PHÂN LẬP VIRUS PRRS TỪ HUYẾT THANH HEO CON TRÊN MÔI TRƯỜNG TẾ BÀO MARC145 VÀ XÁC ĐỊNH VIRUS BẰNG KỸ THUẬT RTPCR

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC


LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP VIRUS PRRS TỪ HUYẾT THANH HEO CON
TRÊN MÔI TRƯỜNG TẾ BÀO MARC-145 VÀ XÁC ĐỊNH
VIRUS BẰNG KỸ THUẬT RT-PCR

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Niên khóa: 2004 - 2008
Sinh viên thực hiện: TRẦN ÁNH HỒNG

Tháng 9/2008


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC


LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP VIRUS PRRS TỪ HUYẾT THANH HEO CON
TRÊN MÔI TRƯỜNG TẾ BÀO MARC-145 VÀ XÁC ĐỊNH
VIRUS BẰNG KỸ THUẬT RT-PCR

Giáo viên hướng dẫn:

Sinh viên thực hiện:

ThS. TRẦN THỊ BÍCH LIÊN

TRẦN ÁNH HỒNG

BSTY. HOÀNG THANH HẢI

Thaùng 9/2008

ii


LỜI CẢM ƠN
 Với tất cả lòng kính trọng và yêu thương, con xin tri ân công ơn sinh thành,
dưỡng dục của Ba Mẹ _ những Người đã cho con được như hôm nay.
 Em xin chân thành cảm ơn ThS. Trần Thị Bích Liên và BSTY. Hoàng Thanh
Hải đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em trong suốt thời gian hoàn thành khóa
luận.
 Xin được gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu Trường Đại học Nông Lâm TP.
Hồ Chí Minh, quý thầy cô Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học cùng các Khoa, Bộ
môn khác đã tận tình truyền đạt kiến thức cho em trong suốt bốn năm đại
học.
 Xin cảm ơn cô Lê Thị Hà_Bộ môn Vi sinh – Truyền nhiễm, Khoa Chăn nuôiThú y, anh Lương Quý Phương, chị Đặng Ngọc Thùy Dương, cùng các anh
chị ở Trung tâm Phân tích Thí nghiệm Hóa Sinh, trường Đại học Nông Lâm
TP. Hồ Chí Minh đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo nhiều điều kiện thuận lợi cho
em trong thời gian thực tập tốt nghiệp.
 Xin cảm ơn các bạn lớp DH04SH, cùng các bạn thân thương nhóm A week –
holiday đã chia sẻ mọi khó khăn, động viên Hồng trong suốt bốn năm qua.
 Em cảm ơn Anh …

TP. Hồ Chí Minh, tháng 09 năm 2008
Sinh viên thực hiện
Trần Ánh Hồng

iii


TÓM TẮT
Đề tài: “Phân lập virus PRRS từ huyết thanh heo con trên môi trường tế bào
MARC-145 và xác định virus bằng kỹ thuật RT-PCR” được thực hiện từ tháng
4/2008 đến tháng 9/2008, tại Bộ môn Vi sinh – Truyền nhiễm, Khoa Chăn nuôi –
Thú y, và tại Trung tâm Phân tích Thí nghiệm Hóa Sinh, trường Đại học Nông Lâm
Tp.Hồ Chí Minh.
Mục tiêu của đề tài là phát hiện virus PRRS trong huyết thanh heo cai sữa,
nhằm nghiên cứu sâu hơn những đặc điểm của virus và góp phần giúp ích cho
những nghiên cứu sau này.
Nội dung thực hiện bao gồm:
-

Phát hiện kháng thể kháng virus PRRS trong huyết thanh bằng kỹ thuật
ELISA.

-

Phân lập virus PRRS từ những mẫu huyết thanh trên, bằng cách gây
nhiễm 2 lần trên môi trường tế bào MARC-145.

-

Phát hiện virus từ dịch tế bào nuôi cấy sau khi gây nhiễm lần 2 bằng kỹ

thuật RT-PCR.

