NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TỔNG HỢP HỆ ENZYM CELLULASE, PROTEASE, PECTINASE VÀ CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN CELLULASE CỦA CÁC CHỦNG Trichoderma ssp.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

************

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TỔNG HỢP HỆ ENZYM
CELLULASE, PROTEASE, PECTINASE VÀ CÁC
YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN CELLULASE
CỦA CÁC CHỦNG Trichoderma ssp.

Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Niên khóa: 2004 - 2008
Sinh viên thực hiện: PHẠM THỊ BÍCH NGA

Tháng 9/2008


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HCM
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
************

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TỔNG HỢP HỆ ENZYM
CELLULASE, PROTEASE, PECTINASE VÀ CÁC
YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN CELLULASE
CỦA CÁC CHỦNG Trichoderma ssp.

Giáo viên hướng dẫn:

Sinh viên thực hiện:

TS. LÊ ĐÌNH ĐÔN

PHẠM THỊ BÍCH NGA

Tháng 9/2008
ii


LỜI CẢM ƠN
Em xin gửi lời cảm ơn đến:
Ban giám hiệu Trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm
Bộ môn Công Nghệ Sinh Học đã tạo điều kiện thuận lợi cho em trong thời gian học
tập vừa qua.
Ban giám đốc Trung tâm Phân Tích Hóa Sinh - Trường Đại học Nông Lâm TP.
Hồ Chí Minh cùng toàn thể các anh chị tại Trung Tâm đã tạo điều kiện thuận lợi cũng
như tận tình giúp đỡ em trong thời gian thực tập tốt nghiệp.
Thầy TS. Lê Đình Đôn đã tận tình hướng dẫn và truyền đạt cho em những kinh
nghiệm quý báu trong suốt thời gian làm đề tài.
Cô ThS. Trương Phước Thiên Hoàng đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ em
trong thời gian qua.
Các anh chị làm việc tại phòng Bệnh cây trong thời gian qua đã giúp đỡ và hỗ
trợ em rất nhiều trong thời gian em làm đề tài.
Các bạn lớp Nông học K30 làm đề tài tại phòng Bệnh cây, khoa Nông học đã
giúp đỡ tôi trong suốt thời gian làm đề tài.
Các bạn lớp Công Nghệ Sinh Học K30 đã luôn đồng hành, chia sẻ vui buồn,

động viên và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và làm đề tài.
Con xin thành kính ghi ơn cha mẹ. Cha mẹ và người thân luôn là chỗ dựa vững
chắc về tinh thần và vật chất cho con.

TP. Hồ Chí Minh, tháng 9 năm 2008
Phạm Thị Bích Nga

iii


TÓM TẮT
Phạm Thị Bích Nga, Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh, tháng 9/2008.
“Nghiên cứu khả năng tổng hợp hệ enzym cellulase, protease, pectinase và các
yếu tố ảnh hưởng đến enzym cellulase của các chủng Trichoderma sp”. Đề tài được
thực hiện tại Phòng Bệnh cây, khoa Nông Học và Viện Nghiên cứu Công nghệ sinh
học và Công nghệ môi trường, trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh, từ tháng
04/2008 đến tháng 9/2008.
Giáo viên hướng dẫn: TS. Lê Đình Đôn
Hệ enzym của nấm Trichoderma có hoạt tính rất cao, nên các nhà khoa học có
định hướng sử dụng chúng để sản xuất enzym phục vụ trong nhiều lĩnh vực khác nhau.
Tuy nhiên cho đến hiện tại thì các sản phẩm cellulase tạo ra hàng năm vẫn chưa đáp
ứng đủ nhu cầu. Để góp phần nhỏ vào định hướng nêu trên, chúng tôi tiến hành nghiên
cứu khả năng sinh tổng hợp của các chủng Trichoderma với mục tiêu:


Tìm ra chủng có khả năng sinh tổng hợp enzym có hoạt tính cao.



Thử nghiệm sản xuất enzym cellulase thương mại.

Nội dung nghiên cứu:


Khảo sát khả năng sinh tổng hợp hệ enzym cellulase, protease và pectinase

của 30 chủng Trichoderma trên môi trường có bổ sung chất cảm ứng.


Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố nuôi cấy đến hoạt tính cellulase.



Thử nghiệm sản xuất cellulase dạng pilot trên môi trường bán rắn.

Kết quả đạt được:


Tất cả các chủng đều có khả năng sinh tổng hợp cellulase và protease, nhưng

chỉ có 19 trong 30 chủng là có khả năng sinh tổng hợp pectinase.


Thời gian tối ưu cho chủng T205 sản xuất cellulase là 48 giờ, pH tối ưu 5,5 và

nồng độ CMC thích hợp cho phản ứng thủy phân của cellulase là 0,6%.


Sản xuất cellulase ở dạng thô.

iv


SUMMARY
Pham Thi Bich Nga, Nong Lam University, September in 2008. “Cellulase,
protease, pectinase enzyme synthetic ability research and inffluence factors on
cellulase enzyme of Trichoderma sp species .’’ The study was practised in Disease
plant derparment, Faculty of Agronomy and Enviromental and Biology technology
researching institute, Nong Lam University, from 04/2008 to 09/2008.
Advisor: Dr. Le Dinh Don
Active ability of enzyme of Trichoderma is high,so scientists have tendency to
use in a lot of different field. However, now, yearly created cellulase products don’t
enough supply for the need. To contribute small part in this tendency, we practised the
research about synthetic biology ability of Trichoderma species, with the aim:


Find Trichoderma species have synthetic biology ability of the high

active enzyme.



Testing produce commercial cellulase.

Content:


Investigation of cellulase, protease, pectinase enzyme synthetic biology

abbility in 30 Trichoderma species on medium with reactive substance suplement.





Survey inffluence of cullturing factors to cellulase action



Testing of pilot cellulase product on semi – soilid medium.

