KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ỨC CHẾ AFLATOXIN CỦA Bacillus subtilis PHÂN LẬP TỪ ĐẤT

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ỨC CHẾ AFLATOXIN CỦA
Bacillus subtilis PHÂN LẬP TỪ ĐẤT

Ngành học

: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện

: VÕ THIÊN THI HẠ

Niên khóa

: 2007 – 2011

Tháng 7/2011


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ỨC CHẾ AFLATOXIN CỦA Bacillus
subtilis PHÂN LẬP TỪ ĐẤT

Hướng dẫn khoa học

Sinh viên thực hiện

PGS.TS. NGUYỄN NGỌC HẢI

VÕ THIÊN THI HẠ

Tháng 7/2011
ii


LỜI CẢM ƠN
Con xin khắc ghi công lao sinh thành và dưỡng dục của cha mẹ. Con cám ơn gia
đình đã luôn động viên và là chỗ dựa tinh thần cho con mỗi khi gặp khó khăn.
Chân thành cảm ơn
Ban chủ nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, cùng quý thầy cô đã dạy bảo và
truyền đạt cho em những kiến thức quý báu trong suốt thời gian học tại trường.
PGS.TS. Nguyễn Ngọc Hải đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em trong suốt thời
gian thực hiện đề tài.
TS. Lê Anh Phụng, ThS. Trương Đình Bảo, ThS. Nguyễn Ngọc Thanh Xuân đã
nhiệt tình giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành tốt khóa luận.
Cám ơn các bạn Khánh Linh, Oanh, Ngọc, Tường cùng thực tập tại phòng vi sinh
đã nhiệt tình giúp đỡ trong suốt thời gian làm đề tài ở phòng.
Cuối cùng em xin cám ơn những người bạn đã giúp đỡ, an ủi và chia sẻ cùng em
những khi gặp khó khăn.

i

TÓM TẮT
Aflatoxin là loại độc tố nấm mốc quan trọng gây ảnh hưởng rất lớn đến sức khỏe
con người và vật nuôi đặc biệt là gây tổn hại nghiêm trọng tới tế bào gan. Việc ức chế
sự phát triển của nấm mốc và sản sinh aflatoxin là điều cần thiết để hạn chế sự nhiễm
nấm mốc trong thức ăn và tổn thất về kinh tế trong chăn nuôi gia súc. Một trong những
loài vi sinh vật có khả năng ức chế sự phát triển của nấm mốc và sản sinh aflatoxin đó
là vi khuẩn Bacillus subtilis nên chúng tôi đã thực hiện đề tài “Khảo sát khả năng ức
chế sản sinh aflatoxin của các chủng Bacillus subtilis phân lập từ đất” tại phòng Thí
nghiệm vi sinh Khoa Chăn Nuôi Thú Y trường Đại Học Nông Lâm Tp.HCM từ tháng
1 năm 2011 đến tháng 7 năm 2011. Và chúng tôi đã có được những kết luận sau:
Sau 7 ngày nuôi cấy chung Aspergillus flavus và Bacillus subtilis trên môi trường
thạch nước cốt dừa, quan sát dưới đèn UV nhận thấy một số chủng vi khuẩn Bacillus
subtilis có khả năng ức chế sự sinh trưởng và sản sinh aflatoxin của nấm mốc
Aspergillus flavus và đã chọn được chủng vi khuẩn Bacillus subtilis số 8 là có khả
năng ức chế mạnh nhất.
Sau khi nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường có và không có aflatoxin với các
nồng độ khác nhau trong 6 ngày được kết quả phân tích thống kê (p > 0,05) hàm
lượng aflatoxin và số lượng vi khuẩn không có mối tương tác với nhau.

ii


SUMMARY
Aflatoxin is a dangerous toxic from fungi which damages greatly to liver of the
human and animals. Therefore it is imperative to inhibit the growth of bacteria and
reduce the concentration of aflatoxin. Although there were many methods to reduce
amount of aflatoxin as well as the growth of mould, most of scientists still use
antagonistic microorganisms for their research because of its safety. As we found that
one of microorganisms could inhibit the growth of fungi and aflatoxin was Bacillus

subtilis.

The

of Bacillus subtilis

thesis
isolated

“Survey

of inhibited aflatoxin production by strains

from

soil”

was

carried

out

at

Microbiological Laboratory of the Faculty of Animal Husbandry and Veterinary,
Agriculture and Forestry University from January to July in 2011. And we had the
following results:
After culturing Aspergillus flavus and Bacillus subtilis together in 7 days on
coconut agar, observed under UV light , we found that some strains of Bacillus subtilis

could inhibit the production of aflatoxin of Aspergillus flavus and Bacillus subtilis 8
strain was selected as the strongest inhibitor.
After 6 days culturing the bacteria in the TSB with and without aflatoxin with
different concentrations, we had found that there is no interaction between
aflatoxin and Bacillus subtilis development with p > 0,05.