-

Gây nhiễm lần 3 trên môi trường tế bào MARC-145 các chủng virus phân
lập được, nhằm khảo sát đặc tính phát triển của virus trên tế bào MARC145.

Sau thời gian thực hiện, chúng tôi thu được các kết quả sau:
-

83,33% mẫu huyết thanh có kết quả ELISA dương tính.

-

Qua 2 lần gây nhiễm trên tế bào MARC-145 và xác định virus bằng kỹ
thuật RT-PCR, chúng tôi phân lập được virus PRRS từ 5 trên tổng số 12
mẫu huyết thanh, chiếm tỷ lệ 41,67%.

-

Bệnh tích tế bào do virus PRRS gây ra xuất hiện rõ và tăng dần qua 3 lần
gây nhiễm. Bệnh tích thường xuất hiện vào ngày thứ 2 sau gây nhiễm, rõ
nhất vào ngày thứ 4, từ ngày thứ 5 đến ngày thứ 7, hầu hết tế bào chết và
bong khỏi bề mặt nuôi cấy.

iv


ABSTRACT
The graduating thesis “ Isolating PRRS virus from sera of piglets in MARC145 cells and identifying this virus by RT-PCR” was carried out from April to

September, 2008, at Microbiology and Infectious Diseases Dept., Faculty of Animal
Science Veterinary, and Center For Chemical And Biological Analysis And
Experiment of Nong Lam university, Ho Chi Minh city.
The purpose of this study is isolating PRRS virus from serum samples of
piglets to study deeply about some characteristics of PRRSV and to be the premise
for later studies.
The contents includes:
-

To detect PRRSV antibody in serum by ELISA.

-

To isolate PRRSV from these serum samples by two consecutive incubations
in MARC-145 cells.

-

To detect PRRSV in cell suspension of the second passage.

-

To infect again MARC-145 cells with PRRSV from the cell suspension of the
second passage, which are possitive to PRRSV, to study more about some
characteristics of this virus.
When finishing the study, we have found that:

-

83,33 percents of investigated sera samples show positive results by ELISA

technique.

-

After two consecutive incubations of these samples in MARC-145 cells, then
identifing the presence of PRRSV by RT-PCR, we have isolated PRRSV in 5
samples from 12 serum samples with the percentage of 41,67.

-

The CPEs induced by PRRSV is gradually become clear and increased
through three passages. The CPEs emerge in the second day post incubation
and be clearest in the fourth day post incubation.

v


MỤC LỤC
Lời cảm ơn............................................................................................................iii
Tóm tắt.................................................................................................................. iv
Abstract.................................................................................................................. v
Mục lục ................................................................................................................. vi
Danh sách các chữ viết tắt .................................................................................... ix
Danh sách các hình, bảng, sơ đồ ........................................................................... x
Chương 1: MỞ ĐẦU ........................................................................................... 1
1.1.

Đặt vấn đề................................................................................................... 1

1.2.

Mục đích - Yêu cầu .................................................................................... 2

Chương 2: TỔNG QUAN ................................................................................... 3
2.1.

Sơ lược về virus PRRS .............................................................................. 3

2.1.1. Lịch sử bệnh và tên gọi .............................................................................. 3
2.1.2. Phân loại ..................................................................................................... 4
2.1.3. Một số đặc điểm về hình thái và cấu trúc................................................... 4
2.1.4. Chu trình nhân lên của virus PRRS trong tế bào........................................ 6
2.1.5. Sức đề kháng .............................................................................................. 9
2.1.6. Loài mắc bệnh ............................................................................................ 9
2.1.7. Chất chứa virus........................................................................................... 9
2.1.8. Cơ chế sinh bệnh ...................................................................................... 10
2.1.9 Triệu chứng .............................................................................................. 10
2.2.

