Phân lập, tuyển chọn và nghiên cứu khả năng phân hủy phenol của một số chủng vi khuẩn tạo màng sinh học ( Luận văn thạc sĩ)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

LÊ THÀNH CÔNG

PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ NGHIÊN CỨU
KHẢ NĂNG PHÂN HỦY PHENOL CỦA MỘT SỐ
CHỦNG VI KHUẨN TẠO MÀNG SINH HỌC
Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS. Nghiêm Ngọc Minh

THÁI NGUYÊN - 2014
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

i

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của chúng tôi. Các kết quả
trong luận văn là trung thực và là các kết quả thực tế do chúng tôi nghiên cứu, chƣa
từng đƣợc công bố trong các công trình khác. Các tài liệu tham khảo có nguồn gốc
rõ ràng và đƣợc trích dẫn đầy đủ.
Thái Nguyên, ngày 20 tháng 5 năm 2014
Học viên

Lê Thành Công

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

ii

LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên cho tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Nghiêm
Ngọc Minh, Trưởng phòng Công nghệ sinh học Môi trường, Viện Công nghệ sinh
học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tận tình hướng dẫn, chỉ
bảo và dìu dắt tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn.
Tôi cũng xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới các anh chị cán bộ Phòng
Công nghệ sinh học Môi trường – Viện Công nghệ sinh học, đặc biệt là TS. Lê Thị
Nhi Công, ThS. Cung Thị Ngọc Mai, ThS. Vũ Thị Thanh, CN. Vũ Hải Hà đã
giúp đỡ và chỉ bảo tận tình tôi trong quá trình hoàn thành luận văn của mình.
Tôi xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo Khoa Khoa học sự sống - Trường
Đại học Khoa học, đặc biệt là PGS.TS. Nguyễn Vũ Thanh Thanh - Trưởng Khoa
Khoa học sự sống đã tạo điều kiện, giới thiệu, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học
tập và nghiên cứu tại trường.
Bên cạnh đó, tôi cũng xin chân thành cảm ơn gia đình và bạn bè và người
thân đã luôn động viên, khích lệ và giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này.
Với tất cả những tình cảm và lòng biết ơn chân thành sâu sắc, tôi xin cảm ơn
tất cả những sự giúp đỡ quý báu đó.
Thái Nguyên, tháng 5 năm 2014
Học Viên

Lê Thành Công

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

iii

MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ....................................................................................................... i
LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................ ii
MỤC LỤC ................................................................................................................. iii
DANH MỤC CÁC BẢNG........................................................................................ vi
DANH MỤC CÁC HÌNH ........................................................................................ vii
BẢNG CHỮ VIẾT TẮT ........................................................................................... ix
MỞ ĐẦU .....................................................................................................................1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .....................................................................3
1.1. Cấu trúc, tính chất vật lý, hóa học của phenol...............................................3
1.1.1. Cấu trúc phenol .......................................................................................3
1.1.2. Tính chất vật lý .......................................................................................3
1.1.3. Tính chất hóa học ....................................................................................3
1.2. Tổng quan về tình hình ô nhiễm phenol trên thế giới và Việt Nam ..............5
1.2.1. Trên thế giới ............................................................................................5
1.2.2. Ở Việt Nam .............................................................................................5
1.3. Ảnh hƣởng của phenol tới môi trƣờng và sức khỏe con ngƣời .....................6
1.3.1. Ảnh hƣởng tới môi trƣờng ......................................................................6
1.3.2. Ảnh hƣởng tới sức khỏe con ngƣời ........................................................7
1.4. Biện pháp xử lý ô nhiễm phenol ....................................................................9
1.4.1. Biện pháp cơ học ....................................................................................9
1.4.2. Biện pháp vật lý ......................................................................................9
1.4.3. Biện pháp hóa học.................................................................................10
1.4.4. Biện pháp sinh học................................................................................10
1.5. Giới thiệu chung về màng sinh học (biofilm)..............................................16
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

