Nghiên cứu thành phần hóa học của cây bát giác liên (dysosma difformis)

BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

MAN THANH LONG

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC
CỦA CÂY BÁT GIÁC LIÊN
(DYSOSMA DIFFORMIS)
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

HÀ NỘI 2018


BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

MAN THANH LONG
Mã sinh viên: 1301253

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC
CỦA CÂY BÁT GIÁC LIÊN
(DYSOSMA DIFFORMIS)
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

Người hướng dẫn:
1.PGS.TS. Bùi Hồng Cƣờng
2.DS. Nguyễn Thị Dung
Nơi thực hiện:
1.Viện Dƣợc liệu
2.Bộ môn Dƣợc học cổ truyền

HÀ NỘI 2018


Lời cảm ơn
Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Bùi Hồng Cường – Phó trưởng bộ môn Dược
học cổ truyền, Trường Đại học Dược Hà Nội và DS. Nguyễn Thị Dung – Trường Đại
học Y Dược Hải Phòng đã trực tiếp hướng dẫn, tận tình giúp đỡ và tạo điều kiện thuận
lợi để tôi có thể nghiên cứu và hoàn thành khóa luận này.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới PGS.TS. Phương Thiện Thương –Trưởng khoa Hóa
phân tích và tiêu chuẩn, Viện Dược liệu, Bộ Y tế và DS. Phạm Giang Nam, cùng các
anh chị nghiên cứu viên của khoa Hóa phân tích và tiêu chuẩn, Viện Dược liệu đã
giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình định hướng nghiên cứu và làm thực nghiệm.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô công tác tại Bộ môn Dược học cổ truyền đã
giúp đỡ, tạo điều kiện tốt nhất để tôi có thể hoàn thành khóa luận này.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến tất cả quý thầy cô Trường Đại học Dược Hà Nội đã
dạy dỗ, trang bị kiến thức cho tôi trong suốt 5 năm theo học tại trường.
Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè, đồng nghiệp luôn bên
cạnh, động viên và giúp đỡ tôi trong thời gian qua.
Hà Nội, ngày 10 tháng 5 năm 2018
Sinh viên

Man Thanh Long


MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC BẢNG
DANH MỤC HÌNH
ĐẶT VẤN ĐỀ................................................................................................................. 1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN ......................................................................................... 2

1.1. Tổng quan về chi Dysosma ................................................................................. 2
1.1.1. Về vị trí phân loại........................................................................................... 2
1.1.2. Về đặc điểm thực vật chung .......................................................................... 2
1.1.3. Về thành phần hóa học ................................................................................. 2
1.1.4. Về tác dụng sinh học và độc tính .................................................................. 5
1.1.5. Về tác dụng, công dụng và một số bài thuốc trong YHCT .......................... 8
1.2. Tổng quan về cây Bát giác liên (Dysosma difformis) ...................................... 10
1.2.1. Về vị trí phân loại......................................................................................... 10
1.2.2. Về đặc điểm thực vật và phân bố ................................................................ 10
1.2.3. Về thành phần hóa học ............................................................................... 11
1.2.4. Về tác dụng sinh học ................................................................................... 13
1.2.5. Về công dụng và bài thuốc trong YHCT..................................................... 13
CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 15
2.1. Nguyên liệu nghiên cứu và phƣơng tiện nghiên cứu...................................... 15
2.1.1. Nguyên liệu .................................................................................................. 15
2.1.2. Phương tiện nghiên cứu .............................................................................. 15
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu.................................................................................. 16
2.2.1. Phương pháp chiết xuất cao toàn phần và phân đoạn .............................. 16
2.2.2. Nghiên cứu về thành phần hóa học ............................................................ 16
CHƢƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ................................. 19
3.1. Kết quả chiết xuất cao toàn phần và phân đoạn ............................................ 19
3.1.1. Chiết xuất ..................................................................................................... 19
3.2. Phân lập và xác định cấu trúc một số hợp chất trong phân đoạn ethyl
acetat từ dịch chiết Bát giác liên. ............................................................................ 20
3.2.1. Phân lập một số hợp chất từ cắn ethyl acetat ............................................. 20
3.2.2. Kiểm tra độ tinh khiết chất phân lập .......................................................... 22


3.2.3. Xác định các hợp chất phân lập
được ........................................................25

3.3. Bàn luận .............................................................................................................31
3.3.1. Về chiết xuất cao toàn phần và phân đoạn từ Bát giác liên ......................31
3.3.2. Về phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất .........................................31
KẾT LUẬN ..................................................................................................................34
KIẾN NGHỊ .................................................................................................................34
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

d: Doublet
dd: Doublet of doublet
DEPT: Distortionless Enhancement by Polarization Transfer
ESI-MS: Khối phổ phương pháp phun sương tĩnh điện áp suất thường
Hz: Hertz
m/z: Mass to charge ratio
m: Multiplet
MeOH: Methanol
mp: Nhiệt độ nóng chảy (melting point)
NMR: Cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance)
NXB: Nhà xuất bản
PĐ: Phân đoạn
s: Singlet
SKLM: Sắc ký lớp mỏng
t: Triplet
TLTK: Tài liệu tham khảo
TT: Thuốc thử
UV: Phổ tử ngoại (Ultra Violet Spectroscopy)
v/v: Thể tích trên thể tích

YHCT: Y học cổ truyền
δ: Độ dịch chuyển hóa học


DANH MỤC BẢNG

TRANG

Bảng 1.1. Các chất phân lập được từ một số loài Dysosma

3

Bảng 1.2. Công dụng của một số loài Dysosma

9

Bảng 3.1. Khối lượng các cắn phân đoạn dịch chiết ethanol

19

Bảng 3.2. Kết quả SKLM của 2 chất với 3 hệ dung môi

24

Bảng 3.3. Đối chiếu phổ 13C-NMR, 1H-NMR của hợp chất 1 với dữ liệu

25

Bảng 3.4. Đối chiếu phổ 13C-NMR, 1H-NMR của hợp chất 2 với dữ liệu

28


DANH MỤC HÌNH

TRANG

Hình 1.1. Một số hợp chất lignan trong một số loài Dysosma

4

Hình 1.2. Cây bát giác liên (Dysosma difformis)