Các phương pháp chẩn đoán .................................................................... 11

2.2.1. Chẩn đoán lâm sàng.................................................................................. 11
2.2.2. Chẩn đoán phi lâm sàng ........................................................................... 11
2.2.2.1.Phát hiện kháng thể ................................................................................. 11
2.2.2.2.Phát hiện virus hoặc kháng nguyên virus PRRS ..................................... 14
2.2.2.3.Phương pháp sinh học phân tử ................................................................ 20

vi

Chương 3: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH ........................ 26
3.1. Thời gian và địa điểm................................................................................ 26
3.2. Đối tượng và số lượng mẫu ....................................................................... 26
3.3. Nội dung nghiên cứu ................................................................................. 26
3.4. Vật liệu và dụng cụ.................................................................................... 27
3.4.1. Vật liệu và dụng cụ cho phản ứng ELISA................................................. 27
3.4.2. Thiết bị và dụng cụ nuôi cấy tế bào và phân lập virus PRRS ................... 27
3.4.3. Vật liệu nuôi cấy tế bào MARC- 145........................................................ 27
3.4.4. Vật liệu và hoá chất chiết tách RNA ........................................................ 27
3.4.5. Thiết bị và dụng cụ cho phản ứng PCR.................................................... 27
3.4.6. Kit sử dụng cho RT-PCR ......................................................................... 28
3.4.7. Vật liệu và hoá chất điện di sản phẩm RT-PCR........................................ 28
3.5. Phương pháp tiến hành .............................................................................. 29
3.5.1. Phương pháp lấy mẫu ................................................................................ 29
3.5.2. Phương pháp xử lý và bảo quản mẫu ........................................................ 29
3.5.3. Phương pháp thực hiện phản ứng ELISA.................................................. 29
3.5.4. Phương pháp nuôi cấy tế bào MARC- 145 ............................................... 30
3.5.4.1.Hồi phục tế bào........................................................................................ 30
3.5.4.2.Cấy chuyển tế bào ................................................................................... 30
3.5.5. Phương pháp phân lập virus ..................................................................... 31
3.5.5.1.Phương pháp gây nhiễm tế bào lần thứ nhất ........................................... 32
3.5.5.2.Phương pháp thu hoạch dịch tế bào......................................................... 32
3.5.5.3.Phương pháp gây nhiễm lần hai và lần ba bằng dịch tế bào đã thu hoạch32
3.5.6. Phương pháp xác định sự hiện diện của virus bằng kỹ thuật RT-PCR ..... 32
3.5.6.1. Chu trình nhiệt của phản ứng RT-PCR .................................................. 33
3.5.6.2. Điện di sản phẩm RT-PCR ..................................................................... 33
Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN........................................................ 34
4.1. Kết quả ELISA trên huyết thanh heo ........................................................ 34
4.2. Kết quả phân lập virus trên môi trường tế bào MARC-145....................... 35
4.2.1 .Kết quả gây nhiễm lần một trên môi trường tế bào MARC-145............... 35

vii


4.2.2. Kết quả gây nhiễm lần hai trên môi trường tế bào MARC-145................ 37
4.2.3. Kết quả RT-PCR từ mẫu dịch tế bào sau khi gây nhiễm (passage) lần 2 . 39
4.2.4. Kết quả gây nhiễm lần ba trên môi trường tế bào MARC-145 ................. 42
Chương 5: KẾT LUẬN, TỒN TẠI VÀ ĐỀ NGHỊ ......................................... 47
5.1. Kết luận...................................................................................................... 47
5.2. Tồn tại........................................................................................................ 47
5.3. Đề nghị ...................................................................................................... 47
TÀI LIỆU THAM KHẢO................................................................................. 48
PHỤ LỤC

viii


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
CPE :

Cytopathic Effect

DNA:

Deoxynucleotide Acid

dNTP:

Deoxynucleotide Triphosphate

ELISA:

Enzyme Linked Immunosorbent Assay

EMEM: Eagle Minimum Essential Medium
FA:

Florescent Antibody Staining

FBS :

Fetal Bovine Serum.

