NGHIÊN CỨU CÁC THÔNG SỐ KỸ THUẬT ĐỂ NUÔI CẤY CHỦNG VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS VAE.NATTO

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU CÁC THÔNG SỐ KỸ THUẬT ĐỂ NUÔI CẤY
CHỦNG VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS VAE.NATTO

Họ và tên sinh viên: PHẠM ÁNH DUYÊN
Ngành: CÔNG NGHỆ HÓA HỌC
Niên khóa: 2007 – 2011

Tháng 08/2011


NGHIÊN CỨU CÁC THÔNG SỐ KỸ THUẬT ĐỂ NUÔI CẤY CHỦNG VI
KHUẨN BACILLUS SUBTILIS VAE.NATTO

Tác giả

PHẠM ÁNH DUYÊN

Khóa luận được đệ trình để đáp ứng yêu cầu
cấp bằng kỹ sư ngành:
Công Nghệ Hóa Học

Giáo viên hướng dẫn:
ThS. VƯƠNG THỊ VIỆT HOA

Tháng 08 năm 2011
i

LỜI CẢM ƠN
Tôi xin gửi lòng biết ơn sâu sắc đến:
Ban giám hiệu trường Đại học Nông Lâm TP.HCM, Ban chủ nhiệm Bộ môn Công
Nghệ Hóa Học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá
trình học tập tại trường.
ThS. Vương Thị Việt Hoa, người đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, động viên tôi
trong suốt quá trình thực hiện luận văn. Cám ơn cô đã truyền đạt cho tôi những kiến
thức, kinh nghiệm vô cùng quý báu trong suốt thời gian thực hiện khóa luận tốt nghiệp.
ThS. Nguyễn Minh Hiền, người đã truyền đạt cho tôi những kiến thức về thực tập
vi sinh trong thời gian thực tập.
Các bạn lớp DH07HH đã luôn bên tôi, giúp đỡ, động viên, chia sẽ cùng tôi trong
thời gian thực tập cũng như trong suốt những năm học vừa qua.
Ba mẹ, bậc sinh thành đã sinh ra và nuôi dưỡng tôi, các anh chị em trong gia đình
luôn quan tâm, ủng hộ tôi học tập và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này.
Những người bạn thân luôn bên tôi, động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện đề
tài.
Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 10 tháng 08 năm 2011
Sinh viên thực hiện

Phạm Ánh Duyên

ii


TÓM TẮT

Đề tài “Nghiên cứu các thông số kỹ thuật để nuôi cấy chủng vi khuẩn Bacillus
subtilis vae.natto” được tiến hành tại phòng thí nghiệm I4 – Trường Đại học Nông Lâm

Tp.HCM. Thời gian từ tháng 03/2011 đến tháng 08/2011.
Đề tài được bố trí qua 4 thí nghiệm:
Thí nghiệm 1: Xác định môi trường dinh dưỡng thích hợp để nuôi cấy chủng vi
khuẩn B.natto.
 Yếu tố cố định: nuôi cấy trong tủ ấm ở nhiệt độ 400C.
 Yếu tố nghiên cứu: môi trường dinh dưỡng (MRS, NB, NGĐ, NGĐ + YE)
Kết quả thu được: B.natto phát triển mạnh nhất trong môi trường NGĐ + YE và
đạt được mật độ đỉnh là 9,52 log(TB/ml).
Thí nghiệm 2: Xác định nhiệt độ thích hợp để nuôi cấy chủng vi khuẩn B.natto.
 Yếu tố cố định: môi trường dinh dưỡng (NGĐ + YE).
 Yếu tố nghiên cứu: nhiệt độ (300C, 370C, 400C, 450C).
Kết quả thu được: B.natto phát triển mạnh nhất ở nhiệt độ 450C và đạt được mật
độ đỉnh 10,08 log(TB/ml).
Thí nghiệm 3: Xác định pH thích hợp để nuôi cấy chủng vi khuẩn B.natto.
 Yếu tố cố định: môi trường dinh dưỡng (NGĐ + Y.E), nhiệt độ 450C.
 Yếu tố nghiên cứu: pH (pH = 5; pH = 5,5; pH = 6; pH = 6,5; pH = 7).
Kết quả thu được: B.natto phát triển mạnh ở pH = 6 và đạt được mật độ đỉnh
10,24 log(TB/ml).
Thí nghiệm 4: Kiểm tra khả năng lên men đậu nành của bột B.natto.
Sản xuất được bột B.natto và đánh giá được khả năng lên men của bột so với dịch
(bột B.natto lên men tốt hơn so với dịch B.natto).

iii


ABSTRACT

Thread "Look at the specifications for culturing bacteria Bacillus subtilis
ssp.natto" was conducted in the laboratory I4 - HCMC University of Agriculture and
Forestry. Period from January to March 08/2011 03/2011.

Topics are arranged over four experiments:
Experiment 1: Determine the appropriate nutrient medium for culturing bacteria
B.natto.
 Fixed factor: cultured in the incubator at a temperature of 400C.
 Studied factor: nutrient medium (MRS, NB, NGD, NGD + YE).
 The result: B.natto fastest grow in the environment NGD + YE and reach the
peak density of 9,52 log (TB / ml).
Experiment 2: Determine the appropriate temperature for culturing bacteria
B.natto.
 Fixed factors: nutrient medium (NGD + YE).
 Studied factors: temperature (300C, 370C, 400C, 450C).
 The result: B.natto fastest grow at temperatures 450C and reach the peak
density of 10,08 log (TB / ml).
Experiment 3: Determine the appropriate pH for culturing bacteria B.natto.
 Fixed factors: nutrient medium (NGD + YE), temperature 450C.
 Studied factors: pH (pH = 5; pH = 5,5; pH = 6; pH = 6,5; pH = 7).
 The result: B.natto fastest grow at pH = 6 and reach the peak density of 10,24
log (TB / ml).
Experiment 4: Test the ability of powdered fermented soybeans B.natto.
Production of the powder B.natto and assess the ability of starch fermentation
comparing with juice (B.natto fermented dough better than the juice B.natto).