iii


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ......................................................................................................i
TÓM TẮT.......................................................................................................... ii
SUMMARY...................................................................................................... iii
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT................................................................vi
DANH SÁCH CÁC BẢNG ..............................................................................vii
DANH SÁCH CÁC HÌNH.............................................................................. viii
Chương 1 MỞ ĐẦU............................................................................................1
1.1. Đặt vấn đề .................................................................................................1
1.2. Yêu cầu của đề tài .....................................................................................2
1.3. Nội dung thực hiện....................................................................................2
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................3
2.1. Khái quát về vi khuẩn Bacillus subtilis......................................................3
2.1.1. Lịch sử phát triển ................................................................................3
2.1.2. Đặc điểm phân loại và sự phân bố của vi khuẩn Bacillus subtilis ........3
2.1.2.1. Đặc điểm phân loại .......................................................................3
2.1.2.2. Đặc điểm phân bố .........................................................................3
2.1.3. Đặc điểm hình thái ..............................................................................4
2.1.4. Đặc điểm nuôi cấy ..............................................................................4
2.1.5. Đặc điểm sinh hóa...............................................................................5
2.1.6. Đặc điểm cấu trúc kháng nguyên.........................................................5

2.1.7. Bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis .........................................................6
2.1.7.1. Cấu tạo của bào tử ........................................................................6
2.1.7.2. Đặc điểm và tác dụng của bào tử...................................................7
2.1.8. Tính chất đối kháng của Bacillus subtilis với vi khuẩn gây bệnh .........7
2.1.9. Những nghiên cứu về tác dụng đối kháng Aspergillus… ...................10
2.2. Khái quát về nấm mốc sinh aflatoxin.......................................................11
2.2.1. Khái niệm về nấm mốc .....................................................................11
2.2.2. Độc tố nấm mốc ................................................................................12
2.2.3. Độc tố aflatoxin ................................................................................12
iv


2.2.3.1. Nguồn gốc ..................................................................................12
2.2.3.2. Cấu trúc hóa học và đặc tính hóa lý của aflatoxin........................13
2.2.3.3. Sự sinh tổng hợp aflatoxin ..........................................................15
2.2.3.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự tạo aflatoxin...................................15
2.2.3.5. Cơ chế gây bệnh của aflatoxin ....................................................16
2.2.3.6. Những tác hại do aflatoxin gây ra ...............................................17
2.2.3.7. Các phương pháp phân hủy aflatoxin ..........................................18
Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU............................22
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ...........................................................22
3.2.Đối tượng khảo sát ...................................................................................22
3.3. Thiết bị dụng cụ thí nghiệm.....................................................................22
3.4. Môi trường nuôi cấy................................................................................22
3.5. Phương pháp nghiên cứu .........................................................................22
3.5.1. Kiểm tra khả năng sinh aflatoxin của Aspergillus flavus… ...............22
3.5.1.1. Kiểm tra khả năng sinh aflatoxin của Aspergillus flavus .............23
3.5.1.2. Đánh giá sơ bộ khả năng ức chế sản sinh aflatoxin… ........................23
3.5.2. Đánh giá ảnh hưởng của aflatoxin và khả năng làm giảm aflatoxin…24
3.5.2.1. Đánh giá ảnh hưởng của aflatoxin lên sự phát triển của vi khuẩn 24

3.5.2.2. Đánh giá tác động của vi khuẩn lên hàm lượng aflatoxin ............26
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN...........................................................28
4.1. Kiểm tra khả năng sinh aflatoxin của Aspergillus flavus… .....................28
4.1.1. Kiểm tra khả năng sinh aflatoxin của Aspergillus flavus....................28
4.1.2. Đánh giá sơ bộ khả năng ức chế sản sinh aflatoxin…. .......................29
4.2. Đánh giá tác động của aflatoxin và khả năng làm giảm aflatoxin… ........31
4.2.1. Đánh giá tác động của aflatoxin lên sự phát triển của vi khuẩn..........31
4.2.2. Đánh giá ảnh hưởng của vi khuẩn lên hàm lượng aflatoxin. ..............32
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ...............................................................35
5.1. Kết luận...................................................................................................35
5.2. Đề nghị ...................................................................................................35
TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................36

v


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

cfu

Colony-forming unit

ctv

Cộng tác viên

DNA

Deoxyribonucleic acid

ppb

Part per billion

UV

Ultra Violet

RNA

Rebonucleic acid

vi


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng 2.1 Các phản ứng sinh hóa của Bacillus subtilis ........................................... 5
Bảng 2.2 Sự khác nhau giữa tế bào sinh dưỡng và bào tử của Bacillus subtilis ..... 6
Bảng 2.3 Số lượng của Escherichia coli (cfu/ml) .................................................. 10
Bảng 2.4 Khả năng ức chế aflatoxin B1 của các chủng vi khuẩn ............................ 11
Bảng 2.5 Một số loài nấm mốc có khả năng sinh aflatoxin .................................. 13
Bảng 2.6 Ảnh huởng của pH lên hàm luợng aflatoxin (µg/150 ml) ........................ 14
Bảng 2.7 Khả năng ức chế aflatoxin của các chủng Bacillus subtilis .................... 21
Bảng 3.1 Đánh giá tác động của aflatoxin lên vi khuẩn ......................................... 25
Bảng 3.2 Đánh giá ảnh hưởng của vi khuẩn lên hàm lượng aflatoxin ....................27
Bảng 4.1 Tổng số vi khuẩn Bacillus subtilis ......................................................... 32
Bảng 4.2 Hàm lượng aflatoxin .............................................................................. 33
Bảng 4.3 Giá trị pH và hàm lượng aflatoxin vào ngày 0, ngày 6............................ 33

