NGHIÊN CỨU SỰ THỦY PHÂN ENZYME COLLAGENASE TỪ VI KHUẨN Bacilus subtilis TRÊN CÁC CƠ CHẤT KHÁC NHAU VÀ TINH SẠCH ENZYME BẰNG SẮC KÝ LỌC GEL

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HCM
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC


LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU SỰ THỦY PHÂN ENZYME COLLAGENASE
TỪ VI KHUẨN Bacilus subtilis TRÊN CÁC CƠ CHẤT
KHÁC NHAU VÀ TINH SẠCH ENZYME
BẰNG SẮC KÝ LỌC GEL

Nghành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Niên khóa: 2004 – 2008
Sinh viên thực hiện: NGUYỄN CAO TRÍ

Tháng 9/2008


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HCM
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC


LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU SỰ THỦY PHÂN ENZYME COLLAGENASE
TỪ VI KHUẨN Bacilus subtilis TRÊN CÁC CƠ CHẤT
KHÁC NHAU VÀ TINH SẠCH ENZYME
BẰNG SẮC KÝ LỌC GEL

Giáo viên hướng dẫn:

Sinh viên thực hiện:

PGS. TS. NGUYỄN TIẾN THẮNG

NGUYỄN CAO TRÍ

CN. ĐỖ THỊ TUYẾN

Tháng 9/2008


LỜI CẢM ƠN

Con xin thành kính tri ân ông bà, cha mẹ, người thân trong gia đình luôn bên
con trong con trao cho con tình thương, sự hiểu biết, cuộc sống vật chất và tình thần
đầy đủ để con có ngày hôm nay.
Em xin chân thành cảm ơn cô Đỗ Thị Tuyến, thầy Nguyễn Tiến Thắng, chị
Nguyễn Thị Như Quỳnh đã nhiệt tình chỉ dạy, hướng dẫn, tạo mọi điều kiện thuận lợi
cho em trong suốt thời gian làm đề tài. Em xin chân thành cảm ơn: Ban giám hiệu
trường đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bôn Môn Công
Nghệ Sinh Học cùng tất cả quý thầy cô đã dạy dỗ, dìu dắt, trao cho em kiến thức, kinh
nghiệm trong suốt những năm học qua.
Xin cảm ơn đến tất cả bạn bè đã cùng mình học tập, chia sẽ trong thời gian qua.
Xin cảm ơn quốc gia, xã hội đã cung cấp cho chúng em những tiện nghi, tạo điều kiện
cho chúng em được học tập trong môi trường an ninh, hòa bình, tự do nhất.

Thủ Đức, tháng 9 năm 2008.
Nguyễn Cao Trí

iii


TÓM TẮT KHÓA LUẬN

NGUYỄN CAO TRÍ, Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học Trường Đại Học Nông
Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh. Tháng 9 năm 2008. “Nghiên Cứu Sự Thủy Phân
Enzym Collagenase Từ Vi Khuẩn Bacillus subtilis Trên Các Cơ Chất Khác Nhau
và Tinh Sạch Enzyme Bằng Sắc Ký Lọc Gel”. Đề tài thực hiện tại: Viện Sinh Học
Nhiệt Đới, thời gian :1/3-1/6/2008.
Hội đồng giáo viên hướng dẫn :


PGS. TS: Nguyễn Tiến Thắng



CN:

Đỗ Thị Tuyến

Đề tài thực hiện các nội dung :
1)

Xác định tác nhân tủa thích hợp thu hồi CPT enzyme có HL protein cao.

2)

Khảo sát hoạt độ collagenase của CPT tủa bằng các tác nhân khác nhau

trên các cơ chất khác nhau, xác định cơ chất đặc trưng.
3)

Xác định pH, nhiệt độ tối ưu của enzyme.

4)

Tinh sạch enzyme bằng sắc ký lọc gel.

5)

Xác định trọng lượng phân tử

enzyme bằng điện di trên gel

polyacrylamide.
Kết quả :
1)

(NH4)2SO4 65% là tác nhân tủa thích hợp thu hồi CPT có HL protein cao.

2)

CPT tủa bằng muối (NH4)2SO4 70% cho hoạt độ enzyme cao nhất trên các

cơ chất casein, collagen, gelatin. Cơ chất đặc trưng của collagenase là collagen.
3)

Khoảng pH 5-6, nhiệt độ 45-550C là pH và nhiệt độ tối ưu của enzyme.

4)

Sau quá trình sắc ký tất cả các CPT đều có HĐR tăng lên đáng kể. Trong

đó, CPT tủa bằng muối (NH4)2SO4 70% có độ tinh sạch cao nhất tiếp đến là
CPT tủa bằng acetone 70% và sau cùng là CPT tủa bằng cồn 5:1
5)

Trọng lượng phân tử của collagenase từ vi khuẩn Bacillus subtilis nằm

trong khoảng 72,31- 94,83 kDa.

iv


SUMMARY

Nguyen Cao Tri, Department of Biotechnology Nong Lam university of Ho Chi Minh
city. Steptember 2008. “Study Hydrolysis Enzyme Collagenase from Bacterial
Bacillus subtils over Differents Substances and Purification Enzyme by Size
Exclusion Chromatography”. The subject was practised at Institute Tropical
Biology, time: 1/3- 1/6/2008.
Teacher guide:


Prf. Dr. Nguyen Tien Thang



Ms. Do Thi Tuyen

The subject was practised contents:
1) Definition agen crystalize suitable take back sudiment product has high quantity
protein.
2) Examination active collagenase of sudiment product crystalized by different
agents over substances, define special substance.
3) Definition ideal pH, temperature of enzyme.
4) Purification enzyme by size exclution chromatography.
5) Definition molecular weight enzyme by gel electrophoresis polyacrylamide.
Result:
1) (NH4)2SO4 65% is suitable agent crystalize take back sudiment product give
high quantity protein.
2) Sudiment product was crystalized salt (NH4)2SO4 70% give highest active
enzyme over substances: casein, collagen, gelatin. Special substance of enzyme
is collagen.
3) pH 5-6, temperature 45-550C are ideal pH and temperature of enzyme.
4) After process size exclusion chromatography all sudiment product equal have
degree pure increase. In, sudiment product crystalized by salt (NH4)2SO4 70%

v


has highest degree pure, continuation is sudiment product crystalized by
acetone 70% final is sudiment product crystalized by alcohol 5:1.
5) Molecular weight of collagenase from bacterial Bacillus subtilis in 72,31- 94,83
kDa.

