .....................................................................................................................2
1.3. Nội dung thực hiện ...................................................................................................2
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...............................................................................3
2.1. Sơ lược về C.sinensis................................................................................................3
2.1.1.Phân loại khoa học..................................................................................................3
2.1.2. Sự phân bố của nấm C.sinensis .............................................................................4
2.1.3. Cơ chế xâm nhiễm của nấm C.sinensis vào vật chủ..............................................4
2.1.4. Mô tả đông trùng hạ thảo.......................................................................................4
2.1.5. Thành phần hóa học của đông trùng hạ thảo .........................................................6
2.1.6. Tác dụng của đông trùng hạ thảo ..........................................................................6
2.2. Các phương pháp nhân sinh khối C.sinensis ............................................................8
Chương 3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................11
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ..........................................................................11
3.1.1. Thời gian..............................................................................................................11
3.1.2. Địa điểm ..............................................................................................................11
3.2. Vật liệu thí nghiệm .................................................................................................11
3.2.1. Đối tượng nghiên cứu ..........................................................................................11
3.2.2. Dụng cụ và thiết bị ..............................................................................................11
3.2.3. Hóa chất ...............................................................................................................11
3.3. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................................11
3.3.1. Chuẩn bị môi trường............................................................................................11
3.3.2. Phục hồi nguồn nấm ............................................................................................12
iv
3.3.3. Khảo sát hình thái ................................................................................................12
3.3.4. Khảo sát tốc độ sinh trưởng trên môi trường bán rắn..........................................12
3.3.5. Đánh giá chất lượng nấm C.sinensis khi nuôi cấy trên giá thể ...........................12
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................................13
4.1. Đặt điểm hình thái và khả năng hình thành quả thể của C.sinensis .......................13
4.2. Sự phát triển của nấm C.sinensis trên các giá thể khác nhau .................................15
4.2.1. Đặc điểm phát triển của nấm C.sinensis trên các giá thể ....................................15
4.2.2. So sánh sự phát triển của nấm C.sinensis trên các giá thể khác nhau .................19
4.3. Đánh giá chất lượng nấm C.sinensis sau khi nuôi cấy trên giá thể ........................22
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..........................................................................24
5.1. Kết luận...................................................................................................................24
5.2. Đề nghị ...................................................................................................................24
TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................25
PHỤ LỤC ......................................................................................................................27
v
DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng 4.1 Mức độ lan tơ của nấm C.sinensis trên giá thể bắp .......................................15
Bảng 4.2 Mức độ lan tơ của nấm C.sinensis trên giá thể bắp - nhộng ..........................17
Bảng 4.3 Mức độ lan tơ của nấm C.sinensis trên giá thể bắp - kê ................................18
Bảng 4.4 Mức độ lan tơ của nấm C.sinensis trên giá thể bắp - kê - nhộng ...................19
Bảng 4.5 Mức độ phát triển của nấm C.sinensis ..........................................................19
Bảng 4.6 Lượng giá thể còn lại trên 4 nghiệm thức sau 29 ngày ..................................20
Bảng 4.7 Kết quả phân tích thống kê bằng phần mềm MSTATC.................................21
Bảng 4.8 Kết quả phân tích hàm lượng amino axit .......................................................23
DANH SÁCH CÁC HÌNH
Hình
Hình 2.1 C. militaris và C.sinensis ..................................................................................3
Hình 2.2 Nấm C.sinensis mọc thành cây.........................................................................4
Hình 2.3 Mô tả nấm mọc thành cây ................................................................................5
Hình 4.1 Khuẩn lạc nấm C.sinensis trên môi trường PGA ..........................................13
Hình 4.2 Hình thái nấm C.sinensis dưới kính hiển vi ...................................................13
Hình 4.3 Bào tử nấm C.sinensis dưới kính hiển vi .......................................................14
Hình 4.4 Quả thể nấm C.sinensis. .................................................................................14
Hình 4.5 Nấm C.sinensis trên giá thể bắp .....................................................................16
Hình 4.6 Nấm C.sinensis trên giá thể bắp - nhộng ........................................................16
Hình 4.7 Nấm C.sinensis trên giá thể bắp - kê ..............................................................17
Hình 4.8 Nấm C.sinensis trên giá thể bắp - kê - nhộng .................................................18
Hình 4.9 Nấm C.sinensis phát triển trên giá thể sau 29 ngày........................................22
vi
Chương 1 MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Đông trùng hạ thảo là một dạng kí sinh giữa một loài nấm túi có tên khoa học
là C.sinensis với ấu trùng của một số loài côn trùng cánh vảy. Phần dược tính của
thuốc đã được chứng minh là do các chất chiết xuất từ nấm C.sinensis.
Đông trùng hạ thảo là một vị thuốc bồi bổ hết sức quý giá, có tác dụng tích cực
với các bệnh như rối loạn tình dục, thận hư, liệt dương, di tinh, đau lưng mỏi gối, ho
hen do phế hư hoặc cả phế, thận đều hư, và có tác dụng tốt đối với trẻ em chậm lớn.