11

Hình 1.3. Một số thành phần hóa học có trong Bát giác liên (Dysosma

12

difformis)
Hình 2.1. Mẫu bát giác liên nghiên cứu

15

Hình 2.2. Sơ đồ chiết xuất mẫu nghiên cứu

18

Hình 3.1. Sơ đồ chiết xuất và phân đoạn từ Bát giác liên

20

Hình 3.2. Sắc ký đồ của cắn ethyl acetat (EtOAc) và 7 phân đoạn

21

Hình 3.3. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ phân đoạn ethyl acetat

22

Hình 3.4. Sắc ký đồ của PĐ2, hợp chất 2, PĐ1, hợp chất 1 hệ I

23

Hình 3.5. Sắc ký đồ của PĐ2, hợp chất 2, PĐ1, hợp chất 1 hệ II

23

Hình 3.6. Sắc ký đồ của PĐ2, hợp chất 2, PĐ1, hợp chất 1 hệ III

24

Hình 3.7. Hợp chất 1 phân lập được

26

Hình 3.8. Cấu trúc hóa học và phổ NMR của hợp chất 1

27

Hình 3.9. Hợp chất 2 phân lập được

39

Hình 3.10. Cấu trúc hóa học và phổ NMR của hợp chất 2

30


ĐẶT VẤN ĐỀ
Việt Nam là nước có khí hậu nhiệt đới gió mùa, với độ ẩm cao, lượng mưa lớn,
vì vậy thảm thực vật phát triển vô cùng phong phú với trên 12000 loài thực vật trong
đó 4000 loài có khả năng sử dụng làm thuốc. Với hệ thực vật đa dạng như vậy, chúng
không những cung cấp nguồn thực phẩm dồi dào mà còn cho chúng ta nguồn thuốc
chữa bệnh quý giá. Xu hướng đi sâu nghiên cứu và tìm kiếm các hoạt chất tự nhiên có
hoạt tính sinh học cao từ các loài thực vật làm dược phẩm chữa bệnh đang ngày càng
thu hút được sự quan tâm của các nhà khoa học bởi ưu điểm của chúng là độc tính
thấp, dễ hấp thu và chuyển hóa trong cơ thể.
Cây bát giác liên còn gọi là cây độc cước liên, độc diệp nhất chi hoa, cước diệp,
…, có tên khoa học là Dysosma difformis (tên đồng nghĩa là Podophyllum tonkinense
Gagnepain), phân bố chủ yếu ở một số tỉnh của Trung Quốc (Quảng Tây, Quý Châu,
Hồ Nam, …) và Việt Nam (Lai Châu, Lào Cai, Yên Bái,...) [8]. Ở Trung Quốc, cây bát
giác liên được sử dụng trong Y học cổ truyền với công dụng chữa rắn cắn, sưng tấy, áp
xe vú, nhọt độc, đờm ho [5], [8]. Toàn cây bát giác liên được dùng làm thuốc trừ
phong, tiêu viêm, giải độc, tiêu phù, sát trùng với nhiều bài thuốc quý [34], [48]. Ở
Việt Nam, cây bát giác liên được dùng chủ yếu dựa vào kinh nghiệm dân gian. Đặc
biệt, người dân ở một số địa phương đã dùng bát giác liên cùng với hoàng đỗ quyên và
tử bối kì trong một bài thuốc để chữa ung thư vú [8].
Nhằm tạo cơ sở khoa học cho việc khai thác, nghiên cứu và nâng cao giá trị sử
dụng loài dược liệu này, đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học của cây bát giác

liên (Dysosma difformis)” được thực hiện với mục tiêu sau:
- Chiết xuất, phân lập 1-2 chất tinh khiết từ phần dưới mặt đất của loài Bát giác
liên (Dysosma difformis) thu hái ở Sa Pa, Lào Cai.
- Xác định cấu trúc của các hợp chất phân lập được.

1


CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về chi Dysosma
1.1.1. Về vị trí phân loại
Theo khung phân loại ngành Ngọc lan, vị trí phân loại của chi Dysosma được
thể hiện như sau [1], [3]:
Giới thực vật: Plantae
Ngành Ngọc lan: Magnoliophyta
Lớp Ngọc lan: Magnoliosida
Bộ Hoàng liên: Ranunculales
Họ Hoàng liên gai: Berberidaceae
Chi: Dysosma
Theo Shaw, chi Dysosma được bao gồm trong chi Podophyllum [25], nên theo
nhiều công bố gần đây, một số loài thuộc chi Podophyllum được sắp xếp thuộc chi
Dysosma.
1.1.2. Về đặc điểm thực vật chung
Cây thảo, sống lâu năm. Thân rễ bò, nhiều mấu, nhiều rễ con. Phần trên mặt đất
thẳng, có lá bắc lớn bao quanh gốc. Lá hình khiên, xẻ sâu hoặc chia 3-9 thùy. Hoa mọc
thành cụm hoặc chùm tán. Lá đài 6, thoái hóa. Cánh tràng 6, màu đỏ tía. Cuống hoa rủ
xuống, chiều dài như nhau. Bao phấn hướng trong, tự khai. Nhụy hoa đơn độc, bầu 1
ô, nhiều lá noãn, đầu nhụy hình cầu. Quả mọng màu đỏ hoặc tím đỏ. Hạt nhiều, phần
thịt quả ít [25].
1.1.3. Về thành phần hóa học

Các lignan được tìm thấy nhiều trong giới thực vật. Tuy nhiên, nhóm
aryltetralin chỉ được tìm thấy trong một vài họ thực vật. Chi Dysosma là một nguồn
nguyên liệu phong phú của các lignan nhóm 1-aryltetralin, nhóm hoạt chất có hoạt tính
chống ung thư mạnh. Ngoài ra, một số nhóm chất có hoạt tính sinh học khác cũng đã
được tìm thấy và phân lập từ dịch chiết của một số loài Dysosma bao gồm: flavonoid,
alkaloid, steroid, chất nhựa,…
Tóm tắt các chất đã phân lập được từ một số loài Dysosma được trình bày trong
bảng 1.1 và hình 1.1.