vi

MỤC LỤC
Trang
Lời cảm ơn.................................................................................................................. iii
Tóm tắt khóa luận ....................................................................................................... iv
Summary..................................................................................................................... v
Mục lục ....................................................................................................................... vii
Danh mục các chữ viết tắt .......................................................................................... x
Danh mục các bảng..................................................................................................... xi
Danh mục các biểu đồ ................................................................................................ xiii
Danh mục các hình ..................................................................................................... xv
CHƯƠNG 1. MỞ ĐẦU.............................................................................................. 1
1.1. Đặt vấn đề............................................................................................................ 1
1.2. Mục tiêu của đề tài............................................................................................... 2
CHƯƠNG 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................... 4
2.1. Đại cương về enzyme .......................................................................................... 4
2.1.1. Lịch sử phát hiện enzyme................................................................................. 4
2.1.2. Định nghĩa ........................................................................................................ 5
2.1.3. Cấu tạo enzyme ................................................................................................ 6
2.1.4. Danh pháp và phân loại ................................................................................... 7
2.1.5. Tính chất của enzyme ...................................................................................... 8
2.1.6. Đặc điểm nổi bật của enzyme........................................................................... 8
2.1.7. Cơ chế tác dụng của enzym.............................................................................. 8
2.1.8. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của enzyme ........................................... 9
2.2. Giới thiệu về collagenase .................................................................................... 12
2.2.1. Khái niệm về collagenase ................................................................................ 12
2.2.2. Tình hình nghiên cứu collagenase trên thế giới .............................................. 12
2.2.3. Nghiên cứu collagenase ở Việt Nam................................................................ 16
2.2.4. Khả năng sử dụng Collagenase ........................................................................ 16
vii

2.3. Đại cương về vi khuẩn Bacillus Subtillis ............................................................ 19
2.3.1. Lịch sử .................................................................................................. 19
2.3.2. Phân loại và đặc điểm....................................................................................... 19
2.4. Giới thiệu về sắc ký lọc gel ................................................................................. 20
2.4.1. Khái niệm về sắc ký ........................................................................................ 20
2.4.2. Các thuật ngữ dùng trong sắc ký ..................................................................... 21
2.4.3. Sắc ký lọc gel ................................................................................................... 22
2.5. Giới thiệu về điện di trên gel Polyacrylamide..................................................... 23
CHƯƠNG 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU CHÍNH............... 25
3.1. Địa điểm thí nghiệm ............................................................................................ 25
3.2. Nguyên liệu.......................................................................................................... 25
3.3. Hóa chất và các thiết bị thí nghiệm chủ yếu sử dụng.......................................... 25
3.3.1. Hoá chất ........................................................................................................... 25
3.3.2. Các thiết bị thí nghiệm chủ yếu đã sử dụng ..................................................... 26
3.4. Phương pháp nghiên cứu chính .......................................................................... 28
3.4.1. Phương pháp thu nhận enzyme......................................................................... 28
3.4.2.Phương pháp xác định HL protein theo Bradford ............................................. 31
3.4.3. Xác định hoạt độ enzyme Collagenase – Phương pháp
Ninhydrin của Rosen .................................................................................................. 33
3.4.4.Khảo sát ảnh hưởng của pH đến HĐ của enzyme............................................. 36
3.4.5.Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến HĐ của enzyme..................................... 36
3.4.6. Phương pháp tinh sạch enzyme bằng sắc ký lọc gel ....................................... 36
3.4.7. Phương pháp phân tích enzyme bằng điện di trên gel polyacrylamide............ 38
3.4.8. Phương pháp xử lý số liệu ................................................................................ 40
CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................. 42
4.1. Khảo sát hoạt độ của CPT enzyme trên các cơ chất ........................................... 42
4.1.1. HL protein và HĐ của CPT enzyme được tủa bằng acetone
ở các nồng độ khác nhau trên các cơ chất .................................................................. 42

4.1.2. HL protein và HĐ của CPT enzyme được tủa bằng cồn 96O ở
các tỉ lệ khác nhau trên các cơ chất ............................................................................ 45
4.1.3. HL protein và HĐ của CPT enzyme được tủa bằng (NH4)2SO4

viii


bão hòa ở các nồng độ khác nhau trên các cơ chất .................................................... 48
4.1.4. So sánh giữa các tác nhân tủa cho HL protein enzyme cao nhất .................... 51
4.1.5. So sánh HĐ enzyme với 3 tác nhân tủa khác nhau trên 3 cơ chất .................. 52
4.2. Khảo sát ảnh hưởng pH của cơ chất đến HĐ enzyme trên cơ chất đó .............. 53
4.2.1. pH tối ưu cho hoạt động của CPT enzyme tủa bằng acetone 70%
trên các cơ chất ........................................................................................................... 53
4.2.2. pH tối ưu cho hoạt động của CPT enzyme tủa bằng cồn 96O tỷ lệ 1:5
trên các cơ chất .......................................................................................................... 54
4.2.3. pH tối ưu cho hoạt động của CPT enzyme tủa bằng (NH4)2SO4
bão hòa 70% trên các cơ chất ..................................................................................... 55
4.3. Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ của cơ chất đến hoạt độ enzyme
trên cơ chất đó .......................................................................................................... 56
4.3.1. Nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của CPT enzyme tủa bằng
acetone 70% trên các cơ chất...................................................................................... 56
4.3.2. Nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của CPT enzyme tủa bằng
cồn 96O tỉ lệ 1 :5 trên các cơ chất .............................................................................. 57
4.3.3. Nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của CPT enzyme tủa bằng
(NH4)2SO4 70% trên các cơ chất ............................................................................... 58
4.4. Tinh sạch enzyme collagenase bằng sắc kí lọc gel ............................................. 60
4.4.1. CPT với tác nhân tủa là acetone 70%............................................................... 60
4.4.2. CPT với tác nhân tủa là cồn 96O tỉ lệ 1:5............... .... ...................................... 61
4.4.3. CPT với tác nhân tủa là (NH4)2SO4 bão hòa 70% .......................................... 61
4.4.4. So sánh HĐR của CPT enzyme trước và sau sắc ký ........................................ 62