vii

DANH SÁCH CÁC HÌNH
Hình 2.1 Hình thái vi khuẩn Bacillus subtilis ...................................................... 4
Hình 2.2 Cấu trúc hóa học của surfactin .............................................................. 8
Hình 2.3 Cấu trúc hóa học của agrastatin ............................................................ 9
Hình 2.4 Cấu trúc hóa học của iturin ................................................................... 9
Hình 2.5 Aspergillus flavus ................................................................................11
Hình 2.6 Cấu trúc hóa học của các loại aflatoxin ................................................14
Hình 2.7 Điều kiện tạo aflatoxin từ nấm mốc .....................................................15
Hình 2.8 Sự gắn kết của aflatoxin B1 vào chuỗi DNA ở vị trí 7N Guanin ...........17
Hình 3.1 Thí nghiệm khả năng sinh aflatoxin của Aspergillus flavus ..................23
Hình 3.2 Khả năng ức chế sản sinh aflatoxin của vi khuẩn Bacillus subtilis .......23
Hình 3.3 Đánh giá ảnh hưởng của aflatoxin lên sự phát triển của vi khuẩn..........26
Hình 4.1 Khuẩn lạc Aspergillus flavus dưới ánh đèn UV sau 5 ngày nuôi cấy ....28
Hình 4.2 Khuẩn lạc vi khuẩn tiếp xúc và chưa tiếp xúc với khuẩn lạc nấm mốc .29
Hình 4.3 Vòng sáng aflatoxin những chỗ tiếp xúc, không tiếp xúc với vi khuẩn .29
Hình 4.4 Sự ức chế của khuẩn lạc vi khuẩn đối với khuẩn lạc nấm mốc .............30
Hình 4.5 Vòng sáng aflatoxin dưới sự phát triển của vi khuẩn Bacillus subtilis ..30
Hình 4.6 Vòng sáng aflatoxin của A. flavus ........................................................31

viii


Chương 1 MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Nấm mốc và độc tố nấm mốc có ảnh hưởng rất lớn đến năng suất nông sản và
làm giảm giá trị dinh dưỡng của thực phẩm, thậm chí nó còn sinh ra các độc tố gây
bệnh.
Người ta đã phát hiện trên 300 loại độc tố nấm mốc. Độc tố quan trọng nhất cho

đến hiện nay là aflatoxin do nấm mốc Aspergillus sản sinh. Các loại nông sản thường
bị nhiễm aflatoxin là ngũ cốc (ngô, kê, lúa miến, gạo, lúa mì), hạt có dầu (lạc, đậu
tương, hạt hướng dương, hạt bông), gia vị (ớt, hạt tiêu đen, rau mùi, nghệ, gừng) và
các loại quả hoặc hạt khác như hạt dẻ, dừa…Aflatoxin cũng có thể xuất hiện trong sữa
của động vật được cho ăn bằng thức ăn nhiễm aflatoxin. Aflatoxin gây rối loạn chức
năng, suy giảm miễn dịch, …gây độc cho gia súc, gia cầm và cũng là chất gây ung thư
gan cho con người.
Trong điều kiện ẩm độ và nhiệt độ thích hợp, nếu không được bảo quản tốt thì
các loại ngũ cốc cũng như thức ăn gia súc rất dễ bị nhiễm các loại nấm mốc sinh
aflatoxin. Điều đó sẽ gây tổn thất rất lớn cho nhà chăn nuôi và ảnh hưởng đến sức
khỏe người tiêu dùng. Đã có nhiều phương pháp nhằm làm giảm và phân hủy aflatoxin
như: phương pháp vật lý, hóa học, và sinh vật học.
Ngày nay các phương pháp sinh vật học được hướng tới nhiều nhất vì nó không
gây ô nhiễm môi trường. Phương pháp này sử dụng các loài nấm mốc, nấm men, vi
khuẩn, xạ khuẩn không có độc tính để làm giảm aflatoxin. Một số chủng Bacillus
subtilis đã được thử nghiệm về khả năng ức chế sự phát triển và sản sinh aflatoxin
của nấm mốc. Việc bổ sung Bacillus subtilis vào thức ăn gia súc ngoài tác dụng làm
giảm sự tổng hợp aflatoxin còn giúp cải thiện tiêu hóa cho gia súc nhờ các enzyme như
amylase và protease.
Chúng tôi tiến hành đề tài: “ Khảo sát khả năng ức chế aflatoxin của Bacillus
subtilis phân lập từ đất”

1


1.2. Yêu cầu của đề tài
Đánh giá khái quát khả năng làm giảm aflatoxin và ảnh hưởng của aflatoxin lên
sự phát triển của vi khuẩn.
1.3. Nội dung thực hiện
Đánh giá khả năng ức chế của vi khuẩn Bacillus subtilis lên sự phát triển và sinh

tổng hợp aflatoxin của Aspergillus flavus trên môi trường thạch nước cốt dừa.
Khảo sát ảnh hưởng của aflatoxin lên sự phát triển của vi khuẩn Bacillus subtilis và khả
năng làm giảm aflatoxin của Bacillus subtilis.