HRPO:

Horseradish Peroxidase

IFA:

Immuno Peroxidase Monolayer Assay

IHC:

Immunohistochemistry Staining

IPMA:

Immuno peroxidase Monolayer Assay

LAH:

Lactalbumin Hydrolysate

MSD:

Mystery Swine Disease

OIE :

Office of International Epidemiology

ORF:

Open Reading Frame

PAM:

Porcine Alveolar Macrophage

PEARS : Porcine Epidemic Abortion and Respiratory Syndrome
PBS:

Phosphate Buffer Saline

PBSA:

Phosphate Buffer Saline Solution A

PCR:

Polymerase Chain Reaction

PRRS:

Porcine Reproductive And Respiratory Syndrome

RNA:

Ribonucleotide Acid

RT-PCR: Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction
SVN:

Serum Virus Neutralization

SIRS :

Swine Infertility and Respiratory Disease

TBE:

Tris Borate EDTA

TMB :

Tetramethylbenzidine

ix

DANH SÁCH CÁC HÌNH, BẢNG, SƠ ĐỒ
HÌNH..........................................................................................................TRANG
Hình 2.1. Virus PRRS ........................................................................................... 4
Hình 2.2. Mô hình bộ gen virus PRRS .................................................................. 5
Hình 2.3. Mô hình chu trình nhân lên của virus PRRS trong tế bào ..................... 8
Hình 2.4. Đại thực bào bình thường .................................................................... 10
Hình 2.5. Đại thực bào bị nhiễm virus PRRS...................................................... 10
Hình 4.1. Hình sản phẩm RT-PCR từ mẫu DTB gây nhiễm lần 2..................... 41
Hình 4.2. Đối chứng âm vào ngày thứ 5 ............................................................. 43
Hình 4.3. Mẫu không có bệnh tích tế bào vào ngày thứ 5 sau khi gây nhiễm .... 43
Hình 4.4. Mẫu có bệnh tích tế bào nghi ngờ vào ngày thứ 5 sau gây nhiễm....... 44
Hình 4.5. Đối chứng dương ngày thứ 5 sau khi gây nhiễm ................................ 44
Hình 4.6. Bệnh tích tế bào ở mẫu 1.4 vào ngày thứ 5 sau khi gây nhiễm lần 1.. 45
Hình 4.7. Bệnh tích tế bào ở mẫu 2.4 vào ngày thứ 5 sau khi gây nhiễm lần 1 .. 45
Hình 4.8. Bệnh tích tế bào ở mẫu 2.4 vào ngày thứ 5 sau khi gây nhiễm lần 2 .. 46
Hình 4.9. Bệnh tích tế bào ở mẫu 1.4 vào ngày thứ 5 sau khi gây nhiễm lần 3 .. 46
BẢNG.........................................................................................................TRANG
Bảng 4.1. Kết quả ELISA.................................................................................... 34
Bảng 4.2. Kết quả gây nhiễm lần một trên môi trường tế bào MARC-145 ........ 36
Bảng 4.3. Kết quả gây nhiễm lần hai trên môi trường tế bào MARC-145 ......... 38
Bảng 4.4. Kết quả CPE và RT-PCR từ mẫu dịch tế bào sau 2 lần gây nhiễm .... 39
Bảng 4.5. Kết quả gây nhiễm lần ba trên môi trường tế bào MARC-145........... 42
SƠ ĐỒ........................................................................................................TRANG
Sơ đồ 3.1. Sơ đồ phân lập và xác định virus PRRS. ............................................. 31
Sơ đồ 3.2. Sơ đồ thực hiện phản ứng RT-PCR ..................................................... 33