4.5. Kết quả phân tích enzyme collagenase bằng điện di trên
gel polyacrylamide ..................................................................................................... 64
CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ.................................................................. 67
5.1. Kết luận .............................................................................................................. 67
5.2. Đề nghị ............................................................................................................. 68
TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................................... 70
PHỤ LỤC

ix


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

A. alginolyticus

: Aeromonas alginolyticus

A. iophagus

: Achromobacter iophagus

Aa

: axit amin

B. alvei DC-1

: Bacillus alvei DC-1

B. subtilis

: Bacillus subtilis

C. histolyticum

: Clostridium histolyticum

CPT

: chế phẩm thô

DNC

: dịch nuôi cấy

ĐVHĐ

: đơn vị hoạt độ

E

: enzyme

HĐ

: hoạt độ

HĐR

: hoạt độ riêng

HL

: hàm lượng

I

: inhibitor

KLPT

: khối lượng phân tử

KS

: khảo sát

MT

: môi trường

OD

: optical density

P

: product

PAGE

: polyacrylamide gel

S

: substance

SDS

: sodium dodecyl sunfate

SEC

: size exclusion chromatography

UI

: unit internatinal

TL

: tỉ lệ

VSV

: vi sinh vật
x


DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang
Bảng 3.1: TL giữa aceton và dịch enzyme trong quá trình tủa aceton....................... 29
Bảng 3.2: TL giữa cồn và dịch enzyme trong quá trình tủa cồn ................................ 30
Bảng 3.3: TL giữa dịch enzyme và muối (NH4)2SO4 bão hòa ở các
nồng độ ...................................................................................................................... 30
Bảng 3.4: Dựng đường chuẩn albumine..................................................................... 32
Bảng 3.5: Dựng đường chuẩn leucine ........................................................................ 34
Bảng 4.1: HL protein và HĐ của enzyme collagenase tủa theo
các nồng độ aceton trên cơ chất casein....................................................................... 42
Bảng 4.2: HL protein và HĐ của enzyme collagenase tủa theo
các nồng độ aceton trên cơ chất collagen ................................................................... 43
Bảng 4.3: HL protein và HĐ của enzyme collagenase tủa theo
các nồng độ aceton trên cơ chất gelatin...................................................................... 44
Bảng 4.4: HL protein và HĐ của CPT enzyme được tủa bằng
cồn 96O ở các TL khác nhau trên cơ chất casein ........................................................ 45
Bảng 4.5: HL protein và HĐ của CPT enzyme được tủa bằng
cồn 96O ở các TL khác nhau trên cơ chất collagen .................................................... 46
Bảng 4.6: HL protein và HĐ của CPT enzyme được tủa bằng
cồn 96O ở các TL khác nhau trên cơ chất gelatin ....................................................... 47
Bảng 4.7: HL protein và HĐ của CPT enzyme tủa bằng (NH4)2SO4
bão hòa ở các nồng độ khác nhau trên cơ chất casein ............................................... 48
Bảng 4.8: HL protein và HĐ của CPT enzyme tủa bằng (NH4)2SO4
bão hòa ở các nồng độ khác nhau trên cơ chất collagen ........................................... 49
Bảng 4.9: HL protein và HĐ của CPT enzyme tủa bằng (NH4)2SO4
bão hòa ở các nồng độ khác nhau trên cơ chất gelatin. ............................................. 50
Bảng 4.10: So sánh giữa các tác nhân tủa cho HL protein enzyme cao nhất ............ 51
Bảng 4.11: So sánh HĐ enzyme với ba tác nhân tủa Khác Nhau

xi

trên ba cơ chất............................................................................................................. 52
Bảng 4.12: Ảnh hưởng pH các cơ chất đến hoạt độ enzyme tủa
bằng aceton 70% trên các cơ chất ............................................................................. 53
Bảng 4.13: Ảnh hưởng pH các cơ chất đến hoạt độ enzyme tủa
bằng cồn 96O tỷ lệ 1:5 trên các cơ chất ...................................................................... 54
Bảng 4.14: Ảnh hưởng pH các cơ chất đến hoạt độ enzyme tủa
bằng (NH4)2SO4 bão hòa 70% trên các cơ chất.......................................................... 55
Bảng 4.15: Ảnh hưởng nhiệt độ các cơ chất đến hoạt độ Enzyme
tủa bằng aceton 70% trên các cơ chất......................................................................... 56
Bảng 4.16: Ảnh hưởng nhiệt độ các cơ chất đến hoạt độ enzyme
tủa bằng cồn 96O tỉ lệ 1 : 5 Trên Các Cơ Chất .......................................................... 57
Bảng 4.17: Ảnh hưởng nhiệt độ các cơ chất đến hoạt độ enzyme
tủa bằng (NH4)2SO4 70% trên các cơ chất ................................................................. 58
Bảng 4.18 : Liệt kê pH, nhiệt độ tối ưu cho hoạt độ Enzyme
collagease của CPT tủa bằng các tác nhân trên các cơ chất ...................................... 59
Bảng 4.19: Hiệu suất và độ tinh sạch của enzyme collagenase
sau sắc ký.................................................................................................................... 62
Bảng 4.20 : HĐR của các CPT enzyme trước và sau sắc ký...................................... 62
Bảng 4.21: Giá trị Rf và LgM của thang chuẩn protein ............................................. 64
Bảng 4.22: Trọng lượng phân tử của dịch enzyme tủa bằng cồn
và đã qua sắc ký ......................................................................................................... 65
Bảng 4.23 : Trọng lượng phân tử của dịch enzyme tủa bằng
acetone và đã qua sắc ký............................................................................................ 65
Bảng 4.24: Trọng lượng phân tử của dịch enzyme tủa bằng
amoni sulfat bão hòa và đã qua sắc ký ...................................................................... 66