2


Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Khái quát về vi khuẩn Bacillus subtilis
2.1.1. Lịch sử phát triển
Bacillus subtilis được phát hiện đầu tiên trong phân ngựa (1941) bởi tổ chức y
học Nazi của Đức. Ban đầu Bacillus subtilis được sử dụng chủ yếu để phòng bệnh lỵ
cho các binh sĩ Đức chiến đấu ở Bắc Phi. Đến những năm 1949 – 1957 khi Henrry,
Albot và cộng sự tách được các chủng Bacillus subtilis thuần khiết thì “subtilis
therapy” có nghĩa là thuốc subtilin ra đời trị các chứng viêm ruột, viêm đại tràng,
chống tiêu chảy trong rối loạn tiêu hóa. Ngày nay, vi khuẩn này đã được sử dụng phổ
biến và rộng rãi trong nhiều lĩnh vực: y học, chăn nuôi, thực phẩm, … (trích dẫn bởi
Phạm Hoàng Thái, 2007).
2.1.2. Đặc điểm phân loại và sự phân bố của vi khuẩn Bacillus subtilis
2.1.2.1. Đặc điểm phân loại
Theo Bergey (1994), vi khuẩn Bacillus subtilis thuộc
Bộ:

Eubacterriales

Họ:

Bacillaceae

Giống:

Bacillus

Loài:

Bacillus subtilis

2.1.2.2. Đặc điểm phân bố
Vi khuẩn Bacillus subtilis thuộc nhóm vi sinh vật bắt buộc của đường ruột,
chúng được phân bố hầu hết trong tự nhiên như trong, bụi, đất, nước… và cỏ khô nên
còn đuợc gọi là trực khuẩn cỏ khô. Phần lớn chúng tồn tại trong đất, thường trong đất
trồng trọt chứa khoảng 10 – 100 triệu cfu/g, ở đất nghèo dinh dưỡng như sa mạc, đất
hoang thì Bacillus subtilis rất hiếm. Nước, bùn ở cửa sông và nước biển có sự tồn tại
của bào tử và tế bào sinh dưỡng vi khuẩn Bacillus subtilis.

3


2.1.3. Đặc điểm hình thái

Hình 2.1 Hình thái vi khuẩn Bacillus subtilis.

/>
Vi khuẩn Bacillus subtilis có dạng trực ngắn, hai đầu tròn, bắt màu Gram dương,
kích thước 0,5 – 0,8 µm x 1,5 – 3 µm, thường đứng đơn lẻ hoặc tạo thành chuỗi ngắn,
có khả năng di động, có 8 – 12 tiêm mao, sinh bào tử có kích thước 0,6 – 0,9 µm. Bào
tử Bacillus subtilis phát triển bằng cách nảy chồi do sự nứt của vỏ, có khả năng chịu
nhiệt, chịu ẩm, tia tử ngoại, phóng xạ…(Tô Minh Châu, 2000). Vị trí bào tử trong tế
bào sinh dưỡng không theo quy luật nào, có thể lệch tâm, gần tâm nhưng không chính
tâm (Nguyễn Lân Dũng, 2001).

2.1.4. Đặc điểm nuôi cấy
- Điều kiện nuôi cấy: hiếu khí, nhiệt độ tối ưu 37oC.
- Nhu cầu O2: Bacillus subtilis là vi khuẩn hiếu khí nhưng có khả năng phát triển
trong môi trường thiếu oxy.
- Độ pH: Bacillus subtilis thích hợp nhất với pH = 7 – 7,4.
- Trên môi trường thạch đĩa TSA: khuẩn lạc dạng tròn, rìa răng cưa không đều,
có tâm sẫm màu, phát triển chậm, màu vàng xám, đường kính 3 – 5 mm. Sau 1 – 4
ngày bề mặt nhăn nheo, màu hơi sẫm.
- Trên môi trường thạch nghiêng TSA: dễ mọc, tạo thành màu hơi xám, rìa gợn
sóng.
- Môi trường canh TSB: Bacillus subtilis phát triển làm đục môi trường, tạo
màng nhăn trên bề mặt môi trường canh, lắng cặn kết lại như vẩn mây ở đáy, khó tan
đều khi lắc lên.
- Dinh dưỡng: cần các nguyên tố C, H, O, N và các nguyên tố khác.
4


2.1.5. Đặc điểm sinh hóa
Bảng 2.1 Các phản ứng sinh hóa của Bacillus subtilis
Phản ứng sinh hóa

Kết Quả

Hoạt tính catalase

+

Sinh indol

-

MR

+

VP

+

Sử dụng citrate
Khử nitrate

+

Tan chảy gelatin

+

Di động

+

Phân giải tinh bột

+

Arabinose

+

Xylose
Saccharose

+

Mannitol

+

Glucose

+

Lactose

-

Mantose

+

( Theo Holt, 1992)
Dung huyết: một số dòng gây dung huyết trên thạch máu ngựa và thỏ do tác dụng
của hemolysine.
2.1.6. Đặc điểm cấu trúc kháng nguyên
Bacillus subtilis có cấu trúc kháng nguyên H và O, cấu trúc kháng nguyên dạng
D và L của acid glutamic.
Sản sinh kháng sinh subtilin và bacitracin có tác dụng ức chế vi khuẩn G+ và G-.
Đa số chủng Bacillus subtilis không gây bệnh.

