Tổng quan về thuốc sinh học tương tự và ứng dụng trong y dược

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐINH THỊ THẢO

TỔNG QUAN VỀ THUỐC SINH HỌC
TƯƠNG TỰ VÀ ỨNG DỤNG TRONG
Y- DƯỢC
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2018


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐINH THỊ THẢO
Mã sinh viên: 1301376

TỔNG QUAN VỀ THUỐC SINH HỌC
TƯƠNG TỰ VÀ ỨNG DỤNG TRONG
Y- DƯỢC
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
PGS.TS Nguyễn Thị Lập
Nơi thực hiện: Bộ môn Hóa Sinh

HÀ NỘI - 2018


LỜI CẢM ƠN

Trong suốt thời gian thực hiện khóa luận tốt nghiệp tôi đã nhận được rất
nhiều sự chỉ bảo, những lời khuyên cũng như sự động viên từ thầy cô, gia đình
và bạn bè.
Đầu tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến PGS.TS. Nguyễn Thị
Lập, giảng viên Bộ môn Hóa sinh – Trường Đại học Dược Hà Nội. Cô đã nhận
tôi vào bộ môn cũng như tạo mọi điều kiện tốt nhất để giúp tôi tiến hành khóa
luận tốt nghiệp.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu cùng toàn thể các thầy cô
giáo trường Đại học Dược Hà Nội đã dạy dỗ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho
tôi trong thời gian tôi học tập tại trường.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ sự yêu thương và biết ơn sâu sắc tới gia đình, chị
Đinh Thị Hoa, em Lê Thị Ngọc Diễm, các chị em nhà 64 và bạn bè đặc biệt là
bạn Dương Thị Hồng Nhung, Phạm Đăng Lượng đã luôn bên tôi, ủng hộ và
động viên tôi, là chỗ dựa tinh thần vững chắc khi tôi gặp khó khăn trong học tập
cũng như trong cuộc sống.
Do thời gian cũng như kiến thức của bản thân có hạn, khóa luận này còn
có nhiều thiếu sót. Tôi rất mong nhận được sự góp ý của các thầy cô, bạn bè để
khóa luận được hoàn thiện hơn.
Hà Nội, ngày 18 tháng 5 năm 2018
Sinh viên
Đinh Thị Thảo


MỤC LỤC
Trang
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ ...................................................................................................... 1
CHƯƠNG I: TÌM HIỂU CÁC CÔNG NGHỆ SINH HỌC TRONG VIỆC

CHẾ TẠO THUỐC SINH HỌC TƯƠNG TỰ ................................................. 2
1. Các định nghĩa .......................................................................................... 2
1.1. Các định nghĩa của thuốc sinh học tương tự ...................................... 2
1.2. Các định nghĩa liên quan .................................................................... 4
2. Một số đặc điểm của thuốc sinh học tương tự........................................ 9
2.1. Tổng quan về thay đổi trong và sau dịch mã……………………….10
2.2. Đặc tính lý hóa……………………………………………………...12
3. Công nghệ sinh học trong chế tạo thuốc sinh học tương tự………….14
3.1. Công nghệ tái tổ hợp ADN ………………………………………….15
3.1.1. Nguyên tắc…………………………………………………....15
3.1.2. Ứng dụng công nghệ tái tổ hợp trong chế tạo một số thuốc sinh
học tương tự………………………………………………………....17
3.1.2.1 Chế tạo kháng thể đơn dòng tái tổ hợp………………………17
3.1.2.2. Chế tạo protein dung hợp Fc (Fc-fusion protein)………….21
3.2. Các hệ thống biểu hiện gen –tế bào chủ…………………………….25
3.2.1. Hệ thống biểu hiện gen là tế bào vi khuẩn, nấm men………. 28
3.2.1.1. Một số dòng tế bào vi khuẩn, nấm men (gồm cả tế bào
côn trùng) sử dụng hiện nay.………………………………...28
3.2.1.2. Ưu, nhược điểm……………………………………..29
3.2.2. Hệ thống biểu hiện gen là tế bào động vật…………………..30
3.2.2.1. Một số dòng tế bào động vật sử dụng hiện nay…….30


3.2.2.2. Ưu, nhược điểm……………………………………..31
3.2.3. Hệ thống biểu hiện gen là tế bào thực vật……………….......32
3.2.3.1. Một số dòng tế bào thực vật sử dụng hiện nay……..32
3.2.3.2. Ưu, nhược điểm……………………………………..33
CHƯƠNG II: QUÁ TRÌNH ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG THUỐC SINH
HỌC TƯƠNG TỰ…………………………………………..............................35
1. Vấn đề chất lượng, an toàn và hiệu quả………………………………35

2. Quy trình đánh giá……………………………………………………...35
2.1. Hướng dẫn của các cơ quan quản lý………………………………..35
2.2. Các kỹ thuật và phương pháp phân tích đặc tính…………………..38
CHƯƠNG III: ỨNG DỤNG CỦA CÁC THUỐC SINH HỌC TƯƠNG TỰ
TRONG Y – DƯỢC…………………………………………………………...41
1. Sự phát triển của thuốc sinh học tương tự trong điều trị……………41
2. Vấn đề ngoại suy chỉ định và vấn đề khả năng hoán đổi với sản phẩm
của nhà phát minh trong điều trị………………………………………...44
CHƯƠNG IV: BÀN LUẬN…………………………………………………...47
1. Về định nghĩa và các công nghệ chế tạo………………………………47
2. Về quy trình đánh giá chất lượng……………………………………..49
3. Về ứng dụng của thuốc sinh học tương tự……………………………49
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT…………………………………………………...51
TÀI LIỆU THAM KHẢO


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

Ký hiệu

Tiếng Anh

Tiếng Việt

ADN

Deoxyribonucleic acid

Acid deoxyribonucleic

ARN
Ribonucleic acid
CHO (cell) ChineseHamster Ovary (cell)

Acid ribonucleic
Tế bào buồng trứng của chuột
hamster Trung Quốc
thay đổi hóa học