xii

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ
Trang
Biểu đồ 4.1: Biểu diễn HL protein và HĐ của enzyme collagenase
tủa theo các nồng độ aceton trên cơ chất casein......................................................... 42
Biểu đồ 4.2: Biểu diễn HL protein và HĐ của enzyme collagenase
tủa theo các nồng độ aceton trên cơ chất collagen ..................................................... 43
Biểu đồ 4.3: Biển diễn HL protein và HĐ của enzyme collagenase
tủa theo các nồng độ aceton trên cơ chất gelatin........................................................ 44
Biểu đồ 4.4: Biển diễn HL protein và HĐ của CPT enzyme được
tủa bằng cồn 96O ở các TL khác nhau trên cơ chất casein ......................................... 46
Biểu đồ 4.5: Biển diễn HL protein và HĐ của CPT E\enzyme được
tủa bằng cồn 96O ở các TL khác nhau trên cơ chất collagen...................................... 47
Biểu đồ 4.6: Biển diễn HL protein và HĐ của CPT enzyme được
tủa bằng cồn 96O ở các TL khác nhau trên cơ chất gelatin ........................................ 48
Biểu đồ 4.7: Biển diễn HL protein và HĐ của CPT enzyme tủa
bằng (NH4)2SO4ở các nồng độ khác nhau trên cơ chất casein .................................. 49
Biểu đồ 4.8: Biển diễn HL protein và HĐ của CPT enzyme tủa
bằng (NH4)2SO4 ở các nồng độ khác nhau trên cơ chất collagen.............................. 50
Biểu đồ 4.9: Biển diễn HL protein và HĐ của CPT enzyme tủa bằng
(NH4)2SO4 ở các nồng độ khác nhau trên cơ chất gelatin. ........................................ 51
Biểu đồ 4.10: So sánh giữa các tác nhân tủa cho hàm lương protein
enzyme cao nhất ......................................................................................................... 52
Biểu đồ 4.11: So sánh hoạt độ enzyme với ba tác nhân tủa khác nhau
trên ba cơ chất ............................................................................................................ 53
Biểu đồ 4.12: Biểu diễn ảnh hưởng pH các cơ chất đến hoạt độ
enzyme tủa bằng aceton 70% trên các cơ chất .......................................................... 54
Biểu đồ 4.13: Biểu diễn ảnh hưởng pH các cơ chất đến hoạt độ

xiii

enzyme tủa bằng cồn 96O tỷ lệ 1:5 trên các cơ chất ................................................... 55
Biểu đồ 4.14: Biểu diễn ảnh hưởng pH các cơ chất đến hoạt độ
enzyme tủa (NH4)2SO4 bão hòa 70% trên các cơ chất ............................................... 56
Biểu đồ 4.15: Biểu diễn ảnh hưởng nhiệt độ các cơ chất đến HĐ
enzyme tủa bằng aceton 70% trên các cơ chất ........................................................... 57
Biểu đồ 4.16: Biểu diễn ảnh hưởng nhiệt độ các cơ chất đến HĐ
enzyme tủa bằng cồn 96O tỉ lệ 1 : 5 trên các cơ chất ................................................. 58
Biểu đồ 4.17: Biểu diễn ảnh hưởng nhiệt độ các cơ chất đến HĐ
enzyme tủa bằng (NH4)2SO4 bão hòa 70% trên các cơ chất ..................................... 59
Biểu đồ 4.18: Sắc ký đồ lọc gel Biogel P100 (tủa bằng cetone) ................................ 60
Biểu đồ 4.19: Sắc ký đồ lọc gel Biogel P100 (tủa bằng cồn) .................................... 61
Biểu đồ 4.20: Sắc ký đồ lọc gel Biogel P100 (tủa bằng(NH4)2SO4 ) ......................... 61
Biểu đồ 4.21: Biểu diễn hiệu suất và độ tinh sạch của enzyme sau sắc ký ................ 62
Biểu đồ 4.22: Biểu diễn sự chênh lệch HĐR enzyme trước
và sau tinh sạch........................................................................................................... 63
Biểu đồ 4.23: Biểu diễn sự tương quan giữa LgM của những protein
trong thang chuẩn với Rf ............................................................................................ 65

xiv


DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Hình 2.1. Vi khuẩn B.subtilis ..................................................................................... 19
Hình 2.2. Sơ lược nguyên tắc sắc ký .......................................................................... 20
Hình 2.3. Cơ chế sắc ký lọc gel.................................................................................. 23
Hình 3.1. Máy lắc ...................................................................................................... 26
Hình 3.2. Máy đo pH .................................................................................................. 26
Hình 3.3. Cân phân tích ............................................................................................. 27

Hình 3.4. Nồi hấp Tommy- SS-325............................................................................ 27
Hình 3.5. Máy cất nước .............................................................................................. 27
Hình 3.6. Máy khuấy từ.............................................................................................. 27
Hình 3.7. Máy ly tâm lạnh.......................................................................................... 27
Hình 3.8. Bể ổn nhiệt ................................................................................................. 27
Hình 3.9. Hệ thống máy sắc ký lọc gel ............................................................................28
Hình 3.10. Máy đo OD .............................................................................................. 28
Hình 3.11. Cấu tạo hoá học phân tử Ninhydrin.......................................................... 33
Hình 3.12. Phương trình phản ứng Ninhydrin........................................................... 33
Hình 3.13. Sơ đồ tổng quát quy trình thực hiện đề tài ............................................... 41
Hình 4.1. Kết quả chạy điện di của các CPT enzyme collagenase............................. 64