iv

1.5.1. Định nghĩa.............................................................................................16
1.5.2. Sự hình thành biofilm ..............................................................................18
1.5.2. Các yếu tố ảnh hƣởng tới sự hình thành biofilm ..................................19
1.6. Phƣơng pháp phân loại vi sinh vật ..............................................................20
1.6.1. Phân loại vi sinh vật theo phƣơng pháp truyền thống ..........................20
1.6.2. Phân loại vi sinh vật bằng sinh học phân tử .........................................20
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................22
2.1. Nguyên liệu, hoá chất, thiết bị sử dụng ..........................................................22
2.1.1. Nguyên liệu ..............................................................................................22
2.1.2. Hoá chất, môi trƣờng ...............................................................................22
2.1.3. Thiết bị và dụng cụ ..................................................................................23
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ................................................................................24
2.2.1. Thu thập mẫu ...........................................................................................24
2.2.2. Làm giàu tập đoàn vi sinh vật trên môi trƣờng chứa phenol ...................24
2.2.3. Phân lập và tuyển chọn một số chủng vi khuẩn có khả năng sử dụng
phenol.................................................................................................................25
2.2.4. Đánh giá và tuyển chọn một số chủng vi khuẩn tạo màng sinh học .......26
2.2.5. Phân loại và định tên một số chủng vi khuẩn tạo màng sinh học ............27
2.2.6. Nghiên cứu một số điều kiện hoá lý ảnh hƣởng tới khả năng tạo màng
sinh học do các chủng vi khuẩn tạo thành .........................................................30
2.2.7. Đánh giá khả năng phân huỷ phenol của màng sinh học đa chủng tạo
thành ở điều kiện tối ƣu .....................................................................................31
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................33
3.1. Thu thập mẫu và phân lập một số chủng có khả năng phân huỷ phenol........33
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

v

3.1.1. Thu thập mẫu ...........................................................................................33
3.1.2. Phân lập một số chủng có khả năng phân huỷ phenol .............................33
3.1.3. Sàng lọc các chủng vi khuẩn có khả năng tạo màng tốt ..........................36
3.1.4. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào của các chủng nghiên cứu ........37
3.2. Phân loại và định tên 3 chủng tạo biofilm tốt ................................................38
3.2.1. Tách chiết DNA tổng số ..........................................................................38
3.2.2. Nhân đoạn gen 16S rRNA bằng kỹ thuật PCR ........................................39
3.3. Nghiên cứu một số điều kiện hoá lý ảnh hƣởng tới khả năng tạo màng sinh
học .........................................................................................................................41
3.3.1. Ảnh hƣởng của pH ...................................................................................41
3.3.2. Ảnh hƣởng của nhiệt độ...........................................................................42
3.3.3. Ảnh hƣởng của nguồn carbon ..................................................................43
3.3.4. Ảnh hƣởng của nguồn nitor .....................................................................44
3.4. Đánh giá khả năng phân huỷ phenol của biofilm đa chủng tạo thành ở điều
kiện tối ƣu ..............................................................................................................45
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...................................................................................49
PHỤ LỤC ..................................................................................................................50
TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................51

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

vi

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Bảng giá trị giới hạn cho phép của tổng nồng độ phenol ...........................6
Bảng 1.2. Ảnh hƣởng của phenol đến sức khoẻ của con ngƣời và động vật ..............8
Bảng 1.3. Các vi sinh vật có khả năng phân huỷ sinh học phenol ............................12
Bảng 2.1. Các môi trƣờng nuôi cấy ..........................................................................22
Bảng 2.2. Các thành phần của phản ứng PCR ..........................................................28
Bảng 3.1. Hình thái, đặc điểm khuẩn lạc và tế bào của 3 chủng vi khuẩn ...............37