CM

Chemical modification

CMC

chemistry, manufacturing, and
control

Hóa học, sản xuất và kiểm soát

E.coli

Escherichia coli

vi khuẩn Escherichia coli

EMA
EU
Fc

European Medicines Agency
European Union
Fragment crystallizable

Cơ quan quản lý thuốc Châu Âu
Châu Âu
Mảnh có thể kết tinh được

FDA

Food and Drug Administration Cơ quan quản lý thực phẩm và
dược phẩm

G-CSF

Granulocyte-colony
stimulating factor
Human Embryonic Kidney
Cells

Yếu tố kích thích dòng bạch cầu
hạt
Tế bào thận người chưa phát triển

IgG

Immunoglobulin G

Kháng thể immunoglobulin G

mAb
(mAbs)

Monoclonal antibody

Kháng thể đơn dòng

P/GP

Protein / Glycoprotein

Protein / Glycoprotein

HEK

PD
Pharmacodynamics
PK
Pharmacokinetics
PTM/CTM Post-translational
modification/ Co-translational
modification
TNF
Tumor necrosis factor

Dược lực học
Dược động học
Biến đổi sau dịch mã/ biến đổi
trong dịch mã

WHO

Tổ chức Y tế thế giới

World Health Organization

Yếu tố hoại tử khối u


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng

Tên

Trang

1.1

So sánh thuốc sinh học và thuốc hóa dược.

5

1.2

Phân biệt một số kiểu thuốc sinh học

8

1.3

So sánh các hệ thống biểu hiện protein tái tổ hợp

27

1.4

Một số thuốc sinh học tương tự được EMA phê duyệt sử

28

dụng hệ biểu hiện là vi khuẩn E.coli.
1.5

Một số thuốc sinh học tương tự sử dụng CHO làm hệ biểu

30

hiện.
2.1

Các vấn đề được đưa ra trong hướng đẫn đánh giá về chất

38

lượng được ban hành bởi EMA và FDA
2.2

Các phương pháp phân tích kiểm tra để chỉ ra sự tương tự.

39

3.1

Các nhóm thuốc sinh học tượng tự đã được phê duyệt tại

41

Châu Âu.


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình

Tên

Trang

1.1

Cấu trúc chung của một kháng thể

18

1.2

Đa dạng chức năng của protein dung hợp chứa Fc

22

1.3

Cấu trúc của phân tử etanercept

25

1.4

Biểu đồ hệ thống biểu hiện gen được sử dụng trong sản

25

xuất các thuốc đã được phê duyệt (2006)


ĐẶT VẤN ĐỀ
Các thuốc sinh học đang được phát triển mạnh mẽ trong những năm gần
đây, được sản xuất từ những tế bào sống bằng các công nghệ sinh học hiện đại,
ứng dụng từ công nghệ tái tổ hợp ADN. Ngày nay, các thuốc sinh học đang đóng
vai trò quan trọng trong liệu pháp điều trị các bệnh nguy hiểm đe dọa tính mạng
và hiếm gặp như ung thư, đái tháo đường, thiếu máu, viêm khớp dạng thấp, đa xơ
cứng bì,… kể từ lần đầu được phê duyệt bời FDA năm 1980, số lượng các thuốc
sinh học phát minh ngày càng tăng và hàng chục thuốc đã và đang đối mặt với sự
hết hạn độc quyền. Theo đó, các thuốc sinh học tương tự cũng được mở đường
để đưa vào thị trường đầy tiềm năng này. EU đã đi tiên phong trong việc thiết lập
hàng rào tiêu chuẩn pháp lí cho các thuốc sinh học tương tự vào thị trường đánh
dấu bởi sự phê duyệt biệt dược Omnitrope (chứa hoạt chất chính là Somatropin)
vào 12/04/2006. Không thể phủ nhận rằng sự phát triển của ngành công nghiệp
sản xuất thuốc sinh học tương tự đang có sức hút mạnh mẽ đối với các nhà
nghiên cứu phát triển và nhà sản xuất dược phẩm trên thế giới. Gắn liền với sự
phát triển của các thuốc sinh học tương tự là việc ứng dụng công nghệ sinh học

hiện đại từ các giai đoạn sản xuất đến các bước đánh giá sự tương tự so với sản
phẩm phát minh.
Để có cái nhìn tổng quan và cập nhật về con đường phát triển của các
thuốc sinh học tương tự, đề tài “Tổng quan về các sản phẩm tương tự sinh học
và ứng dụng trong Y-Dược” được thực hiện với các mục tiêu sau:
1. Giới thiệu được công nghệ chế tạo thuốc sinh học tương tự.
2. Giới thiệu được quy trình đánh giá chất lượng các thuốc sinh học tương tự.
3. Giới thiệu được ứng dụng của thuốc sinh học tương tự trong Y-Dược.

1


CHƯƠNG I: ĐỊNH NGHĨA VÀ CÔNG NGHỆ SINH HỌC TRONG VIỆC
CHẾ TẠO THUỐC SINH HỌC TƯƠNG TỰ
1. Các định nghĩa
1.1. Các định nghĩa của thuốc sinh học tương tự
Từ năm 2001, các cuộc thảo luận về khuôn khổ pháp lý đối với thuốc sinh
học tương tự nổi lên, sự ra đời của các thuốc sinh học tương tự là tất yếu theo
nhu cầu của thị trường khi các thuốc sinh học phát minh đang trên đà hết hạn bảo
hộ bản quyền. Thuốc sinh học tương tự ra đời mang lại lợi ích lớn nhất cho bệnh
nhân là làm giảm đáng kể chi phí điều trị mà vẫn đảm bảo đạt được sự an toàn và
hiệu quả điều trị.
Thuốc sinh học tương tự xuất hiện trên thế giới với nhiều tên gọi khác
nhau: tại Châu Âu nó xuất hiện với tên gọi là sản phẩm thuốc sinh học tương tự
(similar biological medicinal product); tại Mỹ nó được gọi là thuốc sinh học theo
sau (follow-on biologics) và Thuốc sinh học tương tự (biosimilars); WHO gọi
các sản phẩm này là thuốc sinh học tương tự (2 tên gọi là similar biotherapeutic
product-SBP hay Biosimilar); tại Brazil nó được gọi là thuốc sinh học (Biologic
product); tại Ấn Độ là thuốc sinh học tương tự (similar biologic); tại Mexico là
sản phẩm sánh ngang bằng thuốc sinh học (biocomparable); tại Canada là thuốc