xv


CHƯƠNG 1
MỞ ĐẦU

1.1. Đặt vấn đề
Trong thiên nhiên, đâu đâu cũng có sự sống. Nơi nào có sự sống nơi đó có các
hoạt động sống náo nhiệt: sinh trưởng, phát triển, sinh sôi nảy nở v.v…Những hoạt
động sống này gắn bó chặt chẽ với enzyme. Có thể nói từ khi trên trái đất có sự sống,
enzyme đã tham gia vào mọi hoạt động sống. Thế giới nếu không có enzyme cũng sẽ
không có sự sống.
Enzyme có thể tham gia vào bất kỳ quá trình nào của hoạt động sống. Hiện
tượng sống của sinh vật muôn màu nghìn vẻ: tiêu hóa, hô hấp, vận động, sinh đẻ, lớn
lên, phát dục ở động vật; nảy mầm, ra rễ, nở hoa, kết trái, quang hợp ở thực vật; phân
chia lên men ở vi sinh vật v.v… đều không tách rời với enzyme.
Đặc trưng cơ bản nhất của hoạt động sống là trao đổi chất. Qua hàng loạt các
phản ứng hóa học phân giải các chất cũ, tổng hợp các chất mới, đều cần đến rất nhiều

enzyme. Số lượng enzyme được các nhà khoa học phát hiện đã lên đến mấy nghìn. Sự
tồn tại của chúng đóng góp công lao cho hoạt động sống.
Trong vũ trụ chỉ có sinh vật mới tổng hợp được enzyme. Dù sinh vật bậc cao
hay bậc thấp đều có thể tổng hợp enzyme. Enzyme có bản chất của protein và có tính
đặc hiệu cơ chất, đặc hiệu phản ứng rất nghiêm ngặt. Nó không chỉ có thể thực hiện
khả năng xúc tác bên trong cơ thể mà còn có thể thực hiện cả những phản ứng bên
ngoài cơ thể khi tạo cho chúng những điều kiện thích hợp để hoạt động. Điều này đã
mở ra một trong những nghành công nghiệp hiện đại và phát triển nhất hiện nay:
nghành công nghiệp sản xuất enzyme đưa vào phục vụ cho cuộc sống. Enzyme có thể
được tổng hợp thu nhận từ các nguồn gốc khác nhau: động vật, thực vật, vi sinh vật.
Trong đó, enzyme thu nhận từ nguyên liệu vi sinh vật tương lai gần sẽ là hướng phát
triển chủ yếu. Bởi vì dùng vi sinh vật để sản xuất enzyme tương đối ổn định, không
chịu ảnh hưởng nhiều của thời tiết khí hậu, đồng thời sản lượng cao, dễ dàng sản xuất
1


ở qui mô lớn. Enzyme sản xuất bằng vi sinh vật phạm vi thích ứng với pH và nhiệt độ
tương đối rộng. Cộng thêm vào sự chọn lựa giống vi sinh vật và công nghệ gen người
ta tạo ra những chủng loại chế phẩm enzyme lý tưởng và làm tăng sản lượng của
enzyme.
Hiện nay, chế phẩm enzyme trên thế giới đã có đến mấy trăm loại. Mức tiêu thụ
enzyme vào năm 1990 đã đạt 1,7 tỷ USD. Riêng Trung Quốc đầu thập kỷ 60 chỉ có
một xưởng sản xuất enzyme, đến năm 1991 cả nước đã có 23 xưởng. Năm 1992, sản
lượng đạt 13.400 tấn. Với sự cải tiến về công nghệ, công nghệ enzyme đang bước vào
một thời kỳ phát triển mới, trở thành một lĩnh vực sôi nổi của nghành công nghệ cao.
Những năm gần đây, các nước trên thế giới đăng ký bản quyền chế phẩm enzyme đã
lên tới trên 1000 loại. Có thể thấy rằng, sự bùng nổ của công nghệ enzyme đã trở thành
một xu thế tất nhiên.
Cho đến hiện nay, thế giới vi sinh vật vẫn là một thế giới khổng lồ vô cùng rộng
lớn con người vẫn khổng thể nào khám phá khai thác hết. Cho nên, mặc dù có rất

nhiều công trình nghiên cứu về enzyme vi sinh vật và những ứng dụng của chúng
trong các lĩnh vực khác nhau song những điều bí ẩn kì diệu của chúng vẫn còn đó và
đang thu hút hấp dẫn đối với các nhà khoa học. Người ta vẫn luôn tìm kiếm những khả
năng bất ngờ thú vị của chúng để phục vụ cho cuộc sống, cải thiện cuộc sống, nâng
cao sản xuất.
Từ đó, với mục đích đóng góp phần nào vào sự hiểu biết về enzyme vi sinh vật
nói riêng và enzyme nói chung. Chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài:“ Nghiên Cứu Sự
Thủy Phân Enzyme Collagenase Từ Vi Khuẩn Bacillus subtilis Trên Các Cơ Chất
Khác Nhau và Tinh Sạch Enzyme Bằng Sắc Ký Lọc Gel”.
1.2. Mục tiêu của đề tài
Xác định tác nhân, tỉ lệ, nồng độ, tủa thích hợp thu CPT enzyme có hàm lượng
protein cao.
Khảo sát, kết luận về hoạt độ của enzyme sau khi được tủa bằng các tác nhân
aceton, cồn, muối amoni sunfat trên các cơ chất :casein, collagen, gelatin. Xác định cơ
chất đặc trưng của enzyme.
Xác định pH, nhiệt độ tối ưu cho hoạt động xúc tác của enzyme collagenase.
Bước đầu tinh sạch enzyme bằng sắc ký lọc gel Biogel P100.

2


Xác định trọng lượng phân tử collagenase từ vi khuẩn B.subtilis bằng phương
pháp điện di trên gel polyacrylamide.