iv


MỤC LỤC
Trang
Trang tựa .......................................................................................................................... i
Lời cảm ơn ...................................................................................................................... ii
Tóm tắt ........................................................................................................................... iii

Abstract .......................................................................................................................... iv
Mục lục ........................................................................................................................... v
Danh sách các chữ viết tắc ............................................................................................. ix
Danh sách các hình ......................................................................................................... x
Danh sách các bảng........................................................................................................ xi
Chương 1: Mở đầu
1.1 Đặt vấn đề ................................................................................................................. 1
1.2 Mục đích đề tài ......................................................................................................... 2
1.3 Nội dung đề tài.......................................................................................................... 2
1.4 Yêu cầu ..................................................................................................................... 2
Chương 2: Tổng quan tài liệu
2.1 Tổng quan về Bacillus subtilis .................................................................................. 3
2.1.1 Lịch sử nghiên cứu về Bacillus subtilis ............................................................... 3
2.1.2 Phân loại............................................................................................................... 3
2.1.3 Đặc điểm của Bacillus subtilis ............................................................................. 4
2.1.3.1 Đặc điểm sinh thái học và phân bố trong tự nhiên....................................... 4
2.1.3.2 Đặc điểm hình thái ....................................................................................... 5
2.1.3.3 Đặc điểm sinh hóa ........................................................................................ 5
2.1.3.4 Đặc điểm nuôi cấy ........................................................................................ 6
2.1.3.5 Bộ gen của Bacillus subtilis ......................................................................... 7
2.1.3.6 Bào tử của vi khuẩn Bacillus subtilis ........................................................... 7
2.1.4 Tính chất đối kháng của Bacillus subtilis ............................................................ 9
2.1.5 Hệ enzyme của Bacillus subtilis ........................................................................ 10
2.1.5.1 Các enzyme nội bào Bacillus subtilis ........................................................ 10
2.1.5.2 Các enzyme ngoại bào của Bacillus subtilis .............................................. 10
v


2.1.6 Ứng dụng của vi khuẩn Bacillus subtilis ........................................................... 11
2.1.6.1 Ứng dụng ở Việt Nam ................................................................................ 11

2.1.6.2 Ứng dụng trên thế giới ............................................................................... 13
2.1.6.3 Một vài ứng dụng cụ thể ............................................................................ 14
2.2 Thực phẩm chức năng............................................................................................. 20
2.2.1 Định nghĩa .......................................................................................................... 20
2.2.2 Các loại thực phẩm chức năng ........................................................................... 21
2.2.2.1 Các loại thực phẩm thiên nhiên chưa qua chế biến .................................... 21
2.2.2.2 Thực phẩm chế biến ................................................................................... 22
2.2.3 Các lưu ý khi sử dụng TPCN ............................................................................. 22
2.2.4 Phân biệt............................................................................................................. 23
2.2.4.1 Sự khác biệt của TPCN (Functional Food) với thực phẩm (Food) ............ 23
2.2.4.2 Sự khác biệt của TPCN (Functional Food) với thuốc (Drug) .................... 24
2.2.5 Những tác dụng độc đáo của TPCN .................................................................. 24
2.2.6 Tình hình phát triển TPCN trên thế giới và khu vực ......................................... 24
2.2.7 Tại Việt Nam...................................................................................................... 25
Chương 3: Vật liệu và phương pháp
3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu .......................................................................... 26
3.1.1 Thời gian ............................................................................................................ 26
3.1.2 Địa điểm ............................................................................................................ 26
3.2 Nguyên liệu ............................................................................................................. 26
3.3 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất thí nghiệm ................................................................... 26
3.3.1 Thiết bị ............................................................................................................... 26
3.3.2 Dụng cụ.............................................................................................................. 26
3.3.3. Hóa chất ............................................................................................................ 27
3.3.4. Điều kiện nuôi cấy ............................................................................................ 27
3.4 Pha chế môi trường ................................................................................................. 27
3.4.1 Môi trường MRS dạng canh .............................................................................. 27
3.4.2 Môi trường NB dạng canh ................................................................................. 27
3.4.3 Môi trường nước giá đậu ................................................................................... 28
3.4.4 Môi trường nước giá đậu bổ sung thêm YE ...................................................... 28