2


Bảng 1.1. Các chất phân lập được từ một số loài Dysosma
Bộ
Tên loài

Các chất đã phân lập đƣợc

phận

TLTK

dùng
Dysosma

Rễ,

podophyllotoxin, 4´-demethylpodophyllotoxin,

emodi

thân rễ

podophyllotoxin

[45]

glucosid,

(Podophyllum

deoxypodophyllotoxin,

hexandrum)

dimethylpodophyllotoxin

4´glucosid,

4´-

demethylisopicropodophyllon,
podophyllotoxon,

picropodophyllotoxin,

isopicropodophyllon,

4´-

demethyldeoxypodophyllotoxin, α-peltatin, βpeltatin, kaempferol, quercetin.
Dysosma

Rễ,

Dysosmarol,

pleiantha

thân rễ

glucoside,

4´-demethylpodophyllotoxin

[34]

podorhizol-β-D-glucoside,

(Podophyllum

podophyllotoxin

glucoside,

pleianthum)

demethylpodophyllotoxin, podophyllotoxin, 4´demethyldeoxy

4´-

podophyllotoxin,

dehydropodophyllotoxin,

diphyllin,

podophyllotoxone, quercetin, quercetin 3-Oglucopyranoside, kaempferol, kaempferol 3-Oglucopyranoside, acacetin.
Dysosma

Rễ

podophyllotoxin,

α-peltatin,

versipellis

podophyllotoxin

(Podophyllum

demethylpodophyllotoxin,

versipelle)

deoxypodophyllotoxin,

[22],

4´-

[30],

glucosid,

[53]
4´-

demethyldeoxypodophyllotoxin,
podophyllotoxon,
glucosid,

β-peltatin,

diphyllin,

picropodophyllotoxin-4-O-

cleistanthin

B,

demethylpodophyllotoxin-4-O-glucosid,

3

4´-

picropodophyllotoxin-4-O-β-D-glucopyranosyl
(1→6)-β-D-glucopyranosid,
quercetin,

daucosterol,

quercetin-3-O-β-D-glucopyranosid,

kaempferol,

kaempferol-3-O-β-D-

glucopyranosid, β-sitosterol.
Dysosma

Thân

Sikkimotoxin.

[13]

aurantiocaulis rễ
(Podophyllum
sikkimense)

R2

R1

Podophyllotoxin: R1=OH, R2=H, R3=CH3

O
O
O

4´-Demethylpodophyllotoxin R1=OH, R2=H, R3=H
Deoxypodophyllotoxin: R1=H, R2=H, R3=CH3

O

4´-Demethyldeoxypodophyllotoxin: R1=H, R2=H, R3=H
H3CO

OCH3
OR3

O

OH

O

O

O

O

O

O

O

O

H3CO

H3CO

OCH3

OCH3
OR

OR

α-peltatin: R=H

Podophyllotoxon: R=CH3

β-peltatin: R=CH3

4´-Demethylpodophyllotoxon: R=H

Hình 1.1. Một số hợp chất lignan trong một số loài Dysosma

4

1.1.4. Về tác dụng sinh học và độc tính
1.1.4.1. Tác dụng sinh học
Theo các nghiên cứu đã công bố gần đây thì chi Dysosma có nhiều tác dụng
sinh học sau:
 Tác dụng chống ung thư
Nghiên cứu của Sheng Hu và cộng sự (2015) đã chứng minh tác dụng chống
ung thư của deoxypodophyllotoxin (DPPT) đối với tế bào PCa người DU-145 (tế bào
ung thư tuyến tiền liệt). Dữ liệu cho thấy rằng DPPT làm giảm đáng kể sự gia tăng của
tế bào và kích hoạt mức biểu hiện của caspase-3 (một protease tham gia vào quá trình
phân hủy ADN) do sự gia tăng chết tế bào theo chương trình (apoptosis) trong các tế
bào DU-145. Ngoài ra, điều trị với DPPT còn làm giảm đáng kể mức phosphoryl hóa
Akt và kích hoạt đường dẫn tín hiệu XEN (Bax)/phosphatase và Tensin homolog
(PTEN) trong các tế bào DU-145 [26].
Ngoài ra, từ chất podophyllotoxin, các nhà khoa học đã cải tiến cấu trúc, tạo ra
một loạt các chất có hoạt tính tốt trên lâm sàng như etoposid, teniposid. Etoposid là
một chất chống ung thư hiệu quả và được sử dụng trong lâm sàng để điều trị ung thư
phổi tế bào nhỏ, ung thư tinh hoàn và ung thư biểu mô lymphô, thường sử dụng trong
các liệu pháp kết hợp với các thuốc chống ung thư khác. Teniposid có đặc tính chống
ung thư tương tự etoposid, có vai trò quan trọng trong điều trị bệnh thần kinh ở trẻ em
[17].
 Tác dụng chống oxy hóa
Nghiên cứu trên in vitro của Showkat Ahmad và cộng sự (2013) đã cho thấy cao
chiết n-hexan của Dysosma emodi (Podophyllum hexandrum) có khả năng thu dọn tốt
đối với các gốc tự do DPPH, O2•, OH• và H2O2. Mức độ ảnh hưởng của cao chiết nhexan của Dysosma emodi tương đương với tác dụng chống oxy hóa của vitamin E
[21].
Nghiên cứu của Mengfei Li cùng cộng sự (2012) cho thấy cao chiết từ rễ
Dysosma emodi có khả năng chống oxy hoá cao hơn cao chiết từ các bộ phận khác
trong các thử nghiệm DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) và FRAP (Ferric
reducing/antioxidant power). Các thành phần như PADE (acid phthalic, ester