5


2.1.7. Bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis
Một trong những đặc điểm quan trọng của Bacillus subtilis là khả năng tạo bào
tử. Bào tử vi khuẩn là một dạng biến đổi đặc biệt của tế bào sinh dưỡng trong một giai
đoạn nào đó của quá trình sinh trưởng của vi khuẩn, mỗi tế bào chỉ tạo thành một bào
tử (Nguyễn Khắc Tuấn, 1996).
2.1.7.1. Cấu tạo của bào tử
Ngoài cùng của bào tử là một lớp màng, dưới lớp màng là vỏ. Vỏ bào tử có nhiều
lớp. Đây là những lớp có tác dụng ngăn chặn sự thẩm thấu của nước và các chất tan
trong nước. Dưới lớp vỏ là lớp màng trong của bào tử và trong cùng là một khối tế bào
chất đồng nhất. Trong các bào tử tự do không tồn tại sự trao đổi chất, vì vậy có thể giữ
ở trạng thái tiềm sinh trong nhiều năm (Lê Đỗ Mai Phương, 2004).
Bào tử khác tế bào sinh dưỡng về cấu trúc, thành phần hóa học và cấu trúc sinh lý.
Bảng 2.2 Sự khác nhau giữa tế bào sinh dưỡng và bào tử của Bacillus subtilis
Đặc tính

Tế bào sinh dưỡng

Bào tử

Tế bào G+, điển

Vỏ bào tử dày, khó thấm

hình

nước

Canxi

Thấp

Cao

Protein

Thấp

Cao

Hoạt tính enzyme

Cao

Thấp

Khả năng chịu nhiệt

Yếu

Mạnh

Chịu bức xạ

Kém

Mạnh

Thấp

Cao

Cấu trúc
Thành phần hóa học

Hoạt tính các chất hóa
học và acid
Khả năng bắt màu chất
nhuộm

Phải dùng phương pháp

Dễ nhuộm

đặc biệt

(Tô Minh Châu, 2000)

6


2.1.7.2. Đặc điểm và tác dụng của bào tử
Bào tử vi khuẩn không phải là bộ phận làm chức năng sinh sản mà là một thể
biến đổi của tế bào nhằm bảo tồn, đổi mới và nâng cao sức sống của vi khuẩn. Bào tử
là một hình thức tiềm sinh của vi khuẩn, có sự đề kháng cao với các nhân tố bất lợi của
ngoại cảnh.
Theo Nguyễn Xuân Thành và ctv (2005) thì sự tồn tại lâu dài của bào tử là do
chúng có các đặc tính sau:

- Nước trong bào tử phần lớn ở trạng thái liên kết, do đó không có khả năng làm
biến tính protein khi tăng nhiệt độ.
- Do trong bào tử có một lượng lớn ion Ca++ và acid dipicolinic. Protein trong
bào tử kết hợp với dipicolinat canxi tạo thành một phức chất có tính ổn định cao đối
với nhiệt độ.
- Các enzyme và các hoạt chất sinh học khác trong bào tử đều tồn tại dưới dạng
không hoạt động làm hạn chế sự trao đổi chất của bào tử với môi trường bên ngoài.
- Sự có mặt của các acid amin chứa lưu huỳnh, đặc biệt là cysteine giúp bào tử đề
kháng với tia cực tím.
- Với cấu trúc có nhiều màng bao bọc và tính ít thẩm thấu của các lớp màng, làm
cha các chất hóa học và các chất sát trùng khó có thể tác động đến bào tử.
Khi gặp điều kiện thuận lợi, bào tử sẽ nảy mầm và phát triển thành một tế bào
mới có sức sống mạnh mẽ hơn (Nguyễn Khắc Tuấn, 1996).
2.1.8. Tính chất đối kháng của Bacillus subtilis với vi khuẩn gây bệnh
Mỗi loài vi sinh vật khác nhau sẽ thích hợp ở điều kiện môi trường khác nhau,
sinh khuẩn lạc khác nhau.
Thay đổi môi trường hoặc các yếu tố môi trường bất lợi tức là thay đổi điều kiện
sống sẽ hạn chế hoặc ức chế sự phát triển của vi sinh vật. Thực tế, khi môi trường nuôi
cấy nấm mốc gây bệnh có sự hiện diện của Bacillus subtilis với một số lượng lớn sẽ
xảy ra sự cạnh tranh chất dinh dưỡng, cạnh tranh không gian giữa vi khuẩn và nấm.
Do vi khuẩn phát triển nhanh hơn (trong 24 giờ) sẽ sử dụng phần lớn chất dinh dưỡng
trong môi trường, đồng thời tạo ra một số loại kháng sinh nên sự sinh trưởng của nấm
bị ức chế (Nguyễn Lân Dũng và Hoàng Đức Nhuận 1976; trích dẫn Lý Kim Hữu, 2005).
7