vi


3.5 Phương pháp làm thạch nghiêng, thạch đĩa ............................................................ 28
3.5.1 Thạch nghiêng .................................................................................................... 28
3.5.2 Thạch đĩa ............................................................................................................ 28
3.6 Phân lập giống thuần khiết bằng cách cấy ria......................................................... 29
3.7 Phương pháp cấy chuyền vi sinh vật ...................................................................... 30
3.8 Phương pháp nhuộm Gram ..................................................................................... 31
3.8 Phương pháp đếm số lượng vi sinh vật bằng buồng đếm hồng cầu ....................... 33
3.9 Bố trí thí nghiệm ..................................................................................................... 35
3.9.1 Hoạt hóa và kiểm tra độ thuần khiết của vi khuẩn B.natto ............................... 35
3.9.1.1 Hoạt hóa chủng vi khuẩn B.natto ................................................................ 35
3.9.1.2 Kiểm tra độ thuần khiết của vi khuẩn B.natto............................................. 35
3.9.2 Thí nghiệm 1: Xác định môi trường dinh dưỡng thích hợp để nuôi cấy chủng vi
khuẩn B.natto ................................................................................................................ 35
3.9.3 Thí nghiệm 2: Xác định nhiệt độ thích hợp để nuôi cấy chủng vi khuẩn B.natto
....................................................................................................................................... 36
3.9.4 Thí nghiệm 3: Xác định pH thích hợp để nuôi cấy chủng vi khuẩn B.natto ..... 37
3.9.5 Thí nghiệm 4: Kiểm tra khả năng lên men đậu nành của bột B.natto ............... 39
Chương 4: Kết quả và thảo luận
4.1 Hoạt hóa và kiểm tra độ thuần khiết của vi khuẩn B.natto..................................... 42
4.1.1 Hoạt hóa chủng vi khuẩn B.natto ...................................................................... 42
4.1.1.1 Kết quả ......................................................................................................... 42
4.1.1.2 Nhận xét ....................................................................................................... 42
4.1.2 Kiểm tra độ thuần khiết của vi khuẩn B.natto ................................................... 43
4.1.2.1 Kết quả ......................................................................................................... 43
4.1.2.2 Nhận xét ....................................................................................................... 43
4.2 Thí nghiệm 1: Xác định môi trường dinh dưỡng thích hợp để nuôi cấy chủng vi
khuẩn B.natto ................................................................................................................ 44

4.2.1 Kết quả thí nghiệm ............................................................................................ 44
4.2.2 Nhận xét ............................................................................................................. 45
4.3 Thí nghiệm 2: Xác định nhiệt độ thích hợp để nuôi cấy chủng vi khuẩn B.natto .. 46
4.3.1 Kết quả thí nghiệm ............................................................................................ 46

vii


4.3.2 Nhận xét ............................................................................................................. 47
4.4 Thí nghiệm 3: Xác định pH thích hợp để nuôi cấy chủng vi khuẩn B.natto .......... 48
4.4.1 Kết quả thí nghiệm ............................................................................................ 48
4.4.2 Nhận xét ............................................................................................................. 49
4.5 Thí nghiệm 4: Kiểm tra khả năng lên men đậu nành của bột B.natto .................... 50
4.5.1 Kết quả thí nghiệm ............................................................................................ 50
4.5.2 Nhận xét ............................................................................................................. 51
Chương 5: Kết luận và đề nghị
5.1 Kết luận ................................................................................................................... 52
5.2 Đề nghị .................................................................................................................... 53
Tài liệu tham khảo ........................................................................................................ 54
Phụ lục .......................................................................................................................... 56

viii


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
B.natto: Bacillus subtilis vae.natto
VK: vi khuẩn
MRS: De Man, Rogosa, Sharpe
NB: Nutrient Broth
YE: Yeast Extract

TPCN: thực phẩm chức năng
TB: tế bào
tb: trung bình
t0: nhiệt độ
NGĐ: nước giá đậu
TN: thí nghiệm

ix


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Trang
Hình 2.1 Tế bào vi khuẩn Bacillus subtilis quan sát dưới kính hiển vi ......................... 5
Hình 3.1: Các bước nhuộm Gram ................................................................................ 32
Hình 3.2: Buồng đếm hồng cầu ................................................................................... 33
Hình 3.3: Cách đếm tế bào trong buồng đếm hồng cầu............................................... 34
Hình 3.4: Sơ đồ quy trình chế biến bột giống cấp 1 .................................................... 39
Hình 3.5: Sơ đồ quy trình thử nghiệm kiểm tra khả năng lên men của B.natto dạng bột
và dạng nước ................................................................................................................. 40
Hình 4.1: Kết quả hoạt hóa chủng vi khuẩn B.natto .................................................... 42
Hình 4.2: Kết quả phân lập chủng vi khuẩn B.natto .................................................... 43
Hình 4.3: Hình nhuộm Gram của vi khuẩn B.natto ..................................................... 43
Hình 4.4: Đồ thị đường cong sinh trưởng của B.natto ở thí nghiệm xác định môi trường
dinh dưỡng thích hợp .................................................................................................... 45
Hình 4.5: B.natto ở các môi trường nuôi khác nhau .................................................... 45
Hình 4.6: Đồ thị đường cong sinh trưởng của B.natto ở thí nghiệm xác định nhiệt độ
nuôi thích hợp ............................................................................................................... 47
Hình 4.7: B.natto ở các nhiệt độ nuôi khác nhau ......................................................... 47
Hình 4.8: Đồ thị đường cong sinh trưởng của B.natto ở thí nghiệm xác định pH nuôi
thích hợp ....................................................................................................................... 49

Hình 4.9: B.natto ở các pH khác nhau ......................................................................... 49
Hình 4.10: Bột giống B.natto cấp 1 ............................................................................. 50
Hình 4.11: Đậu nành lên men sau 24 giờ..................................................................... 50
Hình 4.12: Đậu nành lên men sau 48 giờ..................................................................... 51

x


DANH SÁCH CÁC BẢNG

Trang
Bảng 2.1 Phản ứng sinh hóa của vi khuẩn Bacillus subtilis........................................... 6
Bảng 2.2: Một số loại enzyme do Bacillus subtilis sinh tổng hợp, đặc tính và phản ứng
thủy phân....................................................................................................................... 11
Bảng 3.1: Bảng bố trí thí nghiệm xác định môi trường dinh dưỡng thích hợp............ 36
Bảng 3.2: Bảng bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ nuôi thích hợp ............................ 37
Bảng 3.3: Bảng bố trí thí nghiệm xác định pH thích hợp ............................................ 38
Bảng 3.4: Bảng bố trí thí nghiệm kiểm tra khả năng lên men đậu nành của B.natto dạng
bột và dạng nước ........................................................................................................... 41
Bảng 4.1: Bảng kết quả thí nghiệm xác định môi trường dinh dưỡng thích hợp ........ 44
Bảng 4.2: Bảng kết quả thí nghiệm xác định nhiệt độ nuôi thích hợp ......................... 46
Bảng 4.3 Bảng kết quả thí nghiệm xác định pH thích hợp .......................................... 48
Bảng 4.4: Bảng kết quả thí nghiệm kiểm tra khả năng lên men đậu nành của B.natto
dạng bột và dạng nước .................................................................................................. 51

