PHÁT HIỆN RICE GRASSY STUNT VIRUS (RGSV) GÂY BỆNH VÀNG LÙN TRÊN CÂY LÚA (Oryza sativa L.) BẰNG KỸ THUẬT DAS – ELISA VÀ RT – PCR

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
************

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

PHÁT HIỆN RICE GRASSY STUNT VIRUS (RGSV) GÂY
BỆNH VÀNG LÙN TRÊN CÂY LÚA (Oryza sativa L.)
BẰNG KỸ THUẬT DAS – ELISA VÀ RT – PCR

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Niên khóa : 2004-2008
Sinh viên thực hiện: NGUYỄN THỊ BẢO TRINH

Tháng 9/2008


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
************

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

PHÁT HIỆN RICE GRASSY STUNT VIRUS (RGSV) GÂY
BỆNH VÀNG LÙN TRÊN CÂY LÚA (Oryza sativa L.)
BẰNG KỸ THUẬT DAS – ELISA VÀ RT – PCR

Giáo viên hướng dẫn:
ThS. TRẦN THỊ VIỆT HÀ

Sinh viên thực hiện:
NGUYỄN THỊ BẢO TRINH

ThS. NGUYỄN THỊ HOA
ThS. NGUYỄN VŨ PHONG

Tháng 9/2008


LỜI CẢM TẠ
Để hoàn thành luận văn này con xin chân thành cảm tạ:
Gia đình là chỗ dựa về vật chất và tinh thần cho con trong suốt thời gian học tập
và làm luận văn.
Tôi xin chân thành cảm tạ:
Ban Giám Hiệu Trường Đại Học Nông Lâm Tp. HCM.
Ban Chủ Nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học cùng toàn thể quý Thầy Cô
trong bộ môn.s
ThS. Trần Thị Việt Hà, ThS. Nguyễn Thị Hoa, ThS. Nguyễn Vũ Phong đã tận
tình hướng dẫn tôi hoàn thành luận văn này.
Các thầy cô đã cho tôi nhiều kiến thức bổ ích.
Chị Nguyễn Thị Thu Hiền cùng các anh chị trong Trung Tâm Kiểm Dịch Thực
Vật Sau Nhập Khẩu II.
Các thầy cô, anh chị tại Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm trường Đại học
Nông Lâm đã giúp đỡ, tạo điều kiện cho tôi hoàn thành tốt luận văn.
Tập thể lớp Công Nghệ Sinh Học khóa 30 và tất cả các anh chị, bạn bè đã gắn
bó, góp sức cùng tôi trong suốt thời gian học tập và làm luận văn vừa qua.
Thành phố Hồ Chí Minh, 2008.
Sinh viên thực hiện
Nguyễn Thị Bảo Trinh

iii


TÓM TẮT
NGUYỄN THỊ BẢO TRINH. ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ
MINH, tháng 9/2008. ”Phát hiện Rice Grassy Stunt Virus (RGSV) trên cây lúa
(Oryza L. sativa) bằng kĩ thuật DAS-ELISA và RT-PCR”.
Đề tài được thực hiên tại Trung Tâm Kiểm Dịch Thực Vật Sau Nhập Khẩu II và Trung
Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh trường Đại học Nông Lâm.
 Thí nghiệm được thực hiện gồm 3 nội dung chính.
Mẫu được thu thấp theo triệu chứng nhiễm bệnh vàng lùn như: Cây lúa lùn,
mọc nhiều chồi, lá có xu hướng mọc thẳng đứng, lá vàng từ chóp lá vào tới bẹ lá,
thường có những đốm rỉ sắt trên bề mặt lá. Thu thập mẫu tại 3 địa điểm: Tiền Giang,
Cần Thơ, Bình Dương.
Xác định tác nhân gây bệnh vàng lùn bằng phương pháp DAS-ELISA. Mẫu
được phân tích là những lá lúa có triệu chứng bệnh virus.
Tiến hành ly trích RNA tổng số từ lá lúa bằng hai phương pháp: Ly trích bằng
TRIzol Reagent (Invitrogen) và mini Kit AurumTM total RNA (Bio-Rad).
Mẫu dương tính RGSV được chọn để thực hiện RT-PCR nhằm bước đầu xây
dựng quy trình RT-PCR để chẩn đoán RGSV. Từ đó, khẳng định lại kết quả ELISA
đồng thời sản phẩm thu được từ RT-PCR sẽ được dùng cho những nghiên cứu xa hơn.
 Kết quả thu được:
Đánh giá được hai phương pháp ly trích RNA tổng số. Đối với mẫu thí nghiệm
là lá lúa thì phương pháp ly trích bằng TRIzol cho hiệu quả cao hơn, giá thành của mỗi
mẫu ly trích thì gần như bằng nhau ở cả hai phương pháp tuy nhiên ly trích bằng
TRIzol thì độc hại hơn và tốn nhiều thời gian hơn.
Kết quả DAS-ELISA, đối với những mẫu thu thập được mà có triệu chứng đặc
trưng của bệnh vàng lùn thì cho kết quả ELISA rất tốt hầu như các mẫu thu thập đều
nhiễm RGSV.

