Ứng dụng nhựa macroporous trong làm giàu catechin chè xanh (camellia sinensis l )

BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

TẠ THỊ MAI HẠNH

ỨNG DỤNG NHỰA MACROPOROUS
TRONG LÀM GIÀU CATECHIN
CHÈ XANH (Camellia sinensis L.)
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

HÀ NỘI - 2018


BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

TẠ THỊ MAI HẠNH
1301126

ỨNG DỤNG NHỰA MACROPOROUS
TRONG LÀM GIÀU CATECHIN
CHÈ XANH (Camellia sinensis L.)
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ
Người hướng dẫn: DS. Trần Trọng Biên
Nơi thực hiện: Bộ môn Công nghiệp dƣợc

HÀ NỘI - 2018


LỜI CẢM ƠN
Với tất cả sự kính trọng, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến:

Dƣợc sĩ Trần Trọng Biên ngƣời thầy trực tiếp hƣớng dẫn, chỉ bảo tận tình
cho tôi trong suốt thời gian thực hiên khóa luận. Bằng tất cả kinh nghiệm và sự
nhiệt tình, thầy đã giúp đỡ và truyền cảm hứng cho tôi trên con đƣờng nghiên
cứu khoa học.
Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Nguyễn Văn Hân đã luôn quan tâm, giúp
đỡ và chỉ bảo cho tôi, giúp tôi tháo gỡ những khó khăn trong quá trình thực hiện
khóa luận.
Tiếp theo tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô, anh chị kỹ thuật viên bộ
môn Công Nghiệp Dƣợc luôn tạo điều kiện để tôi có thể hoàn thành khóa luận
một cách tốt nhất.
Tôi xin gửi lời cảm ơn tới ban giám hiệu, các bộ môn và phòng ban, các
thầy cô cùng toàn thể cán bộ công nhân viên Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội đã
dạy dỗ và chỉ bảo tận tình cho tôi trong suốt 5 năm học tập tại trƣờng.
Cuối cùng, tôi gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè, những ngƣời đã luôn
ủng hộ, động viên và yêu thƣơng tôi trong suốt thời gian vừa qua.
Do thời gian thực hiện đề tài có hạn nên không thể tránh khỏi những sai
sót. Tôi rất mong có đƣợc sự góp ý quý báu của các thầy cô và các bạn sinh
viên.
Hà Nội, tháng 5 năm 2018
Sinh viên
Tạ Thị Mai Hạnh


MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC BẢNG
DANH MỤC HÌNH VẼ
ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................ 1
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN ...................................................................................... 2

1.1 Giới thiệu về cây chè ........................................................................................... 2
1.1.1 Đặc điểm thực vật và phân bố ................................................................... 2
1.1.2 Thành phần hóa học .................................................................................. 2
1.2 Nhựa macroporous và ứng dụng trong làm giàu các hợp chất từ thiên nhiên ..... 5
1.2.1 Nhựa macroporous ................................................................................... 6
1.2.2 Ứng dụng trong phân lập và làm giàu các hợp chất thiên nhiên............... 7
1.3 Một số phƣơng pháp chiết xuất và làm giàu catechin từ lá chè xanh ................ 10
CHƢƠNG 2: NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU ......................................................................................................... 14
2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị ..................................................................................... 14
2.1.1 Nguyên liệu ............................................................................................. 14
2.1.2 Hóa chất................................................................................................... 15
2.1.3 Thiết bị thí nghiệm .................................................................................. 15
2.2 Nội dung nghiên cứu .......................................................................................... 16
2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu .................................................................................... 16
2.3.1 Phƣơng pháp định lƣợng EGCG ............................................................. 16
2.3.2 Phƣơng pháp định tính EGCG ................................................................ 17
2.3.3 Tạo cao khô từ chè xanh ......................................................................... 17
2.3.4 Phƣơng pháp nghiên cứu sự hấp phụ và phản hấp phụ tĩnh ................... 18
2.3.5 Phƣơng pháp nghiên cứu sự hấp phụ và phản hấp phụ động.................. 20
CHƢƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ............................... 22


3.1 Xây dựng và thẩm định phƣơng pháp định lƣợng ............................................. 22
3.1.1 Độ thích hợp hệ thống ............................................................................. 22
3.1.2 Khoảng tuyến tính ................................................................................... 22
3.2 Khảo sát sự hấp phụ và phản hấp phụ tĩnh trên các nhựa macroporous ............ 23
3.2.1 Lựa chọn nhựa macroporous ................................................................... 23
3.2.2 Khảo sát nồng độ dịch ban đầu ............................................................... 24
3.2.3 Khảo sát pH dịch ban đầu ....................................................................... 26

3.2.4 Khảo sát nồng độ dung môi rửa giải ....................................................... 27
3.3 Khảo sát quá trình hấp phụ và giải hấp phụ động trên cột nhựa ........................ 28
3.3.1 Thể tích dịch hấp phụ .............................................................................. 28
3.3.2 Thể tích dịch rửa giải .............................................................................. 30
3.4 Xây dựng quy trình làm giàu catechin ............................................................... 32
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ..................................................................................... 38
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................ 39


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

Tên đầy đủ

STT

Ký hiệu

1

BV

2

EGCG

(-)- Epigallocatechin gallat

3

HPLC

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance
Liquid)

4

RSD

5

SKLM

Sắc ký lớp mỏng

6

tt/tt

Thể tích/thể tích

Bed Volume

Độ lệch chuẩn tƣơng đối (Relative Standard
Deviation)