5


diisobutyl ester), BADE (1,2-benzendicarboxylic acid, ester diisooctyl), Polyneuridin,
PODD (Deoxypodophyllotoxin), β-sitosterol và POD (Podophyllotoxin) có khả năng
chống oxy hoá ở một mức độ nhất định. PODD, POD và Polyneuridin có khả năng
chống oxy hoá mạnh hơn với các giá trị IC50 và FRAP là 9,61 ± 0,81 và 2923,98 ±
21,89 μM; 9,98 ± 0,24 và 2847,27 ± 14,82 μM; 13,37 ± 0,35 và 2404,32 ± 36,88 μM
so với chất đối chứng ASA (Ascorbic acid) với các giá trị là 60,78 ± 1,22 và 1267,5 ±
30,24 μM ( p< 0,01) [40].
 Tác dụng kháng virus
Việc điều tra hoạt tính kháng virus của các lignan phân lập từ các loài Dysosma
bắt đầu bằng việc sử dụng một dịch chiết cồn chống lại chứng chuột bạch (một loại
bệnh do papillomavirus gây ra) [37]. Bedows và Hatfield đã chỉ ra rằng
podophyllotoxin, deoxypodophyllotoxin, và β-peltatin có hoạt tính chống lại virus sởi
(virus ARN) và virus Herpes simplex I (HSV-I, virus ADN). Họ đề xuất rằng hoạt tính
này có thể là do sự phá vỡ các tế bào vi khuẩn gây cản trở sự nhân lên của virus [12].
Ngoài ra, một số dẫn chất podophyllotoxin từ dịch chiết của một số loài
Dysosma cho thấy sự ức chế sự sao chép của HIV do ức chế virus sao chép ngược
[10]. Macrae và cộng sự đánh giá hoạt tính kháng virus của podophyllotoxin, αpeltatin, và diphyllin trên Cytomegalovirus murin (MCMV, virus ADN) và virus
Sindbis (virus ARN). Podophyllotoxin (241 nM) và α-peltatin (250 nM) cho thấy có sự
ức chế tốt đối với virus MCMV (74 và 85%) và ức chế thấp kém virus Sindbis (3 và
5% tương ứng) [37].
Castro cùng cộng sự đã tổng hợp một số dẫn xuất podophyllotoxin (sửa đổi ở
vòng E) và đánh giá khả năng chống lại virus herpes simplex II (HSV-II). Trong các
chất tạo ra, có hai dẫn chất của podophyllotoxin có hoạt tính cao ở hàm lượng 23 và 25
μg/ml [36].
 Tác dụng bảo vệ gan
Bằng cách đo các thông số sinh hóa khác nhau (như alanin aminotransaminase,
aspartat aminotransaminase, lactat dehydrogenase và các enzym chống oxy hóa trong

huyết thanh), Showkat Ahmad Ganie và cộng sự (2013) đã chỉ ra rằng: cao chiết nhexan của Dysosma emodi với liều 20, 30 và 50 mg/kg/ngày có tác dụng bảo vệ gan

6


trên chuột thí nghiệm, chống lại stress oxy hóa do CCl4 gây ra bằng cách làm giảm
hoạt tính của các enzym marker trong huyết thanh, và làm tăng đáng kể glutathion
(GSH), glutathion peroxidase (GPx), glutathion reductase (GR), superoxid dismutase
(SOD) và glutathion-S-transferase (GST) ở các mức khác nhau, phụ thuộc vào liều
[21].
Theo một nghiên cứu khác: nhóm chất flavonoid trong loài Dysosma versipellis
(Podophyllum versipelle) đã được chứng minh có tác dụng bảo vệ gan do độc tố
podophyllotoxin (POD) gây ra. Trên chuột Thụy Sĩ, nhóm sử dụng cả POD và
flavonoid có tỷ lệ tử vong và tổn thương gan, thận thấp hơn đáng kể so với nhóm chỉ
dùng POD. Các tác dụng biểu hiện trên lâm sàng gồm giảm nồng độ transaminase
huyết tương, phosphatase kiềm, lactat dehydrogenase, ure huyết tương, creatinin và
tăng nồng độ glutathion [30], [39].
 Các tác dụng khác
Thân rễ và rễ của loài Dysosma emodi có chứa một hỗn hợp nhựa gọi là
podophyllin. Năm 1820, nhựa này được liệt kê trong Dược điển Hoa Kỳ như một
thuốc tẩy [43], nhưng việc sử dụng nó đã giảm do có độc tính cao [14]. Tuy nhiên, tình
hình đã thay đổi kể từ khi Kaplan (1942) đưa ra một chế phẩm có chứa cao chiết cồn
của podophyllin trong dầu khoáng để điều trị bệnh hoa liễu [33]. Từ sự kiện này, đã có
một mối quan tâm mới trong nghiên cứu nhựa và tìm kiếm các ứng dụng mới từ chất
này.
Trong việc tìm kiếm các hợp chất trừ sâu mới từ thực vật, Miyazawa và cộng sự
đã chỉ ra hoạt tính diệt côn trùng tốt của podophyllotoxin và acetylpodophyllotoxin
được phân lập từ dịch chiết dichloromethan của thân rễ Dysosma emodi (thử trên loài
côn trùng Drosophila melanogaster) [44]. Trong một nghiên cứu khác với
podophyllotoxin và deoxypodophyllotoxin, Inamori và cộng sự đã chỉ ra rằng hai chất

này đều có hoạt tính diệt côn trùng đối với Culex pipiens molestus (95% tỷ lệ chết ở 20
ppm và 85% tỷ lệ chết ở 500 ppm) và đối với ấu trùng Epilachna sparsa orientalis
(90% tỷ lệ chết ở 20 ppm) [29]. Theo một nghiên cứu khác của Russell và cộng sự với
β-peltatin-A-methyl ether đã đưa ra kết quả 98% tỷ lệ chết của ruồi nhà (Musca
domestica) ở 100 ppm trong chế độ ăn uống được xác định về mặt hoá học [46].
Do tác động ức chế miễn dịch rõ nét bởi etoposid và các chất tương tự
podophyllotoxin (được phân lập từ các loài Dysosma), các nghiên cứu đã dẫn tới sự
7