x


Chương 1

MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Nền kinh tế nước ta dựa vào nông nghiệp là chủ yếu; trong đó, ngành chăn
nuôi giữ vai trò quan trọng vì đáp ứng được phần lớn nhu cầu thực phẩm thiết yếu
cho con người và đóng góp không nhỏ cho lợi ích kinh tế của đất nước. Trên ưu thế
đó, chăn nuôi heo được xem là ngành tương đối ổn định, và ngày càng phát triển
mạnh nhằm đáp ứng nhu cầu đang gia tăng của xã hội, nhất là sau khi dịch cúm gia
cầm nổ ra đầu tiên vào năm 2003 và thỉnh thoảng vẫn tái phát.
Để phát huy vị thế của ngành chăn nuôi heo, đảm bảo tạo ra nhiều con giống
tốt cho chất lượng thịt cao, ngoài những yếu tố như chọn giống, quản lý, chăm sóc,
dinh dưỡng, các nhà chăn nuôi còn phải đặc biệt lưu tâm đến việc phòng và trị bệnh
trên heo, nhất là những bệnh truyền nhiễm gây ảnh hưởng trực tiếp đến năng suất
sinh sản và tăng trưởng, như: bệnh đóng dấu son, dịch tả heo, bệnh giả dại, ... gần
đây nhất là hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp trên heo (PRRS: porcine
reproductive and respiratory syndrome).
Bệnh được phát hiện từ những năm cuối thập niên 1980, và đầu thập niên
1990 ở một số nước Châu Âu và Châu Mỹ, đến nay đã lan rộng ra nhiều nước trên
thế giới. Bệnh do virus PRRS gây ra, tiến triển phức tạp, khó kiểm soát, với các
triệu chứng như: sẩy thai; heo con sinh ra yếu; hoặc chết trước khi sinh; hay còi cọc,
chậm lớn; ....
Ở Việt Nam, bệnh được phát hiện đầu tiên vào năm 1997, trên đàn heo nhập
từ Mỹ. Gần đây, bệnh lại bùng phát ở nhiều tỉnh thành trong cả nước, gây ra thiệt
hại kinh tế không nhỏ cho ngành chăn nuôi heo. Ở ổ dịch cấp tính, ước tính giảm
sản lượng 5-20%, giảm từ 1-3,8 heo con/nái/năm, thiệt hại từ 100-155 USD/nái/năm
(dẫn liệu Hoàng Văn Năm, 2001). Thể mãn tính làm cho heo thịt chậm lớn, tăng chi
phí thuốc để điều trị các bệnh kế phát. Do đó, nhằm giảm thiểu tác hại, hạn chế

1

những thiệt hại về kinh tế do bệnh gây ra, việc phân lập virus PRRS trên tế bào là
một phương pháp cần thiết, không chỉ phục vụ cho các nghiên cứu về virus PRRS,
mà còn góp phần làm nền tảng cho sự phát triển của nhiều biện pháp chẩn đoán và
phòng bệnh sau này như: sản xuất vaccine, bộ kit xét nghiệm, …
Xuất phát từ thực tế trên, được sự phân công của Bộ môn Công Nghệ Sinh
Học, trường Đại Học Nông Lâm TP. HCM, dưới sự hướng dẫn của ThS. Trần Thị
Bích Liên và BSTY Hoàng Thanh Hải, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Phân
lập virus PRRS từ huyết thanh heo con trên môi trường tế bào MARC-145 và
xác định virus bằng kỹ thuật RT-PCR”
1.2. Mục đích – yêu cầu
1.2.1. Mục đích
Phát hiện sự hiện diện của virus PRRS trong huyết thanh heo sau cai sữa có
biểu hiện nghi ngờ bệnh tại một số trại đã nổ dịch, nhằm nghiên cứu sâu hơn các
đặc điểm của virus, góp phần làm tiền đề cho những nghiên cứu sau này.
1.2.2. Yêu cầu
 Phát hiện kháng thể kháng virus PRRS bằng kỹ thuật ELISA.
 Phân lập virus PRRS trên môi trường tế bào MARC-145.
 Ghi nhận bệnh tích tế bào sau 7 ngày nuôi cấy và thời gian xuất hiện bệnh tích
qua 3 lần gây nhiễm trên tế bào (passage).
 Dùng kỹ thuật RT- PCR để xác định sự hiện diện của virus PRRS từ dịch tế bào
nuôi cấy.