xi


Chương 1
MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề
Trong các loài vi sinh vật được sử dụng làm nguồn cung cấp enzyme, vi khuẩn
Bacillus subtilis là một ví dụ điển hình được các nhà khoa học nghiên cứu nhiều. Các
enzyme ngoại bào của vi khuẩn này đã được đưa vào sản xuất và ứng dụng rộng rãi ở
quy mô công nghiệp vì chúng có các đặc tính hơn hẳn và khả năng sinh tổng hợp các
enzyme rất mạnh so với các enzyme ngoại bào của những vi sinh vật khác. Đặc biệt là
enzym Nattokinase - một hoạt chất sản sinh trong quá trình lên men tự nhiên được xem
là hoạt chất có hiệu quả trong việc ngăn ngừa các chứng bệnh tim mạch.
Enzyme đã được sử dụng từ rất lâu. Khoảng 5.000 năm trước công nguyên ở
Jerico, người ta đã biết đến kỹ thuật làm bánh mì. Trong thành cổ Babylon, nấu rượu
vang, sản xuất dấm, tương, chao… ở các mức độ khác nhau, là những quá trình sinh
học xưa nhất trong lịch sử phát triển văn minh nhân loại.
Ngày nay, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của Công nghệ sinh học, các chế phẩm
enzyme được sản xuất ngày càng nhiều và được sử dụng hầu hết trong các lĩnh vực
như: chế biến thực phẩm, nông nghiệp, chăn nuôi, y tế… Hàng năm khối lượng enzyme
được sản xuất trên thế giới đạt khoảng trên 300.000 tấn với giá trị trên 500 triệu USD,
được phân phối trong các lĩnh vực khác nhau.
Phần lớn enzyme được sản xuất ở quy mô công nghiệp đều thuộc loại enzyme đơn
cấu tử, xúc tác cho phản ứng phân hủy. Khoảng 75% chế phẩm là enzyme thủy phân
được sử dụng cho việc thủy phân cơ chất tự nhiên.

1


Qua nhiều năm, việc sử dụng vi sinh vật một nguồn cung cấp enzyme đã cải thiện
đáng kể hiệu quả sản xuất, các sản phẩm được tạo ra nhiều hơn giá thành giảm, chất
lượng sản phẩm tăng lên đáng kể, làm giảm tác động xấu tới môi trường.
Ở nước ta, việc nghiên cứu và ứng dụng các chế phẩm enzyme ngoại bào từ
Bacillus subtilis đã được tiến hành ở một số cơ sở nghiên cứu, các nhà máy sản xuất ở

qui mô công nghiệp và đóng góp một phần lợi ích vào nền kinh tế quốc dân.
Do vậy, được sự phân công của bộ môn Công nghệ hóa học và dưới sự hướng dẫn
của ThS. Vương Thị Việt Hoa chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu các thông số
kỹ thuật để nuôi cấy chủng vi khuẩn Bacillus subtilis vae.natto”.
1.2 Mục đích đề tài
Tìm ra các điều kiện nuôi tối ưu (môi trường, nhiệt độ, pH…) để nuôi cấy chủng
vi khuẩn Bacillus subtilis vae.natto được ứng dụng để lên men đậu nành làm thực phẩm
chức năng với mục đích bổ sung probiotic vào cơ thể người, có khả năng chống lại các
vi sinh vật gây hại trong ruột, có hiệu quả trong việc ngăn ngừa các chứng bệnh tim
mạch (nhà nghiên cứu sinh lý học Nhật Bản GS Sumi Hiroyuki vào năm 1980).
1.3 Nội dung đề tài
 Hoạt hóa và kiểm tra độ thuần khiết của vi khuẩn B.natto.
 Khảo sát ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến sự sinh trưởng và phát triển
của B.natto.
 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh trưởng và phát triển của B.natto.
 Khảo sát ảnh hưởng của pH đến sự sinh trưởng và phát triển của B.natto.
 Sản xuất thử nghiệm bột B.natto, kiểm tra khả năng lên men đậu nành của bột
B.natto.
1.4 Yêu cầu
Tìm được các thông số kỹ thuật tối ưu để nuôi cấy chủng vi khuẩn B.natto.

2


Chương 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tổng quan về Bacillus subtilis
2.1.1 Lịch sử nghiên cứu về Bacillus subtilis
Bacillus subtilis được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1835 do Christion Erenberg

và tên của loài vi khuẩn này lúc bấy giờ là “Vibrio subtilis”. Gần 30 năm sau, Casimir
Davaine đặt tên cho loài vi khuẩn này là “Bacteridium”. Năm 1872, Ferdimand Cohn
xác định thấy loài trực khuẩn này có đầu vuông và đặt tên là Bacillus subtilis.
Năm 1941, Bacillus subtilis được phát hiện trong phân ngựa bởi tổ chức y học
Nazi của Đức. Lúc đầu, chúng được dùng chủ yếu để phòng bệnh lị cho các binh sĩ Đức
chiến đấu ở Bắc Phi. Năm 1949 - 1957, Henry và cộng sự tách được các chủng thuần
khiết của Bacillus subtilis. Gần đây, Bacillus subtilis đã được nghiên cứu, sử dụng rộng
rãi trên thế giới. Từ đó, thuật ngữ “Subtilis therapy” ra đời. Bacillus subtilis được sử
dụng ngày càng phổ biến và được xem như sinh vật phòng và trị các bệnh về rối loạn
đường tiêu hóa, các chứng viêm ruột, viêm đại tràng, tiêu chảy…
Ngày nay, Bacillus subtilis đã và đang được nghiên cứu rộng rãi với nhiều tiềm
năng và ứng dụng hiệu quả trong chăn nuôi, công nghiệp, xử lý môi trường…
2.1.2 Phân loại
Theo phân loại của Bergey (1974), Bacillus subtilis thuộc:
Giới (Kingdom)