DANH MỤC CÁC BẢNG

STT

Tên bảng

Trang

1

Bảng 2.1: Đặc điểm của nhựa D101 và HPD826*

14

2

Bảng 2.2: Các hóa chất dùng trong thí nghiệm

15

3

Bảng 3.1: Kêt quả thâm định độ thích hợp hệ thống

22

4

Bảng 3.2: Mối tƣơng quan giữa nồng độ EGCG và diện tích
peak

23

5

Bảng 3.3: Kết quả sự hấp phụ và phản hấp phụ của EGCG

24

6

Bảng 3.4: Dung lƣợng và hiệu suất hấp phụ ở các nồng độ
khác nhau

25

7

Bảng 3.5: Dung lƣợng hấp phụ tại các pH khác nhau

26

8

Bảng 3.6: Kết quả sự phản hấp phụ EGCG tại các nồng độ
ethanol

27

9

Bảng 3.7: Nồng độ EGCG theo thể tích dịch rửa giải

31

10

Bảng 3.8: Kết quả quá trình làm giàu catechin

35


DANH MỤC HÌNH VẼ

STT

Tên hình vẽ

Trang

1

Hình 1.1: Công thức tổng quát của catechin

3

2

Hình 1.2: Cấu trúc hóa học của EGCG

4

3

Hình 3.1: Đƣờng biểu diễn tƣơng quan giữa diện tích peak
và nồng độ EGCG

23

4

Hình 3.2: Biểu diễn hiệu suất hấp phụ theo nồng độ EGCG

25

5

Hình 3.3: SKLM biểu diễn sự xuất hiện các vết theo thể tích
dịch nạp

29

6

Hình 3.4: Biểu diễn nồng độ EGCG theo thể tích dịch nạp

30

7

Hình 3.5: Sự thay đổi nồng độ EGCG theo thể tích rửa giải

31

8

Hình 3.6: SKLM biểu diễn sự xuất hiện các vết theo thể tích
rửa giải

32

9

Hình 3.7: Quy trình làm giàu catechin

34

10

Hình 3.8: Hình ảnh cao thô (A) và sản phẩm (B)

35

11

Hình 3.9: Sắc ký đồ cao thô chè xanh

36

12

Hình 3.10: Sắc ký đồ sản phẩm cao làm giàu chè xanh

36

ĐẶT VẤN ĐỀ
Chè xanh (Camellia sinensis L.) là loài cây đƣợc trồng rộng rãi và đƣợc sử
dụng ở rất nhiều nƣớc trên thế giới, đặc biệt là ở các nƣớc châu Á nhƣ Việt
Nam, Nhật Bản, Hàn Quốc,…[20]. Lá chè xanh bao gồm rất nhiều các thành
phần nhƣ catechin, cafein, sắc tố, theanin,… [30]. Các catechin chè xanh chủ
yếu là (-)-epigallocatechin gallat (EGCG), (-)-epigallocatechin (EGC), (-)epicatechin gallate (ECG) và (-)-epicatechin (EC). Các báo cáo chỉ ra rất nhiều
tác dụng sinh học của catechin nhƣ chống ung thƣ, chống dị ứng, kháng khuẩn,
và đặc biệt là hoạt tính chống oxy hóa, dọn gốc tự do [15].
Do các giá trị to lớn mà catechin mang lại, rất nhiều các phƣơng pháp đƣợc
nghiên cứu để chiết xuất và làm giàu catechin chè xanh. Các phƣơng phápm
truyền thống thƣờng đƣợc sử dụng nhƣ là kết tủa bằng muối [7] hoặc sử dụng
dung môi hữu cơ [24]. Các phƣơng pháp này đều gây ra một số nhƣợc điểm nhƣ
dƣ lƣợng dung môi hữu cơ hay các muối vô cơ vẫn tồn tại trong sản phẩm và có
thể ảnh hƣởng tới sức khỏe ngƣời sử dụng. Vì thế, xu hƣớng hiện nay trong việc
phân lập và làm giàu các hợp chất thiên nhiên là sử dụng các chất hấp phụ, phổ
biến nhất là nhựa macroporous. Với nhiều đặc tính thuận lợi nhƣ quy trình chiết
xuất đơn giản, ổn định và có thể tái sử dụng, quá trình làm giàu trên nhựa
macroporous còn sử dụng dung môi là nƣớc và ethanol [16]. Phƣơng pháp này
giúp giảm chi phí sản xuất và giảm ô nhiễm môi trƣờng. Đây đƣợc coi nhƣ một
―kỹ thuật xanh‖ trong sản xuất các hợp chất thiên nhiên. Để nghiên cứu tính khả
thi khi ứng dụng các nhựa macroporous trong làm giàu catechin chè xanh, chúng
tôi đã thực hiện đề tài : “Ứng dụng nhựa macroporous trong làm giàu
catechin chè xanh (Camellia sinensis L.)”. Đề tài đƣợc thực hiện với mục tiêu
chính sau:
1. Đánh giá các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình hấp phụ và giải hấp
phụ catechin lên nhựa macroporous.
2. Xây dựng phƣơng pháp làm giàu catechin từ lá chè.
1

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1 Giới thiệu về cây chè
1.1.1 Đặc điểm thực vật và phân bố
Chè hay còn gọi là trà, có tên khoa học là Camellia sinensis (L.) O.Kuntze,
thuộc họ Chè – Theaceae [3].
Chè là cây thân gỗ, mọc hoang, khi không cắt xén có thể cao tới 10 mét,
đƣờng kính thân lớn,có thể một ngƣời ôm không xuể. Đôi khi mọc thành rừng gỗ
trên núi đá cao. Nhƣng khi trồng, để phù hợp với việc thu hái, ngƣời ta thƣờng cắt
tỉa để cây chỉ cao ít nhất là 2 mét. Nhiều cành đâm ngay từ gốc. Lá mọc so le,
không rụng. Hoa to trắng, mọc ở kẽ lá, mùi thơm, nhiều nhị. Quả nang, thƣờng có
3 ngăn nhƣng chỉ có một hạt do các hạt khác teo đi [3].
Cây chè có nguồn gốc từ Trung Quốc, sau đó đƣợc đem trồng ở nhiều nƣớc
khác nhau trên thế giới. Ở nƣớc ta, chè đƣợc trồng nhiều nhất ở các tỉnh Tuyên
Quang, Hà Giang, Thái Nguyên, Quảng Nam, Đà Nẵng, Ninh Bình… [3].
1.1.2 Thành phần hóa học
Thành phần hóa học trong lá chè bao gồm catechin, cafein, protein,
carbohydrat, theanin, sắc tố, acid amin, enzym, chất khoáng,… [30].
 Catechin
Nhóm hợp chất catechin nằm trong nhóm flavan 3-ol trong phân loại các hợp
chất flavonoid của thực vật. Tùy theo các nhóm thế đính vào 2 vòng A và B mà có
những dẫn chất favan 3-ol khác nhau [2]. Các catechin và các hợp chất gallat của
chúng chiếm khoảng 30% trọng lƣợng khô [1]. Cấu trúc của các catechin là một bộ
khung gồm có 3 vòng phenol đƣợc ký hiệu là A, B và C, khác nhau về mức độ
hydroxyl hóa. Do có 2 C bất đối trong cấu trúc catechin (C2 và C3), mỗi dẫn chất
có 4 đồng phân nên có thể có đến 24 catechin khác nhau. Tuy nhiên hiện nay mới
chỉ có 12 catechin đƣợc phân lập và xác định cấu trúc từ lá chè. Các catechin chè
chủ yếu là EGCG, EGC, ECG, và EC.Với mỗi loại chè khác nhau, tỷ lệ phần trăm
của những catechin này cũng khác nhau [1], [13].