Một số nghiên cứu hiện đại chỉ ra rằng đông trùng hạ thảo có tác dụng tăng cường
công năng của tuyến thượng thận, cải thiện chức năng thận, nâng cao năng lực miễn
dịch, kháng khuẩn, kháng virus, chống ung thư và phóng xạ. Mặt khác các nghiên cứu
cổ truyền cũng như các thực nghiệm hiện đại đều xác định đông trùng hạ thảo hầu
như không có tác dụng phụ đối với cơ thể người và động vật.
Thật vậy từ xưa đến nay đông trùng hạ thảo được biết đến như một loại thần
dược hết sức quý giá. Tuy nhiên, trong tự nhiên C.sinensis chỉ sinh sống và phát triển
được ở những vùng núi cao từ 3500 – 5000 m so với mực nước biển và khí hậu lạnh.
Vì vậy, việc nghiên cứu tìm ra điều kiện nuôi cấy thích hợp để C.sinensis sản sinh
nhiều hợp chất có lợi tương tự như C.sinensis tự nhiên nhằm đáp ứng nhu cầu ngày
càng tăng của con người là rất cần thiết. Do đó nhiều nước trên thế giới như Mỹ, Nhật,
Trung Quốc đã có nhiều nghiên cứu về giá thể trồng C.sinensis và họ đã tìm ra được
loại giá thể thích hợp để nuôi cấy C.sinensis.
Nhằm góp phần tìm kiếm giá thể thích hợp để nuôi cấy nhân tạo sợi nấm
C.sinensis, chúng tôi tiến hành đề tài “Khảo sát sự sinh trưởng và phát triển của nấm
C.sinensis trong các giá thể nuôi cấy khác nhau”.
1
1.2. Yêu cầu
Tìm ra được loại giá thể thích hợp nuôi cấy nấm C.sinensis thông qua việc khảo
sát tốc độ phát triển của nấm C.sinensis khi nuôi cấy trên các giá thể đó.
1.3. Nội dung thực hiện
¾ Khảo sát đặc điểm hình thái của C.sinensis.
¾ Khảo sát sinh trưởng phát triển của C.sinensis khi nuôi cấy trên từng giá thể
khác nhau.
¾ Đánh giá chất lượng nấm C.sinensis sau khi nuôi cấy trên giá thể
Phân tích sơ bộ và đánh giá thành phần amino axit của nấm C.sinensis.
2
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Sơ lược về C.sinensis
Tên gọi "đông trùng hạ thảo" là xuất phát từ quan sát thực tế khi thấy vào
mùa hè nấm C.sinensis mọc chồi từ đầu con sâu nhô lên khỏi mặt đất. Vào mùa
đông thì nhìn cặp cá thể này giống con sâu (côn trùng), còn đến mùa hè thì chúng
trông giống một loài thực vật (thảo mộc) hơn.
2.1.1.Phân loại khoa học
Giới (regnum): Fungi
Phân giới (subregnum): Dikarya
Ngành (phylum): Ascomycota
Phân ngành (subphylum): Pezizomycota
Lớp (class): Ascomycetes
Phân lớp (subclass): Hypocreomycetes
Bộ (order): Hypocreales
Họ (family): Clavicipataceae
Giống (genus): Cordyceps
Loài (species): C.sinensis
Chi nấm Cordyceps có tới 400 loài khác nhau, chỉ riêng ở Trung Quốc đã tìm
thấy khoảng 60 loài. Tuy nhiên cho đến nay người ta mới chỉ nghiên cứu nhiều nhất
được về 2 loài C.sinensis (Berk.) Sacc. và C.militaris (L. ex Fr.) Link.. Loài thứ hai
còn được gọi là Nhộng trùng thảo
Hình 2.1 C. militaris và C.sinensis ().
3
2.1.2. Sự phân bố của nấm C.sinensis
Chỉ phát hiện được C.sinensis vào mùa hè ở một số cao nguyên cao hơn mặt
nước biển từ 3500 - 5000 m. Đó là vùng Tây Trạng, Tứ Xuyên, Thanh Hy, Cam Túc ở
Trung Quốc.
2.1.3. Cơ chế xâm nhiễm của nấm C.sinensis vào vật chủ
Cơ chế xâm nhiễm của nấm C.sinensis vào cơ thể sâu hiện giờ chưa rõ. Nhưng
con sâu này có thể ăn phải bào tử nấm hoặc chúng mắc bệnh ký sinh từ các lỗ thở. Đến
khi sợi nấm phát triển mạnh chúng xâm nhiễm vào các mô vật chủ, sử dụng hoàn toàn
các chất dinh dưỡng trong cơ thể sâu.
Loài nấm này bắt đầu nảy mầm trong các cơ thể sống của một số loài ấu trùng,
tiêu diệt các loài ấu trùng này làm thức ăn của nấm, khiến cho các ấu trùng trở thành
một xác ướp khô tự nhiên. Loài nấm này sống âm ỉ trong lòng đất hơn 5 năm đến giai
đoạn nhất định nấm phát triển thành cây (hình dạng giống thực vật) và phát tán bào tử.