Phương thức diệt nấm và tác nhân gây bệnh của vi khuẩn Bacillus subtilis như sau:
- Đầu tiên vi khuẩn Bacillus subtilis tạo thành khối xung quanh tác nhân gây
bệnh ngăn chặn không cho chúng bám vào vật chủ để gây bệnh.
- Sau đó, Bacillus tiết ra hỗn hợp gồm nhiều lipopeptid (được gọi là serenade) để

làm thủng vách tế bào và màng tế bào chất của tác nhân gây bệnh do đó ngăn chặn sự
phát triển của chúng. Serenade có thể được bảo quản, sử dụng như một loại thuốc trừ
sâu hóa học tổng hợp, đã được kiểm tra và chứng minh trong phòng thí nghiệm là
không gây độc đối với cá hồi, ong mật, chim cút,… và nhiều loài khác. Serenade gồm
3 nhóm lipopeptid có tên là surfactin, agrastatin và iturin. Ba nhóm này kết hợp với
nhau để làm tăng hoạt tính diệt các mầm bệnh kể cả vi sinh vật gây hại, nấm mốc và cả
bào tử gây bệnh của chúng.
Surfactin là nhóm chất có hoạt tính sinh học, bản chất là lipopeptid. Bản thân
surfactin không gây độc cho nấm nhưng khi kết hợp với iturin thì trở thành hợp chất
diệt nấm. Surfactin có khả năng làm thủng vách tế bào của các tác nhân gây bệnh và
bào tử của chúng, giúp cho agrastatin và iturin phát huy tác dụng.

Hình 2.2 Cấu trúc hóa học của surfactin.

( />
Agrastatin vừa mới được phát hiện cũng có khả năng diệt nấm giống như
surfactin và iturin.

8


Hình 2.3 Cấu trúc hóa học của agrastatin

( />
Iturin là nhóm chất chiếm vai trò quan trọng nhất trong quá trình diệt nấm, bản
chất là lipopeptid được chiết từ môi trường nuôi cấy vi khuẩn Bacillus subtilis. Iturin
diệt nấm bằng cách tác dụng lên màng tế bào chất, làm tan màng, tạo thành những lỗ
thủng trên đó để làm mất tính thẩm thấu chọn lọc của màng.

Hình 2.4 Cấu trúc hóa học của iturin

( />
Ngoài ra Bacillus subtilis cũng đối kháng với vi khuẩn gây bệnh như Escherichia
coli. Bacillus subtilis có khả năng tổng hợp một số chất kháng sinh nên gây ức chế quá
trình sinh trưởng và phát triển của Escherichia coli, điều đó được thể hiện qua số
lượng Escherichia coli trong bảng 2.3 (Nguyễn Quỳnh Nam, 2006).

9


Bảng 2.3 Số lượng của Escherichia coli sau 0 giờ, 12 giờ, 24 giờ và 36 giờ nuôi cấy
(cfu/ml)
Mẫu

Thời gian (giờ)
0

12

24

36

1

4,45.1010

29,80.108

15,75.107

<106

2

4,45.1010

19,95.108

9,55.107

<106

3

4,45.1010

17,26.108

8,30.107

<106

4

4,45.1010

19,95.108

13,67.107

<106

5

4,45.1010

23,40.108

2,60.107

<106

Đối chứng

4,45.1010

22,15.1011

61,76.1011

23.1012

Mẫu (1, 2, 3, 4, 5): môi trường TSB chứa Bacillus subtilis và Escherichia coli.
Mẫu đối chứng: môi trường TSB chứa Escherichia coli.

2.1.9. Những nghiên cứu về tác dụng đối kháng Aspergillus của Bacillus subtilis
Trong nước:
Nguyễn Đình Đào năm 1993 đã tiến hành kiểm tra khả năng đối kháng của chủng
Bacillus subtilis AO1 với Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus và kết quả là có

sự ức chế nấm mốc Aspergillus (trích dẫn bởi Nguyễn Thị Ngọc Trân, 1995).
Nguyễn Hữu Phúc và cộng sự năm 1993 đã sử dụng vi khuẩn Bacillus subtilis để
ức chế sinh trưởng và sản xuất aflatoxin của Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus
trên đậu phộng (trích dẫn bởi Lâm Thanh Thúy Trân, 1995).
Nguyễn Thị Ngọc Trân năm 1995 đã tiến hành kiểm tra khả năng đối kháng của
chủng Bacillus subtilis AO1 (do Trung tâm công nghệ sinh học thuộc liên hiệp sản
xuất hóa chất cung cấp) với Aspergillus flavus trên môi trường thạch khoai tây glucose và kết quả rất khả quan.
Năm 2006, Nguyễn Ngọc Thanh Xuân với đề tài “Khảo sát khả năng sử dụng vi
khuẩn Bacillus subtilis có nguồn gốc từ đất trong xử lý nhiễm aflatoxin trên nguyên
liệu bắp” cho thấy vi khuẩn Bacillus subtilis phân lập từ đất có khả năng làm giảm
aflatoxin trên môi truờng bắp. Tỷ lệ nuôi cấy bào tử nấm mốc/ bào tử vi khuẩn là
1/103, hàm luợng aflatoxin giảm 99,6 lần.
Năm 2007, Phạm Hoàng Thái đã thực hiện đề tài “Phân lập vi khuẩn Bacillus
subtilis phân lập từ đất, khảo sát khả năng ức chế sản sinh aflatoxin của các chủng
10