2


OH
4'

2'

HO

OH

C
7

A

O ..
2
B
3

5

4

6'

R2

R1 =

H

OH
O

R1 =

OR1

OH

OH
OH

R2 = H ; OH

Hình 1.1: Công thức tổng quát của catechin
Catechin là các hợp chất không màu, kết tinh hình kim hoặc hình lăng trụ, có
vị chát. Những nghiên cứu hóa học và cấu trúc cho biết rằng các catechin và hợp
chất gallat của chúng hấp phụ quang phổ tử ngoại trong vùng bƣớc sóng từ 266
đến 280 nm.
Các hợp chất catechin còn kém bền với các acid mạnh, các chất kiềm và nhiệt
độ. Catechin bền vững nhất trong môi trƣờng acid (pH ~ 4) và bị phân hủy nhanh
trong khoảng pH từ 4 đến 8, đặc biệt kém bền trong môi trƣờng kiềm có pH>7
[34]. Các epicatechin (thành phần chính trong catechin chè xanh) kém ổn định và
dễ bị oxy hóa ở nhiệt độ trên 80°C. Dƣới tác dụng của các men peroxydase, các
catechin cũng bị oxy hóa và tạo ra các sản phẩm chuyển hóa thứ cấp, góp phần tạo

ra hƣơng thơm đặc trƣng cho các loại chè. Do vậy để ổn định catechin trong quá
trình chiết xuất, thƣờng bổ sung các chất chống oxy hóa và ổn định pH (acid
ascorbic, acid citric…). Ngoài ra còn cần kiểm soát nhiệt độ của hỗn hợp trong quá
trình chiết xuất [1].
Trong các catechin chè, EGCG đƣợc xem là chất chống oxy hóa, chống
ung thƣ và có tính đề kháng cao nhất nên nó đƣợc coi là catechin có giá trị cao
nhất trong lá chè [22].

3


OH
OH
HO

O
OH
O
OH

OH

O

OH
OH

Hình 1.2: Cấu trúc hóa học của EGCG
Hoạt tính chống oxy hóa của EGCG cao gấp 100 lần so với vitamin C và
cao hơn 25 lần so với vitamin E. Tác dụng này đƣợc quy kết cho các nhóm

phenolic trên vòng B và C của EGCG. Ba nhóm hydroxy trên vòng B đƣợc
chứng minh là quan trọng trong việc thể hiện hoạt tính chống oxy hóa và tiêu
diệt các gốc tự do [1].
 Cafein
Cafein cũng đƣợc coi là một trong những thành phần chính trong lá chè.
Hàm lƣợng cafein biến đổi theo mùa, chiếm tới 4% trọng lƣợng chè khô [1].
Cafein tan nhiều trong nƣớc nóng, có khả năng tạo muối tannat với các thành
phần tannin bị oxy hóa tạo nên hƣơng thơm, giảm vị đắng cho nƣớc chè [13].
Do thăng hoa ở 178°C nên khoảng 10% cafein sẽ bị hao hụt khi sấy và chế biến
chè xanh.
Cafein có tác dụng kích thích thần kinh trung ƣơng, đƣợc sử dụng trong
nhiều loại thuốc giảm đau và thuốc kháng virus. Bên cạnh đó, cafein cũng là
một thành phần đƣợc sử dụng nhiều trong nƣớc giải khát giúp tạo cảm giác hƣng
phấn cho ngƣời dùng. Vì vậy, cafein cũng cũng đƣợc coi là hoạt chất có giá trị
đối với sức khỏe con ngƣời.
 Các enzym
Các enzym trong lá chè chủ yếu thuộc 2 nhóm: thủy phân (amilase
protease) và oxy hóa (peroxydase, polyphenol oxydase) [1], [13].

4


Các enzym trong chè xanh hoạt động mạnh ở 40°C, nhiệt độ cao hơn sẽ yếu
dần và bất hoạt ở hơn 70°C. Trong sản xuất chè xanh, cần phải giữ hàm lƣợng
catechin cao, tránh bị oxy hóa. Vì vậy, trong quá trình chế biến chè xanh, ngƣời
ta dùng nhiệt độ cao để diệt men trong nguyên liệu chè [1].
 Các sắc tố
Các sắc tố trong lá chè chủ yếu là: Clorophyll, caroten và xantophyll,
Anthocyanidin. Trong đó clorophyll là sắc tố chủ yếu quyết định màu nƣớc chè
xanh; caroten và xantophyll là các sắc tố màu vàng, không tan trong nƣớc, làm

cho bã chè có màu vàng xỉn. Anthocyanidin khi bị oxy hóa tạo thành hợp chất
tan trong nƣớc làm cho nƣớc chè có màu đồng đỏ. Nồng độ cao sắc tố này làm
chè có vị đắng và làm xấu màu nƣớc pha chè xanh [13].
1.2 Nhựa macroporous và ứng dụng trong làm giàu các hợp chất từ thiên
nhiên
Hiện nay, ứng dụng sử dụng nhựa hấp phụ càng đƣợc quan tâm và chú ý ở
nhiều lĩnh vực khác nhau nhƣ chiết xuất dƣợc liệu, công nghệ sinh học, y sinh
học [5].
Nhựa hấp phụ có cấu trúc polyme, có khung cơ bản là polystyren hoặc
polyacrylic. Các thành phần chính đƣợc sử dụng trong quá trình sản xuất nhựa là
các monome (styrene, divinyl benzene, acrylic) và các chất nhƣ H3PO4, NaOH,
các amin. Dựa trên các đặc điểm vật lý và cảm quan, nhựa tổng hợp đƣợc chia
làm 2 loại :
- Hạt nhựa gel: Là các hạt rắn, trong và cho ánh sáng đi qua.
- Hạt nhựa macroporous: Là các hạt rắn, trên bề mặt có nhiều lỗ xốp
và không cho ánh sáng đi qua.
Các hạt nhựa có kích thƣớc từ 0,3 - 1,2 mm, cứng, trơ, diện tích bề mặt lớn
và có thể dễ dàng xử lý trƣớc khi sử dụng. Khi đƣợc hoạt hóa bởi nƣớc, các hạt
sẽ trƣơng nở, kích thƣớc hạt tăng đáng kể so với hạt ban đầu [5].