Phần "trái nấm" hay tai nấm thường trồi lên mặt đất vào mùa xuân hoặc đầu mùa
hè, luôn luôn lộ ra đầu của nấm. Tai nấm cao từ 5 - 15 cm bên trên bề mặt đất và phóng
ra các bào tử nấm. Đầu của ngọn nấm là một thể đệm (stroma) hình trụ thuôn nhọn.
Hình 2.2 Nấm C.sinensis mọc thành cây. ( và
/>2.1.4. Mô tả đông trùng hạ thảo
Đông trùng hạ thảo có bản chất là dạng ký sinh của loài nấm C.sinensis trên ấu
trùng của một số loài côn trùng cánh vảy. Sâu non trông giống con tằm già, dài 3 – 5
cm, sau khi khô thì bên ngoài có màu vàng kim hoặc màu vàng. Mình sâu non có vân
4
ngang rõ rệt, gần đầu có nhiều vân vòng nhỏ, toàn thân có 3 đôi chân ở ngực, 4 đôi
chân ở bụng, 1 đôi ở đuôi, nhưng chỉ có 4 đôi chân ở bụng là rõ, đầu có chất sừng màu
đỏ nâu. Sau khi sấy khô, sâu non rất giòn dễ gẫy, thịt màu trắng, rắn và có mùi thơm.
Phần khuẩn toạ thường dài hơn sâu non, và dài tới 7 cm, màu nâu sẫm hoặc nâu,
thường ký sinh trên đầu sâu non, phần đầu hơi phình to ra, như hình trụ tròn, dài và
thẳng đứng, ngoài có vân dọc nhỏ, khi sấy khô khuẩn tọa dẻo, dai, khó bẻ gẫy, bên
trong màu nâu nhạt. Phần đầu giống hình cái gậy, màu đen tím hơi sẫm, bên ngoài xù
xì, có nhiều hạt nhỏ nổi lên gọi là cầu quả, hình trứng, hoặc hình bầu dục tròn. Quan
sát dưới kính hiển vi thì thấy mỗi quả cầu bên trong có nhiều tử nang hình dài, mỗi
nang tử có nang bào tử cách mô đó là công cụ truyền ty khuẩn cho thế hệ sau. Đỉnh
khuẩn
tỏa
nhọn,
không
có
cầu
quả,
màu
nâu
xám
hoặc
nâu
đen.
().
Hình 2.3 Mô tả nấm mọc thành cây
giống sâu khi sấy khô.
().
Trước đây, người ta cho rằng đây là vị thuốc mà mùa đông hóa thành sâu, mùa
hè trở thành cây cỏ. Thật ra đó là một thứ nấm mọc ký sinh trên sâu non của một loại
cây như đã mô tả trên. Về mùa đông sâu nằm im dưới đất, nấm phát triển vào toàn
thân sâu để hút chất bổ dưỡng trong con sâu làm cho sâu chết. Đến mùa hè, nấm sinh
ra cơ chất mọc chồi khỏi mặt đất, nhưng gốc vẫn dính liền vào đầu của con sâu
().
5
2.1.5. Thành phần hóa học của đông trùng hạ thảo
Các phân tích hoá học cho thấy trong sinh khối của đông trùng hạ thảo có 17
axit amin khác nhau, có D-mannitol, có lipit, có nhiều nguyên tố vi lượng (Al, Si, K,
Na). Quan trọng hơn là trong sinh khối đông trùng hạ thảo có nhiều chất hoạt động
sinh học mà các nhà khoa học đang dần phát hiện ra nhờ các tiến bộ của ngành hoá
học các hợp chất tự nhiên. Nhiều hoạt chất này có giá trị dược liệu cao. Trong đó phải
kể đến axit cordiceptic, cordycepin, adenosin, hydroxyethyl-adenosin. Đáng chú ý hơn
cả là nhóm hoạt chất HEAA ( Hydroxy-Etyl-Adenosin- Analogs). Đông trùng hạ thảo
còn có chứa nhiều loại vitamin (trong 100 g đông trùng hạ thảo có 0,12 g vitamin B12;
29,19 mg vitamin A; 116,03 mg vitamin C, ngoài ra còn có vitamin B2 (riboflavin),
vitamin E, vitamin K) (http: //www.vi.wikipedia.org).
Cordyceps polysaccharide: các polysaccharide thúc đẩy quá trình sinh trưởng
và phát triển của tế bào lympho, kích hoạt tế bào lympho T và lympho B, hoạt hóa
miễn dịch tế bào nhằm nâng cao hệ miễn dịch, kháng virus, ngăn ngừa bệnh thiếu oxy,
làm giảm đau, giảm chứng sơ hóa gan, trị viêm gan và bảo vệ gan. Chống viêm, chống
oxy hóa, chống khối u, chống di căn ().
Cordycepin: chống ung thư, côn trùng và chống vi khuẩn hoạt động
().
Mannitol: thành phần diosmol trong mannitol có thể tìm thấy ở nhiều thực vật
nhưng chỉ ở C.sinensis mới có hàm lượng diosmol cao nhất. Ngoài công dụng làm
giãm mỡ máu, đường máu và cholesterol còn giúp mạch máu giãn nở, phòng chóng
bệnh tim mạch hữu hiệu ().