2


Chương 2

TỔNG QUAN
2.1 Sơ lược về virus PRRS

2.1.1. Lịch sử bệnh và tên gọi
Năm 1987, bệnh được phát hiện lần đầu tiên ở Mỹ, do chưa xác định căn
nguyên bệnh nên được gọi là “bệnh thần bí trên heo” (Mystery Swine Disease MSD). Sau đó, bệnh lây lan rộng trên toàn thế giới và được gọi bằng nhiều tên: hội
chứng hô hấp và vô sinh của heo (Swine Infertility and Respiratory Disease - SIRS),
bệnh bí hiểm ở heo (MSD), hội chứng hô hấp và sảy thai ở heo (Porcine Epidemic
Abortion and Respiratory Syndrome-PEARS), hội chứng hô hấp và sinh sản ở heo
(PRRS), bệnh tai xanh (Blue-eared Pig Disease). Năm 1992, Hội nghị quốc tế về
bệnh này đã nhất trí dùng tên PRRS (porcine reproductive and respiratory
syndrome) và được Tổ chức Dịch tễ thế giới (OIE) công nhận.
Ở Việt Nam, bệnh được phát hiện đầu tiên vào năm 1997 bằng kiểm tra huyết
thanh học trên đàn heo nhập từ Mỹ (10/51 con có huyết thanh dương tính). Năm
1999 một khảo sát của Cơ quan Thú Y Vùng 6 ở một số trại giống tại các tỉnh phía
Nam cho thấy tỉ lệ heo có huyết thanh dương tính với bệnh rất khác nhau, từ 1,3%
cho tới 68,29%. Ngày 12/3/2007, đợt dịch đầu tiên bùng nổ tại Hải Dương, chỉ
trong vòng 1 tháng, bệnh đã lây lan sang 6 tỉnh lân cận như Hưng Yên, Bắc Ninh,
Bắc Giang, Thái Bình, Hải Phòng và Quảng Ninh. (dẫn liệu Trần Thị Bích Liên,
2008). Theo đánh giá không chính thức, hiện nay hội chứng PRRS có thể đã chuyển
sang dạng mãn tính tại hầu hết các trại có bệnh (Nguyễn Ngọc Hải và cs, 2008). Kết
quả giải trình tự và gây bệnh thực nghiệm trên heo cho thấy chủng virus PRRS tại
Việt Nam hiện nay có mức độ tương đồng cao về di truyền so với virus PRRS
chủng độc lực cao của Trung Quốc (Tô Long Thành và cs, 2008).

3


2.1.2. Phân loại
Virus PRRS thuộc:
Bộ Nidovirales
Họ Arteriviridae
Giống Arterivirus

Hình 2.1. Virus PRRS
(Nguồn: http//www. agraroldal.hu)
Ba đặc tính quan trọng của giống Arterivirus nói chung và virus PRRS nói
riêng là: (1) Gây nhiễm trùng dai dẳng mà không thể hiện triệu chứng; (2) Nhân lên
bên trong các đại thực bào; (3) Có khả năng biến đổi gen rất lớn.
Dựa trên đặc điểm về kiểu gen, virus PRRS được phân biệt làm 2 genotype:
các dòng virus Châu Âu (tiêu biểu là dòng Lelystad_LV) và các dòng virus Châu
Mỹ (tiêu biểu là dòng VR-2332).
2.1.3. Một số đặc điểm về hình thái và cấu trúc
Virus PRRS có bộ gen là RNA sợi đơn, hình cầu, kích thước 45-60 nm, nhân
nucleocapsid hình khối với đường kính 25-35nm, có vỏ bọc. Vỏ được cấu tạo bởi 2
lớp màng lipid lấy từ tế bào vật chủ, mang 2 loại protein chủ yếu (protein màng M
và protein vỏ E) và 4 loại protein thứ yếu GP2, GP3, GP4 và GP5 (G: glycosylate, P:
protein).
Bộ gen của virus PRRS dài khoảng 15 kb, gồm 8 khung đọc mở (ORFs) mã
hoá cho các thành phần khác nhau của virus: ORF 1a và 1b chiếm 80% của gen, mã
hóa những protein không cấu trúc của virus; các ORF từ 2-7 chiếm 20% còn lại của