: Bacteria

Ngành (Division)

: Firmicutes

Lớp (Class)

: Bacilli

Bộ (Order)

: Bacillales

3


Họ (Family)

: Bacillaceae

Giống (Genus)

: Bacillus

Loài (Species)

: Bacillus subtilis

2.1.3 Đặc điểm của Bacillus subtilis
2.1.3.1 Đặc điểm sinh thái học và phân bố trong tự nhiên
Vi khuẩn Bacillus subtilis thuộc nhóm vi sinh vật hiếu khí hay kỵ khí tùy nghi.
Chúng phân bố hầu hết trong môi trường tự nhiên, phần lớn cư trú trong đất và rơm rạ,
cỏ khô nên được gọi là “trực khuẩn cỏ khô”, thông thường đất trồng trọt có khoảng 106
– 107 triệu CFU/g. Đất nghèo dinh dưỡng ở vùng sa mạc, đất hoang thì sự hiện diện của
chúng rất hiếm. Ngoài ra, chúng còn có mặt trong các nguyên liệu sản xuất như bột mì
(trong bột mì vi khuẩn Bacillus subtilis chiếm 75 – 79% vi khuẩn tạo bào tử), bột gạo,
trong các thực phẩm như mắm, tương, chao… Bacillus subtilis đóng vai trò đáng kể về
mặt có lợi cũng như mặt gây hại trong quá trình biến đổi sinh học.
Bacillus subtilis có khả năng dùng các hợp chất vô cơ làm nguồn carbon trong khi
một số loài khác như Bacillus sphaericus, Bacillus cereus cần các hợp chất hữu cơ là
vitamin và amino acid cho sự sinh trưởng. Đặc biệt các loài như Bacillus popilliae,
Bacillus lentimobus có nhu cầu dinh dưỡng phức tạp, chúng không phát triển trong môi
trường nuôi cấy vi khuẩn thông thường như: Nutrient Agar (NA), Nutrient Broth (NB).

Năm 1993, giáo sư Richard Losik và cộng sự thuộc Đại học Havard ở Boston
(Mỹ) và Jose Gonzalez – Pastor của Trung tâm công nghệ sinh học quốc gia ở Madrid
(Tây Ban Nha) đã chứng minh được loài Bacillus subtilis có tập tính ăn thịt đồng loại.
Chúng dùng cách này như một phương pháp đơn giản để thoát khỏi những trường hợp
có đời sống giới hạn như dinh dưỡng trong môi trường đã cạn kiệt. Một cách đơn giản
là các cá thể khỏe mạnh sinh tổng hợp kháng sinh tiêu diệt những cá thể xung quanh cả
khác loài lẫn cùng loài, để thu lấy chất dinh dưỡng bên trong, giúp chúng sống sót chờ
đến khi môi trường thuận lợi hơn. Ngoài ra, để tránh những ảnh hưởng của môi trường
khắc nghiệt, chúng thường tạo ra bào tử, nhưng cách này tiêu hao khá nhiều năng
lượng.

4


2.1.3.2 Đặc điểm hình thái
Bacillus subtilis là trực khuẩn nhỏ, hai đầu tròn, bắt màu tím Gram (+), kích thước
0,5 – 0,8µm x 1,5 – 3µm, đơn lẻ hoặc thành chuỗi ngắn. Vi khuẩn có khả năng di động,
có 8 – 12 lông, sinh bào tử hình bầu dục nhỏ hơn nằm giữa hoặc lệch tâm tế bào, kích
thước từ 0,8 – 1,8µm. Bào tử phát triển bằng cách nảy mầm do sự nứt của bào tử,
không kháng acid, có khả năng chịu nhiệt (ở 1000C trong 180 phút), chịu ẩm, tia tử
ngoại, tia phóng xạ, áp suất, chất sát trùng. Bào tử có thể sống vài năm đến vài chục
năm. Đã có những chứng cứ về việc duy trì sức sống của bào tử Bacillus subtilis trong
200 – 300 năm.

Hình 2.1 Tế bào vi khuẩn Bacillus subtilis quan sát dưới kính hiển vi.
2.1.3.3 Đặc điểm sinh hóa
Lên men không sinh hơi các loại đường như: glucose, maltose, manitol,
saccharose, xylose và arabinose.
Thử nghiệm indol (-), VP (+), nitrate (+), H2S (-), NH3 (+), catalase (+), amylase
(+), casein, (+), citrate (+), có khả năng di động (+) và hiếu khí (+).