Adenosin: có vai trò quan trọng trong quá trình chuyển hóa năng lượng của cơ
thể. Adenosin giúp cải thiện tuần hoàn ngoại biên và tim mạch, cải thiện năng lực cơ
bắp, giảm sự sinh trưởng của tế bào xấu, tăng lượng oxy trong máu. Vì vậy việc bổ
sung hàm lượng adenosine hàm lượng cao cho cơ thể là vô cùng cần thiết giúp cơ thể
luôn luôn dồi dào năng lượng để hoạt động hiệu quả ().
2.1.6. Tác dụng của đông trùng hạ thảo
• Vai trò của trùng thảo với chức năng thận
Đứng từ góc độ đông y mà nói, Đông trùng hạ thảo có thể tư âm bổ dương
chính là bổ thận dương. Đứng từ góc độ tây y mà nói, nó có tác dụng tương đương
với vai trò của một loại nội tiết tố nam giới androgen, đặc biệt là trong số đó có một
6
trong những adenosine có tác dụng cải thiện tuần hoàn và lưu lượng máu cục bộ của
thận, đồng thời còn có thể điều tiết prostaglandin trong thận cho đến các nội tiết tố và
tổ chức thần kinh của chức năng sinh dục. Do đó đông trùng hạ thảo có tác dụng trị
liệu rất tốt đối với những người gặp khó khăn về sinh lý do rối loạn chức năng tình
dục hoặc giảm nội tiết tố ở tuổi trung niên (http:// forum.vncnus.net).
• Vai trò của trùng thảo với bệnh nhân ung thư
Chất Cordycepin trong đông trùng hạ thảo có thể ức chế sự phân hạch của các
tế bào ung thư, trì hoãn sự lây lan của các tế bào ung thư, có khả năng diệt một lượng
lớn các tế bào T, các thực bào trong cơ thể . Các polysaccharides trong đông trùng hạ
thảo có thể góp phần thúc đẩy chuyển hóa hạch, tăng cường khả năng tự chống ung
thư cơ thể. Đồng thời, trùng thảo còn có tác dụng an thần, giảm đau tương đối tốt,
giảm sự khởi đầu của cơn đau ung thư. Hiện nay vẫn chưa có thuốc chữa trị ung thư
đặc hiệu và hầu hết các loại thuốc này không chỉ tốn kém mà còn có tác dụng phụ
tương đối lớn, như vậy nếu so sánh đông trùng hạ thảo không những không có tác
dụng phụ mà còn giúp cơ thể phục hồi một cách toàn diện, tăng cường chức năng
miễn dịch. Do đó, việc sử dụng đông trùng hạ thảo để phòng chống ung thư và dùng
như các chất bổ trợ trị liệu là một lựa chọn tốt (http:// forum.vncnus.net).
• Vai trò của trùng thảo với chức năng gan
Chúng ta biết rằng gan của cơ thể tiêu hóa và các cơ quan giải độc, mỗi ngày
chúng ta ăn vào một lượng lớn thức ăn đều phải trải qua sự phân hủy của gan, rồi
chuyển hóa mới trở thành các vật chất dinh dưỡng của cơ thể. Các loại thuốc, các chất
độc hại hoặc các vật chất quá liều lượng cho phép mà chúng ta đưa vào cơ thể đều
phải thông qua sự đào thải, giải độc ở gan mới có thể tránh được nguy hiểm nhất định
đối với cơ thể, do đó, gan vừa làm việc để bảo vệ chúng ta nhưng ngược lại cũng đòi
hỏi chúng ta phải giữ gìn bảo vệ một cách cẩn thận, đặc biệt là hiện nay khi con người
ngày càng bận rộn, giao lưu xã hội ngày càng thường xuyên và các cuộc tiếp đãi tần
suất lớn, thì việc lưu ý việc bảo vệ gan, phòng ngừa các bệnh về gan trở nên cực kỳ
quan trọng (http:// forum.vncnus.net).
Trùng thảo có thể bảo vệ gan của chúng ta ở bất kì thời điểm nào, các nghiên
cứu đã chỉ ra rằng cordycepin và polysaccharides trong trùng thảo làm tăng chức năng
thực bào của gan, axit cordycep, SOD và vitamin E, có tác dụng chống xơ gan,
peoroxy hóa lipid. Vì trùng thảo có thể tăng cường chức năng miễn dịch, giải độc cho
7
gan và tăng cường vai trò của các thuốc chống viêm gan vi rút, do đó có hiệu quả lớn
trong việc bảo vệ tế bào gan (http:// forum.vncnus.net).
• Vai trò của trùng thảo với việc tạo máu
Đối với vai trò tạo máu của trùng thảo, vai trò này chủ yếu do thành phần
polysaccharides trong trùng thảo có tác dụng đáng kể trong việc cải thiện chức năng
tạo máu của các tế bào tủy xương , thúc đẩy sự sản sinh ra tế bào hồng cầu, đồng thời
chống lại bệnh ung thư máu (bệnh máu trắng) và hiện tượng giảm bạch cầu trung tính,
có tác dụng rất tốt với những bệnh nhân ung thư máu đang trong giai đoạn trị liệu
(http:// forum.vncnus.net).