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

vii

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Cấu trúc hoá học của phenol .................................................................................. 3
Hình 1.2. Con đƣờng mở vòng ở vị trí ortho bởi ................................................................. 13
Hình 1.3. Con đƣờng phân hủy sinh học kỵ khí phenol bởi Pseudomonas sp. ................... 14
Hình 1.4. Cấu trúc của biofilm qua ảnh hiển vi quét ........................................................... 18
Hình 1.5. Sự hình thành biofilm .......................................................................................... 19
Hình 2.1. Sơ đồ chu trình nhiệt phản ứng PCR .................................................................. 29
Hình 3.1. Mẫu nƣớc (A) và mẫu bùn (B) thu thập đƣợc từ bể chứa nƣớc thải kho xăng dầu
Đức Giang, Gia Lâm, Hà Nội .............................................................................................. 33
Hình 3.2. Mẫu làm giàu vsv trên môi trƣờng khoáng Gost dịch có bổ sung 50 ppm phenol
............................................................................................................................................. 34
Hình 3.3. Tập đoàn vi sinh vật trên môi trƣờng khoáng Gost thạch .................................... 35
Hình 3.4. Khả năng sinh trƣởng và phát triển của các chủng vi khuẩn ............................... 36
Hình 3.5. Khả năng tạo biofilm của 8 chủng vi khuẩn ........................................................ 36
Hình 3.6. Khả năng tạo màng của 8 chủng vi khuẩn ........................................................... 37
Hình 3.7. Hình ảnh điện di DNA tổng số 3 chủng vi khuẩn ................................................ 39

Hình 3.8. Hình ảnh điện di sản phẩm nhân đoạn gen 16S rRNA của các chủng vi khuẩn .. 39
Hình 3.9. Cây phát sinh chủng loại của 3 chủng ĐGP2, ĐGP4 và ĐGP8........................... 40
Hình 3.10. Ảnh hƣởng của pH lên khả năng tạo biofilm của các chủng vi khuẩn .............. 42
Hình 3.11. Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên khả năng tạo biofilm của các chủng vi khuẩn ...... 43
Hình 3.12. Ảnh hƣởng của nguồn carbon lên khả năng tạo màng sinh học của các chủng vi
khuẩn .................................................................................................................................... 44
Hình 3.13. Ảnh hƣởng của nguồn nitor lên khả năng tạo màng sinh học của các chủng vi
khuẩn .................................................................................................................................... 45
Hình 3.14. Khả năng sinh trƣởng và phát triển của màngsinh học do các chủng vi khuẩn
tạo thành ở các nồng độ phenol khác nhau .......................................................................... 46
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

viii

Hình 3.15. Hiệu suất phân hủy 150 ppm phenol của màng sinh học đa chủng của mẫu đối
chứng và mẫu thí nghiệm sau 7 ngày xử lý ......................................................................... 47

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

ix

BẢNG CHỮ VIẾT TẮT
DNA

: Deoxyribonucleic acid

EPS

: Extracellular Polymeric Substances (hợp chất ngoại bào)

h

: hour (giờ)

kDa

: KiloDalton

LB

: Luria-Bertani

LD50

: Lethal Dose, 50% (liều lƣợng gây chết một nửa)

mg, g

: milligram, gram

OD

: Optical Density (mật độ quang học)

GAC

: Granular Activated Carbon (than hoạt tính dạng hạt)

PAC

: Powder Activated Carbon (than hoạt tính dạng bột)

PCR

: Polymerase Chain Reaction (phản ứng chuỗi trùng hợp)

ppm

: parts per million (đơn vị một phần triệu, mg/l)