The result was showed:


All of Trichoderma species have cellulase, protease synthetic biology ability

but 19 in 30 species have pectinase synthesize.


The optimal time to produce cellulase of T205 species is 48 hours, optimal

pH is 5,5 level, and suitable concentration of CMC for hydrolysis reaction is 0,6%.


Cellulase was produced with coarse.

v


MỤC LỤC

TRANG

TRANG TỰA

Lời cảm ơn................................................................................................................. iii
Tóm tắt....................................................................................................................... iv
Summary .................................................................................................................... v
Mục lục ...................................................................................................................... vi
Danh sách các chữ viết tắt ......................................................................................... ix
Danh sách các hình và biểu đồ ................................................................................... x
Danh sách các bảng .................................................................................................. xi
Chương 1. MỞ ĐẦU................................................................................................. 1
1.1.Đặt vấn đề ............................................................................................................ 1
1.2. Mục đích .............................................................................................................. 2
1.3. Yêu cầu ................................................................................................................ 2
Chương 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU...................................................................... 3
2.1. Đặc điểm của nấm Trichoderma ......................................................................... 3
2.1.1. Đặc điểm phân loại........................................................................................... 3
2.2.2. Môi trường sống ............................................................................................... 3
2.2.3. Đặc điểm về hình thái....................................................................................... 4
2.1.4. Đặc điểm sinh học ............................................................................................ 5
2.1.5. Các nghiên cứu ứng dụng vi nấm Trichoderma............................................... 5
2.1.5.1.Bảo vệ thực vật ............................................................................................... 5
2.1.5.2. Cải thiện năng suất cây trồng ........................................................................ 7
2.1.5.3. Nguồn gen để sử dụng trong chuyển gen ...................................................... 7
2.1.5.4. Sản xuất enzym.............................................................................................. 7
2.2. Hệ enzym thủy phân của nấm Trichoderma ....................................................... 8
2.2.1. Hệ enzyme cellulase ......................................................................................... 8
2.2.2. Định nghĩa enzym cellulase.............................................................................. 8

2.2.3. Phân loại ........................................................................................................... 9
2.2.4. Cellulose ........................................................................................................... 9

vi


2.2.5. Cơ chế xúc tác ................................................................................................ 10
2.2.6. Ứng dụng của enzym cellulase....................................................................... 10
2.3. Hệ enzyme protease........................................................................................... 12
2.3.1. Định nghĩa ...................................................................................................... 12
2.3.2. Phân loại ......................................................................................................... 12
2.3.3. Tính chất ........................................................................................................ 13
2.3.4. Cơ chế xúc tác ................................................................................................ 13
2.3.5. Ứng dụng của protease ................................................................................... 14
2.4. Hệ enzym pectinase........................................................................................... 15
2.4.1. Định nghĩa ...................................................................................................... 16
2.4.2. Pectin .............................................................................................................. 16
2.4.3. Phân loại và cơ chế xúc tác ............................................................................ 17
2.4.4. Ứng dụng của enzym pectinase...................................................................... 17
2.5. Sản xuất enzym vi sinh vật................................................................................ 18
2.5.1. Tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng
hợp enzym cao............................................................................................... 18
2.5.2. Nuôi vi sinh vật trên môi trường bán rắn để thu chế phẩm enzym ............... 18
Chương 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ...................................................... 20
3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện........................................................................ 20
3.2. Vật liệu .............................................................................................................. 20
3.2.1. Giống vi sinh vât ............................................................................................ 20
3.2.2. Nguồn nguyên liệu thu nhận enzyme ............................................................. 20
3.2.3. Các môi trường sử dụng trong thí nghiệm ..................................................... 20
3.3. Dụng cụ và thiết bị ............................................................................................ 23

3.4. Phương pháp nghiên cứu

..................................................................... 23

3.4.1. Cấy chuyền các dòng nấm Trichoderma ........................................................ 22
3.4.2. Phương pháp định tính enzyme cellulase protease và pectinase bằng
cách đo đường kính phân giải .................................................................................. 23
3.4.3. Phương pháp nuôi cấy bán rắn nấm Trichoderma ......................................... 23
3.4.4. Phương pháp thu nhận ezym .......................................................................... 24
3.4.5. Phương pháp xác định hàm lượng đường khử ............................................... 24
3.4.6. Phương pháp xác định hoạt tính enzym cellulase .......................................... 24
vii


3.4.7. Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố nuôi cấy đến
hoạt tính cellulase ..................................................................................................... 26
3.4.7.1. Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến hoạt
tính cellulase ............................................................................................................ 26
3.4.7.2. Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của pH nuôi cấy lên enzym cellulase ... 27
3.4.8. Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của nồng độ cơ chất (CMC)
lên hoạt tính của enzym ............................................................................................ 28
3.4.9. Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của các nguồn cơ chất tự
nhiên khác nhau lên hoạt tính của enzym................................................................. 28
3.4.10. Xử lý kết quả ............................................................................................... 29
Chương 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN............................................................. 30
4.1. Định tính sơ bộ vòng phân giải các hệ enzym cellulase, protease
và pectinase của nấm Trichoderma .......................................................................... 30
4.2. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian và pH nuôi cấy đến hoạt tính cellulase ...... 34
4.2.1. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến hoạt tính cellulase .............. 34
4.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy đến hoạt tính cellulase

của chủng T205. ....................................................................................................... 36
4.3. Bước đầu thử nghiệm sản xuất cellulase ở dạng pilot ...................................... 37
4.3.1. Hoạt tính cellulase theo của dạng nuôi cấy PTN và dạng nuôi cấy pilot....... 38
4.3.2. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ cơ chất lên hoạt tính
của enzym cellulase .................................................................................................. 39
4.3.3. Khảo sát khả năng thủy phân của hệ enzym cellulase của chủng
đối với các nguồn cơ chất khác nhau........................................................................ 40
Chương 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................. 42
5.1. Kết luận.............................................................................................................. 42
5.2. Đề nghị .............................................................................................................. 42
TÀI LIỆU THAM KHẢO.................................................................................... ..43
PHỤ LỤC .............................................................................................................. ..46