• Vai trò của trùng thảo với bệnh hen suyễn
Đông trùng hạ thảo có hàm lượng axit trùng thảo phong phú, có tác dụng bổ
phế ích thận, cầm huyết trừ đờm, tăng cường đáng kể hoạt động của phế quản, điều
tiết cơ trơn phế quản, đồng thời cordycepin của trùng thảo có tác dụng mạnh mẽ trong
việc ức chế và diệt trừ các Mycobacterium tuberculosis và vi khuẩn khác có thể gây
nhiễm trùng phổi, axit trùng thảo và polysaccharides cũng có thể khôi phục các tế bào
nang phổi đã bị hư hỏng, và do đó cực kỳ hiệu quả với các loại bệnh phổi và hen phế
quản , đặc biệt là rất tốt cho người già, bệnh nhân lao phổi, những người hút thuốc,
hoặc những người có bệnh hen suyễn (http:// forum.vncnus.net).
• Vai trò của trùng thảo với hệ miễn dịch
Chất cordycepin và polysaccharides trong trùng thảo có tác dụng thúc đẩy
hoặc điều tiết hai chiều đối với hệ miễn dịch. Tác dụng này chủ yếu ở việc hoạt hóa tế
bào miễn dịch và tăng cường chức năng tiêu diệt của tế bào miễn dịch (http://
forum.vncnus.net).
2.2. Các phương pháp nhân sinh khối C.sinensis
Các nghiên cứu về Cordyceps trên thế giới đã chỉ ra rằng các chủng Cordyceps
khác nhau hay thậm chí là cùng một dòng nhưng nếu nuôi cấy ở những điều kiện khác
nhau thì lại cho ra thành phần các hoạt chất khác nhau. Ví dụ cordycepin là một trong
những hợp chất ngoại bào của Cordyceps trong tự nhiên nhưng hợp chất này chỉ có
trong nuôi cấy rắn còn nuôi cấy lỏng thì hoàn toàn không có (John và cs, 2004).
Hiện nay có hai phương pháp nuôi cấy Cordyceps:
Phương pháp thứ nhất: nuôi cấy trên môi trường lỏng (chủ yếu sử dụng tại Trung
Quốc) sợi nấm được đưa vào một bể khử trùng môi trường lỏng, cung cấp các thành
8
phần dinh dưỡng cần thiết cho sợi nấm tăng trưởng nhanh chóng. Sau khi tăng trưởng
trong môi trường chất lỏng, sợi nấm được thu hoạch bằng cách lọc ra khỏi dung dịch
lỏng và sấy khô, sau đó nó có thể được sử dụng hoặc tiếp tục xử lý. Nói chung trong
phương pháp này, các hợp chất ngoại bào được tiết ra trong chu kỳ tăng trưởng bị loại
bỏ cùng với dung dịch nuôi cấy. Phương pháp này làm thất thoát một lượng lớn các
hoạt chất ngoại bào và các hoạt chất này chỉ chiếm một lượng nhỏ trong sợi nấm (John
và cs, 2004).
Phương pháp thứ hai: nuôi cấy bề mặt rắn (chủ yếu sử dụng ở Nhật Bản và
Mỹ). Phương pháp này sợi nấm được trồng trong túi nhựa hoặc lọ thủy tinh chứa một
số loại hạt ngũ cốc được khử trùng, hạt này thường là lúa gạo, lúa mì và lúa mạch đen.
Sau giai đoạn tăng trưởng, sợi nấm được thu hoạch cùng với các hạt ngũ cốc còn lại.
Đây là kĩ thuật nuôi cấy dễ nắm bắt và vốn đầu tư thấp, khía cạnh tiêu cực của phương
pháp này là lượng hạt thường nhiều hơn lượng sợi nấm. Tuy nhiên, lợi ích của phương
pháp này là các hợp chất ngoại bào được thu hoạch cùng với giá thể và sợi nấm (John
và cs, 2004).
y Các loại giá thể đã được sử dụng
Giá thể được lựa chọn hầu hết ở Trung Quốc là môi trường lỏng dựa trên nhộng
tằm, có bổ sung đường, carbohydrates và khoáng chất. Điều này là một sự lựa chọn
hợp lý, vì nấm này được tìm thấy trong tự nhiên trên côn trùng. Nhộng tằm được sấy
khô là sản phẩm phụ sẵn có của một ngành công nghiệp và có ít công dụng khác. Do
đó chúng có sẵn và rẻ. Cơ chất bằng nhộng tằm thì tạo ra sản phẩm có năng suất và
chất lượng tương đối cao. Vấn đề duy nhất với cơ chất này là ở Hoa Kỳ tằm không phù
hợp với qui định của FDA. Và chúng cũng không có ở dạng vật liệu thô cho hầu hết
các máy nuôi cấy Cordyceps trên thế giới (John và cs, 2004).