phát triển của CPH 82, là hỗn hợp của hai podophyllotoxin glucosid. CPH 82 là một
thuốc chống huyết khối không có cấu trúc steroid, được sử dụng trong điều trị viêm
khớp dạng thấp [52]. Ngoài ra, một số loài thuộc chi Dysosma còn có tác dụng diệt
nấm, chống sốt rét [50].
1.1.4.2. Độc tính
Phần lớn các loài của chi Dysosma (D. difformis, D. majorensis, D. veitchii, D.
versipellis) đều có mức độ gây độc trung bình [27]. Nghiên cứu trên chuột thí nghiệm
của X Xu và cộng sự (2013) đã chỉ ra rằng ngộ độc cấp tính Dysoma versipellis
(Podophyllum versipelle) có thể gây ra sự thay đổi bệnh lý đa cơ quan. Có mối tương
quan chặt chẽ giữa độc tính và liều lượng. Các mô và các cơ quan đích là não, tim, gan
và thận [53].
Nghiên cứu của Wei-Fong Kao và cộng sự (1992) đã chỉ ra một số tác dụng
phụ, độc tính có thể gặp phải khi sử dụng dịch chiết Dysosma pleiantha (Podophyllum
pleianthum) bao gồm buồn nôn, nôn mửa, tiêu chảy, đau bụng, giảm tiểu cầu, giảm
bạch cầu, xét nghiệm chức năng gan bất thường, mất điều hòa cảm giác, thay đổi ý
thức và ngứa ran ngoại vi hoặc tê liệt [31].
1.1.5. Về tác dụng, công dụng và một số bài thuốc trong YHCT
1.1.5.1. Tác dụng, công dụng
Theo Dewick (1996), việc sử dụng các loài Dysosma bắt nguồn từ nền văn hoá
Trung Quốc, nơi những cây này đã được dùng từ hơn 2000 năm trước như là một loại

thuốc chống ung thư [18]. Một nghiên cứu khác của Cordell (1993) cũng đã được
khẳng định: các loài Dysosma là những cây thuốc được sử dụng rộng rãi trong dân
gian ở các nền văn hoá Á và Mỹ để điều trị ung thư da và mụn cóc [32]. Và qua cuộc
khảo sát của Hartwell với một bộ sưu tập hơn 3000 loài một lần nữa khẳng định việc
sử dụng Dysosma emodi (P. hexandrum), Dysosma pleiantha (P. pleianthum), và
Dysosma aurantiocaulis (P. sikkimense) trong dân gian đối với bệnh ung thư [24].
Các loài Dysosma đã được người dân Ấn Độ sử dụng trong y học cổ truyền với
các mục đích: gây nôn, xổ, gây độc tế bào, chống ung thư [45], điều trị sốt, bệnh thiếu
máu cục bộ [47], liều nhỏ để điều trị táo bón mạn tính (liều cao gây độc) [19]. Các bộ
phận như thân rễ, củ và quả là những phần chủ yếu của cây được sử dụng cho mục
đích y học để điều trị vết loét, tiêu chảy, rối loạn gan, bệnh lao [47] và các rối loạn phụ

8


khoa [14]. Quả chín được ăn ở một số vùng của dãy Himalaya, Ấn Độ để thúc đẩy sự
thụ thai [32].
Tóm tắt kết quả nghiên cứu về công dụng của một số loài Dysosma được thể hiện
qua bảng 1.2.

Bảng 1.2. Công dụng của một số loài Dysosma
Công dụng

Tên loài

TLTK

Dysosma pleiantha

Ức chế khối u, chống ung thư, điều trị rắn cắn, [34], [48]

(P. pleianthum)

hạch to, khối u, đau đầu mạn tính, u xơ gan, đau
thắt lưng.

Dysosma emodi

Bảo vệ gan, chống ung thư, kháng nấm, có khả [51]

(P. hexandrum)

năng ức chế ADN, ARN và tổng hợp protein,
chữa các vết thương, vết loét.

Dysosma versipellis

Bảo vệ gan in vivo, điều trị mụn nhọt, ung thư [30], [39],

(P. versipelle)

vú, tràng nhạc, chữa rắn cắn.

Dysosma

Gây nôn, xổ, gây độc tế bào, chống ung thư, [19], [32],

aurantiocaulis

điều trị bệnh thiếu máu cục bộ, điều trị táo bón [45], [47]

(P. sikkimense)

mạn tính với liều nhỏ (liều cao sẽ gây độc), điều

[53]

trị sốt, viêm loét, tiêu chảy, rối loạn gan, vết
thương, lao, thúc đẩy sự thụ thai, điều trị các rối
loạn phụ khoa.

1.1.5.2. Một số bài thuốc
 Loài bát giác liên Dysosma versipellis (Podophyllum versipelle):
Bài 1: Điều trị nhọt.
10 gam hoa và rễ bát giác liên, hấp rượu, ngâm và đắp lên các khu vực bị tổn
thương. Hoặc: Lá tươi bát giác liên giã nhỏ, hơ nóng đắp, ngày 1 lần [3].
Bài 2: Chữa bệnh tràng nhạc.
50 đến 100 gam bát giác liên, 100 gam rượu gạo, thêm nước vào sắc [30].
Hoặc: Rễ bát giác liên nghiền thành bột, điều chế với giấm, đắp vào hạch sưng
đau. Hoặc dùng 30 gam thân rễ, sắc nước uống, còn bã đắp tại chỗ [8].
Bài 3: Chữa rắn cắn.
9


Rượu ngâm thân củ bôi lên vùng tổn thương, cũng có thể dùng bằng đường
uống, 10 gam mỗi lần [16]. Hoặc: 6 - 12 gam thân rễ bát giác liên giã nát, lấy
nước uống, bã đắp [3].
1.2. Tổng quan về cây Bát giác liên (Dysosma difformis)
1.2.1. Về vị trí phân loại
Cây bát giác liên hay còn gọi là độc cước liên, cước diệp, pha mỏ (Tày), quỷ

cữu [8] có tên khoa học là Dysosma difformis (Hemsley & E. H. Wilson) T. H. Wang
(tên