sinh học hạng mục nhập sau (subsequent-entry biological); tại Australia là
Biosimilars; tại Việt Nam là sinh phẩm tương tự hay thuốc sinh học tương tự
[30].
Trong định nghĩa thuốc sinh học tương tự đưa ra bởi FDA trên website
chính thức, một thuốc sinh học tương tự là một thuốc sinh học có độ giống cao
và không có những khác biệt có ý nghĩa trên lâm sàng với một thuốc tham chiếu
đang lưu hành và đã được cấp phép bởi FDA. FDA cũng giải thích hai tiêu chí,
thứ nhất là “độ giống nhau cao” được chỉ ra bởi kết quả so sánh về các đặc tính
như độ tinh khiết, xác định về hóa học và hoạt tính sinh học bằng các công nghệ
hiện đại giữa thuốc sinh học tương tự và thuốc tham chiếu, những sự khác biệt
2


nhỏ về thành phần không có hoạt tính trên lâm sàng như chất ổn định, hệ đệm là
có thể chấp nhận và sẽ được định lượng cẩn thận bởi FDA. Những khác biệt nhỏ
xảy ra trong quá trình sản xuất như các biến thể có thể chấp nhận của hoạt chất
cũng được chấp nhận và kiểm soát, điều chỉnh qua từng lô mẻ với cả thuốc sinh
học tương tự và thuốc tham chiếu. Thứ hai là cụm từ “không có những khác biệt
có ý nghĩa trên lâm sàng” được cụ thể là về an toàn, độ tinh khiết và hiệu quả (an
toàn và hiệu lực) và được chỉ ra qua các nghiên cứu dược động học, dược lực học,
đánh giá về tính sinh miễn dịch trên lâm sàng và cả nghiên cứu lâm sàng nếu cần
thiết [21].
Định nghĩa thuốc sinh học tương tự đưa ra bởi EMA một thuốc sinh học
có độ giống cao so với một thuốc sinh học khác đã được phê duyệt ở EU (thuốc
sinh học tham chiếu). EMA cũng giải thích rằng: “độ giống cao” nghĩa của thuốc
sinh học tương tự với thuốc tham chiếu về đặc tính lý, hóa, sinh học, và có thể có
những khác biệt nhỏ so với thuốc tham chiếu nhưng chúng không có ý nghĩa trên
lâm sàng về độ an toàn và hiệu quả [12].
Định nghĩa thuốc sinh học tương tự đưa ra bởi WHO năm 2009: thuốc sinh
học tương tự là một thuốc sinh học tương tự về chất lượng, tính an toàn và hiệu

quả so với một thuốc sinh học tham chiếu đã được cấp phép [42].
Định nghĩa thuốc sinh học tương tự đưa ra bởi Việt Nam: Sinh phẩm
tương tự (còn gọi là thuốc sinh học tương tự) là thuốc sinh học có sự tương tự về
chất lượng, an toàn, hiệu quả so với một thuốc sinh học tham chiếu [3].
Trong đó: Sinh phẩm tham chiếu (còn gọi là thuốc sinh học tham chiếu) là
sinh phẩm được cấp phép lưu hành tại Việt Nam trên cơ sở có đầy đủ dữ liệu về
chất lượng, an toàn, hiệu quả; Sinh phẩm (còn gọi là thuốc sinh học) là thuốc
được sản xuất bằng công nghệ hoặc quá trình sinh học từ chất hoặc hỗn hợp các
chất cao phân tử có nguồn gốc sinh học bao gồm cả dẫn xuất của máu và huyết
tương người. Sinh phẩm không bao gồm kháng sinh, chất có nguồn gốc sinh học

3


có phân tử lượng thấp có thể phân lập thành những chất tinh khiết và sinh phẩm
chẩn đoán in vitro [3].
Như vậy, qua các định nghĩa trên có thể rút ra rằng một sản phẩm được coi
là thuốc sinh học tương tự khi nó thỏa mãn 3 điều kiện sau:
(1): là một thuốc sinh học,
(2): có độ giống cao và không có những khác biệt có ý nghĩa về lâm sàng với
thuốc tham chiếu,
(3): thuốc tham chiếu là một thuốc sinh học đã được cấp phép lưu hành.
Độ giống cao là kết quả đánh giá dựa trên việc phân tích đặc tính chất
lượng như cấu trúc, đặc tính lý hóa, hoạt tính sinh học, những khác biệt nhỏ sẽ
được chấp nhận nhưng phải được chỉ ra và chứng minh là không có ý nghĩa trên
lâm sàng.
1.2. Các định nghĩa liên quan
Thuốc sinh học tương tự và thuốc generic đều là các phiên bản của thuốc
phát minh được tung ra thị trường sau khi các thuốc phát minh hết hạn bảo hộ
độc quyền và có thể là một lựa chọn khác tốt hơn cho bệnh nhân. Thuốc sinh học

tương tự và generic được phê duyệt thông qua các con đường quản lý khác nhau
nhưng đều là con đường rút gọn không yêu cầu thử nghiệm lâm sàng đầy đủ tốn
kém như với một thuốc mới [21]. Nhưng thuốc sinh học tương tự không phải là
sản phẩm generic và để tránh nhầm lẫn người ta không dùng thuật ngữ biogeneric. Đó là do, thuốc sinh học tương tự có kích thước lớn, cấu trúc phức tạp
và không phải là bản sao nguyên của thuốc sinh học phát minh. Thuốc sinh học
có bản chất là protein được sản xuất trong tế bào sống, qui trình sản xuất các
thuốc sinh học rất phức tạp yêu cầu hàng trăm bước phân lập và tinh chế. Với sản
xuất một thuốc sinh học thì “quy trình sản xuất chính là sản phẩm”. Trong thực
tế sản xuất không thể có một bản sao y nguyên của một thuốc sinh học, vì chỉ cần
thay đổi quy trình một chút cũng có thể làm thay đổi sản phẩm cuối cùng. Và
một protein có thể bị biến đổi trong quá trình sản xuất (ví dụ: thêm chuỗi đường,
4


thay đổi cấu trúc protein dẫn đến mất cấu trúc xoắn…), quy trình khác nhau sẽ
cho ra sản phẩm cuối cùng khác nhau làm ảnh hưởng đến tính hiệu quả và an
toàn, và có thể ảnh hưởng đến tính sinh miễn dịch của bệnh nhân. Trong một vài
trường hợp, ngay cả nhà phát minh ra sản phẩm đó cũng gặp phải những tình
huống tương tự như thế [7].
Bảng 1.1: So sánh thuốc sinh học và thuốc hóa dược [5, 6].
Nội dung so Thuốc hóa Thuốc
sánh

dược

Tổng hợp

Tổng

Thuốc

generic

sinh Thuốc

sinh

học tương tự

học

hợp Bản sao chép Sản xuất dựa Phát triển dựa

hóa học

của công thức vào ứng dụng trên phân tử
hóa học của của công nghệ thuốc sinh học
nhà