phân lập đuợc”. Kết quả cho thấy vi khuẩn Bacillus subtilis phân lập từ đất có khả
năng làm giảm aflatoxin trên môi truờng bắp. Tỷ lệ nuôi cấy bào tử nấm mốc/ bào tử
vi khuẩn 1/105, hàm luợng aflatoxin giảm 8,8 lần.
Ngoài nước:
Một số thí nghiệm về khả năng ức chế sinh tổng hợp aflatoxin của một số chủng
vi khuẩn Bacillus subtilis đã được thực hiện với Aspergillus flavus và Aspergillus
parasiticus.
Norio Kimura (1990) đã sử dụng vi khuẩn Bacillus subtilis để ngăn chặn sự phát
triển và sinh độc tố của chủng Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus trên đậu
phộng và bắp. Các chủng Bacillus subtilis NK330 và NK-C-3 ức chế mạnh mẽ sự phát
triển của nấm mốc và tổng hợp aflatoxin.
2.2. Khái quát về nấm mốc sinh aflatoxin
2.2.1. Khái niệm về nấm mốc

Hình 2.5 Aspergillus flavus

A: bào tử; B:thể bình thứ cấp;
C: thể bình sơ cấp; D: thể bọng;
E: cuống đính bào tử.
( />s%20flavus%20nakres.jpg)

Nấm mốc là vi sinh vật (vi nấm) có cấu tạo gần giống với thực vật, sống ký sinh
hay hoại sinh trên nhiều loại chất khác nhau, đặc biệt là các chất hữu cơ đơn giản nhất
là hydratcacbon.

11


Nấm mốc không chứa diệp lục tố, cấu tạo dạng sợi có vách ngăn hoặc không có
vách ngăn. Những sợi nấm này phân nhánh, hình thành từng đám chằng chịt gọi là hệ
sợi nấm.
Có 2 loại sợi:
Sợi nấm dinh dưỡng:nằm trong lớp môi trường, làm nhiệm vụ hấp thu chất dinh
dưỡng cho toàn bộ hệ nấm.
Sợi nấm khí sinh: thường nhô lên trên môi trường, giữ vai trò sinh sản (tạo bào tử).
2.2.2. Độc tố nấm mốc
Là sản phẩm phụ của quá trình trao đổi tự nhiên của nấm móc và có thể gây độc
cho con nguời và gia súc. Độc tố nấm mốc có tính bền với nhiệt độ cao và không bị
tiêu diệt trong quá trình chế biến thức ăn thông thuờng. Tùy từng loại mà độc tố nấm
mốc có thể gây nhiễm độc cấp tính và mãn tính.
Hiện nay đã phát hiện trên 300 loại độc tố mycotoxin từ hơn 100 loài nấm mốc.
Trong đó có khoảng 20 loại độc tố gây nguy hiểm đến sức khỏe con nguời và vật nuôi.
5 loại độc tố nguy hiểm nhất hiện nay là aflatoxin, deoxynivalenol, zearalenone,

ochratoxin và fumonisin (Trần Cúc Phuơng, 2008).
2.2.3. Độc tố aflatoxin
2.2.3.1. Nguồn gốc
Aflatoxin được phát hiện vào năm 1960 khi gây chết trên 10000 gà tây (3 – 6
tuần tuổi) ở Anh với tổn thương gan nặng nề. Sau đó người ta còn phát hiện thêm độc
tố này cũng gây tổn thương gan ở súc vật thí nghiệm khác: chuột, thỏ, khỉ, heo, bò…
Đến 1961, người ta tìm ra bản chất hóa học của độc tố này và đặt tên là aflatoxin.
Aflatoxin là một độc tố được tiết ra từ nấm Aspergillus flavus và Aspergillus
parasiticus,được tìm thấy đầu tiên từ bánh dầu phộng nhập từ Brazil. Trong tự nhiên,
có 4 loại aflatoxin được nấm mốc sinh ra, ký hiệu là AFB1, AFB2, AFG1, AFG2. Loại
B1 có độc tính cao nhất. Ngoài ra còn có một số nấm mốc khác có khả năng sinh
aflatoxin.