viii


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

WA

Water agar

PGA

Potato glucose agar

CMC

Carboxymethyl cellulase

DNS

Acid dinitrosalisylic

OD

Optical density

PTN

Phòng thí nghiệm

GalA

Galacturonic Acid

Me

Methyl

Ac

Acetyl

Rha

Rhamnose

Ara

Arabinose

Gal

Galacturonic

ix


DANH SÁCH HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ
HÌNH

TRANG

Hình 2.1: Trichoderma phát triển trên gỗ mục......................................................... 4
Hình 2.2: Khuẩn ty (A) T. harzianum trên môi trường nuôi cấy và cuống
bào tử đính T. harzianum dưới kính hiển vi (B) ....................................................... 5
Hình 2.3: Sự phát triển vùng rễ của bắp và đậu nành với sự hiện diện và
không hiện diện của dòng T22 ................................................................................... 7
Hình 2.4: Cấu trúc của enzym cellulase được sản xuất bởi Trichoderma ............... 9
Hình 2.5: Sơ đồ thủy phân cellulose của hệ enzym cellulase.................................. 10
Hình 2.6: Cấu trúc enzym protease ......................................................................... 12
Hình 2.7: Sơ đồ thủy phân pectin của hệ enzym pectinase ..................................... 17
Hình 4.1: Một số kết quả định tính hệ enzym của Trichoderma............................. 28
BIỂU ĐỒ

TRANG

Biểu đồ 4.1: Đường kính vòng phân giải CMC của các chủng Trichoderma sau
56 giờ nuôi cấy ..................................................................................... 32

Biểu đồ 4.2: Đường kính vòng phân giải casein của các chủng Trichoderma sau
56 giờ nuôi cấy . ..................................................................................... 32
Biểu đồ 4.3: Đường kính vòng phân giải pectin của các chủng Trichoderma sau
56 giờ nuôi cấy . ..................................................................................... 33
Biểu đồ 4.4: Sự biến thiên hoạt tính cellulase theo thời gian nuôi cấy của 3 chủng
Trichoderma .......................................................................................... 35
Biểu đồ 4.5: Sự biến thiên hoạt tính cellulase theo pH môi trường nuôi cấy ............. 37
Biểu đồ 4.6: Hoạt tính cellulase khi nuôi cấy ở dạng PTN và pilot ........................... 38
Biểu đồ 4.7: Sự biến thiên hoạt tính cellulase theo nồng độ CMC phản ứng ............. 40
Biểu đồ 4.8: Hàm lượng glucose sinh ra do tác dụng của hệ enzym cellulase lên
các nguồn cơ chất tự nhiên khác nhau ..................................................................... 41

x


DANH SÁCH CÁC BẢNG
BẢNG

TRANG

Bảng 3.1: Các chủng Trichoderma sử dụng trong thí nghiệm ....................................22
Bảng 3.2: Xây dựng đường chuẩn glucose.................................................................. 24
Bảng 3.3: Xác định hoạt độ cellulase. ......................................................................... 25
Bảng 3.4: Bố trí thí nghiệm khảo sát thời gian nuôi cấy ............................................. 27
Bảng 4.1: Đường kính vòng phân giải CMC, casein, pectin của các chủng
Trichoderma sau 56 giờ nuôi cấy ................................................................................ 31
Bảng 4.2: Hoạt tính enzym cellulase của 3 chủng Trichoderma theo thời
gian nuôi cấy................................................................................................................. 34
Bảng 4.3: Hoạt tính enzym cellulase của chủng T205 với sự thay đổi pH môi
trường nuôi cấy............................................................................................................. 37

Bảng 4.4: Hoạt tính cellulase theo dạng nuôi cấy ....................................................... 38
Bảng 4.5: Hoạt tính cellulase theo nồng độ của CMC. ............................................... 39
Bảng 4.6: Hàm lượng glucose sinh ra do tác dụng của hệ enzym cellulase lên các
nguồn cơ chất tự nhiên khác nhau ................................................................................ 40

xi


Chương 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Enzym là chất xúc tác sinh học, cho phép các phản ứng cần thiết cho sự sống và
sự sinh sản của tế bào diễn ra ở một vận tốc cao và không tạo ra các sản phẩm phụ như
ở các phản ứng thông thường.
Các enzym ngày càng được ứng dụng vào nhiều lĩnh vực khác nhau, trong đó
những enzym được ứng dụng nhiều nhất là cellulase, protease và pectinase. Cellulase
là enzym được dùng để thủy phân cellulose, một thành phần sinh khối nhiều nhất trong
tự nhiên để tạo thành đường glucose. Bên cạnh đó, protease là nhóm enzym có khả
năng phân giải các liên kết peptid trong phân tử protein được ứng dụng nhiều trong
công nghiệp thuộc da, sản xuất chất tẩy rửa, trong chế biến thịt và các sản phẩm từ
sữa. Để làm trong nước trái cây thu từ dịch ép trái cây thông thường biện pháp hữu
hiệu nhất lại là sử dụng pectinase. Và còn rất nhiều ứng dụng khác xoay quanh 3 nhóm
enzym trên.
Thế giới ngày càng phát triển, nhu cầu tiêu dùng ngày càng cao, nền công –
nông nghiệp ngày càng hiện đại nên lượng enzym cần dùng là rất lớn. Tuy nhiên chế
phẩm enzym trong dịch chiết từ động vật và thực vật lại có nhược điểm lớn nhất là số
lượng rất ít. Vì thế hiện nay các nhà khoa học không ngừng nghiên cứu và sản xuất
enzym từ vi sinh vật. Ưu điểm chính của phương pháp này là có thể tận dụng được đặc
điểm của vi sinh vật như tổng hợp nhanh với số lượng lớn, có thể sử dụng được cơ
chất là phế thải trong công – nông nghiệp.