đồng

nghĩa

là

Dysosma

tonkinensis (Gagnepain)

Hiroe;

Podophyllum

tonkinense Gagnepain; Podophyllum difforme Hemsley & E. H. Wilson; Podophyllum
triangulum Handel-Mazzetti) thuộc chi Dysosma, họ Hoàng liên gai (Berberidaceae),
bộ Hoàng liên (Ranunculales), lớp Ngọc lan (Magnoliosida), ngành Ngọc lan
(Magnoliophyta) [1], [3].
1.2.2. Về đặc điểm thực vật và phân bố
Cây thảo, cao 15 cm đến 30 cm. Thân rễ thường hình trụ, cứng, chia nhiều đốt,
có nhiều rễ nhỏ hình sợi, nhiều xơ. Phần trên mặt đất thẳng, có màu đỏ tía, nhẵn,
đường kính 0,5 - 1 cm. Lá mọc xen kẽ, thường có 1 - 2 cái, phiến lá hình khiên chéo,
có kích thước khác nhau, chủ yếu không phân thùy. Nhánh trên cùng với 1 lá (“nhất
chi hoa”) nên có dạng cuống dài. Cuống lá khác nhau về chiều dài, nhẵn, 20 - 40 cm.
Mặt trên phiến lá có màu đỏ tía kích thước 5 - 11 x 7 - 15 cm, phiến lá mỏng, cả hai bề
mặt nhẵn, gốc lá thường tròn. Mép lá rải rác có hoặc rất ít răng cưa. Hoa mọc từ gần
cuống lá, hình lồng đèn. Cụm hoa có từ 2 - 5 hoa. Cuống 1 - 2 cm, rủ xuống, phủ một

lớp lông trắng mỏng. Cánh đài hình chữ nhật hoặc mũi mác, dài 2 - 2,5 cm x 2 - 5 mm,
bên ngoài có lông, bên trong nhẵn, đỉnh nhọn. Cánh hoa có màu đỏ tía nhạt hình chữ
nhật, 4 - 5 x 0,8 - 1 cm, nhẵn, đầu tròn. Nhị khoảng 2 cm, chỉ nhị 0,8 cm. Bao phấn dài
khoảng 1,2 cm. Nhụy khoảng 0,9 cm. Bầu hình nhạc, đầu nhụy có hình khiên. Quả
mọng hình cầu, dài 1,7 - 2,7 cm, khi chín có màu đen, trong chứa nhiều hạt [8], [25].
Mùa hoa : tháng 3 - 5, mùa quả: tháng 9-10 [3], [5], [8].
Phân bố ở một số tỉnh của Trung Quốc (Quảng Tây, Quý Châu, Hồ Bắc, Hồ
Nam, Tứ Xuyên) và Việt Nam (Lào Cai, Tuyên Quang, Lai Châu, Cao Bằng, Bắc Cạn,
Hà Nội, Hòa Bình, Lạng Sơn) [5], [8], [25].
Bát giác liên là cây đặc biệt ưa ẩm và ưa sáng. Cây mọc rất rải rác dưới tán
rừng, bên khe suối, hốc đá. Độ cao phân bố 1000 - 1300 m. Phần trên mặt đất lụi hàng
10


năm vào mùa khô. Vào tháng 3, từ phần thân rễ, mọc lên 1 - 3 chồi, đó là những thân
giả mang lá sau 30 - 45 ngày, khi lá đạt được độ trưởng thành, cây bắt đầu ra hoa. Tuy
nhiên, trên thực tế nụ hoa đã được hình thành và phát triển gần như cùng một lúc với
lá. Cây tái sinh chủ yếu tự nhiên từ hạt. Thân rễ cũng có khả năng phân nhánh, sau mỗi
năm, phần trên mặt đất tàn lụi, đồng thời tạo thành một “đốt củ” ở thân rễ. Căn cứ vào
số đốt củ trên trục chính của thân rễ, có thể ước tính được tuổi của cây [8].
Hiện nay, cây bát giác liên được xếp vào loài cây thuốc quý hiếm ở Việt Nam.
Trên thực tế, do khai thác quá mức nên cây đã trở nên cực hiếm, rất nguy cấp, đã được
ghi trong sách đỏ Việt Nam, cần được ưu tiên nghiên cứu bảo tồn [7], [8], [9].

Hình 1.2. Cây bát giác liên (Dysosma difformis)
1.2.3. Về thành phần hóa học
Có ít nghiên cứu công bố về thành phần hóa học của loài Dysosma difformis.
Một số tài liệu cho biết cây bát giác liên (Dysosma difformis) có một số thành phần
như: podophyllotoxin (1), picropodophyllotoxin (2), deoxypodophyllotoxin (3),
kaempferol (4), quercetin (5) [8].

Năm 2014, Jie Zhang (Trung Quốc) cùng các cộng sự đã đồng thời xác định
được 5 hợp chất có hoạt tính sinh học từ thân rễ cây bát giác liên (Dysosma difformis)
bằng HPLC gồm 4 flavonoid là quercetin (5), kaempferol (4), rutin (6) và quercitrin
(7); và một lignan: podophyllotoxin (1) [54].