5


Bảng 2.1 Phản ứng sinh hóa của vi khuẩn Bacillus subtilis
Phản ứng sinh hóa

Kết quả

Hoạt tính catalase

+

Sinh indol

-

MR (Metyl red)

+

VP (Voges-Proskauer)

+

Sử dụng citrate

+

Khử nitrate

+

Tan chảy gelatin

+

Di động

+

Phân giải tinh bột

+

Arabinose

+

Xylose

+

Saccharose

+

Manitol

+

Glucose

+

Lactose

-

Maltose

+

(Theo Holt, 1992) (trích Lý Kim Hữu, 2005)

2.1.3.4 Đặc điểm nuôi cấy
Vi khuẩn Bacillus subtilis phát triển trong điều kiện hiếu khí, tuy nhiên vẫn phát
triển được trong môi trường thiếu oxy. Nhiệt độ tối ưu khoảng 370C - 450C, pH thích
hợp khoảng 6,0 – 7,0.

6


Vi khuẩn Bacillus subtilis phát triển hầu hết trên các môi trường dinh dưỡng cơ
bản:
-

Trên môi trường thạch đĩa Trypticase Soy Agar (TSA): khuẩn lạc dạng
tròn, rìa răng cưa không đều, màu vàng xám, đường kính 3 - 5 mm, sau 1 4 ngày bề mặt nhăn nheo, màu hơi nâu.

-

Trên môi trường canh Trypticase Soy Broth (TSB): vi khuẩn phát triển làm
đục môi trường, tạo màng nhăn, lắng cặn, kết lại như vẩn mây ở đáy, khó
tan khi lắc đều.

-

Trên môi trường giá đậu - peptone: khuẩn lạc dạng tròn lồi, nhẵn bóng, đôi
khi lan rộng, rìa răng cưa không đều, đường kính 3 – 4 cm sau 72 giờ nuôi
cấy.

-

Nhu cầu dinh dưỡng: chủ yếu cần các nguyên tố C, H, O, N và một số
nguyên tố vi lượng khác. Vi khuẩn phát triển tốt trong môi trường cung
cấp đủ nguồn carbon (như glucose) và nitơ (như peptone).

2.1.3.5 Bộ gen của Bacillus subtilis
Năm 1997, người ta đã hoàn tất việc nghiên cứu về trình tự gen của Bacillus
subtilis và lần đầu tiên công bố trình tự gen của vi khuẩn này. Bộ gen chứa 4,2 megabase, xấp xỉ 4.110 gen. Trong số đó, chỉ có 192 gen không thể thiếu được, 79 gen được
dự đoán là thiết yếu. Phần lớn gen thiết yếu đều có liên quan với quá trình trao đổi chất
của tế bào.
2.1.3.6 Bào tử của vi khuẩn Bacillus subtilis
 Bào tử
Bào tử là một khối nguyên sinh chất đặc, có chứa các thành phần hóa học cơ bản
như ở tế bào sinh dưỡng nhưng có một vài điểm khác về tỉ lệ giữa các thành phần và có
thêm một số thành phần mới.
Bào tử Bacillus subtilis có dạng elip đến hình cầu, có kích thước 0,6 - 0,9 µm x
1,0 - 1,5 µm, được bao bọc bởi nhiều lớp màng với các thành phần lipoprotein,

peptidoglycan… Bào tử của chúng có khả năng chịu được pH thấp của dạ dày, tiến đến

7


ruột và nảy mầm tại phần đầu của ruột non. Đây là đặc điểm quan trọng trong ứng dụng
sản xuất probiotic từ Bacillus subtilis (Nguyễn Duy Khánh, 2006).
 Khả năng tạo bào tử
Nhờ khả năng tạo bào tử mà vi khuẩn có thể tồn tại được trong các điều kiện bất
lợi (dinh dưỡng trong môi trường cạn kiệt, môi trường tích lũy các sản phẩm trao đổi
chất có hại và nhiệt độ cao…).
Quá trình hình thành bào tử gồm các bước sau:
-

Hình thành những búi chất nhiễm sắc.

-

Tạo tiền bào tử.

-

Tiền bào tử hình thành hai lớp mảng, tăng cao tính bức xạ.

-

Tổng hợp các lớp vỏ bào tử.

-

Giải phóng bào tử.

-

Khi gặp điều kiện thuận lợi thì bào tử sẽ nảy mầm, phát triển thành tế bào
sinh dưỡng mới (Nguyễn Lân Dũng và cộng sự, 2003).

Lúc đầu lớp nguyên sinh chất trong tế bào được sử dụng. Tế bào chất và nhân tập
trung tại một vị trí nhất định trong tế bào. Tế bào chất tiếp tục cô đặc và tạo thành tiền
bào tử. Tiền bào tử dần được bao bọc bởi các lớp màng. Tiền bào tử phát triển và trở
thành bào tử.
Khi bào tử trưởng thành, tế bào dinh dưỡng phân giải và bào tử được giải phóng
ra khỏi tế bào mẹ. Khi gặp điều kiện thuận lợi thì bào tử hút nước và bị trương ra. Sau
đó vỏ của chúng bị phá hủy và bào tử nảy mầm phát triển thành tế bào mới. Mỗi tế bào
sinh dưỡng chỉ tạo ra một bào tử (Lê Đỗ Mai Phương, 2004).
 Thành phần hóa học của bào tử
Các lớp bao và màng của bào tử có cấu tạo cơ bản là protein có chứa nhiều
glyxin, tyroxin và đặc biệt là cystein, ngoài ra còn có sự tham gia của keratin. Nguyên
sinh chất của bào tử có chứa nhiều nhiễm sắc thể, ribosome và enzyme chuyển hóa ở
trạng thái không hoạt động.