Kích thước

100-1000

phát sinh học trong của nhà phát

minh

tế bào chủ

minh

100-1000 Da

10.000-

10.000-

300.000 Da

300.000 Da

Nhiều

Nhiều

Da
Quá

trình Không có

Không có

glycosyl hóa
Cấu trúc phân Đơn

giản, Đơn giản, đã Phức tạp

đã được xác được

tử

Phức tạp

xác

định các đặc định các đặc
tính lý hóa
Khả

năng Thấp

sinh

miễn

tính lý hóa
Thấp

Trung bình-cao Trung bình-cao

ổn định

Nhạy cảm với Nhạy cảm với

dịch
Sự ổn định

ổn định

nhiệt

và

dễ nhiệt

và

dễ

biến đổi trong biến đổi trong

5


quá trình vận quá trình vận
chuyển
Hoạt chất

phải Thường là hỗn Thường là hỗn

Không phải Không
là

kháng là

chuyển

kháng hợp

nguyên, tồn nguyên,

có

tính hợp

có

tính

tồn kháng nguyên, kháng nguyên,

tại độc lập, tại độc lập, nhiều đặc tính nhiều đặc tính
độ

tinh độ tinh khiết và có thể thay và có thể thay

khiết về hóa về hóa học đổi trong suốt đổi trong suốt
học

cao, cao,

tiêu quá trình phát quá trình phát

tiêu

chuẩn chuẩn

tinh triển, khó định triển, khó định

tinh

khiết khiết

được

thiết thiết lập rõ

lập rõ ràng
Thời

gian 7-10 năm

phát

triển

được chuẩn

chuẩn

ràng
1-3 năm

10-15 năm

6-9 năm

thuốc
Giá để phát US
triển

$500-
sản 800M

US

$800- US $10-250M

1300M

phẩm
Phân tích đặc Không yêu Có nhiều kỹ Không yêu cầu
tính

cầu

Không có kỹ

thuật để xác

thuật

định sự giống

dạng sự tương

nhau

giữa

đồng về cấu

thuốc generic

trúc nên thử

và thuốc phát

nghiệm

lâm

minh

sàng

cần

thiết

6

nhận

là


Ngoài ra, các nhà sản xuất thuốc sinh học tương tự không được tiếp xúc
với nguồn nguyên liệu sản xuất của nhà sản xuất thuốc phát minh cũng như quy

trình sản xuất của họ. Do đó nó được sản xuất hoàn toàn độc lập với thuốc phát
minh, nguồn nguyên liệu, tế bào chủ hay quy trình đều có thể khác nên thuốc
sinh học được sản xuất ra chỉ có thể có độ giống cao so với thuốc phát minh chứ
không phải là bản sao y của thuốc phát minh. Bảng 1 sẽ làm rõ hơn sự khác nhau
này.
Cũng cần phải phân biệt định nghĩa thuốc sinh học tương tự (biosimilars)
với các loại thuốc sinh học khác (bảng 2).
Trước hết, thuốc sinh học tương tự không phải là thuốc sinh học thế hệ hai
(second-generation biopharmaceuticals), những thuốc sinh học thế hệ hai có cấu
trúc khác với thuốc phát minh, là phiên bản cải tiến nhưng vẫn giữ được cơ chế
tác dụng.
Thuốc sinh học tương tự cũng không phải là Biomimics (ví dụ: Redituxmột biomimics của Rituximab) - phiên bản sao chép có chủ đích - Biomimics là
những sản phẩm sao chép không được phát triển, đánh giá hay phê duyệt bởi
hướng dẫn qui định cho thuốc sinh học tương tự, sự giống nhau cũng không được
nêu ra bởi các đánh giá so sánh toàn diện hay thang đánh giá; có thể có sự khác
nhau về cấu trúc bậc 1 khi so sánh với thuốc sinh học tham chiếu và có thể khác
với thuốc sinh học tham chiếu về công thức, liều, tính hiệu quả, độ an toàn và sự
sinh miễn dịch của cơ thể.
Thuốc sinh học tương tự cũng không phải là thuốc sinh học phiên bản tốt
hơn (Biobetter). Biobetter là sản phẩm được thiết kế để cải thiện hiệu quả, tính
an toàn, dược động học hoặc khả năng sản xuất, vận chuyển. Biobetter được coi
là thuốc mới và phải có đầy đủ hồ sơ bằng chứng nghiên cứu tiền lâm sàng và
lâm sàng.

7


Bảng 1.2: Phân biệt một số kiểu thuốc sinh học [55].

thuốc sinh học

không phải phát
minh

phát minh

thuốc sinh học
phát minh gốc

Mô tả

thuốc sinh học
không phải thuốc
phát minh khác

thuốc sinh học
tương tự

Bio-betters

Công nghệ đột Cải tiến về hiệu Giá cả hợp lý, Độ an toàn,
phá, một bước quả/

tính

an chất lượng cao

hiệu

quả

tiến lớn trong toàn

không được so

điều trị

sánh

nghiêm

ngặt với thuốc
phát minh
Mục

Thuốc mới có Mục tiêu giống Tương

tiêu

mục tiêu mới

với sinh phẩm lâm

đương Mục đích là

sàng

gốc nhưng có sánh

và sao chép lại

ngang phiên bản của

cải thiện về hiệu được với sản nhà phát minh.
quả/ an toàn…

phẩm phát minh Tập trung vào
sự tiếp cận của
bệnh nhân và
thị trường.