Trichoderma là loài nấm đối kháng, như một tác nhân sinh học phòng trừ nhiều
bệnh hại cây trồng, giúp cho cây sinh trưởng và phát triển tốt hơn. Ngoài ra
Trichoderma còn có khả năng sản xuất rất nhiều enzym. Dựa vào những đặc tính của
nấm Trichoderma và cũng để giải quyết sức ép về nhu cầu enzym nên chúng tôi quyết
định thực hiện đề tài: “Nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp hệ enzym cellulase,
protease, pectinase và các yếu tố ảnh hưởng đến enzym cellulase của các
chủng Trichoderma sp. ”

1


1.2. Mục đích
Khảo sát khả năng sinh tổng hợp hệ enzym protease, cellulase và pectinase của
một số chủng nấm Trichoderma trên môi trường cảm ứng. Đồng thời khảo sát điều
kiện nuôi cấy tối ưu để thu enzym cellulase có hoạt tính cao nhất, nhằm tiến tới thương
mại hóa.
1.3. Yêu cầu


Định tính sơ bộ vòng phân giải các hệ enzym protease, cellulase và pectinase

của các chủng Trichoderma.


Định lượng hoạt tính cellulase của Trichoderma trên môi trường bán rắn.



Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố nuôi cấy đến hoạt tính enzym cellulase.

2


Chương 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Đặc điểm của nấm Trichoderma
2.1.1. Đặc điểm phân loại
Trichoderma là một trong những nhóm vi nấm gây nhiều khó khăn trong công
tác phân loại do các đặc điểm cần thiết cho việc phân loại vẫn còn chưa được biết đầy
đủ. Theo Persoon ex Gray (1801) [32], Trichoderma được phân loại như sau:
Giới:

Fungi

Ngành:

Ascomycota

Lớp:

Euascomycetes

Bộ:

Hypocreales

Họ :

Hypocreaceae

Giống:

Trichoderma

Phương pháp phân loại truyền thống thông thường dựa trên sự khác biệt về hình
thái, chủ yếu là ở bộ phận hình thành bào tử vô tính. Gần đây, nhiều phương pháp
phân loại dựa trên cấu trúc phân tử đã được sử dụng. Hiện nay, nấm Trichoderma
được biết ít nhất 33 loài. Những loài này được phân thành 5 nhóm: Trichoderma,
Longibrachiatum, Satunisporum, Pachybarium, Hypocreanum [9].
2.2.2. Môi trường sống
Nấm Trichoderma hiện diện gần như trong tất cả các loại đất. Chúng phát triển
mạnh ở vùng rễ của cây, hay trên xác sinh vật đã chết, hoặc thực phẩm bị chua, ngũ
cốc, lá cây. Ngoài ra, nấm Trichoderma còn có khả năng tấn công và ký sinh trên
những loài nấm khác. Nhưng chúng không sống nội ký sinh bắt buộc trên thực vật và
rất ít được tìm thấy trên thực vật sống. Chúng được tìm thấy ở mọi nơi trừ những vùng
cực Nam hay cực Bắc, nhiều nhất là ở những khu rừng nhiệt đới ẩm hay cận nhiệt đới
(Gary J. Samuels, 2004).
Khi nuôi cấy, chúng phát triển nhanh ở nhiệt độ 25 – 300C, nhưng kém phát
triển hoặc không phát triển ở nhiệt độ trên 350C (tùy theo loài). Trichoderma phát triển
tốt ở pH từ 4,5 – 6,5 và ưa độ ẩm. Khi đất khô thì quần thể Trichoderma giảm rõ rệt,
song các loài Trichoderma spp khác nhau có yêu cầu về nhiệt độ và độ ẩm cũng khác
3


nhau. Chẳng hạn như vài chủng Trichoderma hamatum và Trichoderma
pseudokoningii có khả năng đáp ứng được với môi trường sống có độ ẩm rất cao,
Trichoderma rivide và Trichoderma polysporum thích hợp ở vùng có nhiệt độ thấp,
trong khi Trichoderma hamatum và Trichoderma koningii phân bố ở vùng khí có khí
hậu khác nhau.

Hình 2.1: Trichoderma phát triển trên gỗ mục [19]
2.2.3. Đặc điểm về hình thái
Khuẩn ty của nấm Trichoderma không màu nếu được nuôi cấy trên môi trường
WA, hoặc màu trắng nếu nuôi cấy trên môi trường PGA. Khuẩn lạc mọc rất nhanh và
sau đó hình thành bào tử đính sau một tuần nuôi cấy. Bào tử đính có màu sắc khác
nhau tùy theo từng loài nấm. Thông thường có màu xanh đậm, xanh vàng hoặc lục
trắng. Bào tử có thể mọc dày đặc hoặc thành từng chùm riêng rẽ. Ở một số loài, sợi
nấm tiết ra những chất làm cho môi trường bên trong có màu vàng, hay tiết ra những
mùi thơm mang tính đặc trưng.
Đặc điểm nổi bật của nấm Trichoderma là bào tử có màu xanh đặc trưng, một
số ít có màu trắng (như T. virens), vàng hay xanh xám. Chủ yếu hình cầu, hình ellip
hoặc hình oval (với tỉ lệ dài : rộng từ 1 – 1.1µm) hay hình chữ nhật (với tỉ lệ dài : rộng
là hơn 1.4 µm), đa số các bào tử trơn láng. Kích thước không quá 5 µm.