8


Bào tử có chứa một lượng lớn canxi, magie và axit dipicolinic. Axit này chiếm từ
5 – 12% khối lượng khô của bào tử (axit này không bao giờ có trong tế bào sinh dưỡng,
nó được hình thành trong quá trình hình thành bào tử và mất đi khi nảy mầm).
Lượng nước trong bào tử rất thấp và tồn tại ở dạng liên kết (Lê Đỗ Mai Phương,
2004).
 Sức đề kháng của bào tử

Bào tử có sức đề kháng cao đối với các yếu tố vật lý và hóa học như: nhiệt độ, tia
cực tím, áp suất và chất sát trùng.
Sở dĩ bào tử có sức đề kháng cao và sống lâu là do các yếu tố sau:
-

Nước trong bào tử phần lớn ở trạng thái liên kết, do đó không có khả năng
làm biến tính protein khi tăng nhiệt độ.

-

Do bào tử có khối lượng lớn ion Ca2+ và axit dipicolinic, protein của bào tử
kết hợp với dipicolinate canxi thành một phức chất có tính chất ổn định cao
đối với nhiệt độ.

-

Các enzyme và các hoạt chất sinh học khác chứa trong bào tử đều tồn tại
dưới dạng không hoạt động, hạn chế sự trao đổi chất của bào tử đối với tế
bào bên ngoài.

-

Với cấu trúc có nhiều màng bao bọc và tính thẩm thấu của các lớp màng
làm cho các chất hóa học và chất sát trùng khó có thể tác động tới bào tử
(Lê Đỗ Mai Phương, 2004).

2.1.4 Tính chất đối kháng của Bacillus subtilis
Với các vi sinh vật gây bệnh:
- Môi trường nuôi cấy nấm bệnh có sự hiện diện của Bacillus subtilis với một
số lượng lớn sẽ gây ra sự cạnh tranh dinh dưỡng, cạnh tranh không gian

sống giữa vi khuẩn và nấm.
- Do vi khuẩn phát triển nhanh hơn (trong 24 giờ) sẽ sử dụng phần lớn các
chất dinh dưỡng trong môi trường, đồng thời tạo ra kháng sinh subtilin nên
sự sinh trưởng của nấm bị ức chế.
9


Với đồng loại: khi chất dinh dưỡng bắt đầu cạn kiệt, các vi sinh vật đối phó bằng
cách chuyển sang trình trạng “ngủ đông” trong một thời gian dài. Bacillus subtilis thực
hiện đều đó bằng cách tạo ra bào tử, có thể duy trì trạng thái sống tiềm tàng trong nhiều
năm, thậm chí hàng thế kỷ, ở giai đoạn rất sớm của sự hình thành bào tử, một vài tế bào
Bacillus subtilis đã tạo ra kháng sinh để giết chết những tế bào vi khuẩn ở bên cạnh
chưa bắt đầu quá trình này. Chất kháng sinh sẽ phá vỡ màng tế bào vi khuẩn bị tấn
công, giải phóng chất dinh dưỡng và được tế bào đang hình thành bào tử tiêu thụ. Đặc
biệt, khi dinh dưỡng trong môi trường đã cạn kiệt, vi khuẩn sẽ tiêu diệt những kẻ xung
quanh để hút chất dinh dưỡng và kéo dài thời kì chờ đợi này, cho đến khi phải chuyển
sang sống tiềm sinh (Nguyễn Duy Khánh, 2006).
2.1.5 Hệ enzyme của Bacillus subtilis
2.1.5.1 Các enzyme nội bào Bacillus subtilis
Trong tế bào Bacillus subtilis nói riêng và vi sinh vật nói chung đều có những
enzyme xúc tác các phản ứng sinh hóa. Các enzyme này được sinh tổng hợp và nằm
trong sinh khối tế bào. Các enzyme này thường không có khả năng di chuyển qua màng
tế bào. Đó là những enzyme nội bào.
Vậy enzyme nội bào (endoenzyme) là những enzyme được vi sinh vật tổng hợp
trong tế bào, nằm trong tế bào và chỉ tham gia vào quá trình phân giải (dị hóa) các hợp
chất hữu cơ có phân tử lượng thấp hay sinh tổng hợp các vật chất trong tế bào của
chúng.
Các enzyme nội bào của Bacillus subtilis: các enzyme thủy phân như protease nội
bào (thường là peptidase và một số protease), pennicillin amidase, catalase, amylase nội
bào…; các enzyme tổng hợp như aspagagin - syntetase; các enzyme tham gia các quá

trình oxy hóa - khử như dehydrogenase, oxydase, cytochrom, peroxydase và các
enzyme tham gia chuyển hóa vật chất có trong tế bào.
2.1.5.2 Các enzyme ngoại bào của Bacillus subtilis
Bacillus subtilis có thể sinh tổng hợp nhiều loại enzyme cần thiết cho quá trình
sống để thích ứng với hoàn cảnh và điều kiện môi trường: amylase (α-amylase), glucanase, xylanase, protease…

10


Bảng 2.2: Một số loại enzyme do Bacillus subtilis sinh tổng hợp, đặc tính và phản ứng
thủy phân.
Enzyme

Nhiệt độ
tối ưu (oC)

α-amylase

70 - 80

pH tối ưu

Phản ứng thủy phân

5,6 - 6,2

Thủy phân liên kết α-1,4-glucoside
trong tinh bột và những polysaccharide
khác

tạo

ra

các

dextrin

và

oligosaccharide
-glucanase

35 - 55

6,0 - 7,0

Thủy phân liên kết -1,6-glucoside của
-glucan tạo ra những chất có phân tử
lượng thấp.

Xylanase

25

5,0

Thủy phân liên kết xylan - một thành
phần của hemicellulose.

Protease

40

6,2 - 7,4

Thủy phân liên kết peptide và protein
và các polypeptide, tạo ra các peptide
có phân tử lượng thấp hơn và các
amino acid.