11


R2
O

OH
O
O

HO

O
O

OR1
OH

OCH3

O

OCH3
OCH3

Rutin (6)

R1 = Glc (6→1)-Rha, R2 = OH

Deoxypodophyllotoxin (3)

Quercitrin (7) R1 = Rha, R2 = OH
Quercetin (5)

R1 = H, R2 = OH

Kaempferol (4) R1 = R2 = H

OH

OH

H

H

O

O

O

O

O

O

H

H3CO

H

O

OCH3

H3CO

OCH3

O

OCH3
OCH3

Picropodophyllotoxin (2)

Podophyllotoxin (1)

Hình 1.3. Một số thành phần hóa học có trong Bát giác liên (Dysosma difformis)
Ở Việt Nam, nghiên cứu về cây bát giác liên nói chung và thành phần hóa học
của loài này nói riêng là một vấn đề mới. Cho đến nay, chỉ có một nghiên cứu về cây
bát giác liên của tác giả Cao Thanh Mai (2014) đã công bố. Nghiên cứu đã mô tả được

các đặc điểm thực vật và dự đoán mẫu nghiên cứu có thể là 1 trong 3 loài: Dysosma
pleiantha (Hance) Woodson (Podophyllum pleianthum Hance), Dysosma majoensis
(Gagnepain) M. Hiroe (Podophyllum majoense Gagnepain), Dysosma difformis
(Hemsley & E. H. Wilson) T. H. Wang ex T. S. Ying (Podophyllum tonkinense
Gagnepain); đã mô tả được đặc điểm vi học đồng thời sơ bộ xác định thành phần hóa
12


học của thân rễ mẫu nghiên cứu bao gồm: flavonoid, saponin, coumarin, glycosid tim,
đường khử, trong đó nhiều nhất là flavonoid [6].
Ngoài ra, chưa có công bố nào về thành phần hóa học của cây bát giác liên
(Dysosma difformis) ở Việt Nam.
1.2.4. Về tác dụng sinh học
Hiện nay chưa có nghiên cứu nào công bố về tác dụng dược lý các phân đoạn
cao chiết xuất từ loài bát giác liên (Dysosma difformis). Tuy nhiên, một số thành phần
hóa học phân lập được từ loài này đã được nghiên cứu tác dụng sinh học trên tim
mạch, chống ung thư và chống oxy hóa.
Từ Dysosma difformis, người ta đã chiết tách được một thành phần kết tinh có
tác dụng kích thích tim ếch cô lập, làm tim ngừng đập ở thời kì tâm thu, làm giãn tĩnh
mạch máu tai thỏ. Còn đối với mạch máu chi sau của ếch và mạch máu thận của thỏ,
thuốc có tác dụng gây co bóp nhẹ. Thành phần nhựa của loài này có tác dụng gây nôn,
tiêu chảy, và gây tử vong trên mèo thí nghiệm [8], [27].
Chất podophyllotoxin thí nghiệm trên chuột nhắt trắng và chuột cống trắng với
nhiều mô hình gây ung thư thực nghiệm đều có tác dụng ức chế tế bào ung thư như tế
bào ung thư bệnh bạch cầu cấp tính, tế bào adenocarcinoma, melanoma và tế bào ung
thư người KB. Cơ chế chủ yếu là ức chế tế bào phân chia tiền kỳ (G2).
Podophyllotoxin dùng bằng đường uống gây tiêu chảy nặng, đau bụng, đi ngoài ra
máu, nghiêm trọng có thể dẫn đến suy sụp kiệt sức. Dùng bằng đường tiêm, đầu tiên
xuất hiện tác dụng kích thích thần kinh trung ương. Về độ độc tính cấp, thí nghiệm
trên chuột nhắt trắng bằng đường tiêm xoang bụng, podophyllotoxin có LD50 = 30 - 35

mg/kg. Do có độc tính lớn nên podophyllotoxin không thể được sử dụng trực tiếp trên
lâm sàng. Người ta cải tiến cấu trúc hóa học, dùng các chất có độ độc thấp hơn và đã
được ứng dụng có kết quả trên lâm sàng trong điều trị một số bệnh ung thư [8], [30].
Các chất flavonoid trong Dysosma difformis bao gồm kaempferol, quercetin,
rutin và quercitrin có nhiều hoạt tính sinh học khác nhau: như kháng virus, kháng
khuẩn, chống viêm, giảm ho, lợi đờm trong viêm phế quản mạn tính, chống ung thư và
các hoạt động chống oxy hoá [8], [54], [39].
1.2.5. Về công dụng và bài thuốc trong YHCT
1.2.5.1. Tính vị, công năng

13


Bát giác liên có vị đắng, cay, tính bình, có tác dụng thanh nhiệt, giải độc, hóa
đờm, tán kết, khử ứ, tiêu thũng. Có độc nhẹ [8].
1.2.5.2. Công dụng
Ở Trung Quốc, bát giác liên được sử dụng khá phổ biến trong y học cổ truyền
với các công dụng: điều trị vết thương nhiễm độc bắt đầu sưng lên, nhọt, chấn thương,
loại trừ vết bầm tím, rắn cắn, bệnh tràng nhạc, Herpes zoster, đau họng, đờm ho, ho
lao, hen, thương hàn, suy nhược cơ thể, đổ mồ hôi, nôn ra máu, đau dạ dày [5], [8].
Ở Việt Nam, bát giác liên ít được sử dụng. Một số địa phương thường dùng bát
giác liên để chữa rắn cắn, sưng tấy, áp xe, mụn nhọt, lở ngứa, sưng yết hầu. Liều dùng:
3 - 9 gam sắc nước uống trong ngày, hoặc chế thành hoàn tán. Dùng ngoài bằng cách
giã nát cây tươi đắp tại chỗ hoặc rễ mài lấy nước bôi. Dùng ngoài không kể liều lượng
[5], [8]. Ngoài ra, bát giác liên (Dysosma difformis) còn có công dụng giải độc gan,
tiêu đờm, chữa quai bị, loại trừ vết bầm tím, bệnh tràng nhạc [2].
Chú ý: phụ nữ có thai không được dùng [8].
1.2.5.3. Bài thuốc
Ung thư vú: bát giác liên, hoàng đỗ quyên mỗi vị 15 gam, tử bối kì 30 gam,
ngâm trong 500 ml rượu vang trắng trong 7 ngày, ngày uống 2 - 3 lần, 10 - 15 ml/lần.

Dùng ngoài xoa [8].