Bước đầu tìm được một quy trình RT-PCR tạo ra sản phẩm khá đặc hiệu dùng
phát hiện sự hiện diện RGSV trong mẫu lá lúa nhiễm bệnh.

iv


SUMMARY
This is Nguyen Thi Bao Trinh studying at Nong Lam University. September, 2008.
The thesis entitled “Detection Rice Grassy Stunt Virus on rice (Oryza sativa) by
DAS-ELISA and RT-PCR methol”.
 The objects of this research are as follows:
- Collecting the samples with the virus symptoms in Tien Giang province, Can Tho
province and Binh Duong province.
- Diagnosing RGSV by DAS-ELISA.
- Isolation total RNA with TRIzol Reagent (Invitrogen) and mini Kit AurumTM
total RNA (Bio-Rad).
- Detection RGSV by RT-PCR methol.
 Results
- Comparing the two methol such as TRIzol Reagent (Invitrogen) and mini Kit
AurumTM total RNA (Bio-Rad). With rice leaves, The TRIzol is better than The mini
Kit AurumTM total RNA.
- DAS-ELISA result data show that all collected sample infect with Rice Grassy
Stunt Virus.
- Finding out the RT-PCR process that can amplify the pretty specific product.

v


MỤC LỤC
LỜI CẢM TẠ .........................................................................................................iii

TÓM TẮT ............................................................................................................... iv
SUMMARY.............................................................................................................. v
MỤC LỤC ............................................................................................................... vi
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT .................................................................... ix
DANH SÁCH CÁC HÌNH....................................................................................... x
DANH SÁCH CÁC BẢNG ...................................................................................xii
Chương 1 GIỚI THIỆU........................................................................................... 1
1.1 Đặt vấn đề........................................................................................................... 1
1.2 Mục đích ............................................................................................................ 2
1.3 Yêu cầu ............................................................................................................... 2
1.4 Giới hạn đề tài .................................................................................................... 2
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU....................................................................... 3
2.1 Sơ lược về cây lúa .............................................................................................. 3
2.1.1 Phân loại khoa học........................................................................................... 3
2.1.2 Nguồn gốc và phân bố..................................................................................... 3
2.1.3 Đặc điểm thực vật học ..................................................................................... 4
2.1.3.1 Bộ rễ lúa........................................................................................................ 4
2.1.3.2 Thân lúa ........................................................................................................ 4
2.1.3.3 Lá lúa ............................................................................................................ 5
2.1.3.4 Bông và hạt lúa............................................................................................. 5
2.1.4 Tầm quan trọng kinh tế.................................................................................... 6
2.1.5 Các bệnh virus thường gặp trên lúa................................................................ 6
2.2 Sơ lược về virus gây bệnh vàng lùn ................................................................. 7
2.2.1 Virus gây bệnh vàng lùn ................................................................................. 7
2.2.1.1 Tên gọi và phân loại ..................................................................................... 7
2.2.1.2 Cấu trúc thể virus ......................................................................................... 7
2.2.1.3 Cấu tạo genome của virus............................................................................. 8
2.2.1.4 Sự truyền bệnh ........................................................................................... 11
2.2.2 Dòng cây kí chủ và triệu chứng của bệnh ..................................................... 12
vi

2.2.3 Phân biệt bệnh vàng lùn với các triệu chứng bệnh khác ............................... 13
2.2.4 Môi giới truyền virus gây bệnh vàng lùn ...................................................... 14
2.2.4.1 Mô tả rầy nâu.............................................................................................. 15
2.2.4.2 Vòng đời của rầy nâu.................................................................................. 15
2.2.4.3 Đặc điểm gây hại ........................................................................................ 16
2.2.4.4 Tác hại về kinh tế của rầy nâu và virus RGSV ......................................... 17
2.3 Các phương pháp xác định bệnh virus trên thực vật ....................................... 17
2.3.1 Phương pháp cây chỉ thị ................................................................................ 17
2.3.2 Phương pháp chẩn đoán bằng kính hiển vi điện tử ....................................... 18
2.3.3 Phương pháp huyết thanh .............................................................................. 18
2.4 Giới thiệu về kĩ thuật ELISA ........................................................................... 18
2.4.1 Nguyên tắc chung .......................................................................................... 18
2.4.2 Phân loại ....................................................................................................... 19
2.5 Giới thiệu về kĩ thuật PCR và RT-PCR............................................................ 21
2.5.1 Giới thiệu về kĩ thuật PCR ............................................................................ 21
2.5.2 Giới thiệu về kĩ thuật RT-PCR ...................................................................... 23
2.6 Các nghiên cứu về RGSV và bệnh vàng lùn ................................................... 26
2.6.1 Tại Việt Nam ................................................................................................ 26
2.6.2 Trên thế giới .................................................................................................. 27
Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.............................. 28
3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu .................................................................... 28
3.2 Nội dung nghiên cứu ........................................................................................ 28
3.3 Dụng cụ và thiết bị .......................................................................................... 28
3.4 Hóa chất ........................................................................................................... 28
3.5 Phương pháp thực hiện..................................................................................... 29
3.5.1 Thu thập và bảo quản mẫu lúa....................................................................... 29
3.5.2 Phương pháp DAS-ELISA ............................................................................ 29
3.5.3 Phương pháp RT-PCR................................................................................... 31

3.5.4 Phân tích sản phẩm PCR ............................................................................... 36
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN............................................................... 37
4.1 Thu thập mẫu .................................................................................................... 37
4.2 Kết quả thu được từ thí nghiệm ELISA ........................................................... 39
vii


4.3 Kết quả ly trích RNA........................................................................................ 42
4.4 So sánh giữa phương pháp ly trich1TRIzol (Ivitrogen) và
AurumTM total RNA mini Kit của Bio-rad ...................................................... 45
4.5 Kết quả RT-PCR .............................................................................................. 47
4.6 So sánh kĩ thuật ELISA và RT-PCR ................................................................ 51
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .................................................................. 53
5.1 Kết luận............................................................................................................. 53
5.2 Đề nghị ............................................................................................................. 53
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 54
PHỤ LỤC

viii


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
RGSV:

Rice Grassy Stunt Virus.

RSV:

Rice Stripe Tenuivirus.

TSWV:

Tomato Spotted Wilt Virus.