RNA

: Ribonucleic acid

vsv

: Vi sinh vật

nm, µm, cm, mm : Nanometer, micrometer, centimeter, milimeter
µl, ml, l

: Microliter, milliliter, liter

HKTS

: Hiếu khí tổng số

PAH

: Polycyclic Aromantic Hydrocarbons

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

1

MỞ ĐẦU
Công nghiệp dầu mỏ là ngành công nghiệp mang lại hiệu quả kinh tế cao và
quan trọng cũng nhƣ là nguồn nguyên liệu vô cùng quý giá với sự phát triển của tất
cả các quốc gia trên thế giới. Tuy nhiên, ngoài nguồn lợi về kinh tế và tầm quan
trọng trong các kế hoạch chiến lƣợc của mỗi quốc gia, ngành công nghiệp này lại
tiềm ẩn những mối nguy hại đến con ngƣời và hệ sinh thái. Đó là các mối nguy hại
đến từ các sự cố tràn dầu, từ cặn thải trong các kho chứa cũng nhƣ lƣợng xăng dầu
sử dụng cho các loại động cơ luôn chứa các hợp chất hữu cơ mạch vòng nhƣ
benzene, phenol, các hợp chất hydrocarbon thơm đa vòng (PAH), ... với hàm lƣợng
lớn, có ảnh hƣởng xấu tới môi trƣờng xung quanh và con ngƣời. Trong các hợp chất
ô nhiễm đó, phenol là một hợp chất hữu cơ khó phân hủy, độc hại, ảnh hƣởng
nghiêm trọng tới môi trƣờng và sức khỏe con ngƣời. Chính vì vậy, việc loại bỏ
nguồn ô nhiễm phenol ra khỏi môi trƣờng là việc làm cấp thiết.
Hiện nay, việc xử lý các hợp chất hữu cơ độc hại nói chung và phenol nói
riêng theo phƣơng pháp phân huỷ sinh học đang là một hƣớng đi mới đầy triển vọng
và thu hút đƣợc sự quan tâm của nhiều nhà khoa học trên thế giới và trong nƣớc.
Bản chất của phƣơng ph
. Một trong các phƣơng
pháp phân huỷ sinh học đƣợc ứng dụng hiện nay là công nghệ màng sinh học

(biofilm) do các vi sinh vật tạo ra. Bản chất của biofilm là một tập hợp các vi sinh
vật gắn trên một bề mặt của vật thể rắn hoặc bề mặt phân cắt giữa các chất lỏng tạo
thành lớp màng polysaccharide ngoại bào bao phủ để bảo vệ các tế bào vi sinh vật
trong đó. Biofilm giúp các vi sinh vật có khả năng liên kết chặt chẽ với nhau, tạo
thành một cấu trúc bền vững khó bị phá hủy bởi các tác nhân bên ngoài nhƣ sự thay
đổi pH, nhiệt độ, nồng độ muối hay tốc độ dòng chảy. Chính vì mật độ các vi sinh
vật trong biofilm cao, nên nó hỗ trợ các quá trình trao đổi chất để từ đó phân hủy
các chất ô nhiễm tốt hơn. Do vậy, để góp phần xử lý các nguồn ô nhiễm phenol,

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

2

chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Phân lập, tuyển chọn và nghiên cứu khả
năng phân huỷ phenol của một số chủng vi khuẩn tạo màng sinh học”.
Mục tiêu của đề tài:
Phân lập, tuyển chọn đƣợc các chủng vi khuẩn vừa có khả năng phân huỷ
phenol cao, vừa tạo màng sinh học tốt từ các mẫu nghiên cứu lấy từ kho xăng dầu
Đức Giang- Gia Lâm- Hà Nội. Đánh giá khả năng phân huỷ và tạo màng sinh học
của các chủng vi khuẩn nghiên cứu trên.
Nội dung của đề tài:
1. Phân lập một số chủng vi khuẩn có khả năng phân huỷ phenol.
2. Tuyển chọn một số chủng vi khuẩn có khả năng tạo màng sinh học.
3. Phân loại và định tên một số chủng vừa có khả năng tạo biofilm tốt, vừa
có khả năng phân hủy phenol cao.
4. Nghiên cứu một số điều kiện hoá lý ảnh hƣởng tới khả năng phân huỷ
phenol của các chủng nghiên cứu.
5. Đánh giá khả năng phân huỷ phenol của màng sinh học đa chủng tạo

thành ở điều kiện tối ƣu.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

Luận vận đậy đu ở file:Luận vận Full