14


CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên liệu nghiên cứu và phƣơng tiện nghiên cứu
2.1.1. Nguyên liệu
Đối tượng nghiên cứu là phần dưới mặt đất của cây bát giác liên thu tại Sa Pa,
Lào Cai vào tháng 4 năm 2017. Đây là sản phẩm của đề tài cấp cơ sở của Viện Dược
liệu có tiêu đề “Đánh giá khả năng thích nghi, sinh trưởng, phát triển của nguồn gen
bát giác liên (Podophyllum tokinense Gagnep.) tại Sa Pa – Lào Cai”. Tên khoa học của
loài nghiên cứu được Khoa Tài nguyên Dược liệu (Viện Dược liệu) giám định là
Dysosma difformis (Hemsley & E. H. Wilson) T. H. Wang, tên đồng nghĩa
Podophyllum tonkinense (Gagnepain). ThS. Nghiêm Đức Trọng (Bộ môn Thực vật,
Trường Đại học Dược Hà Nội) cũng giám định và cho kết quả tương tự (phụ lục III).

Hình 2.1. Mẫu bát giác liên nghiên cứu
2.1.2. Phương tiện nghiên cứu
2.1.2.1. Hóa chất và dung môi
Các thuốc thử, dung môi, hóa chất sử dụng trong nghiên cứu đạt tiêu chuẩn
phân tích đã ghi trong Dược điển Việt Nam V [4].
Chất hấp phụ silica gel pha thường (cỡ hạt 63-200 µm, Merck), pha đảo RP-18
(30 - 50 µm, Merck).
Bản mỏng silica gel F254 tráng sẵn và RP-18 F254 tráng sẵn (Merck), hiện màu
bằng thuốc thử acid sulfuric 10% / ethanol và đốt nóng ở 110◦C
2.1.2.2. Thiết bị, máy móc, dụng cụ
- Cân kỹ thuật Precisa, cân phân tích Statorius độ chính xác 0,001 g.
- Tủ sấy.
15

- Máy cất quay chân không Buchi Rotavapor R-200.
- Bình cầu dung tích 50 - 2000 mL.
- Ống nghiệm, ống effendorf đựng mẫu NMR.
- Bếp cách thủy (Memmert, WB - 14 LO).
- Hệ thống hứng mẫu tự động CF-2 Fraction Collector.
- Hệ thống chấm mẫu CAMAG Linomat 5.
- Máy quang phổ UV-Vis Cary 1E.
- Cột sắc kí: các loại cột đường kính từ 1 - 10 cm, dài từ 30 - 100 cm.
- Đèn tử ngoại 2 bước sóng 254 nm, 366 nm (Vilber lourmat, CN-15-LC).
- Sắc ký cột Silica gel F254 cỡ hạt 60 - 200 µm (Merck), Sephadex LH-20, sắc
ký cột pha đảo RP-18 (30 - 50 µm, Merck).
- Máy đo phổ khối lượng LC/MS/MS-Water-API-ISI (Viện Hóa học, VAST).
- Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H- và

13

C-NMR) của hãng Bruker

(500MHz) (Viện Hóa học, VAST).
- Các trang thiết bị khác thuộc Viện Dược liệu, Bộ môn Dược học cổ truyền Trường Đại học Dược Hà Nội.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp chiết xuất cao toàn phần và phân đoạn
Theo phương pháp chiết xuất các lớp chất theo độ phân cực tăng dần của dung
môi.
Chiết xuất các hoạt chất từ dược liệu bằng ethanol (EtOH) 96% theo phương
pháp chiết nóng. Cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được cắn. Hòa cắn vào
nước, lần lượt lắc phân đoạn với dung môi có độ phân cực tăng dần n-hexan (Hx),
ethyl acetat (EtOAc), và n-butanol (BuOH).

Cất thu hồi dung môi các phân đoạn thu được cắn n-hexan; cắn ethyl acetat; cắn
n-butanol.
Sơ đồ chiết xuất thể hiện ở hình 2.2.
2.2.2. Nghiên cứu về thành phần hóa học
2.2.2.1. Phân lập các hợp chất chính
Quá trình nghiên cứu phân lập hợp chất từ các phân đoạn chủ yếu sử dụng phương
pháp sắc kí cột.
 Cột sắc kí: các loại cột đường kính từ 1 - 10 cm, dài từ 30 - 100 cm.
16


 Chất hấp phụ: silica gel pha thuận cỡ hạt từ 60 - 200 µm và silica gel pha đảo
cỡ hạt 30 - 50 µm.
 Dung môi rửa giải: hỗn hợp dung môi pha từ các dung môi thường dùng như nhexan, methanol, nước, ethyl actetat, aceton, dicloromethan.
 Tiến hành:
Chuẩn bị cột: Cột được rửa sạch, sấy khô, lắp thẳng đứng trên giá cố định.
Ổn định cột: Lót một lớp bông mỏng ở đáy cột. Cân một lượng silica gel cần
dùng vào cốc có mỏ, thêm dung môi rửa giải rồi khuấy đều. Cho hỗn dịch trên vào cột,
mở vòi, rót tiếp dung môi vào và để cho silica gel lắng xuống đáy cột. Tiếp tục hứng
dung môi và rót liên tục vào cột trong một thời gian đến khi cột không còn nén được
nữa. Để ổn định cột trong 24h.
Nạp mẫu lên cột: Cắn được hòa tan trong một lượng dung môi tối thiểu đến
khi tan hoàn toàn sau đó trộn đều với một lượng tối thiểu silica gel, để dung môi bay
hơi hết, làm thành bột mịn rồi rải thành một lớp đều đặn trên mặt silica gel trong cột
sao cho không làm xáo trộn lớp silica gel bề mặt.
Rửa giải: Sử dụng hệ dung môi thích hợp để rửa giải. Kiểm soát tốc độ dòng
chảy dung môi theo thời gian. Hứng dịch rửa giải vào các ống nghiệm và bình thích
hợp. Sắc ký lớp mỏng dùng để theo dõi vết các chất từ các phân đoạn. Sắc ký đồ được
quan sát dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm và 366 nm hoặc dùng thuốc thử là
dung dịch H2SO4 10% trong ethanol. Gộp các phân đoạn có cùng thành phần. Tinh chế

các chất thu được từ các phân đoạn.
2.2.2.2. Phương pháp kiểm tra độ tinh khiết của chất phân lập
Kiểm tra độ tinh khiết bằng sắc ký lớp mỏng (thử trên các hệ dung môi khác
nhau).

17