5


1.2.1 Nhựa macroporous
Theo IUPAC, nhựa macroporous là các hạt có đƣờng kính lỗ xốp trong
khoảng từ 50 nm đến 1µm khi đƣợc ngâm trƣơng nở trong dung môi hoặc ở
trạng thái khô [26].
 Đặc tính hạt nhựa
Các đặc tính đặc trƣng cho khả năng hấp phụ của nhựa macroporous gồm:
tổng diện tích bề mặt, đƣờng kính lỗ xốp và độ phân cực bề mặt [16], [21].

Diện tích bề mặt hạt khá lớn, thƣờng nằm trong khoảng từ 100 đến 1000
m2/g. Diện tích bề mặt càng lớn, khả năng lƣu giữ các phân tử chất tan càng cao.
Đƣờng kính lỗ xốp khoảng từ 100 đến 300 nm. Sự phân tách là tốt nhất khi
đƣờng kính lỗ xốp gấp 2 - 6 lần kích thƣớc phân tử chất tan. Nếu đƣờng kính lỗ
xốp quá nhỏ thì quá trình chất hấp phụ đi vào trong lỗ xốp rất khó. Tuy nhiên,
nếu đƣờng kính lỗ xốp quá lớn thì phân tử chất tan sẽ dễ dàng đi qua bề mặt hấp
phụ. Bên cạnh đó, đƣờng kính lỗ xốp lớn sẽ làm giảm diện tích bề mặt hấp phụ
nên làm giảm dung lƣợng hấp phụ [5].
Các nhựa macroporous khá bền vững. Độ phân cực trải rộng từ không phân
cực cho tới phân cực phụ thuộc vào các monome sử dụng trong quá trình sản
xuất. Sự hấp phụ của mỗi loại nhựa macroporous còn phụ thuộc vào cấu trúc
hình học của nó và có thể kiểm soát bằng việc thay đổi các thành phần trong hỗn
hợp phản ứng trùng hợp [16], [21].
 Phân loại hạt nhựa:
Dựa vào độ phân cực, nhựa macroporous có thể đƣợc chia làm 2 loại chính:
không phân cực và phân cực. Theo độ phân cực lại chia thành phân cực yếu,
phân cực trung bình và phân cực mạnh. Hiện nay các nhựa macroporous thƣờng
đƣợc sử dụng gồm: A101, H103,… (không phân cực); AB-8, HPD722, …(phân
cực yếu); ADS-17, LSA-10,…(phân cực trung bình); NKA-9, NKA-2,… (phân
cực mạnh) [16], [21].
 Cơ chế hấp phụ

6


Nhựa macroporous có thể đƣợc sử dụng để hấp phụ một cách chọn lọc các
thành phần có trong dung dịch nƣớc thông qua lực tĩnh điện, tƣơng tác hydro,
lực VanderWaals, khả năng tạo phức,... [23].
Về nguyên tắc, khả năng hấp phụ một chất lên nhựa sẽ phụ thuộc vào khối
lƣợng phân tử, độ phân cực và cấu hình không gian của chất đó. Do vậy, mỗi

loại nhựa macroporous khác nhau sẽ phù hợp để làm giàu cho mỗi hợp chất khác
nhau. Việc lựa chọn ra loại nhựa phù hợp chủ yếu dựa vào đặc điểm của chất
nghiên cứu và nhựa hấp phụ cũng nhƣ đƣờng kính lỗ xốp và diện tích trên bề
mặt hạt nhựa. Việc hấp phụ hoạt chất thiên nhiên lên nhựa macroporous đặc biệt
hấp dẫn do các yếu tố nhƣ: thuận tiện, vận hành đơn giản, chi phí thấp và không
sử dụng dung môi hóa chất độc hại [16], [21].
1.2.2 Ứng dụng trong phân lập và làm giàu các hợp chất thiên nhiên
Hấp phụ là một trong những phƣơng pháp làm giàu hợp chất hiệu quả, giúp
sơ bộ loại bỏ tạp chất một cách tƣơng đối. Cho đến nay, phƣơng pháp hấp phụ
đang ngày càng trở nên phổ biến đặc biệt trong lĩnh vực dƣợc phẩm. Phƣơng
pháp này cũng đƣợc áp dụng thành công trong việc phân lập và làm giàu các
hợp chất có hoạt tính sinh học nhƣ phenolic, saponin, flavonoid, … [16]. Sau
đây là một số ví dụ về nghiên cứu ứng dụng nhựa macroporous trong làm giàu
các hợp chất từ thiên nhiên.
 Polyphenol/ flavonoid:
Năm 2007, Silva và cộng sự đã ứng dụng nhựa macroporous trong làm giàu
polyphenol ở loài Inga edulis. Nhóm tác giả đã đánh giá khả năng hấp phụ của
các polyphenol trên 4 loại nhựa XAD-7, XAD-16, EXA-90, EXA-118 và khảo
sát các yếu tố ảnh hƣởng nhƣ: hàm lƣợng nƣớc trong dịch chiết cồn, loại nhựa
sử dụng và pH. Kết quả cho thấy XAD-7 là nhựa thích hợp cho quá trình hấp
phụ polyphenol trong dịch chiết lá cây Inga edulis [25].
Trong một nghiên cứu khác ở Trung Quốc năm 2006, các tác giả đã tách và
làm giàu các thành phần flavonoid (luteolin, vitexin và isovitexin) có trong loài
Cajanus cajan. Để làm giàu luteolin trong dịch chiết của lá cây, Fu và cộng sự
7