INSV:

Impatiens Necrotic Spot Virus

ELISA:

Enzyme Linked Immunosorbent Assay.

DAS-ELISA: Double Antibody Sanwich-Enzyme Linked Immunosorbent Assay.
RT-PCR:

Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction.

nu:

Nucleotide.

cDNA:

complementary DNA

ssRNA :

single strand RNA.

ORF:

Open Reading Frame.

Bp:

Base pair

DEPC:

Diethyl Pyrocarbonate

DNA:

Deoxyribonucleic Acid

dNTP:

Deoxyribonucleoside Triphosphate

dsRNA:

double stranded RNA

k Da:

Kilo Dalton

kg:

Kilogram

ml:

Mililitre

µl:

Microlitre

µm:

Micrometre

mm:

Milimetre

mRNA:

Messenger RNA

PCR:

Polymerase Chain Reaction

RdRp:

RNA dependent RNA polymerase

RNA:

Ribonucleic Acid

ix


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Hình 1-Cây lúa................................................................................................................3
Hình 2-Các bộ phận của cây lúa .....................................................................................5
Hình 3-Quan sát RGSV dưới kính hiển vi điện tử..........................................................8
Hình 4-RNA lưỡng tính và sự biểu hiện của nó ............................................................9
Hình 5-Sơ đồ cấu trúc bộ gen của RGSV.....................................................................11
Hình 6 -Lúa nhiễm RGSV ............................................................................................13
Hình 7.1-Lúa nhiễm RGSV……. .................................................................................14
Hình 7.2-Lúa bị ngộ độc hữu cơ................................................................................. s14
Hình 8-Rầy nâu .............................................................................................................15
Hình 9-Cơ chế truyền bệnh của rầy nâu .......................................................................16
Hình 10-ELISA sandwish.............................................................................................20
Hình 11-ELISA gián tiếp..............................................................................................20
Hình 12-Sơ đồ phản ứng PCR ......................................................................................23
Hình 13-Sơ đồ phản ứng RT-PCR................................................................................24
Hình 14-Sơ đồ tổng hợp cDNA ...................................................................................25
Hình 15-Kích thước RNA ly trích từ thực vật .............................................................34
Hình 16-Lúa nghi ngờ nhiễm RGSV tại Tiền Giang....................................................38
Hình 17-Lúa nghi ngờ nhiễm RGSV tại Cần Thơ........................................................38
Hình 18-Lúa nghi ngờ nhiễm RGSV tại Bình Dương..................................................39
Hình 19-Bản ELISA hoàn tất kiểm tra RGSV của lá lúa ở Tiền Giang.......................40
Hình 20-Bản ELISA hoàn tất kiểm tra RGSV của lúa ở Cần Thơ ..............................41
Hình 21-Bản ELISA hoàn tất kiểm tra RGSV của lúa ở Bình Dương ........................42
Hình 22-Ly trích RNA trên lá lúa ở Tiền Giang...........................................................43

Hình 23-Ly trích RNA trên lá lúa ở Cần Thơ...............................................................44
Hình 24-Ly trích RNA trên lá lúa ở Bình Dương.........................................................45
Hình 25-Kiểm tra RNA ly trích AurumTM total RNA mini Kit cỉa Bio-Rad ...............46
Hình 26-Kiểm tra RNA ly trích bằng TRIzol (Invitrogen)...........................................46
Hình 27-Kiểm tra kích thước RNA ly trích từ lá lúa...................................................47
Hình 28-Kết quả RT-PCR lần 1....................................................................................48
Hình 29-Kết quả PCR lần thứ 4....................................................................................49
x


Hình 30-Kết quả PCR lần thứ 5....................................................................................50
Hình 31-Kết quả chạy PCR lần 6..................................................................................51

xi


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng 1-Kết quả ELISA mẫu ở Tiền Giang...................................................................40
Bảng 2-Kết quả ELISA mẫu ở Cần Thơ .......................................................................41
Bảng 3-Kết quả ELISA mẫu ở Bình Dương .................................................................42

xii


Chương 1

GIỚI THIỆU
1.1 Đặt vấn đề
Lúa gạo là một trong năm cây lương thực chính trên thế giới. Theo Ronald
Cantrell, tổng giám đốc Viện Nghiên Cứu Lúa Gạo Quốc Tế (IRRI), không một hoạt