4


A

B

Hình 2.2: Khuẩn ty (A) T. harzianum trên môi trường nuôi cấy và cuống
bào tử đính T. harzianum dưới kính hiển vi (B) [33] [15]
2.1.4. Đặc điểm sinh học
Hầu hết các giống Trichoderma không sinh sản hữu tính mà thay vào đó là cơ
chế sinh sản vô tính bằng bào tử đính từ khuẩn ty. Bào tử đính của Trichoderma là một
khối tròn mọc lên ở đầu cuối của cuống sinh bào tử. Cuống sinh bào tử phân nhiều
nhánh mang các bào tử trần bên trong.
Trichoderma có thể sử dụng nhiều nguồn thức ăn khác nhau từ carbohydrat,

amino acid đến ammonia.
Trichoderma có sự phân bố rộng rãi, chúng có thể tồn tại trên gỗ mục lại có thể
sống ký sinh trên những loài nấm khác là do chúng có khả năng sản xuất rất nhiều loại
enzym thủy phân. Ngoài ra theo Garett (1956), Trichoderma còn có khả năng cạnh
tranh dinh dưỡng rất cao do có một số đặc tính sau:


Sinh trưởng mạnh và bào tử nảy mầm rất nhanh.



Có khả năng sinh tổng hợp các hệ enzym phân giải cao.



Có khả năng tạo kháng sinh.



Chịu được chất kháng sinh.

2.1.5. Các nghiên cứu ứng dụng vi nấm Trichoderma
2.1.5.1. Bảo vệ thực vật
Một trong những nghiên cứu ứng dụng của nấm Trichoderma được nhiều người
quan tâm nhất, đó là khả năng kiểm soát sinh học cũng như khả năng đối kháng với
một số nấm gây bệnh ở thực vật. Tuy nhiên một số giống thường có hiệu quả hơn

5

những giống khác trên một số bệnh nhất định. Nhiều kết quả nghiên cứu cho thấy
Trichoderma spp có thể kiểm soát hiệu quả các nấm gây bệnh như sau:


Rhizoctonia: gây mục rễ, thân và hạt,…



Slerotium rolfsii: xơ cứng ở cà chua và khoai tây.



Pythium spp: gây úng thối ở đậu, thuốc lá, cây con,…



Armellaria mellea: mục rễ ở cây rừng, cao su, thông.



Botrytis cinerea: mốc xám gây hỏng dâu và nho.



Penicillium: hỏng trái ở chanh và chuối.



Phytophtora spp: mục rễ, hỏng trái ở cacao.



Chondeostereum purpurreum: bạc lá ở đào và mận.

Các kết quả nghiên cứu của trường Đại học Cần Thơ, Trung tâm công nghệ sinh
học nông nghiệp TP, Viện Bảo vệ thực vật cũng cho thấy khi sử dụng Trichoderma spp
chúng kìm hãm, hạn chế sự phát triển của các loại nấm gây bệnh nằm ở trong đất đối với
cây trồng. Khả năng phòng trừ một số bệnh như: lở cổ rễ, héo cây, vàng lá, chết nhác,
thối rễ, nức vỏ xì mủ do nấm Phytopthora solani gây ra đối với nấm Trichoderma rất
cao. Ngoài ra enzym ngoại bào của Trichoderma spp tiết ra sẽ phân giải màng vách tế
bào của một số loài tuyến trùng phá hoại rễ cây và làm cho chúng bị chết.
Hiện nay các chủng Trichoderma spp đã được sử dụng rộng rãi trong các chế
phẩm sinh học thương mại như: GlioGard – một chế phẩm với thành phần chính là
Trichoderma virens ngăn chặn sự thối úng của cây con; chế phẩm của Manidharma với
thành phần chính là Trichoderma viride và Trichoderma harzianum giúp ngăn các loại
bệnh trên cây trồng như: thối rễ, thối nâu, héo cây và những loại bệnh khác phát sinh
trong đất trồng. Trichoderma harzianum còn được kết hợp với Trichoderma
polysporum trong việc sản xuất Binabt được dùng chữa trị các vết thương bị nhiễm
trùng ở cây trồng.
Sản phẩm BIMA của Trung Tâm công nghệ sinh học TP. Hồ Chí Minh và ViĐK của Công ty Thuốc sát trùng Việt Nam đang được nông dân sử dụng để tăng khả
năng hoai mục của phân chuồng và giảm mùi hôi thối; đồng thời phòng chống một số
bệnh do nấm Phytophthora palmirova, Furasium solari, Pythium sp, Sclerotium
rolfosii do tác dụng của Trichoderma có chứa trong trong chế phẩm.

6


2.1.5.2. Cải thiện năng suất cây trồng
Những lợi ích mà những loài nấm này mang lại đã được biết đến từ nhiều năm
qua bao gồm việc kích thích sự tăng trưởng và phát triển của thực vật do việc kích

thích sự hình thành nhiều hơn và phát triển mạnh hơn của bộ rễ so với thông thường.
Những cơ chế giải thích cho các hiện tượng này chỉ mới được hiểu rõ ràng hơn trong
thời gian gần đây. Hiện nay, một số giống nấm Trichoderma đã được phát hiện là
chúng có khả năng gia tăng số lượng rễ mọc sâu (sâu hơn 1 m dưới mặt đất). Những rễ
sâu này giúp các loài cây như bắp hay cây cảnh có khả năng chịu được hạn hán.
Một khả năng có lẽ đáng chú ý nhất là những cây bắp có sự hiện diện của nấm
Trichoderma dòng T22 ở rễ có nhu cầu về đạm thấp hơn đến 40% so với những cây
không có sự hiện diện của loài nấm này ở rễ [22] .