đã đánh giá khả năng hấp phụ và phản hấp phụ lên 8 loại nhựa AB-8, NKA-9,
NKA-2, D3520, D101, H1020, H103 và AL-2. Kết quả, AL-2 là nhựa
macroporous cho khả năng hấp phụ luteonin tốt nhất tại pH = 5. Nhiều nghiên

cứu và báo cáo đã chỉ ra khả năng hấp phụ của 1 chất lên nhựa còn phụ thuộc
vào pH của dịch hấp phụ. Ứng dụng điều này để phân lập vitexin và isovitexin
trong lá cây Cajanus cajan, nhóm nghiên cứu của Fu đã thử khả năng hấp phụ
trên 8 nhựa macroporous khác (ADS-5, ADS-7, ADS-8, ADS-11, ADS-17,
ADS-21, ADS-31 và ADS-F8) ở những pH khác nhau. Kết quả cho thấy, tại pH
= 3,5 - 4, nhựa ADS-5 là macroporous thích hợp cho việc phân lập và làm giàu
vitexin và isovitexin [10].
Zhang và cộng sự cũng nghiên cứu làm giàu acid chlorogenic trong dịch
chiết hoa kim ngân (Lonicera japonica) bằng nhựa macroporous. Kết quả
nghiên cứu chỉ ra nhựa HPD-850 là phù hợp cho quá trình làm giàu acid
chlorogenic tại pH dịch chiết là 3,48. Hàm lƣợng hoạt chất tăng lên đáng kể từ
11,2% lên 50% với hiệu suất thu hồi 87,9% [32].
 Glycoside
Năm 2009, Ma và cộng sự đã phân lập và làm giàu salidroside - một
glycosid đƣợc tìm thấy trong dịch chiết cây Rễ vàng (Rhodiola rosea) [19]. Khả
năng hấp phụ, phản hấp phụ tĩnh và động học hấp phụ của salidroside đã đƣợc
nghiên cứu trên 5 loại nhựa macroporous: D101, HPD-200, AB-8, HPD-600 và
ADS-17. Dựa vào hiệu suất hấp phụ, nhựa macroporous HPD-200 đƣợc lựa
chọn để tối ƣu hóa quy trình làm giàu salidroside. Sau 2 lần hấp phụ và phản hấp
phụ từ dịch chiết thô, sản phẩm salidroside thu đƣợc có độ tinh khiết 92,2% với
hiệu suất thu hồi là 48,8%. Phƣơng pháp sử dụng nhựa macroporous để làm giàu
salidroside từ cây Rễ vàng đƣợc cho là có tính hiệu quả và kinh tế hơn so với
các phƣơng pháp thông thƣờng.
Năm 2000, scutellarin - một flavon glycosid trong cây Cúc hoa châu Phi
(Erigeron breviscapus) đã đƣợc Gao và cộng sự làm giàu một cách hiệu quả nhờ
sử dụng nhựa macroporous. Các loại hạt nhựa HPD-100, HPD-300, HPD-400,
8


HPD-450, HPD-500, HPD-600, HPD-700 và HPD-800 đã đƣợc nghiên cứu, và

kết quả chỉ ra rằng nhựa HPD-800 có hiệu suất hấp phụ và phản hấp phụ tốt
nhất. Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng, sau khi sử dụng nhựa HPD-800 để làm giàu
thì hàm lƣợng scutellarin trong dịch rửa giải tăng gần 16 lần so với dich chiết
ban đầu (từ 2,61 đến 41%) với hiệu suất thu hồi là 95% [12].
 Taxol/ taxoid
Paclitaxel và docetaxel là 2 taxol quan trọng mang hoạt tính chống ung thƣ.
Tuy nhiên việc chiết xuất và phân lập 2 hoạt chất này trong thực vật lại có hiệu
suất thấp. 10-DAB III và 7-xyl-10- DAT là 2 tiền chất của paclitaxel có nhiều
trong cây thƣờng xanh. Chính vì vậy, Fu và cộng sự năm 2008 đã tiến hành làm
giàu 2 tiền chất trên thay vì paclitaxel bằng ứng dụng nhựa macroporous. Bằng
việc khảo sát đánh giá khả năng hấp phụ của 10-DAB III và 7-xyl-10- DAT lên
7 loại nhựa macroporous (AB-8, ADS-17, ADS-21, ADS-31, ADS-8, H1020 và
NKA-II), các tác giả đã chỉ ra AB-8 cho hiệu quả tách và làm giàu hoạt chất tốt
nhất. Hàm lƣợng 10-DAB III và 7-xyl-10- DAT tăng cao lần lƣợt 62,4 và 8,5 lần
[9].
 Saponin
Năm 2008, Wan và cộng sự đã sử dụng 4 loại hạt nhựa macroporous: D101, DA- 201, DM-301 và DS-401 trong nghiên cứu làm giàu PTS (19, 20(S)protopanaxatriol saponin) và PDS (20, 20(S)-protopanaxadiol saponin) từ dịch
chiết rễ cây Nhân sâm (Panax pseudoginseng) [28]. Với khả năng hấp phụ tốt
nhất, nhựa DS-401 đƣợc sử dụng để tối ƣu quá trình làm giàu saponin trong rễ
cây nhân sâm trên săc kí cột. PTS và PDS đƣợc rửa giải tối ƣu với dung dịch
ethanol : nƣớc 30% và 80% (tt/tt). Sau khi đƣợc phân lập trên cột nhựa DS-401,
PTS và PDS thu đƣợc có độ tinh khiết là 88,2% và 92,6% với hiệu suất thu hồi
tƣơng ứng là 80,2% và 82,3%.
Năm 2008, G. Jia và cộng sự đã sử dụng nhựa macroporous để làm giàu
madecassosid và asiaticosid trong dịch chiết cây rau má (Centella asiatica) [14].
5 loại nhựa: HPD-100, HPD-300, X-5, AB-8 và D101 đƣợc nghiên cứu để đánh
9