động kinh tế nào nuôi sống nhiều người và hỗ trợ nhiều gia đình bằng việc sản xuất lúa
gạo. Sản xuất lúa gạo ở Việt Nam không chỉ đáp ứng cho nhu cầu lương thực thực
phẩm trong nước mà còn xuất khẩu ra các nước trên thế giới. Việt Nam đứng hàng thứ
hai thế giới về xuất khẩu lúa gạo với 5,3 triệu tấn năm 2005 thu về gần 1,3 tỉ USD
( 2006/12/641541). Tuy nhiên bên cạnh những thành quả
đó, sản xuất lúa gạo đang đối mặt với dịch bệnh bùng phát mạnh tại các tỉnh đồng
bằng sông Cửu Long. Dịch vàng lùn do Rice Grassy Stunt virus (RGSV) và virus này
còn có môi giới truyền bệnh là rầy nâu (Niparvata lugens). Thiệt hại kinh tế rất lớn bởi
khi hiện tượng cháy rầy xảy ra thì kèm theo dịch bệnh do virus RGSV gây bệnh vàng
lùn với các triệu chứng như cây lúa lùn, đâm nhiều chồi, lá vàng, thường không cho
sản lượng. Trong năm 2006, nhiều tỉnh đã phải tổ chức thiêu hủy hàng ngàn hecta lúa
bị nhiễm bệnh. Đến cuối năm 2006 thì tổng cộng có 21 tỉnh, thành bị dịch bệnh với
diện tích khoảng 500.000 triệu ha ước tính sản lượng giảm gần 825.000 tấn, thiệt hại
khoảng 2000 tỉ và ảnh hưởng đến 2,5 triệu người.( />Index.aspx?Article ID= 170744& Channel ID= 3).
Đứng trước nguy cơ thiệt hại về kinh tế, giảm sản lượng xuất khẩu, ảnh hưởng
đến thu nhập của người dân trồng lúa thậm chính có thể dẫn đến nguy cơ thiếu lương
thực, thì các cơ quan nông nghiệp, viện nghiên cứu, chi cục bảo vệ thực vật…ra sức
tuyên truyền các nguy cơ, triệu chứng, các biện pháp phòng chống dịch, góp phần
trong công tác ngăn chặn dịch bệnh. Việc áp dụng thành công các biện pháp phòng
chống dịch bệnh còn yêu cầu một kĩ thuật chuẩn đóan bệnh chính xác, đơn giản và giá
thành hạ bởi việu tiêu hủy một nguồn bệnh chỉ có ý nghĩa khi các ổ dịch được phát
hiện sớm, kịp thời và được kiểm tra trên tòan bộ diện tích đang canh tác. Hiện nay,
phương pháp ELISA dùng để chẩn đoán virus gây bệnh thực vật được xem là phương
pháp có nhiều ưu điểm như: Nhanh, kiểm tra được lượng mẫu nhiều, phát hiện nồng
1


độ pha loãng cao, giá thành kinh tế ở mức có thể chấp nhận được và được ứng dụng
nhiều trong các phòng thí nghiệm. Bên cạnh đó thì kĩ thuật RT-PCR dùng chẩn đoán
virus cũng góp phần vào công tác xác định bệnh do độ nhạy cao có thể giúp chẩn đoán

bệnh chính xác do có một số bệnh trên đồng ruộng như ngộ độc hữu cơ, ngộ độc phèn,
cháy lá có các triệu chứng gần giống như bệnh vàng lùn nên cần có biện pháp chẩn
đoán chính xác để có thể đưa ra biện pháp phòng trừ hiệu quả.
Xuất phát từ thực tế trên cùng với sự chấp nhận của Bộ Môn Công Nghệ Sinh
Học, Trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh, chúng tôi tiến hành. Đề tài “Phát
hiện Rice Grassy Stunt Virus-RGSV gây bệnh vàng lùn trên cây lúa (Oryza L.
sativa) bằng kỹ thuật DAS-ELISA và RT-PCR” nhằm góp phần kiểm soát dịch
bệnh.
1.2 Mục đích
Xác định RGSV hiện diện trong những mẩu lá lúa có triệu chứng đặc trưng
bệnh vàng lùn bằng kĩ thuật DAS-ELISA.
Xây dựng hoàn chỉnh phương pháp chẩn đoán RGSV bằng kĩ thuật RT-PCR.
1.3 Yêu cầu
- Thu thập những cây lúa có triệu chứng bệnh đặc trưng.
- Tiến hành xét nghiệm ELISA đối với những mẫu lúa thể hiện triệu chứng
bệnh vàng lùn.
- Ly trích được RNA từ mẫu lá lúa có độ tinh sạch cao, lượng RNA cao để thực
hiện các bước phân tích tiếp theo.
- Xây dựng quy trình RT-PCR trong giám định RGSV.
1.4 Giới hạn của đề tài

- Khóa luận được thực hiện từ tháng 4/2008 đến tháng 9/2008.
- Đề tài thực hiện trên đối tượng là Rice Grassy Stunt Virus gây bệnh vàng lùn
trên lúa (Oryza sativa).
- Chỉ nghiên cứu về kĩ thuật DAS-ELISA và RT-PCR để chẩn đoán RGSV.

2


Chương 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Sơ lược về cây lúa
2.1.1 Phân loại khoa học
Giới: Plantea
Ngành: Magnoliophyta
Lớp: Liliopsida
Bộ: Poales
Họ: Poaceae
Chi: Oryza
Các loài
-Oryza glaberrima
-Oryza sativa

Hình 1-Cây lúa.
(Nguồn: />2.1.2 Nguồn gốc và phân bố
Người ta cho rằng tổ tiên của chi lúa Oryza là một loài cây hoang dại trên siêu
lục địa Gondwana cách đây ít nhất 130 triệu năm và phát tán rộng khắp các châu lục
trong quá trình trôi dạt lục địa. Hiện nay có khoảng 21 loài cây hoang dại thuộc chi
này và hai loài lúa được thuần hóa là lúa Châu Á (Oryza sativa) và lúa Châu Phi
(Oryza glaberrima). Tổ tiên lúa Châu Á O. sativa là một loài lúa hoang phổ biến
Oryza rufipogon dường như có nguồn tại khu vực xung quanh chân núi Himalaya, với
O. sativa thứ indica ở phía Ấn Độ và O. sativa thứ japonica ở phía Trung Quốc. Hiện
nay đây là giống lúa chính được gieo trồng làm cây lương thực trên khắp thế giới.