Nhật Bản và Mỹ thì cơ chất phổ biến là lúa gạo nhưng các thử nghiệm đã xác
định lúa gạo không phải là giá thể thích hợp cho sản xuất Cordyceps. Giá thể bằng lúa
gạo làm cho nấm không sản xuất đầy đủ các hợp chất chuyển hóa thứ cấp, thành phần
hoạt chất trong Cordyceps được nuôi cấy bằng lúa gạo ít hơn so với những giá thể
khác. Lượng Adenosine hoặc Cordycepin có rất ít khi nuôi trồng Cordyceps bằng lúa
gạo. Hơn nữa, trong lúa gạo có những chất ngăn cản sự tăng trưởng của Cordyceps,
hạn chế giai đoạn tăng trưởng trong khoảng 22 - 24 ngày và khi Cordyceps được trồng
trên lúa gạo sau đó sấy khô và tán thành bột, sản phẩm cuối thực sự là khoảng
9
60 - 75% bột gạo. Vì thế họ đã tìm ra một loại giá thể khác thích hợp hơn lúa gạo đó là
lúa mạch đen là một chất thường được sử dụng cho nuôi cấy rắn, và nó mang lại sản
phẩm với chất lượng cao hơn lúa gạo và giá thể này nếu được bổ sung dầu thực vật thì
sợi nấm sẽ phát triển tốt, dầu này cung cấp chất dinh dưỡng cần thiết cho sợi nấm sử
dụng để sản xuất hợp chất hoạt tính sinh học. Tuy nhiên, lúa mạch đen có điểm bất lợi
khác. Các hợp chất trong lúa mạch đen tạo ra mùi và hương vị đặc trưng, không bị
phân hủy bởi Cordyceps và chúng cô đặc vào sản phẩm cuối. Mùi vị lúa mạch đen che
lắp mùi vị đặc trưng của Cordyceps, và mặc dù sản phẩm cuối có chất lượng tốt hơn so
với các sợi nấm phát triển trên lúa gạo. Lúa mạch đen cũng chứa yếu tố hạn chế tăng
trưởng, ngăn cản sự phát triển của Cordyceps trong khoảng 28 - 30 ngày, các yếu tố
này sẽ được hạn chế một phần nếu được bổ sung khoảng 1% chất đệm bột vỏ sò (John
và cs, 2004).
Hạt kê là một sự lựa chọn tốt nó không có mùi vị đặc trưng riêng và không ngăn
cản sự tăng trưởng và giúp sợi nấm sản xuất đầy đủ các hợp chất thứ cấp. Tuy nhiên
hạt kê có tỷ lệ lớp vỏ kitin bên ngoài so với tinh bột khá cao. Lớp vỏ bên ngoài này
không bị phân hủy và chiếm lượng lớn trong sản phẩm cuối, khoảng 15%. Các vỏ kitin
không thể gỡ bỏ ra khỏi hạt trước khi sử dụng, vì làm như vậy các hạt trở nên dính
trong quá trình khử trùng và mức độ nhiễm cao. Cordyceps không phát triển nhanh
trên hạt kê cũng như trên lúa gạo và lúa mạch đen, nhưng chất lượng sản phẩm cuối lại
cao hơn (John và cs, 2004).
Milo trắng , còn được gọi là bắp kaffir trắng hoặc lúa miến trắng là một lựa
chọn tuyệt vời của giá thể. Milo trắng có ưu điểm là giá rẻ, tỷ lệ tinh bột so với vỏ cao,
không ngăn cảng sự phát triển của sợi nấm và Cordyceps có thể sản xuất đầy đủ các
hợp chất hoạt tính sinh học và không có mùi vị mạnh đặc trưng riêng để cạnh tranh với
mùi vị sản phẩm cuối. Tuy nhiên khi chỉ sử dụng milo trắng sẽ thiếu một số thành
phần thiết yếu cần thiết cho sự phát triển tối ưu của Cordyceps. Việc bổ sung một số
phần của hạt kê vào milo trắng làm tốc độ tăng trưởng bởi một yếu tố tăng 6 lần. Tỷ lệ
tối ưu giữa hạt kê và hạt milo là 1:4 (John và cs, 2004).
Như vậy giá thể lý tưởng cho sự phát triển của Cordyceps là: 1 phần hạt kê, 4
phần milo trắng, ngoài ra còn bổ sung thêm 0,8% bột vỏ sò,1% dầu thực vật. Nấu hỗn
hợp hạt từ 4 - 6 giờ trước khi khử trùng để kích thích Cordyceps tăng trưởng nhanh
hơn nhiều (John và cs, 2004).
10
Chương 3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
3.1.1. Thời gian
Đề tài được thực hiện từ tháng 01/2011 đến tháng 06/2011.
3.1.2. Địa điểm
Trung Tâm Nghiên Cứu Công Nghệ Sinh Học và Môi Trường, Trường Đại Học
Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh.
3.2. Vật liệu thí nghiệm
3.2.1. Đối tượng nghiên cứu
Chủng nấm C.sinensis được cung cấp từ phòng thí nghiệm côn trùng, khoa nông
nghiệp, trường đại học Kobe Nhật Bản.
3.2.2. Dụng cụ và thiết bị
Lò Microwave, kính hiển vi, màng lọc vô trùng, tủ sấy, cân lò xo, nồi hấp vô,
trùng autoclave, tủ cấy, tủ nuôi cấy.