2.1.6 Ứng dụng của vi khuẩn Bacillus subtilis
2.1.6.1 Ứng dụng ở Việt Nam
 Trong y học
Bacillus subtilis được dùng rất nhiều để điều trị bệnh đường ruột mãn tính và còn
điều trị một số bệnh khác.
Bacillus subtilis được Đặng Đức Trạch, Hoàng Thủy Nguyên là giáo sư, bác sĩ
quân y (trong chiến tranh chống Pháp) đã nghiên cứu sản xuất chế phẩm Bacillus
subtilis đưa ra chiến trường nhằm giải quyết bệnh tiêu chảy, góp phần bảo vệ sức khỏe
cho cán bộ chiến sĩ.

11


Năm 1958 – 1960, bác sĩ Phạm Ngọc Thạch đã sản xuất đồng loạt chế phẩm
Bacillus subtilis dùng trị bệnh đường ruột, apxe phổi và chữa bệnh lao.
Năm 1960, xí nghiệp thuốc thú y đã sản xuất chế phẩm Bacillus subtilis để chữa
bệnh tiêu chảy phân trắng ở heo con.
Bệnh viện Bạch Mai Hà Nội đã nghiên cứu sản xuất chế phẩm Bacillus subtilis
dùng điều trị bệnh tiêu chảy ở người.

Năm 1971, Trần Minh Hùng, Lê Thị Ba, Nguyễn Văn Hùng đã nghiên cứu sản
xuất chế phẩm Bacillus subtilis dạng viên, nuôi cấy trên môi trường đậu tương, cua
đồng hấp thụ bằng tinh bột tan.
Bacillus subtilis còn dùng làm kháng nguyên trong thử nghiệm ELISA, dùng
Bacillus subtilis để sản xuất tiểu đơn vị độc tố ho gà với hiệu suất cao 60 – 100 mg/l.
Viện Pasteur Nha Trang đã tiến hành sản xuất chế phẩm Biosubtyl từ chủng
Bacillus subtilis đã sử dụng có hiệu quả trong phòng trị bệnh tiêu chảy.
Từ năm 1983 đến nay viện Vacxin cơ sở 2 Đà Lạt đã sản xuất thuốc Biosubtyl
dạng khô rất thuận tiện cho người sử dụng (Lê Ngọc Tú, 2004).
 Trong công nghiệp
Enzyme amylase của Bacillus subtilis được ứng dụng trong công nghiệp sản xuất
giấy để xử lý tinh bột có trọng lượng phân tử nhất định.
Enzyme protease của Bacillus subtilis được ứng dụng trong công nghiệp dệt tơ
tằm: dùng để khử protein cho tơ lụa tự nhiên, làm bóng mượt, tách rời giữa các sợi tơ
tằm (Lê Ngọc Tú, 2004).
 Trong thực phẩm
Trong sản xuất tương người ta bổ sung thêm Bacillus subtilis để hạn chế sự phát
triển của một số nấm mốc độc khác, đồng thời giảm nồng độ độc tố aflatoxin thường
hiện diện trong một số sản phẩm tương truyền thống.
Enzyme protease của Bacillus subtilis được ứng dụng trong công nghiệp thực
phẩm làm nềm thịt tạo vị ngọt hơn, sản phẩm khi nấu sẽ nhanh chín, mềm, dễ tiêu hóa
hơn nhiều.
12


Trong công nghiệp sản xuất bia: protease thủy phân protein thành những hợp chất
có phân tử lượng trung bình hoặc thấp, do đó bia giữ được chất lượng, không vẫn đục,
ngoài ra còn có khả năng giữ bọt cho bia (Lê Ngọc Tú, 2004).
 Trong nông nghiệp
Trung tâm Sinh học thuộc Liên hiệp sản xuất hóa chất thuộc bộ nông nghiệp nặng

TP.HCM đã nghiên cứu sản xuất chế phẩm Bactophyl từ Bacillus subtilis để phòng trừ
các loại nấm trên rau quả.
Hồ Thị Mỹ Hồng, Nguyễn Thanh Bình thuộc Trung tâm ứng dụng Sinh học Hà
Nội đã sản xuất chế phẩm Bacillus subtilis dùng để phòng trừ nấm bệnh trên bắp
Ostrinia furanacalos. Ngoài ra, Bacillus subtilis có khả năng ức chế mạnh mẽ sự phát
triển các chủng nấm sinh aflatoxin là Aspergillus flavus, A.parasiticus và các chủng
nấm gây bệnh cho cây trồng như: Fusarium, Rhizoctonia, Uromyces fabae (Lê Ngọc
Tú, 2004).
2.1.6.2 Ứng dụng trên thế giới
 Trong y học
Nhiều công trình thế giới, nhất là Anh Quốc cho thấy Bacillus subtilis có tác dụng
với vi khuẩn Gram âm, góp phần làm sáng tỏ cơ chế tác dụng điều trị nhiễm khuẩn của
các chế phẩm chứa Bacillus subtilis.
Nha bào của Bacillus subtilis được dùng làm chất tải vaccin và được sử dụng như
men tiêu hóa sống cho cả người và động vật (Lê Ngọc Tú, 2004).
 Trong công nghiệp
Tại Nhật, hàng năm người ta sản xuất tới hàng chục nghìn tấn chế phẩm amylase
và protease từ chủng Bacillus subtilis.
Ở Đức đã tuyển chọn được một chủng Bacillus subtilis mà amylase của nó có độ
bền như amylase của nấm mốc (Lê Ngọc Tú, 2004).
 Trong nông nghiệp
Năn 1990, Norio Kimura Yokohamo đã sử dụng Bacillus subtilis để ngăn chặn sự
phát triển và sinh độc tố của chủng Aspergillus flavus và A.parasiticus.
13