3


O. sativa đã thích nghi với việc gieo trồng tại Trung Đông và Địa Trung Hải
của Châu Âu vào khoảng năm 800 trước công nguyên. Thời gian sau của thế kỉ 15, thì

lúa đã được trải rộng tới Ý và sau đó là Pháp và sau đó là tất cả các Châu Lục khác
trong thời kì khám phá và chinh phục lớn của người Châu Âu. Năm 1694, lúa đến nam
Carolina, có lẽ có nguồn gốc từ Madagascar. Người Tây Ban Nha đem các giống lúa
tới Nam Mĩ vào đầu thế kỉ 18 ().
2.1.3 Đặc điểm thực vật học
Các giống lúa Việt Nam có những đặc điểm như chiều cao, thời gian sinh
trưởng (dài hay ngắn), chịu thâm canh, chịu chua mặn, chống chịu sâu bệnh...khác
nhau. Song cây lúa Việt Nam đều có những đặc tính chung về hình thái, giải phẫu và
đều có chung các bộ phận rễ, thân, lá, bông và hạt.
( />
01_dacdiemthucvathoc.htm).

2.1.3.1 Bộ rễ lúa
Bộ rễ lúa thuộc loại rễ chùm. Những rễ non có màu trắng sữa, rễ trưởng thành
có màu vàng nâu và nâu đậm, rễ đã già có màu đen. Tùy từng thời kì phát triển mà rễ
lúa có chiều dài khác nhau như: Rễ mạ dài 5-6 cm. Bộ rễ phát triễn mạnh suốt thời kì
đẻ nhánh, làm đồng. Thời kì trổ bông bộ rễ có thể đạt 2-3 km/cây ( />01_ acdiemthucvathoc.htm).
2.1.3.2 Thân lúa
Thân gồm nhiều mắt và lóng. Trước thời kỳ lúa trỗ bông, thân lúa được bao bọc
bởi bẹ lá. Chỉ vài lóng ở ngọn dài ra, số còn lại ngắn và dày đặc. Lóng trên cùng dài
nhất. Cây lúa có thể đẻ nhánh khi có 4-5 lá thật. Từ cây mẹ đẻ ra nhánh con (cấp 1),
nhánh cấp 1 đẻ nhánh cấp 2, nhánh cấp 2 đẻ nhánh cấp 3. Những nhánh hình thành vào
giai đoạn cuối thường là nhánh vô hiệu. Khả năng đẻ nhánh của cây lúa phụ thuộc vào
giống, nhất là điều kiện chăm sóc, ngoại cảnh...cây lúa có nhiều nhánh, tỷ lệ nhánh
hữu hiệu cao, năng suất sẽ cao.

4


2.1.3.3 Lá lúa

Lá lúa điển hình gồm: Bẹ lá, phiến lá, lá thìa và tai lá. Bẹ lá: Là phần đáy lá
kéo dài cuộn thành hình trụ và bao phần non của thân. Phiến lá: Hẹp, phẳng và dài hơn
bẹ lá (trừ lá thứ hai). Lá thìa: Là vảy nhỏ và trắng hình tam giác. Tai lá: Một cặp tai lá
hình lưỡi liềm. Số lá trên cây phụ thuộc chủ yếu vào giống, thời vụ cấy, biện pháp bón
phân và qúa trình chăm sóc. Thường số lá của các giống: Giống lúa ngắn ngày: 12-15
lá, giống lúa trung ngày: 16-18 lá, giống lúa dài ngày: 18-20 lá.
2.1.3.4 Bông và hạt lúa
Thời gian hình thành bông kể từ khi cây lúa bắt đầu phân hoá đòng cho đến khi
lúa trỗ bông. Thời kỳ này nếu được chăm bón tốt, cây lúa đủ dinh dưỡng bông lúa sẽ
phát triển đầy đủ giữ nguyên được đặc tính của giống. Thời gian phát triển bông ở
giống ngắn ngày ngắn hơn ở giống dài ngày.
Hạt lúa gồm: Gạo lức và vỏ trấu.
Gạo lức gồm: Phôi và phôi nhũ.

Hình 2-Các bộ phận của cây lúa.
(Nguồn: />5


2.1.4 Tầm quan trọng kinh tế
Lúa gạo đóng vai trò cốt lõi trong việc phát triển của nhiều quốc gia. Việc sản
xuất lúa gạo nuôi sống gần một nửa hành tinh mỗi ngày, cung cấp hầu hết thu nhập
chính cho hàng triệu hộ gia đình ở vùng quê nghèo khó và lúa gạo cũng có thể lật đổ
chính quyền.
Tuy nhiên, lúa gạo còn rất nhiều điều ấn tượng và quan trọng hơn, đó là những
thành công rất to lớn đã đạt được trong việc dùng lúa gạo để nâng cao đời sống của
những người nghèo khổ trên thế giới. Bằng cách cung cấp cho những người nông dân
trồng lúa những sự chọn lựa và những kĩ thuật mới, giúp người nông dân tăng gia sản
xuất. Và như vậy lúa gạo đã giúp cho thế giới chúng ta được nuôi dưỡng, có công ăn
việc làm ổn định (Nguyễn Ngọc Chinh, 2002).
Châu Á đã thực hiện một cuộc phát triển kinh tế ngoạn mục. Theo thống kê của

Cơ quan Thực phẩm Liên hiệp quốc, trên thế giới có khoảng 147,5 triệu ha đất dùng
cho việc trồng lúa, và 90% diện tích này là thuộc các nước Á châu. Các nước Á châu
cũng sản xuất khoảng 92% tổng sản lượng lúa gạo trên thế giới. Ngày nay, Thái Lan
và Việt Nam là hai nước xuất cảng gạo hàng đầu trong thị trường lúa gạo thế giới.
( />2.1.5 Các bệnh virus thường gặp trên lúa
Có nhiều tác nhân gây bệnh trên lúa như: Nấm, vi khuẩn, tuyến trùng…Trong
các tác nhân gây bệnh đó, bệnh virus gây thiệt hại lớn nhất không phải làm cho cây
trồng bị chết nhanh chóng mà chính là chúng làm cho cây trồng bị thoái hóa, giảm sức
sống, dần dần tàn lụi.
Virus cũng có thể gây nên những thiệt hại nặng nề và nhanh chóng. Các bệnh
gây ra do virus thường đi kèm với tác hại gây ra bởi vector truyền bệnh một số bệnh
phổ biến thường gặp: Tungro (Nephotettix sp.), bệnh vàng lụi (Nephotettix sp.), bệnh
lúa lùn (Nephotettix sp.), bệnh đốm sọc đen lụi (Laodelphax sp.), bệnh vàng lá
(Nephotettix sp.).
Thiệt hại quan trọng thứ hai của virus là ảnh hưởng của bệnh tới phẩm chất và
chất lượng của các sản phẩm nông nghiệp: Hạt lúa bị bệnh vàng lụi thường bị lép
6