giá khả năng hấp phụ, phản hấp phụ và tốc độ hấp phụ. Sau khi đƣợc lựa chọn,

nhựa HPD-100 sẽ đƣợc nạp lên cột và đánh giá các đặc tính hấp phụ và phản
hấp phụ động. Sau quá trình làm giàu, hàm lƣợng madecassosid và asiaticosid
trong dịch rửa giải đƣợc tăng lên từ 3,9% và 2,0% lên 39,7 và 21,5% (gấp hơn
10 lần so với dịch chiết ban đầu). Hiệu suất thu hồi sản phẩm là 70,4% và 72%.
 Carotenoid
Yang và cộng sự năm 2009 đã bắt đầu ứng dụng nhựa macroporous trong
làm giàu crocin (một carotenoid có trong loài Gardenia jasminoides, có vai trò
làm chất màu dùng trong thực phẩm). Nhóm tác giả đã đánh giá khả năng hấp
phụ của crocin lên 10 nhựa macroporous (XAD-1180, XAD-1600, EXA-32,
EXA-45, EXA-50, EXA-117, EXA-118, HP-20, AB-8 và HPD-100). Kết quả
nghiên cứu cho thấy khả năng hấp phụ chọn lọc crocin của các nhựa XAD-1180,
HP-20, HPD-100A và AB-8 vƣợt trội hơn so với các macroporous khác [31].
 Alcol béo
Du và cộng sự đã làm giàu solanesol trong dịch chiết của lá cây thuốc lá
cũng sử dụng nhựa macroporous. Nhóm tác giả cũng đánh giá khả năng hấp phụ
trên 5 loại nhựa SP207, SP700, SP825, SP850 và HP20. Kết quả cho thấy nhựa
SP850 cho hiệu suất hấp phụ cao nhất. Từ đó, tác giả cho thấy tiềm năng sử
dụng nhựa macroporous để làm giàu solanesol cũng nhƣ các ancol béo khác [8].
Tóm lại có thể thấy rằng các hạt nhựa macroporous có ƣu thế hơn so với
các chất hấp phụ truyền thống do chúng có khả năng làm giàu các chất mục tiêu
cao hơn đến 10 lần, độ bền cơ học cao, có thể tái sử dụng và ít sơ nƣớc. Bên
cạnh đó, dung dịch ethanol- nƣớc có thể đƣợc sử dụng để rửa giải các chất mục
tiêu từ nhựa. Nhƣ vậy, việc sử dụng nhựa macroporous đƣợc coi là một kỹ thuật
―xanh‖ trong làm giàu các hợp chất từ thiên nhiên không sử dụng các dung môi
hữu cơ độc hại.
1.3 Một số phƣơng pháp chiết xuất và làm giàu catechin từ lá chè xanh
Hiện nay, các phƣơng pháp chiết xuất và làm giàu catechin từ chè xanh chủ
yếu gồm: chiết bằng dung môi, kết tủa bằng muối, phƣơng pháp sắc ký và sử
10

dụng chất hấp phụ. Mỗi phƣơng pháp sẽ phù hợp với những yêu cầu khác nhau
của chế phẩm.
 Phương pháp chiết bằng dung môi
Từ lâu, các phƣơng pháp chiết xuất các hợp chất catechin chè xanh bằng
dung môi đƣợc áp dụng rộng rãi trên thế giới. Quá trình chiết xuất thƣờng đƣợc
tiến hành trong bình chiết có khuấy và bộ phận gia nhiệt. Dƣợc liệu đƣợc nạp
vào bình chiết cùng với nƣớc (tỷ lệ 1:10, tt/tt). Hỗn hợp chiết đƣợc điều chỉnh
pH về khoảng 3, sau đó gia nhiệt đến 80 - 85°C và duy trì khuấy liên tục trong 3
- 4 giờ. Sau thời gian quy định, hỗn hợp chiết đƣợc làm nguội về nhiệt độ
phòng, lọc bỏ bã và thu lấy phần dịch chiết. Để loại bỏ các tạp màu và cafein,
dịch chiết đƣợc chiết phân bố với cloroform 3 lần (tỷ lệ 1:3, tt/tt). Phần dịch
nƣớc sau đó đƣợc thu lại tiếp tục đƣợc chiết phân bố 3 lần, mỗi lần với ethyl
acetat theo tỷ lệ 3:5 (tt/tt). Các dịch chiết ethyl acetat đƣợc gộp lại, cất loại dung
môi thu đƣợc bột catechin [1].
 Phương pháp kết tủa catechin bằng muối
Để hạn chế sử dụng cloroform, một dung môi độc hại với con ngƣời và môi
trƣờng, năm 1996 Yang và Wang đã sử dụng AlCl3 để kết tủa catechin trong
dịch chiết chè xanh. Tuy nhiên chỉ với một lần kết tủa bằng AlCl3, phƣơng pháp
của Yang và Wang không loại bỏ đƣợc lƣợng cafein dồi dào trong lá chè. Năm
2006, Zhen-Yu Chen, Shu Wang và các cộng sự đã tối ƣu hóa phƣơng pháp trên
để tăng hàm lƣợng catechin cũng nhƣ giảm hàm lƣợng cafein bằng việc tủa 2 lần
với AlCl3. Cụ thể, lá chè khô đƣợc chiết với nƣớc ở 80°C trong vòng 1 giờ. Sau
đó, hỗn hợp đƣợc làm nguội về nhiệt độ phòng và thu dịch chiết. Dịch chiết
đƣợc bổ sung AlCl3 lần thứ nhất và điều chỉnh pH về 5,5 bằng dung dịch
NaHCO3 và để yên trong 1 giờ cho tủa hoàn toàn các catechin. Phần kết tủa sẽ
đƣợc hòa tan lại bằng dung dịch H3PO4 4%, dung dịch tạo thành đem chiết phân
bố với ethyl acetat. Làm bay hơi ethyl acetat thu đƣợc cắn chứa catechin. Cắn lại
đƣợc hòa tan vào nƣớc, bổ sung AlCl3 lần 2 và lặp lại quy trình nhƣ trên. Trong
nghiên cứu này, các tác giả còn khảo sát các yếu tố để tăng tối đa hàm lƣợng