3.2.3. Hóa chất
Khoai tây, glucose, KH2PO4, một số loại hạt ngũ cốc (kê, bắp), bột nhộng
(nhộng tằm được sấy khô sau đó nghiền mịn thành bột), bột vỏ sò, dầu thực vật.
3.3. Phương pháp nghiên cứu
3.3.1. Chuẩn bị môi trường
Chuẩn bị thành phần các hóa chất, các dụng cụ và thiết bị để tiến hành pha môi trường:
Cách nấu môi trường PGA(potato-glucose-agar): khoai tây gọt sạch vỏ, rửa
sạch, thái mỏng rồi nấu trong nước cất. Sau đó lọc lấy phần nước khoai tây, cho
glucose và agar đã cân vào và khuấy đều thêm nước cất cho đủ một lít. Môi trường
được hấp khử trùng bằng autoclave ở 1210C trong 20 phút. Sau đó đổ vào các đĩa petri
sạch đã được sấy khử trùng khoảng 15 – 20 ml mỗi đĩa.
Thành phần môi trường PGA gồm: khoai tây: 200 g, glucose: 20 g, agar: 20 g,
KH2PO4: 1 g, nước cất: 1 lít
Cách nấu môi trường bán rắn: đối vối bắp và kê cần phải nấu trước khi khử
trùng khoảng 4 - 6 giờ, bổ xung các thành phần cần thiết sau đó cho vào bịch nilon.
Giá thể được hấp khử trùng bằng autoclave ở 1210C trong 20 phút.
11
3.3.2. Phục hồi nguồn nấm
Các dòng nấm được giữ trong môi trường ống nghiệm ở nhiệt độ thấp lâu ngày
có thể bị yếu đi hoặc bị nhiễm vi khuẩn và các nấm lạ. Do đó trước khi nhân sinh khối
chúng tôi phải cấy chuyển từ môi trường ống nghiệm ra môi trường phục hồi trong các
đĩa petri rồi từ đó cấy chuyển liên tiếp nhiều lần để cuối cùng thu được dòng thuần
khiết. Môi trường phục hồi là môi trường PGA.
3.3.3. Khảo sát hình thái
Quan sát bằng mắt thường, kính hiển vi.
3.3.4. Khảo sát tốc độ sinh trưởng trên môi trường bán rắn
Đĩa nấm đã phục hồi dùng dao khử trùng cắt mẫu từ đĩa thành hình vuông (thể
tích mỗi mẫu khoảng 0,2 cm3) cấy vào môi trường bán rắn. Nuôi cấy trong tủ ủ ở 20oC,
định kỳ khoảng 4 ngày/lần tính thể tích sợi nấm trên môi trường từ ngày 1 sau nuôi
cấy đến khi nấm mọc hết giá thể trong bịch.
Khảo sát tốc độ phát triển của nấm C.sinensis trên 4 loại giá thể.
a) Giá thể bắp
c) Giá thể bắp–bột nhộng
- Bắp: 50 g
- Bắp: 50 g
- Bột vỏ sò: 0,4 g
- Bột nhộng: 3 g
- Dầu thực vật: 0,5 g
- Bột vỏ sò: 0,4 g
- Dầu thực vật: 0,5 g
b) Giá thể bắp–kê–bột nhộng
d) Giá thể bắp–kê
- Bắp: 40 g
- Bắp: 40 g
- Kê: 10 g
- Kê: 10 g
- Bột nhộng: 3 g
- Bột vỏ sò: 0,4 g
- Bột vỏ sò: 0,4 g
- Dầu thực vật: 0,5 g
- Dầu thực vật: 0,5 g
3.3.5. Đánh giá chất lượng nấm C.sinensis khi nuôi cấy trên giá thể
Thu hoạch sợi nấm cùng với giá thể và sấy khô ở 50 - 55oC đến trọng lượng
không đổi. Sau đó tiến hành phân tích amino axit trong mẫu chứa sợi nấm và mẫu đối
chứng bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (high performance liquid
chromatography, HPLC).
12
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Đặt điểm hình thái và khả năng hình thành quả thể của C.sinensis
Hình 4.1 Khuẩn lạc nấm C.sinensis trên môi trường PGA sau 9 ngày nuôi cấy.
Hình 4.2 Hình thái nấm C.sinensis dưới kính hiển vi quan sát ở vật kính 100X.
(a) Vách ngăn ngăn thành từng đoạn trong sợi nấm; (b) Sợi nấm phân nhánh.
13
Hình 4.3 Bào tử nấm C.sinensis dưới kính hiển vi quan sát ở vật kính 100X.
Khuẩn lạc nấm C.sinensis có màu trắng, mọc nổi lên trên bề mặt thạch nhìn
giống như nút bông.
Sợi nấm có màu trắng khi quan sát dưới kính hiển vi thấy trong sợi nấm có vách
ngăn, sợi nấm phân nhánh.
Bào tử nấm C.sinensis có hình cầu hay hình ô van, màu trắng trong, bề mặt nhẵn.
Khi nuôi cấy nấm C.sinensis ở 22oC với điều kiện có ánh sáng yếu, sợi nấm có
thể hình thành quả thể trên môi trường thạch sau khoảng 45 - 50 ngày. Cây nấm mọc
cao lên trên bề mặt sợi nấm, cây nấm có màu vàng cam, hình trụ tròn, dài và thẳng
đứng, phần đầu hơi phình to ra.