không cho thu hoạch, trong trường hợp được thu hoạch hạt rất nhỏ và hạt gạo bị đen,
khi ăn có vị đắng.
Bệnh virus còn nguy hiểm ở chỗ: Virus kí sinh bắt buộc trong tế bào cây kí chủ
vì vậy khi tế bào bị hủy hoại, chết, virus cũng mất hoạt tính theo. Khi tế bào non phát
triển mạnh, virus cũng phát triển mạnh, tạo ra những triệu chứng điển hình trên cây
non hay bộ phận non của một cây.
Cho đến hiện nay người ta đã phát hiện ra 15 loại bệnh do virus gây hại trên
lúa: Bệnh lúa lùn, bệnh lúa sọc, bệnh vàng lụi, bệnh đốm sọc đen lụi, bệnh trắng lá,
bệnh vàng lá biến động, bệnh Tungro, bệnh lùn lúa cỏ, bệnh lùn xoắn lá lúa, bệnh lá da
cam, bệnh khảm vàng, bệnh hoa lá, bệnh hoa lá chết mô.
2.2 Sơ lược về virus gây bệnh vàng lùn

2.2.1 Virus gây bệnh vàng lùn (rice grassy stunt virus-RGSV)
2.2.1.1 Tên gọi và phân loại
Tên thông dụng
Virus gây bệnh lùn lúa cỏ (Rice Grassy Stunt Virus) RGSV
Vị trí của sự phân loại
Nhóm: Nhóm V ((-)ssRNA)
Họ: Unassigned virus
Nòi: Tenuivirus
Loài: Rice Grassy Stunt Virus
Điểm chú ý trong phân loại và danh pháp
Tên gọi của RGSV xuất phát từ những triệu chứng gây bệnh lùn giống như bụi
cỏ rất dễ nhận thấy trên cây lúa. Trước đây, virus này đã được xác định và có tên là:
Rice rosette virus. RGSV được mô tả đặc tính bởi Hibino và cộng tác viên nghi ngờ
thuộc vào nhóm Rice stripe tenuivirus (RSV).
2.2.1.2 Cấu trúc thể virus
Thể virus sau khi được ly trích có dạng sợi dài cho đến 2 μm và rộng 6-8 nm
khi được quan sát trong uranyl acetate (Cabauatan và ctv, 1985; Hibino và ctv, 1985a;
Hibino và ctv, 1985b; Iwasaki và ctv, 1985b). Nhiều thể virus có dạng sợi cuộn tròn có

7


chu vi 200-2400 nm (trung bình 950-1350 nm) cũng được tìm thấy (Hibino và ctv,
1985a; Hibino và ctv, 1985b). Thể virus rộng khoảng 4 nm khi được xem trong
phosphotungstate.
Lúa bị nhiễm virus có nhiều bó sợi được quan sát trong nhân và tế bào chất
hoặc trong các thể có màng bao bọc hiện diện ở phần tế bào chất của các tế bào diệp
lục (Chen và ctv, 1979; Pellegrini và Bassi, 1978).
Các thể hình ống đi kèm với các hạt có đường kính 25 nm còn được tìm thấy
trong các tế bào mạch rây của lá lúa bệnh (Pellegrini và Bassi, 1978; Shikata và ctv,

1980). Các hạt 25 nm tương tự cũng xuất hiện dưới dạng các mảng kết tinh trong các
thể béo và khí quản của rầy nâu nhiễm virus (Shikata và ctv, 1980).

Hình 3-Quan sát RGSV dưới kính hiển vi điện tử.
(xem trong dung dịch uranyl acetate 1%. Thanh đen dài 100 nm (Nguồn: DPV))
2.2.1.3 Cấu tạo genome của RGSV
Bộ gen của RGSV có 6 đoạn RNA khác nhau, trong khi các tenuivirus khác có
ít hơn, thường là 4 hay 5. Tất cả 6 đoạn RNA của bộ gene virus đều đã được đọc mã
(xem chi tiết tại trang web của NCBI: ). Tổng chiều dài
bộ gene của RGSV là 25142 nu. Cả 6 đoạn RNA đều lưỡng tính (ambisense, mã hoá
protein theo cả 2 chiều dương và chiều bổ sung của phân tử RNA) và đều mang đoạn
mã kết thúc dài 17 nu tương tự nhau. Các đoạn mã kết thúc này có khả năng tự cuốn
lại và tạo nên cấu trúc hình cán chảo. Các đoạn RNA 1, 2, 5 và 6 của RGSV lớn hơn

8


so với các tenuivirus khác, nhưng mỗi ORF hầu như vẫn có cùng kích thước. Khác
biệt này là do vùng không mã hóa của chúng dài hơn.