Ví dụ

Eylea

Pegasys

Inflectra

8

Reditux


Sản phẩm có thể hoán đổi được (Interchangeable product) là thuốc sinh
học tương tự thỏa mãn các yêu cầu bổ sung đề ra bởi Đạo luật Cạnh tranh về giá
của các thuốc sinh học và Đổi mới (Biologics Price Competition and Innovation
Act). Để hoàn thành các yêu cầu bổ sung này sản phẩm cần phải được chứng
minh là sẽ mang lại kết quả trên lâm sàng giống như thuốc tham chiếu trên bất kỳ
bệnh nhân nào. Ngoài ra đối với sản phẩm không phải liều duy nhất thì phải

được đánh giá nguy cơ về an toàn và hiệu quả khi chuyển đổi qua lại giữa sản
phẩm đó và thuốc tham chiếu.Một sản phẩm có thể hoán đổi được có thể thay thế
thuốc tham chiếu mà không cần hỏi ý kiến của người kê đơn [21].
2. Một số đặc điểm của thuốc sinh học tương tự
Để sản xuất được các protein và glycoprotein (P/GP) tái tổ hợp việc đầu
tiên cần thực hiện đó là mô tả đặc điểm của cấu trúc và tác dụng của các phân tử
nội sinh. Đây là việc rất có ý nghĩa, trong khi trình tự gen sẽ xác định trình tự cơ
bản của các acid amin nó sẽ giúp xác định được chính xác cấu trúc của phân tử
hoạt chất. Các thông số cần xác định đó là: cấu trúc của polypeptid (cấu trúc bậc
hai, bậc ba, bậc 4), các đặc tính hóa học (điện tích, thân nước, kỵ nước), thay đổi
sau dịch mã và thay đổi hóa học, và vi môi trường mà nó có thể hiện hoạt tính
của mình. Do đó, khi cố gắng tạo ra một phân tử nội sinh ngoài cơ thể có thể tạo
ra rất nhiều phân tử không đồng nhất trong suốt quá trình phân lập, tinh khiết và
định tính.
Trong thực tế, tương đồng về cấu trúc là mục đích của các nhà phát triển.
Chúng ta hi vọng rằng P/GP tái tổ hợp sẽ mang đặc tính sau dịch mã giống như
phân tử nội sinh vì khi có sự thay đổi sau dịch mã không tự nhiên cơ thể sẽ nhận
diện phân tử P/GP như một kháng nguyên và sinh ra kháng thể chống lại P/GP
điều trị chúng ta đưa vào. Nhưng không thể tránh khỏi sự khác nhau giữa phân tử
tái tổ hợp và phân tử tự nhiên vì các phân tử protein tái tổ hợp được tổng hợp bởi
các mô, tế bào không phải của con người ( ví dụ: tế bào buồng trứng chuột
Hamster Trung Quốc - CHO, tế bào u tủy chuột -NS0, tế bào ung thư tủy
9


Sp2/0,…), tiếp xúc với môi trường nuôi cấy, sản phẩm của các tế bào nguyên vẹn
và bị suy yếu, trải qua giai đoạn sau lên men gồm các quá trình tinh chế, hoàn
thiện công thức và điều kiện bảo quản. Trong hệ thống biểu hiện là sinh vật nhân
sơ ví dụ như E.coli khi sản xuất quá nhiều protein trong một thời gian ngắn
chúng sẽ hình thành thể vùi là thể đậm đặc của protein cuộn gấp sai và không thể

hoạt động chức năng nên chúng cần phải được hòa tan và tái cuộn xoắn trong
ống nghiệm do đó sản phẩm có thể thiếu quá trình thay đổi sau dịch mã tự nhiên
hoặc phải trải qua quá trình sửa sau dịch mã không tự nhiên.
Thêm vào đó, để chỉ ra hiệu quả lâm sàng phục vụ cho quá trình phê duyệt
công ty sản xuất của sản phẩm phát minh phải chỉ ra được đặc tính của sản phẩm
về cấu trúc và chức năng. Nếu được phê duyệt các thông số được thành lập để
định nghĩa sản phẩm cần được đảm bảo duy trì trong suốt tuổi thọ của thuốc, các
thay đổi trong quy trình sản xuất sẽ được phê duyệt nếu có bằng chứng chỉ ra
rằng không có ảnh hưởng đến hiệu quả điều trị và lợi ích của bệnh nhân.
Bản sao chép của thuốc sinh học không thể xác định được cấu trúc, tuy
nhiên, nó cần phải được chứng minh là có thể sánh được với thuốc phát minh. So
sánh về cấu trúc phải nhận biết được điểm khác nhau về cấu trúc giữa thuốc sinh
học tương tự và biologics và phải chỉ ra rằng điểm khác nhau đó không ảnh
hưởng đến hiệu quả điều trị cũng như lợi ích của bệnh nhân [17].
2.1. Tổng quan về thay đổi trong và sau dịch mã
Các biến đổi về cấu trúc của protein được dự đoán bởi việc đọc khung
trình tự gen thường được gọi chung là biến đổi sau dịch mã. Tuy nhiên, các biến
thể có thể xuất hiện từ giai đoạn sớm ví dụ bởi bắt cặp nhầm trong quá trình
phiên mã, dịch mã của ADN, ARN, cấp độ acid amin. Thông thường các biến đổi
trong quá trình dịch mã hay sau dịch mã hay biến đổi hóa học bao gồm quá trình
glycosyl hóa, phosphoryl hóa, sulfat hóa, glycan hóa, sự khử amid, sự khử amin.
Hơn nữa, hồ sơ cấu trúc có thể đa dạng về tuổi, giới tính, sức khỏe và tình trạng
bệnh tật. Bộ gen của con người gồm khoảng 21000 gen mã hóa protein, nhưng
10


thực tế có khoảng 1-2 triệu protein, do các thông số được đề cập phía trên cộng
thêm sự biến đổi do hóa học và enzym trong cơ thể. Theo lý thuyết, mỗi cá thể
người nên thích ứng về miễn dịch với tất cả các phân tử trong hệ gen của chúng
ta, bao gồm cả những biến đổi sau dịch mã và biến đổi về hóa học. Tuy nhiên,