4


gen, mã hóa cho các protein cấu trúc (dẫn liệu Trần Thị Bích Liên, 2008). Trong đó,
3 khung ORFs: 7;6 và 5 có ý nghĩa quan trọng trong định danh virus vì protein mà
chúng quy định là những protein cấu trúc quan trọng nhất, chiếm 90-95% lượng
protein cấu trúc của virus. Đến nay người ta đã xác định được 3 protein cấu trúc
chính của virus PRRS:
* Protein nhân (N-nucleocapsid): là một loại protein nhỏ, trọng lượng
khoảng 15kDa, có tính kiềm và tính miễn dịch cao, được quy định bởi ORF 7.
Kháng thể do protein này tạo ra ở heo nhiễm bệnh thường sớm hơn kháng thể chống

lại bất cứ protein nào khác (dẫn liệu Trần Thị Bích Liên, 2008). Protein N hiện diện
ở mức độ cao trong những tế bào bị nhiễm virus PRRS và chiếm từ 20- 40% lượng
protein của phân tử virus. Hiện nay protein N được dùng như là một kháng nguyên
để phát hiện kháng thể trong huyết thanh của heo.
* Protein màng (M-membrane): là một loại protein có tính kháng nguyên cao,
trọng lượng khoảng 19 kDa, được quy định bởi ORF 6. Protein này ít biến đổi nên
không dùng trong việc xác định dòng virus (dẫn liệu Trần Thị Bích Liên, 2008).
* Protein vỏ glycoprotein (E-envelope): là protein có sự biến đổi nhiều nhất,
trọng lượng khoảng 24-25 kDa, được quy định bởi ORF 5. Bằng kỹ thuật xác định
trình tự gen của virus PRRS, Umthun và Mengeling (1999) đã khẳng định rằng
protein E rất hữu dụng trong việc phân biệt các dòng virus PRRS. Protein này cũng
là nguyên nhân gây ra hiện tượng apoptosis và đóng vai trò quan trọng trong việc
nhận diện thụ thể trên tế bào đích (Nathalie và cs, 2003).

Hình 2.2. Mô hình bộ gen virus PRRS (dựa trên trình tự Lelystad virus)
(Nguồn: Delputte, 2004)

5


Hai dòng virus: Châu Âu và Châu Mỹ không những khác biệt về đặc tính gây
bệnh mà khác nhau ở mức độ nhất định về kiểu gen. Tùy theo ORF mà sự tương
đồng về gen giữa 2 dòng này dao động từ 52% đến 81%. Đây chính là cơ sở cho
việc sử dụng kỹ thuật RT-PCR, RFLP… để chẩn đóan virus PRRS và phân biệt
dòng PRRS châu Mỹ và Châu Âu. Tuy nhiên, các chủng trong cùng một dòng lại rất
gần gũi nhau về cấu trúc kháng nguyên (dẫn liệu Nguyễn Ngọc Hải, 2007).
Qua phân tích gen và theo dõi sự thay đổi trình tự nucleotide của các dòng
PRRS, người ta đã xác định rằng ở dòng Châu Mỹ, các ORFs 7 và 6 có tính ổn định
rất cao, chúng gần như không thay đổi trong suốt quá trình tiến hoá của dòng virus
này. Tuy nhiên, có sự khác biệt rất rõ giữa dòng virus Châu Âu và Châu Mỹ ở 2