3


CHƯƠNG 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. Đại cương về enzyme ( 1, 2, 5, 6)
2.1.1. Lịch sử phát hiện enzyme
Sự phát hiện enzyme cũng giống như mọi sự phát hiện khác, đều phải trải qua
một quá trình lâu dài.
Quan sát đầu tiên về quá trình phân rã xúc tác bởi enzyme được thực hiện bởi
Spallazani (1729-1799) – nhà tu hành đồng thời là nhà tự nhiên học ở Padua –
ITALYA. Ông cho chim ăn những hạt rỗng chứa thịt bên trong và thu được các hạt
rỗng sau quá trình tiêu hoá. Ông kết luận, thịt nằm bên trong hạt đã bị phân rã bởi dịch
dạ dày của chim. Vào khoảng năm 1750 nhà khoa học người Ý, Leomoli đã quan sát
cẩn thận quá trình tiêu hoá của chim ưng. Mọi người đã biết, chim ưng là loài chim ăn
thịt, nó có móng và mõ sắc nhọn, nhưng không có răng. Khi ăn chỉ xé xác con mồi, cả
lông lẫn xương đều nuốt vào dạ dày. Leomoli muốn quan sát xem con mồi đã bị tiêu
hoá ra sao trong dạ dày chim ưng, ông thiết kế một ống kim loại, trong ống chứa thịt
vụn, hai đầu ống được bịt bằng lưới kim loại, sau đó cho chim ưng nuốt. Sau một thời
gian lấy ống kim loại ra. Kết quả thấy rằng trong ống chứa một chất dịch trong suốt,
còn thịt vụn đã biến mất, tựa như đường tan trong nước vậy.
Vì ống kim loại ngăn không cho dạ dày bóp nát, chỉ cho phép dịch vị ngấm vào
trong nên Leomoli nghĩ rằng nhất định có một chất làm tiêu hoá được thịt. Năm 1815
Kirchhoiff phát hiện thấy ở mầm đại mạch có chứa protein gluten làm tan tinh bột
(thúc đẩy quá trình đường hoá ). Lại nói về thí nghiệm của Leomoli ở chim ưng. Năm
1824 có tác giả đã chứng minh là có axit trong dịch vị. Khi đó người ta đã biết axít có
thể phân giải bột thành đường, nên ông cho rằng thịt tan trong dạ dày chim ưng là kết
quả của phản ứng với axít.
Mười năm sau, T.A.HSchwann người Đức chiết suất từ dịch vị ra một chất bột,
có tác dụng tiêu hoá mạnh với thịt nhưng không chua. Schwann gọi chất này là pepsin.
4


Vậy là người ta đã tiến một bước dài trong quá trình tìm ra chất tiêu hoá thức ăn .
Cũng vào thời gian này khoảng năm 1833 có hai nhà khoa học người Đức

Payen và Pensoz đã phân li từ trong dịch mạch nha đã lên men đựơc rất nhiều nấm
men. Lại trải qua một quá trình lao động gian khổ nữa, họ tìm ra trong tế bào nấm men
một chất dạng bột có chức năng xúc tiến nhanh các quá trình phản ứng, đầu tiên họ đặt
tên là diastase (tiếng Hi Lạp có nghĩa là tách rời) cho đến nay người ta gọi chúng là
amylaza.
Nhà vi sinh vật học vĩ đại Louis Pasteur nghiên cứu cơ chế lên men đó 20 năm
trời. Ông cho rằng mọi quá trình lên men đều là kết quả tác dụng của VSV. Kết luận
này tương đối chính xác nhưng chưa phải là lời giải đáp cuối cùng. Vì người ta còn
hỏi:VSV lấy chất gì để tham dự vào quá trình lên men? Pasteur vẫn chưa giải đáp
được câu hỏi này. Mặc dù, ông đã chỉ rõ sự khác biệt giữa chất xúc tác có tổ chức gắn
với màng (vách) tế bào và chất xúc tác không có tổ chức gắn với màng (vách ) tế bào.
Sau này chất xúc tác không gắn với màng được Kuhne vào năm 1878 đặt tên là
enzyme.
Đến năm 1897, hai anh em Eduard và Hans Bucher đem lọc hết nấm men trong
dung dịch lên men và thu được dịch enzyme thuần khiết. Để bảo quản dịch enzyme
,cũng như mọi khi, họ cho rất nhiều đường mía vào. Sau một thời gian điều kì lạ đã
xuất hiện: đường mía cũng lên men sinh ra CO2 và rượu. Nghiên cứu của họ cho
chúng ta thấy rằng trong dịch men có chất xúc tác - nhiều loại enzyme. Có nghĩa là
enzyme ngoài tế bào vẫn có tác dụng.
Phát hiện của anh em Bucher đã mở rộng tầm nhìn của các nhà khoa học nghiên
cứu về các loại enzyme và cũng mở ra một con đường mới. Enzme cuối cùng cũng đã
được phát hiện và nhận thức. Chúng được đưa lên vũ đài sinh vật học hiện đại, đúng
vai trò quan trọng của mình.
2.1.2. Định nghĩa
Enzyme là protein xúc tác sinh học, do tế bào sống sản xuất ra, có tác dụng tăng
tốc độ và hiệu suất phản ứng hóa sinh, mà sau phản ứng vẫn còn giữ nguyên khả năng
xúc tác.(Theo tiếng Hi Lạp: -en có nghĩa là trong, còn -zyme có nghĩa là bột chua).
Sự hiểu biết về enzyme có ý nghĩa thực tiễn rất lớn. Rất nhiều dạng bệnh lý liên
quan trực tiếp đến sự vắng mặt hoặc xáo trộn mật độ của enzyme. Ngoài ra, càng ngày

5


enzyme càng được sử dụng rộng rãi trong chẩn đoán y học, trong công nghiệp hóa học,
trong công nghiệpVSV, trong chế biến thực phẩm và sản xuất nông nghiệp.
2.1.3. Cấu tạo enzyme
Cấu tạo phân tử enzyme rất tinh vi và phức tạp, có phân tử lượng lớn thường là
10.000 đến 100.000 Datol, đa số có dạng protein hình cầu.
Dựa vào thành phần hóa học của enzyme, người ta chia enzyme ra làm hai
nhóm lớn:
a) Enzyme một cấu tử: tức là trong thành phần cấu tạo chỉ có protein, sản
phẩm chỉ gồm các axit amin.
b) Enzyme hai cấu tử: trong thành phần của nó ngoài protein còn có một phần
phi protein (gọi là “nhóm ngoại”). Trong đó phần protein gọi là “feron” hay
“apoenzyme”, phần nhóm ngoại gọi là “agon” hay “coenzyme”. Nhóm ngoại enzyme
thường là các dẫn xuất của vitamin hòa tan trong nước, các kim loại, nucleotide…
Trung tâm hoạt động: mổi hoạt động xúc tác của enzyme đều thông qua bộ
phận đặc biệt, chiếm một phần rất nhỏ của phân tử enzyme gọi là trung tâm hoạt động
của enzyme .
Trung tâm này gồm một số nhóm của acid amin liên kết lại với nhau…(đối với
enzyme một cấu tử). Các gốc acid amin này không nhất thiết sắp xếp ở cạnh nhau
trong cấu trúc bậc 1 nhưng gần nhau trong cấu trúc bậc 2, 3 và 4.
Các nhóm chức của acid amin thường gặp trong trung tâm hoạt động của
enzyme là :
 Nhóm –SH (cysteine).
 Nhóm ε-NH2 (lysine).
 Nhóm –OH (serine, treonine, tyrosine).
 Nhóm –COOH (aspactic acid, glutamic acid).
 Vòng indol (tryptophan).
 Vòng imidazol (histidine).