những hệ thống ngày nay có độ nhạy cao cho phép nhận ra kháng thể có ái lực
thấp đến rất nhiều tự kháng nguyên trong mỗi cá thể. Nghịch lý rằng, mặc dù mỗi
cá thể khỏe mạnh có các kháng thể tự nhận dạng miễn dịch của kháng nguyên
giống hoặc gần giống, nhưng các kháng thể đặc hiệu có thể sẽ được khuếch đại
khi bị bệnh và được coi là một dấu hiệu cho các thể bệnh riêng.
Việc liệt kê các biến đổi trong và sau dịch mã (PTM/CTM) và biến đổi hóa
học (CM) tạo ra các P/GP không đồng nhất được thực hiện bằng sự phát triển
mang tính cách mạng trong khối phổ khối lượng và định lượng, định nghĩa của
hơn 300 cấu trúc biến đổi sau dịch mã và biến đổi hóa học, phân tích của
530,264 trình tự trong cơ sở dữ liệu Swiss-Prot đã giúp xác định 87.308 PTM đã
được xác định bằng thực nghiệm và 234.938 phân tử được cho là PTM. Tiềm
năng của sự phức tạp về cấu trúc và chức năng có thể được đánh giá cao từ thực
tế là bộ gen của con người mã hóa cho 518 protein kinase và 200 phosphatase.
CTM/PTM phổ biến thứ hai là sự glycosyl hóa. Oligosaccharid có thể được gắn
vào vị trí asparagin để tạo ra các glycoprotein liên kết N hoặc gắn vào các nhóm
hydroxyl của serin, threonin hay tyrosin để tạo các dạng glycol- liên kết O. Đầu
liên kết N gồm hơn 500 cấu trúc oligosaccharid khác nhau, do đó có thể được
gắn ở các vị trí glycosyl hóa khác nhau để tạo nên hơn 1000 dạng glycan khác
nhau; kết quả của hoạt động của hơn 250 enzym vận chuyển gốc glycosyl.
Ví dụ về sự đa dạng và phức tạp là kháng thể đơn dòng. Một trình tự đầy
đủ của một phân tử IgG gồm khoảng 40 vị trí asparagin/glutamin; do vậy, sự khử
amid ngẫu nhiên của một trong các vị trí đó sẽ làm xuất hiện 40 biến thể cấu trúc
(các isoform); sự khử amid của 2 vị trí sẽ làm xuất hiện 40*40=1560 biến thể;…
Và cứ như thế với độ dài của cả một phân tử IgG khi được sửa sau dịch mã sẽ có
11


thể làm xuất hiện 108 isoform. Kháng thể đơn dòng tái tổ hợp có một thách thức
duy nhất là chúng phải được đánh giá trên cơ sở từng trường hợp, mỗi thành
phần được cấu tạo bởi hai chuỗi nặng và hai chuỗi nhẹ, có chuỗi hằng định duy

nhất. May mắn rằng công nghệ ngày nay cho phép sàng lọc và chọn sớm các
dòng không có các vị trí acid amin dễ bị biến đổi sau dịch mã trong vùng xác
định bổ sung của chúng, các tiêu chí khác có thể được lựa chọn và tối ưu độ tan,
độ ổn định,… Trình tự vùng cố định có thể cũng được lựa chọn (có thể là lớp Ig
và phân lớp) để xác định hợp chất/sản phẩm thuốc cuối cùng được phát triển.
Một thuốc muốn được công nhận là thuốc sinh học tương tự cần phải đưa ra
được bằng chứng về sự so sánh ngang bằng về cấu trúc và chức năng [17].
2.2. Đặc tính lý hóa
Nhiều ý kiến cho rằng để so sánh thuốc sinh học tương tự và thuốc phát
minh thì xây dựng dựa trên đặc tính lý hóa sẽ đem lại kết quả tin cậy hơn là các
thử nghiệm lâm sàng hạn chế. Thừa nhận rằng các thử nghiệm lâm sàng bao quát
và đắt đỏ mà nhà phát minh cần thực hiện để được phê duyệt sản phẩm không
cần thiết phải áp dụng đối với phát triển thuốc sinh học tương tự. Một thử
nghiệm lâm sàng hạn chế có thể mang lại kết quả không đáng tin cậy do các bệnh
đồng thời, sự khác biệt liên quan hay không liên quan giữa các bệnh nhân…
Bước đầu tiên để phát triển một thuốc sinh học tương tự là tìm hiểu được các đặc
tính của thuốc phát minh, sử dụng nhiều mẫu thu được từ các hiệu thuốc, từ đó
sơ bộ lựa chọn ra các dòng và cuối cùng là xác nhận khả năng so sánh của sản
phẩm. Bất lợi với các nhà phát triển là các kỹ thuật sử dụng và kết quả nghiên
cứu đặc tính lý hóa của nhà phát minh không được công bố. Nhà sản xuất và
bệnh nhân có được nhiều lợi ích hơn nếu có sự giúp đỡ thành lập các kỹ thuật và
quy trình đã được ứng dụng. Sự sẵn có của nguyên liệu đối chiếu tiêu chuẩn đã
phân tích đặc tính bằng phương pháp hiện đại, và sự sẵn sàng của các phòng thí
nghiệm học thuật hay thương mại điều khiển từ bên ngoài đối với các quy trình
nội bộ sẽ là một bước tiến lớn để đạt được mục đích trên [17].
12