Hình 4-RNA lưỡng tính và sự biểu hiện của nó.
(Nguồn: Theo Mayo ctv, 2000)
RNA1
Đoạn RNA1 dài 9760 nu, hơn 790 nu so với của RSV (Rice Stripe Tenuivirus).
Đoạn RNA này có mang một trình tự ORF trên trình tự bổ sung bắt đầu là codon khởi
sự AUG ở vị trí 209-211 kéo dài đến codon kết thúc UAG (8984-8986). Sản phẩm
phiên mã của ORF này là một protein gồm 2925 acid amine (khoảng 339.1 KDa)
tương tự với protein RNA polymerase được mã hóa bởi RNA1 của RSV. Ngoài ra còn
có 2 ORF ở gần đầu 5’ của chính RNA1 này. Dữ liệu nghiên cứu cho thấy trình tự nu
của RNA1 và trình tự acid amine của protein 339.1 K có sự tương tự khác nhau so với

trình tự của RSV và các phlebovirus khác của họ Bunyaviridae. So sánh 2140 acid
amine giữa RGSV và RSV cho thấy sự giống nhau là 37,9%, sự tương tự là 74,4%,
vùng có sự tương tự cao nhất là 1350-2000 ở đầu N, giống nhau đến 54%. Trong khi
đó sự tương tự so với các phlebovirus khác lại thấp hơn, khoảng 36%. Như vậy, RNA
polymerase của RGSV và RSV khá tương tự nhau và trình tự vùng này cũng có kích
thước tương đối giống so với các polymerase của phlebovirus và các virus liên quan
khác, tuy nhiên vùng ở 2 đầu trình tự (500 acid amine đầu N và 300 đầu C) lại cho sự
tương tự thấp, chỉ khoảng 20%.

9


Protein 339,1K này có một domain giàu Arg/Gly (R/G) là motif gắn RNA ở đầu
C PDSQFPTYNPPSSRGRGRRGRGRSYMF-(C terminus), và ở đầu C có 27 acid
amine hình thành vùng ưa nước và cấu trúc Beta riêng biệt, nên phần này chính là
phần protein phơi bày trên bề mặt.
Đầu C của protein RNA polymerase là phần giàu các aa có tính ưa acid như
Asp, Glu. Vùng ưa acid tương tự cũng được tìm thấy ở protein 339,1K của RGSV,
vùng này có lẽ cần thiết cho sự tương tác với khuôn RNA hay cho sự gấp cuộn của
chính protein polymerase. Protein L của TSWV (BR-01) có đầu C ưa acid mạnh với 5
Asp và 5 Glu, nhưng vùng này lại không có trên protein L của INSV, nên dường như
vùng ưa acid không phải là trình tự thiết yếu phổ biến. Vì vậy motif gắn RNA trong
gen RNA polymerase của RGSV có thể mang tính chuyên biệt cho virus đó cũng như
cho cả cấu trúc RNA lưỡng tính.
RNA2
RNA2 gồm 4056 nu với 2 ORF, một ở RNA2 và một trên RNA2 bổ sung. Vùng
568 nu giữa hai ORF này là vùng giàu oligo (A). Hai protein được mã hóa từ RNA2
cũng khá tương đồng với các protein của RNA2 ở các chủng tenuivirus khác. Protein
23±3K cho độ tương đồng yếu nhưng có ý nghĩa: 22-30% độ giống nhau, 65% độ
tương tự. Còn protein 93±9K thì khoảng: 21% độ giống nhau, 67% độ tương tự.

RNA3 và RNA4
Có chiều dài tương ứng là 3123 và 2915 nu, cũng giống như các đoạn RNA
khác của RGSV, chúng có một ORF trên RNA gốc và một ORF trên đoạn bổ sung.
Vùng giữa hai ORF trên RNA3 rất dài, khoảng 1382 nu với nhiều đoạn lặp lại. Trong
vùng này có nhiều oligo (A) và 11 phần AU lặp lại. Còn ở RNA4 thì chỉ có 2 oligo (G)
và oligo (U). Các protein mã hóa bởi RNA3 và 4 cho sự tương đồng rất thấp so với các
protein của các tenuivirus khác.
RNA5 và RNA6
Có trình tự nucleotide tương ứng 2704 và 2584 nu các đoạn RNA5, 6 tương
ứng với RNA 3, 4 của RSV. Protein vỏ (N-nucleocapsid) của RGSV được mã hóa bởi
đoạn mã theo chiều bổ sung của RNA5.
Như vậy, qua các dữ liệu phân tích cho thấy gen RNA polymerase của RGSV
có độ tương đồng cao so với RSV, một chủng chuẩn của chi tenuivirus. Tuy nhiên sự
tương đồng toàn bộ trình tự của protein RNA polymerase thì không đủ là nhân tố
10


marker phát sinh loài cho nhiều virus, nhất là với những trình tự có độ tương đồng
thấp. Mặt khác, so sánh các đoạn RNA5, 6 của RGSV với các đoạn RNA3 và 4 của
các tenuivirus khác lại cho mức độ tương đồng trình tự thấp. Hơn nữa, các đoạn
RNA3, 4 của RGSV dường như không liên quan đến các RNA của các chủng trong
tenuivirus, 2 đoạn này hình như là duy nhất ở RGSV. Vì vậy có thể RGSV là một chi
mới tách biệt so với chi tenuivirus (Shigemitsu và ctv, 1998).