 Nhóm guanilic (arginine).
Với enzyme hai cấu tử, ngoài một số nhóm chức của acid amin còn có nhóm
ngoại tham gia trung tâm hoạt động enzyme là những ion kim loại hóa trị hai như :Fe,
Co, Mn, Zn, Cu…
6


Phân tử enzyme cũng như trung tâm hoạt động của nó không có cấu tạo rắn
chắc mà mềm dẻo, cấu hình không gian có thể thay đổi khi tiếp xúc với cơ chất
…(theo thuyết “tiếp xúc cảm ứng” của Koslande).
Do đó khi thay đổi hình dạng phân tử enzyme dẫn đến khả năng xúc tác bị thay
đổi.
2.1.4. Danh pháp và phân loại
a) Danh pháp
Theo quy ước quốc tế, tên gọi của enzyme thường được gọi theo cơ chất đặc
hiệu của chúng cùng với tên kiểu phản ứng mà chúng tham gia. Theo đó tên một
enzyme thường có hai phần: phần đầu là tên cơ chất, trong trường hợp phản ứng đó là
phản ứng lưỡng phân thì phần thứ nhất là tên gọi của hai cơ chất viết cách nhau hai
chấm; phần sau chỉ khái quát bản thân của phản ứng .
Tuy nhiên có nhiều loại enzyme vì thói quen nên vẫn được gọi theo tên cũ,
không theo hệ thống phân loại. Ví dụ: trysin, chimotrypsin, pepsin…
b) Phân loại
Năm 1960, Hiệp hội hóa sinh hóa quốc tế (IUB) đã thống nhất phân loại
enzyme ra làm 6 lớp và được đánh số thứ tự từ 1 đến 6. Các số thứ tự này là cố định
cho mổi lớp.
 Enzyme oxi hóa-khử (Oxydoreductase): đây là loại enzyme xúc tác phản
ứng oxy hóa-khử.
 Enzyme vận chuyển (Transferase): loại enzyme này có thể xúc tác các chất
tham gia phản ứng để di chuyển một số gốc.
 Enzyme thủy phân (Hydrolase): enzyme thủy phân phân bố rất rộng trong

cơ thể sinh vật, chủng loại cũng rất nhiều. Chúng có thể thủy phân đối với gluxit, lipit,
protit khiến những chất này biến thành glucose, axit béo và các axit amin.
 Enzyme phân giải (Lyase): Tác dụng chủ yếu của chúng là xúc tác cho một
chất tách ra thành hai hoặc nhiều hợp chất khác.
 Enzyme dị cấu (Isomerase): chúng có thể làm cho các chất đồng phân dị cấu
(khác cấu trúc) chuyển hóa lẫn nhau.
 Enzyme tổng hợp (Lygase): Tác dụng của enzyme này là xúc tác để cho hai
chất hoặc nhiều chất phản ứng tổng hợp thành một chất mới.

7


2.1.5. Tính chất của enzyme
Vì enzyme có cấu tạo là protein nên chúng có đầy đủ tính chất của protein:
Tan trong nước, các dung dịch đệm, dung môi hưu cơ có cực khác, dung dịch
muối loãng , glycerin, khi hòa tan thì tạo thành dung dịch keo.
Không tan trong dung môi không phân cực.
Không thẩm tích qua màng bán thấm.
Dễ bị biến tính và có thể mất hoạt tính xúc tác khi chịu nhiệt độ cao, bởi tác
động bên ngoài hoặc các tác nhân hóa học .
Enzyme có tính lưỡng tính (do có nhóm –COOH và –NH2).
Trong dung dịch, enzyme dễ dàng bị kết tủa bởi các yếu tố vật lý và hóa học
vốn làm kết tủa protein (ví dụ: muối trung hòa sulphat amon, các dung môi hữu cơ như
acetone, ethanol) ở nhiệt độ thấp mà không làm mất hoạt tính enzyme. Do đó, để thu
chế phẩm enzyme ta có thể dùng các tác nhân này. Tuy nhiên, enzyme sẽ mất hoạt tính
xúc tác dưới tác dụng của các yếu tố gây biến tính protein như: nhiệt độ cao, acid hay
kiềm đặc, muối kim loại nặng nồng độ cao. Do đó người ta thường dùng các tác nhân
này để kìm hãm hoạt tính enzyme khi cần thiết .
2.1.6. Đặc điểm nổi bật của enzyme
Thứ nhất, enzyme xúc tác với hiệu quả cao. Chất xúc tác đều có thể ảnh hưởng

đến tốc độ của phản ứng hóa học, khiến cho phản ứng tăng nhanh hàng ngàn, vạn
lần, thậm chí còn cao hơn nữa. Về mặt này enzyme hơn hẳn, nó có thể làm tăng tốc
phản ứng lên hàng trăm triệu đến hàng chục tỷ lần.
Thứ hai, enzyme có tính chọn lựa rất cao, còn gọi là tính chuyên hóa. Có nghĩa
là mổi enzyme chỉ có thể xúc tác cho một loại phản ứng, tác dụng với một chất hoặc
một loại chất, giống như chìa khóa chỉ mở được một ổ khóa .
Thứ ba, enzyme rất nhạy bén với nhiệt độ cao. Phản ứng hóa học trong cơ thể
sinh vật đều xảy ra ở nhiệt độ thường, không cần đến nhiệt độ cao. Đó là một ưu
điểm tuyệt vời không đòi hỏi thiết bị gì mấy, không cần đến nhiều năng lượng so
với phản ứng hóa học thông thường. Như vậy, sẽ giảm giá thành.
2.1.7. Cơ chế tác dụng của enzyme
Enzyme là chất xúc tác sinh học, do đó mang đầy đủ các đặc điểm của chất xúc
tác nói chung. Nghĩa là chỉ cần một lượng nhỏ đã làm tăng đáng kể vận tốc phản ứng,