Thử thách trong việc sản xuất thuốc sinh học tương tự so với Generic là
xác định đặc tính lý hóa. Ngay cả đối với nhà phát minh thuốc sinh học việc sản

xuất nhất quán qua từng lô mẻ đã là điều rất khó nên đối với nhà sản xuất thuốc
sinh học tương tự để sản xuất được một sản phẩm tương tự là một thử thách rất
lớn. Đó là do các chi tiết bổ sung về sự không đồng nhất về cấu trúc hóa lý của
một thuốc sinh học vượt ra ngoài những yếu tố chính đã được biết đến về thuốc
phát minh: trình tự các acid amin trong chuỗi polypeptid của nó. Thông tin về sự
đa dạng, không đồng nhất của phân tử thuốc sinh học trong một mẻ hay qua từng
lô mẻ chỉ được biết bởi nhà phát minh và cơ quan quản lý càng làm quy trình sản
xuất thuốc sinh học tương tự khó khăn hơn việc sản xuất generic. Thực tế là, đối
với sản xuất generic một khi đã xác định được cấu trúc hóa học của sản phẩm
hóa dược phát minh họ dễ dàng thiết kế lại được con đường tổng hợp để sản xuất
ra phân tử đó. Nhưng đối với thuốc sinh học cấu trúc hóa học của trình tự acid
amin của thuốc sinh học phát minh không phải là cấu trúc cuối cùng hoàn thiện
của nó. Từ góc nhìn hóa lý, một cấu trúc sinh học bao gồm một nhóm các biến
đổi hóa học trong chuỗi polypeptid (bao gồm cấu trúc bậc 1 và các liên kết cộng
hóa trị) và những thay đổi về cấu trúc vật lý đến cấp độ cuộn xoắn của nó (là kết
quả của các sửa đổi hóa học và/ hoặc các thay đổi vật lý thay thế các liên kết bậc
hai không hóa trị chịu trách nhiệm cuộn xoắn không gian ba chiều và sự ổn định
của sản phẩm). Những thay đổi hóa lý bổ sung theo suốt chiều dài của các acid
amin tạo nên một cấu trúc tổng thể cuối cùng của thuốc sinh học. Tuy nhiên, sự
xuất hiện của những thay đổi hóa lý bổ sung này không nhất thiết xuất hiện ở
mỗi phân tử thuốc sinh học. Sự thật là mỗi thay đổi về cấu trúc được phân bố đặc
trưng độc lập giữa các phân tử, như vậy tỷ lệ các phân tử thuốc sinh học với mỗi
thay đổi bổ sung là rất đa dạng, từ mỗi phân tử thuốc sinh học có tất cả các thay
đổi quan sát được trong một mẫu đến một số phân tử chỉ có duy nhất một phần
trong tổng số biến đổi quan sát được và những phân tử không chứa biến đổi nào
trong các biến đổi quan sát được.
13


Ngoài ra, một số biến đổi cấu trúc hóa học quan sát được có thể xảy ra ở

nhiều vị trí trên một phân tử thuốc sinh học đưa ra một con đường khác về sự
phân bố các thay đổi cấu trúc này. Kết hợp tất cả những thay đổi này ở một mức
độ nhất định về sự đa dạng trong phân bổ các thay đổi về cấu trúc trong các phân
tử thuốc sinh học qua từng lô mẻ, và với vô số kiểu thay đổi khác nhau có thể
xuất hiện, tạo ra nhiều quần thể các phân tử khác nhau hay các biến thể của thuốc
sinh học. Kết quả cuối cùng là một thuốc sinh học có thể được xem như một hỗn
hợp không đồng nhất của các phân tử protein (hay còn gọi là proteform) khi so
sánh với thuốc hóa dược sử dụng công nghệ tách hiện đại gọi là điện di mao
quản (capillary electrophoresis -CE). Trong nhiều trường hợp, sự không đồng
nhất này thường đươc gọi là sự không đồng nhất nhỏ (microheterogeneity) do
kích thước tương đối nhỏ của các thay đổi hóa học bổ sung hay vùng mà sản
phẩm chịu sự thay đổi hóa lý, đặc biệt là so với toàn bộ kích thước của phân tử
sinh học. Sự không đồng nhất này hay tập hợp rộng lớn các dạng biến thể của
thuốc sinh học có thể được chia làm hai loại chính là các hợp chất gần với thuốc
sinh học (drug-product-related substances) (có thể so sánh với dạng chính của
thuốc sinh học về hiệu lực và an toàn) và các tạp chất liên quan (không có khả
năng so sánh với dạng thuốc chính về hiệu lực và độ an toàn). Do vậy, nhà sản
xuất thuốc sinh học tương tự phải tìm ra sự phức tạp về cấu trúc chi tiết bổ sung
này và sự đa dạng của nó quan từng lô mẻ (yếu tố làm tăng tính không đồng nhất
cấu trúc của một thuốc sinh học phát minh) và sau đó nhân bản và kiểm soát thì
mới thành công trong việc phát triển một sản phẩm thuốc sinh học tương tự [17].
3. Công nghệ sinh học trong chế tạo thuốc sinh học tương tự
Trong phạm vi các thuốc sinh học tương tự, các sản phẩm được thiết kế
bởi công nghệ gen chủ yếu là các protein tái tổ hợp, bởi vì chúng được biểu hiện
và sản xuất bởi các hệ thống sinh học (ví dụ: vi khuẩn, nấm men, tế bào động
vật) đã được chèn trình tự gen cụ thể mã hóa cho protein mong muốn. Hiện nay
các hormone như insulin, hormon tăng trưởng, erythropoietin, yếu tố kích thích
14

tạo dòng bạch cầu hạt, kháng thể đơn dòng, protein dung hợp Fc được phát triển
bởi các nhà sản xuất thuốc sinh học tương tự nhờ công nghệ tái tổ hợp ADN.
3.1. Công nghệ tái tổ hợp ADN
3.1.1.Nguyên tắc
Công nghệ tái tổ hợp ADN đã cho phép các nhà công nghệ sinh học phân
lập và khuếch đại một gen đơn từ bộ gen của một sinh vật để có thể nghiên cứu,
biến đổi và chuyển nó vào trong một cơ thể sinh vật khác. Các kỹ thuật này còn
được gọi là tạo dòng gen do nó có thể sản xuất ra một số lượng lớn các gen xác
định [2].
7 giai đoạn chính của công nghệ tái tổ hợp ADN
Giai đoạn 1: phân lập vật liệu gen (ADN)
Acid nucleic là vật liệu gen có ở trong mọi cơ thể sống. Trong hầu hết các
cơ thể sống chúng tồn tại ở dạng acid deoxyribonucleic hay còn gọi tắt là ADN.
ADN cần phải được tinh khiết khỏi các thành phần khác của tế bào như protein,
RNA, enzym,… để có thể cắt lấy đoạn ADN mong muốn nhờ enzym cắt giới hạn.
Để phân lập được ADN cần phải trải qua 3 bước:
Bước 1: Vì ADN được bao bọc bên trong màng nên để giải phóng ADN
cùng với các phân tử lớn khác như protein, polysaccharide và lipid, tế bào vi
khuẩn, thực vật hay mô động vật cần được trộn với enzym lysozyme nếu là tế
bào vi khuẩn, cellulose nếu là tế bào thực vật và chitinase nếu là nấm.
Bước 2: loại bỏ RNA bằng enzym ribonuclease, loại bỏ protein bằng
enzym protease.
Bước 3: loại bỏ các phân tử tạp khác ở các bước tinh chế ADN cuối cùng
khi thêm ethanol lạnh. Thu lấy sợi ADN vẩn trong dung dịch.
Giai đoạn 2: cắt đoạn ADN ở một vị trí xác định
Enzym giới hạn được ủ với ADN. Tùy vào loại enzym mà tối ưu hóa điều
kiện ủ.
Giai đoạn 3: phân lập đoạn ADN mong muốn
15