11


catechin trong cắn thu đƣợc nhƣ lƣợng AlCl3, pH, nhiệt độ hỗ hợp kết tủa. Kết
quả catechin thu đƣợc trong cắn chiếm hơn 90%, EGCG chiếm hơn 60%. Tuy
nhiên phƣơng pháp này trải qua nhiều công đoạn khiến cho hiệu suất thu hồi
catechin giảm và chƣa thể tách riêng biệt đƣợc các catechin trong hỗn hợp. Các
catechin có giá trị cao nhƣ EGCG chƣa đƣợc sản xuất với độ tinh khiết cao [6].
 Phương pháp sắc ký lọc gel
Kỹ thuật tách sắc ký đã đƣợc sử dụng để tách riêng biệt các thành phần
trong hỗn hợp catechin chè xanh, ví dụ nhƣ để sản xuất EGCG - một chất có giá
trị lớn nhất trong hỗn hợp catechin với hàm lƣợng cao. Năm 1981, Fumio Okada
và đồng nghiệp sản xuất EGCG bằng phƣơng pháp sắc ký lọc gel Sephadex từ
dịch chiết nguyên liệu chè. Sau khi dịch chè đƣợc hấp phụ hoàn toàn trên cột sắc
ký, tác giả dùng hệ dung môi rửa giải n-buthyl alcohol/acetone/nƣớc (4:1:2,
tt/tt/tt) để tách riêng biệt các catechin. EGCG sẽ thu đƣợc sau khi kết tinh ở phân
đoạn rửa giải tƣơng ứng, ngoài ra còn thu đƣợc các sản phẩm phụ nhƣ cafein và
acid gallic. Các phƣơng pháp sắc ký trên có thể thu hồi EGCG một cách nhanh
chóng và tiến hành sản xuất liên tục thông qua quy trình tách chiết đơn giản.
Dung môi ít độc hại tới sức khỏe và môi trƣờng, có thể thu hồi đƣợc. Tuy nhiên
với phƣơng pháp này, hệ thống thiết bị yêu cầu đòi hỏi công nghệ kỹ thuật cao,
chỉ phù hợp với các nƣớc phát triển [11].
 Phương pháp sử dụng các chất hấp phụ
Xu hƣớng mới trong công nghệ làm giàu các hợp chất tự nhiên ngày nay là
sử dụng các chất hấp phụ. Các chất hấp phụ thƣờng đƣợc sử dụng nhƣ: than hoạt
tính, nhựa macroporous, lignocellulose,…. Nhìn chung, các phƣơng pháp này
thƣờng đơn giản, không sử dụng dung môi hữu cơ độc hại, có thể nâng cấp trên
quy mô công nghiệp, chi phí thấp, phù hợp với các nƣớc đang phát triển nhƣ ở
Việt Nam.
Năm 2013, Yongfeng Liu và cộng sử đã tiến hành khảo sát khả năng hấp

phụ của polyphenol chè (trong đó chủ yếu là các catechin) trên 10 nhựa
macroporous (GS-1, GS-2, GS-3, GS-4, GS-5, GS-6, GS-7, GS-8, GS-9, và GS12


18). Kết quả cho thấy GS-18 có khả năng hấp phụ tốt nhất và đƣợc sử dụng để
làm giàu chất nghiên cứu. Một số các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình làm giàu
lên nhựa GS-18 cũng đƣợc tác giải nghiên cứu nhƣ nồng độ dịch hấp phụ, tốc độ
nạp dịch, dung môi rửa giải và nhiệt độ,…. Sau khi tối ƣu các thông số trên, hàm
lƣợng các catechin chè xanh tăng lên khoảng 3 lần [17]. Năm 2015, Marija D.
và các đồng nghiệp đã thu hồi EGCG từ dịch chiết chè xanh bằng cách dùng cột
hấp phụ chứa than hoạt tính. EGCG có khả năng hấp phụ chọn lọc trên than hoạt
và dễ dàng rửa giải bằng ethanol 20%. Gần đây, chất hấp phụ dùng nhựa
macroporous đƣợc sử dụng rộng rãi do chúng có thể tách chiết đƣợc nhiều loại
hợp chất khác nhau nhƣ polyphenol, glycoside và carotenoid. Năm 2013, Xin
Zhang và công sự đã nghiên cứu khả năng hấp phụ của các catechin chè xanh
lên 8 loại nhựa macroporous bao gồm: AB-8, D101, S-8, HP-20, D-3520,
polyamide, DM-130, NKA-II và chỉ ra rằng nhựa polyamide có khả năng hấp
phụ chọn lọc với các catechin (EGCG, EGC, ECG và EC). Bên cạnh đó các yếu
tố ảnh hƣởng tới khả năng hấp phụ của catechin chè xanh cũng đƣợc các tác giả
nghiên cứu nhƣ tốc độ dòng, pH, nồng độ dịch chiết, dung môi rửa giải. Hàm
lƣợng catechin trong dịch chiết đƣợc tăng lên đáng kể, lên tới hơn 90%. Nhƣ
vậy, có thể thấy đƣợc tiềm năng sử dụng các nhựa macroporous trong làm giàu
các catechin từ chè xanh [33].
EGCG là chất chiếm hàm lƣợng lớn nhất trong tổng lƣợng catechin có
trong lá chè, đƣợc coi là hoạt chất có giá trị lớn trong số các catechin do mang
hoạt tính cao nhất. Vì vậy việc nghiên cứu chiết tách và làm giàu catechin cũng
nhƣ EGCG trong chè xanh mang lại giá trị và ý nghĩa quan trọng. Trong đề tài
này, chúng tôi sẽ tiến hành nghiên cứu để lựa chọn ra loại nhựa macroporous
phù hợp, ứng dụng trong việc chiết tách và làm giàu catechin trong lá chè. Hàm
lƣợng catechin đƣợc đánh giá thông qua việc định lƣợng EGCG có trong mẫu.

Do có 8 nhóm OH cùng 4 vòng benzen trong cấu trúc nên 2 nhựa macroporous
D101 và HPD826 đều có khả năng hấp phụ EGCG trong chè xanh.

13


CHƢƠNG 2: NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ
PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị
2.1.1 Nguyên liệu
Nguyên liệu chè:
Nguồn gốc: Lá chè tƣơi thu mua tại Thái Nguyên vào tháng 11 năm 2017
và đƣợc giám định tại bộ môn Thực Vật – Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội.
Xử lý nguyên liệu: Lá chè đƣợc sấy khô ở 50°C trong tủ sấy tĩnh tới khi
hàm ẩm đạt dƣới 5%. Sau đó, lá chè đƣợc xay thành bột thô và bảo quản trong
túi kín.
Hạt nhựa macroporous:
Nguồn gốc: Nhựa macroporous D101 mua của công ty Anhui sanxing resin
technology và HPD826 đƣợc mua của công ty Bonchem Co, Ltd có xuất xứ
Trung Quốc.
Xử lý nhựa: Ngâm nhựa macroporous với ethanol 96% trong 24 giờ. Loại
bỏ lớp váng bần trên lớp dung môi sau đó rửa hạt nhựa nhiều lần bằng nƣớc cất.
Tiếp tục ngâm các nhựa macroporous với nƣớc cất trong 24 giờ. Sau đó lọc rửa
hạt nhựa trên phễu lọc Bunchner. Nhựa thu đƣợc bảo quản trong lọ thủy tinh có
nắp đậy kín.
Bảng 2.1: Đặc điểm của nhựa D101 và HPD826*
Đặc điểm

Nhựa D101

Nhựa HPD826

Cấu trúc

Styren

Liên kết Hydro

Diện tích bề mặt (m2/g)

400

500-600

Đƣờng kính lỗ xốp (nm)

10,0-11,0

9,0-10,0

Kích thƣớc hạt (mm)

0,3-1,3

0,3-1,3

Độ phân cực

Không phân cực

Phân cực

*: Số liệu do nhà sản xuất cung cấp.