8


sau phản ứng chất xúc tác sẽ được hoàn lại với lượng và cấu tạo như ban đầu. Tuy
nhiên, enzyme có cường lực xúc tác mạnh hơn rất nhiều lần so với xúc tác vô cơ nghĩa
là lượng enzyme cần rất ít nhưng xúc tác chuyển hóa một lượng cơ chất rất lớn trong
một thời gian rất ngắn.
Enzyme có tác dụng làm giảm năng lượng hoạt hóa và làm cho phản ứng xảy ra
nhanh chóng, dễ dàng thông qua các phản ứng tạo phức trung gian. Khi đó tổng số
năng lượng hoạt hóa của chúng nhỏ hơn trường hợp không có chất xúc tác.
Sự tạo thành phức hợp ES và biến đổi phức này thành sản phẩm P trải qua ba
giai đoạn sau:
E + S ↔ES →E + P
E: enzyme; S: cơ chất; ES: phức hợp enzyme – cơ chất; P: sản phẩm.
Giai đoạn thứ nhất: enzyme kết hợp với cơ chất tạo thành phức hợp enzyme –cơ
chất (ES) không bền giữa enzyme và cơ chất hình thành liên kết giữa các nhóm hoạt

động trong trung tâm hoạt động của enzyme với cơ chất. Phản ứng ở giai đoạn này xảy
ra nhanh và đòi hỏi năng lượng hoạt hóa thấp.
Giai đoạn thứ hai: là giai đoạn tạo phức chất hoạt hóa, đây là giai đoạn xảy ra
sự biến đổi cơ chất dưới tác dụng của một số nhóm chức trong trung tâm hoạt động
của enzyme và làm cho cơ chất từ chỗ không hoạt động trở thành hoạt động, một số
liên kết trong cơ chất bị kéo căng ra và mật độ electron trong cơ chất bị thay đổi.
Giai đoạn thứ ba: là giai đoạn tạo ra sản phẩm và giải phóng enzyme, đây là
giai đoạn cuối quá trình phản ứng. Từ cơ chất sẽ hình thành sản phẩm và enzyme được
giải phóng dưới dạng tự do như ban đầu.
Trong quá trình tác động enzyme thể hiện tính đặc hiệu và linh động được giải
thích qua hai thuyết: “chìa khóa và ổ khóa” của Fischer và “tiếp xúc cảm ứng” của
Koslande.

2.1.8. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của enzyme
a) Nồng độ cơ chất
Tốc độ phản ứng enzyme phụ thuộc vào nồng độ cơ chất. Nồng độ cơ chất tăng
độ phản ứng xúc tác của enzyme tăng, nhưng khi nồng độ cơ chất tăng đến mức cao
thì tốc độ phản ứng đạt đến cực đại không tăng nữa. Thời điểm này enzyme bão hòa cơ
chất .

9


b) Nồng độ enzyme
Nếu cố định nồng độ cơ chất, tốc độ phản ứng xúc tác bởi enzyme tỉ lệ thuận
với hàm lượng enzyme nhưng khi tăng cao nồng độ enzyme thì tốc độ cũng không
tăng nữa .
c) Nhiệt độ
Nhiệt độ có tác dụng làm tăng tốc độ của phản ứng enzyme lên đến tốc độ cực
đại đến chừng nào enzyme chưa bị biến tính. Tuy nhiên tốc độ phản ứng enzyme

không phải lúc nào cũng tỷ lệ thuận với nhiệt độ phản ứng .Tốc độ phản ứng chỉ tăng
đến một giới hạn nhiệt độ nhất định.Vượt quá nhiệt độ đó, tốc độ phản ứng sẽ giảm và
dẫn đến mức triệt tiêu. Nhìn chung, nhiệt độ thích hợp của đa số enzyme nằm trong
khoảng 40oC -50oC (với enzyme từ động vật), 50o -60oC (với enzyme từ thực vật ).
Khi nhiệt độ tăng lên đến khoảng 60-70oC thì phần lớn các enzyme mất hẳn
hoạt tính và nhiệt độ đó gọi là nhiệt độ tới hạn.
Nhiệt độ quá thấp cũng làm giảm mạnh hoạt tính của enzyme, nhưng do trong
điều kiện này enzyme không bị biến tính nên khi đưa nhiệt độ trở lại điều kiện thích
hợp thì hoạt tính của enzyme lại được phục hồi.
Nhiệt độ tối thích của enzyme không phải là hằng số mà là còn phụ thuộc vào
nhiều yếu tố như cơ chất, pH môi trường, nồng độ enzyme, nguồn enzyme…đặc biệt
thời gian tác dụng càng dài thì nhiệt độ tối thích càng giảm.
Mổi enzyme yêu cầu một nhiệt độ xúc tác tối ưu riêng, ở nhiệt độ này tốc độ
phản ứng sẽ tăng từ 1÷2 lần.
d) pH
Enzyme rất nhạy cảm với pH của môi trường vì nó ảnh hưởng đến mức độ ion
hóa cơ chất, ion hóa enzyme và độ bền của protein - enzyme đa số enzyme đều bền
trong khoảng pH: 5÷9, độ bền của enzyme có thể tăng lên khi có các yếu tố làm bền
như: cơ chất, Ca2+ ..... mổi enzyme có một giá trị pH thích hợp riêng, không cố định
mà phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau như: bản chất hóa học, cơ chất, nhiệt độ
dung dịch đệm phản ứng…với nhiều enzyme protease, pH thích hợp ở vùng trung tính,
nhưng cũng có một số enzyme có pH thích hợp rất thấp (pepsin, protease acid của vi
sinh vật…) hoặc khá cao như trypsin có pH thích hợp 8÷9.

10