12


Bảng 2.5 Một số loài nấm mốc có khả năng sinh aflatoxin
Aflatoxin

Loài nấm mốc

Tác giả

B1

B2

G1

G2

(2)

(3)

(4)

(5)

Aspergillus flavus

+

+

Aspergillus parasiticus

+

+

+

+

Coduer và ctv, 1963

Aspergillus nomius

+

+

+

+

Kurzman và ctv, 1987

Aspergillus oryzae

+

Basappa và ctv, 1967

Aspergillus niger

+

Kulik và Holaday, 1967

Aspergillus wentii

+

Kulik và Holaday, 1967

Aspergillus ruber

+

Kulik và Holaday, 1967

Aspergillus ostianus

+

Aspergillus ochraceus

+

Penicillium puberulum

+

Penicillium variabile

+

Kulik và Holaday, 1967

Penicillium frequentans

+

Kulik và Holaday, 1967

Penicillium citrinum

+

Kulik và Holaday, 1967

Rhizopus sp.

+

Van Walbeck và ctv, 1968

(1)

(6)
Sargeant và ctv, 1961

+

Scot và ctv, 1968
Van Walbeck và ctv, 1968

+

+

+

Kulik và Holaday, 1967

Các loài nấm có vai trò quan trọng trong sản sinh aflatoxin là Aspergillus flavus
và Aspergillus parasiticus, các loài nấm khác: Penicillium spp và Rhizopus sp. thường
ít có vai trò gây bệnh trong thực tế (Lê Anh Phụng, 2001).

2.2.3.2. Cấu trúc hóa học và đặc tính hóa lý của aflatoxin
Cấu trúc hóa học của aflatoxin: là hợp chất hữu cơ có nhân đa mạch vòng, gọi là
difurannocumarin. Trong cấu trúc phân tử có các nhóm lacton và metoxyl, không có
nhóm hydroxyl tự do.

13


Hình 2.6 Cấu trúc hóa học của các loại aflatoxin

( />
Tính chất vật lý: Aflatoxin là tinh thể trắng, bền với nhiệt, không bị phân hủy khi
đun nấu ở nhiệt độ thông thường (ở 120oC, phải đun 30 phút mới mất tác dụng độc) do
vậy nó có thể tồn tại trong thực phẩm không cần sự có mặt của nấm mốc tương ứng,
đồng thời nó rất bền với các men tiêu hóa.
A. Ciegler và ctv (1966) đã tiến hành thí nghiệm thử ảnh huởng của độ pH lên
hàm luợng aflatoxin.
Bảng 2.6 Ảnh huởng của pH lên hàm luợng aflatoxin (µg/150 ml) trong thí nghiệm
của A. Ceigler và ctv (1966)
pH

Ngày
0

1

2

3

4

5,5

190

190

190

190

190

6,5

190

190

190

190

152

7,5

190

190

190

190

114

8,5

76

76

76

76

46

9,5

46

19

19

19

23

o

Thí nghiệm tiến hành trên môi trường TGY ở 28 C, pH đuợc điều chỉnh bởi NaOH và HCl.

14


Aflatoxin tan trong một số dung môi hữu cơ như chloroform, methanol, ethanol,
aceton, benzene… không tan trong các dung môi béo như hexan, ether ethylic, ether
dầu hỏa…
Aflatoxin B1 và B2: phát ra màu xanh nước biển dưới ánh sáng UV.
Aflatoxin G1 và G2: phát ra màu xanh lá cây dưới ánh sáng UV.
Các loại aflatoxin khác là sản phẩm chuyển hóa từ 4 loại aflatoxin B1, B2, G1, G2
trong cơ thể động vật như aflatoxin M1, aflatoxin M2, …
Trong các loại trên thì aflatoxin B1 được sản sinh với số lượng nhiều nhất trong
nông sản và cũng gây tác hại nhiều nhất.
2.2.3.3. Sự sinh tổng hợp aflatoxin
Aflatoxin là chất biến duỡng thứ cấp đuợc tổng hợp theo con đuờng polyketid
(Steyn, 1984). Có 17 gen mã hóa cho 12 enzyme xúc tác các phản ứng sinh tổng hợp
aflatoxin. Gen điều hòa trong sinh tổng hợp aflatyoxin có ký hiệu là AflR. Ở
Aspergillus flavus gen Afl-2 chịu trách nhiệm trong sinh tổng hợp aflatoxin B1 và
aflatoxin B2, trong khi gen apa-2 ở Aspergillus parasiticus có vai trò quyết định trong
sinh tổng hợp 4 loại aflatoxin B1, B2, G1 và G2 (Payne và Brown, 1998; trích dẫn Lê
Anh Phụng, 2001).
2.2.3.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự tạo aflatoxin

Hình 2.7 Điều kiện tạo aflatoxin từ nấm mốc
Aflatoxin là sản phẩm trao đổi chất thứ cấp trong quá trình biến dưỡng của nấm

mốc nên aflatoxin chỉ đuợc tạo ra khi nấm đã phát triển. Do đó điều kiện để nấm mốc
phát triển tốt cũng là điều kiện giúp tạo ra nhiều aflatoxin.
- Loại nấm mốc:
Khả năng sinh aflatoxin khác nhau giữa các loài, thậm chí giữa các chủng khác
nhau trong cùng một loài. Trong đó Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus sinh
aflatoxin nhiều nhất. Chỉ có khoảng 50% chủng Aspergilus flavus là có khả năng sinh
15