14


2.1.2 Hóa chất
Bảng 2.2: Các hóa chất dùng trong thí nghiệm.
STT

Tên hóa chất

Tiêu chuẩn

Nguồn gốc

chất lƣợng

Chất chuẩn
1.

EGCG chuẩn

Trung Quốc

Hàm lƣợng 99,78%

Dung môi
2.

Methanol

Merck (Đức)

Tiêu chuẩn HPLC

3.

Acid phosphoric đặc

Trung Quốc

Tinh khiết hóa học

4.

Ethyl acetat

Trung Quốc

Tinh khiết hóa học

5.

Acid formic

Trung Quốc

Tinh khiết hóa học

6.

Acid acetic

Trung Quốc

Tinh khiết hóa học

7.

Acid citric

Trung Quốc

Tinh khiết hóa học

8.

Ethanol 96%

Việt Nam

Tinh khiết hóa học

2.1.3 Thiết bị thí nghiệm
 Thiết bị
- Tủ sấy MEMMERT (Đức)
- Cân phân tích Mettler Toledo AB204-S (Thụy Sỹ)
- Hệ thống máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Shimadzu (Nhật Bản)

- Máy cất quay Buchi B490 và R220 (Thụy Sỹ)
- Máy lắc ngang IKA KS-125 (Đức).
- Máy phun sấy B-290 Buchi (Thụy Sỹ)
 Dụng cụ
- Bình nón 100 ml, 250 ml
- Bình định mức 25 ml, 50 ml, 100 ml.
15


- Màng lọc thô cellulose; màng lọc cellulose acetat 0,45µm.
- Cột thủy tinh
- Cốc có mỏ, pipet, ống đong.
2.2 Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu ảnh hƣởng một số yếu tố lên quá trình hấp phụ và phản hấp
phụ nhƣ: loại nhựa sử dụng, nồng độ và pH dịch hấp phụ, nồng độ ethanol
rửa giải.
- Nghiên cứu khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng đến sự hấp phụ và phản hấp
phụ lên cột nhựa macroporous.
- Lựa chọn các thông số khảo sát tối ƣu, xây dựng phƣơng pháp làm giàu
catechin.
2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1 Phương pháp định lượng EGCG
Lựa chọn chất đánh dấu cho hỗn hợp các catechin là EGCG. Tiến hành
định lƣợng EGCG bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao. Tham khảo tài
liệu [29] và thực nghiệm, các điều kiện sắc ký đƣợc lựa chọn nhƣ sau:
- Cột sắc ký: Supelcosil C18 (250 × 4,60 mm; 5 µm), cột bảo vệ RP18.
- Pha động: Methanol - nƣớc - acid phosphoric (20 : 79,9 : 0,1; tt/tt/tt).
Lọc đệm qua màng lọc có kích thƣớc lỗ lọc 0,45µm.
- Tốc độ dòng: 0,8 ml/phút.
- Thể tích tiêm mẫu: 20 µl

- Detetor UV: bƣớc sóng 280 nm.
Chuẩn bị mẫu:
Mẫu thử (cao thô, cao làm giàu): Cân chính xác một lƣợng mẫu thử tƣơng
đƣơng chứa khoảng 10 mg EGCG chuẩn vào bình định mức 50 ml. Thêm 10 ml
nƣớc cất, siêu âm 15 phút cho tan hoàn toàn. Sau đó, bổ sung nƣớc cất đến vạch
và lắc đều.

16


Mẫu chuẩn: Cân chính xác khoảng 10 mg EGCG chuẩn vào bình định mức
50 ml. Thêm 10 ml nƣớc cất lắc hòa tan hoàn toàn. Sau đó bổ sung nƣớc cất đến
vạch và lắc đều.
Các mẫu thử và mẫu chuẩn đƣợc lọc qua màng 0,45µm trƣớc khi tiêm mẫu.
Nồng độ EGCG trong mẫu thử đƣợc xác định nhƣ sau:

Trong đó:
Ct: nồng độ dung dịch thử; Cc: nông độ dung dịch chuẩn; St và Sc lần lƣợt
là diện tích peak thử và peak chuẩn.
2.3.2 Phương pháp định tính EGCG
EGCG trong các mẫu thử đƣợc định tính bằng phƣơng pháp sắc ký lớp
mỏng.
Tham khảo tài liệu [27] và thực nghiệm, điều kiện sắc ký lớp mỏng đƣợc
lựa chọn nhƣ sau:
- Bản mỏng Silicagel 60F254 của Merck: Hoạt hóa ở 110°C trong 30 phút.
- Dung môi khai triển: ethyl acetat : nƣớc: acid formic: acid acetic băng
(70:30:3:2, tt/tt/tt/tt), lấy lớp dung môi phía trên.
- Chất chuẩn: EGCG chuẩn nồng độ 100 µg/ml
- Phát hiện vết dƣới bƣớc sóng 254 nm.
Tiến hành khai triển sắc ký các mẫu dịch sau qua cột trên cùng một bản mỏng

với điều kiện nhƣ trên.
2.3.3 Tạo cao khô từ chè xanh
Quá trình chiết xuất đƣợc thực hiện trong bình chiết có bộ phận gia nhiệt.
Tham khảo tài liệu [4] và thực nghiệm, quy trình chiết xuất đƣợc tiến hành nhƣ
sau: Nạp 1kg bột dƣợc liệu vào bình chiết. Bổ sung thêm 2 lít dung dịch ethanol
40%, gia nhiệt đến 70°C và duy trì trong 1 giờ. Sau thời gian quy định, rút dịch
chiết. Phần bã tiếp tục thêm 2 lít dung môi, chiết lặp lại 2 lần theo quy trình trên.

17