Hình 2.3: Sự phát triển vùng rễ của bắp và đậu nành với sự hiện diện
và không hiện diện của dòng T22 [15]
2.1.5.3. Nguồn gen để sử dụng trong chuyển gen
Nhiều vi sinh vật kiểm soát sinh học đều có chứa một số lượng lớn gen mã hoá
các sản phẩm có hoạt tính cần thiết sử dụng trong kiểm soát sinh học. Nhiều gen có
nguồn gốc từ Trichoderma đã được tạo dòng và có tiềm năng ứng dụng rất lớn trong
chuyển gen để tạo ra cây có khả năng kháng được nhiều bệnh. Chưa có gen nào được
thương mại hóa, tuy nhiên có một số gen hiện đang được nghiên cứu và phát triển.
2.1.5.4. Sản xuất enzym
Mặc dù có rất nhiều loài vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp hệ enzym phân
hủy cellulose nhưng cho đến nay được biết thì chỉ có Trichoderma và Aspergillus
niger được xem là nguồn vi sinh vật chính để sản xuất cellulase có giá trị thương mại.
7


Trong đó hệ enzym cellulase do nấm Trichoderma tổng hợp có hoạt tính endo – β –
glucanase và exo – β – glucanase rất cao trong khi đó thì exo – β – glucanase của
Aspergillus lại thấp hơn. Do đó, ngày càng có xu hướng sử dụng cellulase thu từ
Trichoderma hơn.
Ở Nhật thời kỳ đầu cellulase được sản xuất bằng phương pháp lên men
Trichoderma bề mặt trên cám gọi là phương pháp Koji. Hiện cho đến nay phương

pháp Koji vẫn còn được sử dụng, mặc dù có một số bất lợi, nhưng cũng có thuận lợi là
có thể thực hiện lên men ở thể tích nhỏ. Hàng năm từ Aspergillus niger và
Trichoderma viride người ta sản xuất được khoảng 70 – 80 tấn cellulase.
Chủng Trichoderma viride QM6 với các dòng đột biến của nó đang được quân
đội Mỹ sử dụng để nghiên cứu về cellulase. Mục đích các nghiên cứu mới này là giúp
nâng cao sản lượng cellulase, giảm giá thành của cellulase [5].
Ngoài ra các hệ enzym khác như pectinase, protease, chitinase,…thu từ
Trichoderma cũng đang được các nhà khoa học nghiên cứu và phát triển.
2.2. Hệ enzym thủy phân của nấm Trichoderma
2.2.1. Hệ enzym cellulase
Cellulose và hemicellulose là hai thành phần sinh khối hữu cơ lớn nhất được
tạo thành hàng năm trên trái đất. Do vậy nếu tìm ra được công nghệ thích hợp để
thủy phân cellulose và hemicellulose tạo ra các đơn vị thành phần của chúng
(chủ yếu là glucose) thì có lẽ điều này sẽ có một ý nghĩa to lớn đối với sự phát
triển của xã hội loài người. Cho đến nay, trong khá nhiều trường hợp người ta vẫn sử
dụng acid sulfuric để thủy phân cellulose và hemicellulose. Tuy công nghệ này có hiệu
quả cao nhưng không đạt yêu cầu trong thực phẩm và gây ô nhiễm môi trường. Do
vậy, càng ngày càng có xu thế sử dụng cellulase, enzym thủy phân cellulose
cho mục đích trên.
2.2.2. Định nghĩa enzym cellulase
Cellulase là một phức hệ enzym gồm nhiều enzym tham gia vào những phản
ứng kế tiếp khi thủy phân cellulose, để cuối cùng tạo ra đường glucose.

8


Hình 2.4: Cấu trúc của enzym cellulase được sản
xuất bởi Trichoderma [23]
2.2.3. Phân loại
The Wood và Mc.Cral (1979), hệ enzym phân hủy cellulose chủ yếu gồm 3 loại enzym:



Endocellulase (EC.3.2.1.4) (endoglucanase endoglucanase, endo – 1,4 β –

glucanase, C – cellulase) có hoạt tính Cx, tức là chúng sẽ tham gia phân giải các liên
kết  - 1,4 glucoside của chuỗi cellulose để tạo thành những phân tử glucose
cellobiose, và cellodextrin.


Exocellulase (EC 3.2.1.91) (exobiohydrolase, exo –  – glucanase). Chúng

chuyển hóa cellulose từ đầu không khử của chuỗi glucan và từ cellodextrin. Ngoài ra
nó còn tác dụng vào các liên kết hydrogen trong cellulose, theo đó thì endocellulase sẽ
dễ dàng thủy phân cellulose hơn (Reese và ctv, 1950) [25].


Β – glucosidase (EC.3.2.1.21): enzym thủy phân cellobiose thành glucose.

β – glucosidase có 2 cơ chất là: cellobiose và cellohexanose (6 đơn vị glucose).
β – glucosidase thuỷ phân nhanh hơn cellohexanose. Chúng không có khả năng thủy
phân cellobiose nguyên thủy.
2.2.4. Cellulose
Cellulose có nhiều trong thực vật, chúng thường liên kết với các chất khác như
lignin, hemicellulose, pectin. Cellulose là thành phần chủ yếu của vách tế bào thực
vật. Cellulose tinh khiết có màu trắng, dạng sợi nhỏ liên kết với nhau thành bó
gọi là mixen.
Khi thủy phân bằng acid sulfuric đậm đặc cellulose cho các gốc β – glucose.
Trong phân tử cellulose các gốc này liên kết với nhau bằng liên kết β – glycosidic 1 – 4.
Cellulose là chuỗi dài không phân nhánh với số gốc glucose từ hàng nghìn đến hàng

9


chục triệu. Cellulose không tan trong nước, chỉ tan trong dung dịch amoniac của
hydrosyl đồng [4].
2.2.5. Cơ chế xúc tác
Quá trình enzym cellulase thủy phân cellulose là một quá trình rất phức tạp với
sự tham gia của 3 nhóm enzym: enzym C1, Cx và β – glucosidase:
Cellulose