Hình 4.4 Quả thể nấm C.sinensis.
14
Theo Đặng Trường Nguyễn, (2010) C.sinensis cũng có khả năng hình thành
cây trên môi trường lỏng ở 22oC nhưng hình dạng quả thể chưa rõ ràng. Điều này
chứng tỏ khả năng nấm C.sinensis hình thành quả thể trên môi trường nhân tạo là
hoàn toàn có thể, do đó có thể nghiên cứu sâu hơn nhằm xác định được môi trường và
điều kiện nuôi cấy tối ưu để nấm C.sinensis có thể hình thành quả thể trên môi trường
nhân tạo.
4.2. Sự phát triển của nấm C.sinensis trên các giá thể khác nhau
Nấm C.sinensis được nuôi cấy trên giá thể, tiến hành đo thể tích sợi nấm phát
triển trên giá thể. Kết quả được đo liên tục từ ngày đầu tiên nuôi cấy đến ngày thứ 41
(giá thể bắp đến ngày thứ 29) với khoảng thời gian 4 ngày/lần đo. Với thể tích của
mảnh thạch mang sợi nấm cấy trên giá thể vào ngày đầu tiên khoảng 0,2 cm3.
4.2.1. Đặc điểm phát triển của nấm C.sinensis trên các giá thể
a) Đặc điểm phát triển của nấm C.sinensis trên giá thể bắp
Bảng 4.1 Mức độ lan tơ của nấm C.sinensis trên giá thể bắp
Đợt 1
Đợt 2
Đợt 3
Ngày
3
3
(cm )
(%)
(cm )
(%)
(cm3)
1
0,2
0,1
0,2
0,1
0,2
5
11
6
12,7
7
12,7
9
54,6
30
58,24
32
54,6
13
82
45
100,1
55
91
0,1
7
31
50
17
91
50
109,3
60
100,1
55
55
21
100,1
55
127,4
70
109,2
60
62
25
109
60
136,5
75
118
65
67
29
33
118,5
125,6
65
69
151
160,2
83
88
132,8
140,1
73
77
74
78
37
131
72
163,5
90
145,5
80
81
41
136,3
75
169,2
93
% = (thể tích lan tơ : thể tích giá thể) x 100%
149,2
82
83
15
(%)
0,1
7
30
50
Giá trị trung bình
(%)
Hình 4.5 Nấm C.sinensis trên giá thể. (a) Giá thể bắp khi chưa cấy nấm; (b) Sợi nấm
C.sinensis phát triển trên giá thể bắp sau 41 ngày.
Tốc độ tăng trưởng của nấm trên giá thể bắp từ ngày 1 - 5 khá chậm, bắt đầu
tăng nhanh từ ngày 5 - 13, chậm và đều từ ngày 13 - 41.
Tốc độ tăng trưởng trung bình của nấm C.sinensis trên giá thể bắp 2,02%/ngày.
b) Đặc điểm phát triển của nấm C.sinensis trên giá thể bắp - nhộng
Hình 4.6 Nấm C.sinensis trên giá thể. (a) Giá thể bắp - nhộng khi chưa cấy nấm; (b) Sợi
nấm C.sinensis phát triển trên giá thể bắp - nhộng sau 29 ngày.
16
Bảng 4.2 Mức độ lan tơ của nấm C.sinensis trên giá thể bắp - nhộng
Giá trị
Đợt 1
Đợt 2
Đợt 3
Ngày
trung bình
(cm3)
(%)
(cm3) (%) (cm3) (%)
(%)
1
0,2
0,1
0,2
0,1
0,2
0,1
0,1
5
10,9
6
12,74
7
12,72
7
7
9
63,7
35
74,61
41
72,5
40
39
13
109,1
60
127
70
118,3
65
65
17
127,2
70
145,6
80
136,4
75
75
21
145,6
80
154,7
90
154,7
85
85
25
163,8
90
169,3
97
169,3
93
93
29
172,9
95
178,4
99
178,4
% = (thể tích lan tơ : thể tích giá thể) x 100%
98
97
Tốc độ tăng trưởng của nấm trên giá thể bắp - nhộng khá chậm từ ngày 1 - 5,
tăng nhanh từ ngày 5 - 13, chậm lại và đều từ ngày 13 – 29.
Tốc độ tăng trưởng trung bình của nấm C.sinensis trên giá thể bắp - nhộng
3,35%/ngày.
c) Đặc điểm phát triển của nấm C.sinensis trên giá thể bắp - kê
Hình 4.7 Nấm C.sinensis trên giá thể. (a) Giá thể bắp - kê khi chưa cấy nấm; (b) Sợi nấm
C.sinensis phát triển trên giá thể bắp - kê sau 41 ngày.
Tốc độ tăng trưởng của nấm trên giá thể bắp - kê khá chậm từ ngày 1 - 5, tăng
nhanh từ ngày 5 - 13, chậm lại từ ngày 13 – 21, khá nhanh từ ngày 21 – 29 và chậm
lại từ ngày 29 – 41.
17