Sử dụng điện di trên gel agarose, có thể kiểm tra hoạt động của enzym cắt
giới hạn nhờ phương pháp này. Vì ADN mang điện tích âm nó sẽ di chuyển về
cực dương hay còn gọi là anod và ADN sẽ tách nhau ra trong quá trình nó di
chuyển. Sau quá trình điện di này đoạn ADN mong muốn sẽ được tách ra.
Giai đoạn 4: Khuếch đại gen nhờ kỹ thuật PCR
Phản ứng chuỗi trùng hợp hay PCR là kỹ thuật sao chép nhân bản ADN
trong ống nghiệm. Kỹ thuật này được phát triển bởi Kary Mullis năm 1985 và
nhận giải Nobel hóa học năm 1993. PCR được sử dụng để khuếch đại gen mong
muốn sử dụng 2 đoạn mồi primer.
Giai đoạn 5: gắn mảnh ADN vào vector
Quy trình này yêu cầu một ADN vector và một ADN nguồn cho gen quan
tâm. Để hai ADN gắn được với nhau thì chúng nên được cắt bởi cùng một enzym
cắt bên trong phân tử acid nucleic (gọi là endonuclease). Sau đó cả hai được ghép
với nhau bằng cách trộn ADN vector, gen quan tâm và enzym ligase để tạo thành
ADN tái tổ hợp hay ADN lai.
Có ba nhóm vector chính được sử dụng trong tạo dòng ADN và nhân bản
chúng trong tế bào vật chủ gồm: (1) nhóm plasmid; (2) nhóm phage/phagemid;
(3) nhóm nhiễm sắc thể nhân tạo (BAC và YAC). Vector chuyển gen là phân tử
ADN có khả năng tự tái sinh, tồn tại độc lập trong tế bào vật chủ và mang được
các gen cần chuyển. Các vector chuyển gen phải thỏa mãn các yêu cầu tối thiểu
sau:
-

Có trình tự khởi đầu sao chép (ori) để có thể tự sao chép mà tồn tại độc lập.

-

Có các vị trí nhận biết đơn (SRS) nơi mà các enzym hạn chế nhận biết để

cắt rời làm chỗ lắp ráp đoạn gen ngoại lai vào. Các trình tự này thường nằm xa
điểm khởi đầu sao chép để tránh bị cắt nhầm.
-

Có trình tự khởi động (promoter) để tiến hành phiên mã gen ngoại lai.

-

Đảm bảo sự di truyền bền vững của ADN tái tổ hợp ở dạng độc lập hay

gắn vào nhiễm sắc thể tế bào vật chủ.
16


-

Có các gen chỉ thị để dễ dàng phát hiện ra thể tái tổ hợp
Giai đoạn 6: chèn ADN tái tổ hợp vào tế bào chủ
Có rất nhiều phương pháp để chèn ADN tái tổ hợp vào tế bào chủ nhưng

cần phải chắc rằng tế bào chủ có khả năng tiếp nhận ADN tái tổ hợp. Nếu một
ADN tái tổ hợp chứa gen kháng kháng sinh ví dụ như ampicillin được chuyển
vào tế bào E.coli thì tế bào chủ này sẽ biến thành tế bào kháng ampicillin. Gen
kháng ampicillin trong trường hợp này được gọi là một marker có thể lựa chọn.
Sau khi các tế bào biến đổi chúng được nuôi cấy trong thạch agar chứa ampicillin,
chỉ những tế bào đã biến đổi thành công sẽ tiếp tục phát triển, những tế bào khác
sẽ bị chết.
Giai đoạn 7: Lấy hoặc nuôi trồng sản phẩm gen ngoại lai.
Khi chèn một mảnh ADN ngoại lai vào một vector tạo dòng và chuyển nó
vào tế bào vi khuẩn, ADN lạ sẽ được nhân lên. Mục đích cuối cùng là để sản

xuất một hệ biểu hiện protein mong muốn. Sự biểu hiện của gen ngoại lai hoặc
các gen của tế bào chủ liên quan đến việc hiểu rất nhiều chi tiết kỹ thuật. Nếu
protein được mã hóa bằng gen đích được biểu hiện trong tế bào chủ khác loài, nó
được gọi là protein tái tổ hợp. Các tế bào chứa gen mong muốn được nuôi ở quy
mô nhỏ trong phòng thí nghiệm sua đó sẽ được chiết lấy protein mong muốn
bằng cách sử dụng các kỹ thuật tách chiết [2, 37].
3.1.2. Ứng dụng công nghệ tái tổ hợp trong chế tạo một số thuốc sinh học
tương tự
3.1.2.1. Chế tạo kháng thể đơn dòng tái tổ hợp
Cấu trúc kháng thể (hình 1) gồm 2 phần là phần hằng định (C) và phần
biến đổ i (V), cấu tạo bởi 4 chuỗi polypeptid: 2 chuỗi nặng (H), 2 chuỗi nhẹ (cùng
là lamda hoặc cùng là kappa), các chuối liên kết với nhau nhờ cầu nối disulfit.
Vùng hằng định không có vai trò nhận diện kháng nguyên, được đặc trưng bởi
chuỗi acid amin giống nhau giữa các kháng thể. Vùng biến đổ i khác nhau giữa
các kháng thể.Vị trí nhận diện kháng nguyên được gọi là paratope gồm Vh+Vl.
17