C1

cellulose hoạt hóa

Cx

β-glucosidase
cellobiose
glucose

Cơ chế tác động của C1 cho tới nay vẫn còn đang tiếp tục nghiên cứu. Thậm chí
các tác giả còn cho rằng C1 không phải là một enzym mà chỉ là yếu tố C1. Khi các vi
sinh vật phân giải và phát triển trên cơ chất cellulose thì yếu tố C1 có tác động làm
biến đổi cellulose nhưng khi tách riêng thì tác dụng này không hiểu rõ.
Nhìn chung có 2 loại enzym chính phân giải cellulose là cellulase C1 và
cellulase Cx. C1 tác dụng sơ bộ vào các phân tử cellulose tự nhiên và biến chúng thành
cellulose mạch thẳng, sau đó dưới tác động của Cx, cellulose bị phân giải thành
cellobiose hòa tan trong nước. Cuối cùng dưới tác động của β – glucosidase, cellobiose
bị thủy phân thành D – glucose.

Hình 2.5: Sơ đồ thủy phân cellulose của hệ enzym cellulase [28]
2.2.6. Ứng dụng của enzym cellulase
 Ứng dụng trong xử lý chất thải hữu cơ chứa cellulose
Các chất thải hữu cơ chứa cellulose chiếm một khối lượng lớn trong tổng số
chất thải hữu cơ hiện nay. Trong các chất thải hữu cơ có nguồn gốc từ thực vật
10


cellulase chiếm 50%, đặc biệt chúng lại khó phân hủy trong điều kiện tự nhiên. Thời
gian phân hủy có thể kéo dài trên 8 tháng ở điều kiện khí hậu nhiệt đới, ở những vùng
khí hậu ôn đới và cận nhiệt đới thời gian phân hủy dài hơn nhiều. thời gian phân hủy
càng lâu càng gây ô nhiễm môi trường. Để khắc phục tình trạng này hiện nay các nhà
khoa học đã đưa vào khối ủ chế phẩm vi sinh vật giàu cellulase.
 Ứng dụng trong sản xuất chế phẩm thực phẩm
Các sản phẩm sản xuất từ thực vật chứa rất nhiều cellulose gây hiện tượng
khó tiêu hóa ở người. Người và những động vật không nhai lại thường thiếu vi sinh vật
phân giải cellulose trong đường tiêu hóa, do đó việc chế biến thực phẩm bằng chế
phẩm cellulase có ý nghĩa làm tăng hiệu suất sử dụng thức ăn.
 Ứng dụng cellulase trong tế bào vi sinh vật như một loại phân bón vi sinh vật
Đã có nhiều nước sử dụng chế phẩm vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp
cellulase mạnh như một loại phân bón vi sinh vật. Các chế phẩm này là những tế bào
vi sinh vật sống. Khi được bón vào đất trồng có nhiều chất hữu cơ chứa cellulose,
chúng sẽ phân hủy nhanh các chất hữu cơ này tạo thành chất mùn, giúp cho cây trồng
phát triển nhanh hơn.
 Ứng dụng cellulase trong kỹ thuật di truyền
Tế bào thực vật thường chứa lignocellulose hoặc pectinosecellulose. Các
thành phần khác cũng thuộc họ này, trong đó có cả mannan và glucan. Các hợp chất
này thường rất khó phá, trong khi trong công nghệ tế bào lại cần thu nhận tế bào trần.
Các nhà di truyền học cho biết phương pháp sử dụng cellulase để phá vỡ tế bào thực
vật để tạo ra tế bào trần là tốt nhất vì cellulase không ảnh hưởng xấu đến tế bào trần.

Ngoài tế bào thực vật người ta còn sử dụng cellulase để phá vỡ thành tế bào nấm men
để phục vụ trong các nghiên cứu di truyền.
 Ứng dụng trong sản xuất glucose
Từ lâu chúng ta đã biết các loại nguyên liệu giàu cellulose như rơm, rạ,
cỏ,...được động vật nhai lại sử dụng vì trong hệ tiêu hóa của chúng có hệ vi sinh vật
tiết ra enzym cellulase thủy phân cellulose thành đường đơn giản dễ tiêu hóa. Về
nguyên tắc các nguyên liệu giàu cellulose đều có thể thuỷ phân thành dịch đường đơn
giản bằng cách sử dụng enzym cellulase. Cho đến nay thì dịch đường được sản xuất
bằng cách sử dụng enzym thủy phân chỉ dừng lại ở mức ứng dụng trong nuôi cấy lên

11


men, sản xuất cồn công nghiệp. Trong tương lai triển vọng sử dụng trong chế biến
thực phẩm dành cho người không còn xa nữa.
2.3. Hệ enzym protease
2.3.1. Định nghĩa
Protease hay peptidase (EC.3.4) là nhóm enzym thủy phân có khả năng cắt mối
liên kết peptide (-CO~NH-) trong các phân tử polypeptide, protein và một số cơ chất
khác tương tự thành các amino acid tự do hoặc các peptide phân tử thấp.

Hình 2.6: Cấu trúc enzym protease [30]
2.3.2. Phân loại
Dưới tác dụng của enzym protease, protein sẽ bị phân hủy: protein → pepton
→ polypeptid → peptid → acid amin. Đây là quá trình phân hủy tương đối phức tạp và
có sự tham gia của nhiều protease khác nhau gồm 2 loại chính: endoprotease và
exoprotease. Cả 2 loại này có thể lấy từ nhựa đu đủ, dạ dày, tụy tạng,… nhưng nhiều
nhất vẫn là từ vi sinh vật.
Năm 1960, Hartley chia protease ra 4 nhóm dựa trên thành phần cấu tạo của
trung tâm hoạt động trong enzym này:



Protease nhóm 1 (protease serin): nhóm này là các loại protease có serin trong

trung tâm hoạt động (bao gồm các loại enzym tripsin, kimotripsin, elastase, subtilis,
các enzym xúc tác làm đông máu, acrozin).