Hình 5-Sơ đồ cấu trúc bộ gen của RGSV.
(Các thanh đen hình sợi chỉ tượng trưng cho các RNA với chiều dài đã được xác định.
Các mũi tên đen tượng trưng cho các sản phẩm protein. Chiều mũi tên là chiều của
quá trình dịch mã để tạo ra chuỗi polypeptide)
(Nguồn: />2.2.1.4 Sự truyền bệnh
Theo kết quả nghiên cứu về sự truyền bệnh cho thấy virus chỉ truyền qua rầy

nâu Nilaparvata lugens (Rivera và ctv, 1966) và một số loài rầy khác N. bakeri, N.
muiri (Iwasaki và ctv, 1980a). Khoảng 20- 40% cá thể trong quần thể N. lugens đều có

11


khả năng truyền được virus. Tất cả các dạng như rầy đực, rầy cái, cánh dài hay cánh
ngắn, khi hình thái nâu sẫm hoặc nhạt đều có thể truyền được bệnh.
Rầy nâu chỉ cần chích hút trên bụi lúa bị vàng lùn trong 1 giờ là đã lấy được
RGSV. Sau khi lấy mầm bệnh rầy nâu chưa thể truyền bệnh ngay mà cần có thời gian
cho virus di chuyển lên tuyến nước bọt và nhân mật số lên cao mới bắt đầu truyền
bệnh. Thời gian ủ virus gây vàng lùn là 4 ngày (từ 1- 21 ngày) sau thời gian ủ virus
này rầy nâu chỉ cần chích hút 1 giờ là đã lây được bệnh.
Rầy nâu mang virus thường giữ được nguồn bệnh suốt đời. Mặc dù phần lớn
không truyền bệnh hằng ngày mà thường tiến hành với khoảng cách 2-3 ngày.
Virus RGSV không được truyền qua trứng rầy. Tuy nhiên rầy non có khả năng truyền
bệnh cao hơn và có giai đoạn ủ virus ngắn hơn rầy trưởng thành (Chen, 1983). Tuổi
thọ trung bình của rầy nâu truyền bệnh là 15,4 ngày và ngắn hơn so với rầy nâu không
truyền bệnh là 17,5 ngày (Ling, 1972).
RGSV không truyền qua hạt của cây lúa bệnh (Ling, 1972) hoặc qua phấn hoa.
Virus cũng không được truyền bằng cách tiếp xúc giữa cây lúa khoẻ mạnh với cây lúa
bệnh, hoặc lây bệnh qua tiếp xúc bằng tay. Thường sau khi cây lúa bị rầy nâu truyền
virus chưa thể hiện triệu chứng ngay mà cần có thời gian ủ bệnh (thời gian virus nhân
mật số lên cao làm cho bụi lúa bị bệnh). Thời gian ủ bệnh của cây lúa là 15 ngày (từ
11-25 ngày). Do đó, bệnh vàng lùn thường được phát hiện trên ruộng lúa từ 25-35
ngày sau khi sạ (tức là bị rầy nâu đến ruộng vào 7-10 ngày sau khi sạ).
2.2.2 Dòng cây kí chủ và triệu chứng bệnh
Phổ ký chủ của RGSV thu hẹp trên các loài lúa Oryza spp. và rầy Nilaparvata
spp. Triệu chứng của cây lúa nhiễm RGSV có những biểu hiện như sau:
- Màu sắc của cây lúa bệnh: Lá lúa từ xanh nhạt, vàng nhạt, vàng cam, vàng khô.

- Vị trí lá bị vàng: Lá dưới bị vàng trước, lần lượt đến các lá bên trên.
- Vết vàng trên lá: Từ chóp lá vàng lần vào bẹ.
- Đặc điểm của lá lúa bệnh: Lá có khuynh hướng xòe ngang.
- Lúa nếu nhiễm bệnh trong giai đoạn còn non thường bị lùn rất nhiều, mọc
nhiều chồi và có lá thẳng đứng. Các lá bệnh thường ngắn, hẹp, có màu nhạt, và có
nhiều đốm nhỏ màu nâu với hình dạng không cố định (Abeygunawardena, 1969; Ling,
1972; Rivera và ctv, 1966; Tantera và ctv, 1973).
12


- Lúa nếu nhiễm bệnh trong thời kì đẻ nhánh, bụi lúa bệnh đẻ quá nhiều nhánh,
bụi lúa to hơn, vẫn có chiều cao tương đương với các bụi khác, chưa khác biệt lắm.
Càng về sau nhìn toàn cảnh thấy lúa phát triển không đều do bụi lúa bị bệnh không
phát triển chiều cao cuối cùng các bụi lúa bệnh sẽ khô và lụi dần như cháy rầy từng
chòm.
- Lúa trưởng thành khi bị nhiễm bệnh có lá bị vàng, bông bị nâu và hạt lép
(Iwasaki và ctv, 1980b; Rivera vàctv, 1966).
- Khi trổ thường không có gié hoặc gié có hạt lép.

Hình 6-Lúa nhiễm RGSV.
(Nguồn: Theo Rogelioc C Cabunagan, 2006)
2.2.3 Phân biệt bệnh vàng lùn với các triệu chứng bệnh khác trên lúa
Trên đồng ruộng cũng thường xuất hiện một số dạng bệnh khác có triệu chứng
gần giống với triệu chứng bệnh vàng lùn. Đó là triệu chứng của các bệnh như: Tuyến
trùng bướu rễ, ngộ độc hữu cơ, ngộ độc phèn, bệnh cháy lá và sâu phao đục bẹ. Do đó,
cần nắm rõ triệu chúng và sự khác biệt trong triệu chứng của từng loại bệnh để có biện
pháp phòng trừ và điều trị thích hợp.
Tuyến trùng bướu rễ (Meloidogyne sp): Tuyến trùng có thể sống trong điều kiện
ngập nước tuy nhiên không thể xâm nhập vào rễ cây lúa. Nhưng khi ruộng lúa khô
tuyến trùng này nhanh chóng xâm nhập vào rễ tạo bướu rễ có hình dạng và kích thước

khác nhau. Khi ruộng lúa bị khô nước, nhưng khi đưa nước và bón phân thì cây lúa
vẫn còi cọc.

13