Protease nhóm 2 (mercapto protease): là các protease có nhóm (-SH) trong

trung tâm hoạt động (bao gồm bromelin, papain, fixin,…).


Protease nhóm 3 (metalloprotease): là các protease có kim loại trong trung

tâm hoạt động và trực tiếp tham gia các quá trình xúc tác (bao gồm các protease trung
tính của Bacillus hoặc Colagenase).

12




Protease nhóm 4 (protease acid): là các protease có α – carboxyl trong trung

tâm hoạt động. Có 2 loại protease acid là aspartic acid protease và glutamic acid
protease. Nhóm này bao gồm pepsin, renin và protease của nấm sợi.
Như vậy, tùy theo vùng hoạt động pH của protease mà các enzym protease tồn
tại ở dạng protease acid, protease trung tính hay protease kiềm.
Dựa vào khoảng pH tối thích người ta chia chúng làm 3 loại :



Protease acid pH ≤ 3.



Protease trung tính pH = 6 – 7.5.



Protease kiềm pH = 8 – 11.

2.3.3. Tính chất
Protease của động vật hay thực vật chỉ chứa một trong hai loại endo và
exoprotease. Còn vi sinh vật có khả năng sản xuất cả hai loại trên do đó protease của
vi sinh vật có tính đặc hiệu khác thường, chúng có thể phân hủy đến 80% các liên kết
peptide có trong phân tử protein. Nó không những phá hủy hoàn toàn và nhanh chóng
các liên kết peptide mà còn có khả năng phá hủy chậm một số liên kết không đặc trưng
khác. Như vậy trong từng trường hợp cụ thể của sự phân hủy protein, cần nghiên cứu
chọn lọc loài vi sinh vật thích hợp và những điều kiện tối ưu cho hoạt độ
protease của nó.
Phần lớn protease của vi khuẩn hoạt động trong pH hẹp còn protease của nấm
mốc thì ngược lại, có nhiều loài rất khác nhau và cá thể hoạt động trong phạm vi pH
rộng. Protease serin từ nấm ngoài hoạt tính protease serin, còn có hoạt tính protease
trung tính và acid.
Hiện nay có 2 loại protease của Trichoderma được biết đến và tinh sạch đó là:


Aspartic acid protease được tìm thấy ở Trichoderma reesei với trọng lượng

phân tử là 42,5 kDa; pH tối ưu là 3 – 5; pI 4,3.


Serine protease ở Trichoderma harzianum: trong nhóm này có ít nhất 3

protease khác nhau với pI 6,5; 7,0 và 9,2. Trọng lượng phân tử tối đa là 31 kDa.
2.3.4. Cơ chế xúc tác
Nhóm serine protease là nhóm peptidase lớn nhất và được phát hiện ở mọi giới
sinh vật như eukaryote, prokaryote, archaea và virus. Những enzym này đều có chung
một cơ chế xúc tác phản ứng thủy phân thông qua hai bước chính (Barrett, 1994):

13




Bước 1, acyl hóa: hình thành liên kết cộng hóa trị giữa nhóm -OH của

serine với nguyên tử cacbon trong nhóm carboxyl của phân tử cơ chất nhờ có hỗ
trợ của nhóm imidazole từ histidine. Kết quả phản ứng này là tạo ra một hợp chất
trung gian và một ion imidazolium (phản ứng cộng). Hợp chất trung gian không bền
này nhanh chóng bị thủy phân thành một acyl-enzym, vòng imidazole và
một amine (phản ứng khử) [30].


Bước 2, khử acyl hóa: phức hệ acyl – enzym bị thủy phân bởi phân tử H2O

theo chiều ngược lại của bước một. Trong đó, nhóm imidazole chuyển proton của gốc
(-OH) từ serine cho nhóm amine để tái sinh lại enzym.
2.3.5. Ứng dụng của protease

 Ứng dụng protease trong sản xuất các chất tẩy rửa
Protease là một trong những thành phần không thể thiếu trong tất cả các loại
chất tẩy rửa, từ chất tẩy rửa dùng trong gia đình đến những chất làm sạch kính hoặc
răng giả và kem đánh răng. Việc ứng dụng enzym vào các chất tẩy rửa nhiều nhất là
trong bột giặt. Các protease thích hợp để bổ sung vào chất tẩy rửa thường có tính đặc
hiệu cơ chất rộng để dễ dàng loại bỏ các vết bẩn do thức ăn, máu và các chất do cơ thể
con người tiết ra.
Chất tẩy rửa đầu tiên có chứa enzym vi khuẩn được sản xuất vào năm 1956
với tên BIO - 40. Đến năm 1963, Novo Industry A/S đã giới thiệu alcalase dưới
tên thương mại là BIOTEX được chiết xuất từ B. licheniformis. Và đến gần đây, tất
cả các protease bổ sung vào chất tẩy dùng trên thị trường đều là serine protease
được sản xuất từ các chủng Bacillus (Rao và ctv 1998; Thangam và ctv, 2002), và
chủ yếu là từ B. subtilis. Trên thế giới, mỗi năm người ta đã sử dụng 89% enzym này
cho ngành công nghiệp tẩy rửa. Trong đó hai công ty lớn là Novo Nordisk và
Genencor International mỗi năm đã cung cấp cho toàn cầu hơn 95% lượng enzym
protease (Gupta và ctv, 2002).
 Ứng dụng protease trong công nghiệp da
Việc sản xuất da động vật hiên nay hoàn toàn thủ công. Enzym protease có
thể được ứng dụng vào trong một số công đoạn của công nghiệp da, trong đó có 2
công đoạn có thể sử dụng enzym là công đoạn tách lông thú khỏi da và công đoạn
làm sạch da.

14