khung đọc mở này, chẳng hạn sự tương đồng về trình tự axit amin của ORFs 7 giữa
2 dòng virus này chỉ vào khoảng 57-59% và của ORFs 6 là 70-81%. Trong khi đó,
khung đọc mở ORFs 5 lại biến đổi nhiều giữa các chủng trong cùng 1 dòng Châu
Mỹ và chỉ tương đồng với dòng Châu Âu khoảng 51-59%. Sự tương đồng về trình
tự axit amin quy định do các khung đọc mở ORFs 2, 3 và 4 giữa các dòng Châu Mỹ
và Châu Âu tương ứng chỉ ở từ 63,58% và 68% (dẫn liệu Nguyễn Ngọc Hải, 2007).
2.1.4. Chu trình nhân lên của virus PRRS trong tế bào
Theo Delputte (2004), chu trình nhân lên của virus PRRS trong tế bào gồm
những giai đoạn sau:
 Bám dính và xâm nhập
Virus PRRS có tính hướng tế bào chuyên biệt đối với các đại thực bào phế
nang heo (porcine alveolar marophage_PAM), một số dòng tế bào liên tục như CL
2621, và các dòng tế bào thận khỉ mặt xanh Châu Phi (African monkey cell lineMA-104).
Virus xâm nhập vào tế bào bằng con đường nhập nội bào (endocytosis) qua
trung gian là những thụ thể (receptor) đặc hiệu trên bề mặt tế bào đích. Hiện nay,
nhiều nghiên cứu đã xác định heparan sulphate và sialoadhesin là những thụ thể
giúp virus PRRS bám dính và xâm nhập vào tế bào PAM (Vanderheijden và cs,
2003; Delputte và cs, 2004; Kim và cs, 2005; Calvert và cs, 2007); còn vimentin và

6


CD151 là các thụ thể có chức năng tương tự trên tế bào MARC-145 (Kim và cs,
2005; Shanmukhappa và cs, 2007).
Ngoài ra, Calvert và cs (2007) đã chứng minh rằng CD163_1 protein hiện
diện trên PAM; tế bào ung thư mô bạch huyết ở người; dòng tế bào thận khỉ mặt
xanh Châu Phi (MARC-145 và Vero); tế bào sơ cấp của màng bụng chuột; và tế bào
DH82 ở chó, cũng được xem như 1 thụ thể của virus PRRS trên tế bào, đóng vai trò
quan trọng đối với quá trình xâm nhập, cởi vỏ, và giải phóng RNA virus vào tế bào
chất.

 Sự nhân lên của bộ gen và dịch mã những RNA thông tin
Sau khi xâm nhập vào tế bào, bộ gen của virus được phóng thích ra ngoài tế
bào chất của tế bào bị nhiễm. Sau đó, nó được dịch mã thành phức hợp những men
cần thiết cho sự nhân lên của virus và những protein không cấu trúc. Những protein
này kết hợp với lưới nội chất không hạt tạo ra những túi có màng kép. Những túi
này là nơi mà RNA của virus được tổng hợp, đồng thời sẽ mang phức hợp cần cho
sự nhân lên của virus. Tiếp theo, các RNA thông tin của virus được tạo ra, trong đó
những RNA thông tin phụ trợ sẽ được mã hóa thành những protein cấu trúc.
 Sự lắp ráp và thoát ra ngoài tế bào của virus
Người ta cho rằng RNA được tạo ra ở những túi có màng kép sẽ kết hợp với
protein N để tạo thành những nuccleocapsid. Để tạo vỏ, những nuccleocapsid này sẽ
đi vào trong lưới nội chất không hạt. Sau đó, chúng được chuyển qua bộ máy Golgi
vì một số protein cấu trúc được hoàn thiện tại đây. Trong những tế bào bị nhiễm
virus, những hạt virus tập trung tại bộ máy Golgi và lưới nội chất không hạt, sau đó
chúng thoát ra ngoài bằng con đường xuất ngoại bào.

7


Hình 2.3. Mô hình chu trình nhân lên của virus PRRS trong tế bào
(Nguồn : Delputte, 2004)

Sau khi nhân lên, hầu hết các chủng virus PRRS đều gây bệnh tích tế bào. Tuy
nhiên một số chủng virus ít gây bệnh tích hoặc chỉ gây bệnh tích tế bào sau khi cấy
chuyển (passage) (OIE, 2000). Nhìn chung, biểu hiện bệnh tích chính là những tế
bào bị nhiễm sẽ co tròn, tập trung lại, dày lên, nhân kết đặc và tách ra một lớp sau
2-4 ngày nuôi cấy. Toàn bộ lớp tế bào bong ra và bị phá hủy sau 6 ngày (Benfield
và cs, 1992). Một số chủng virus tạo ra những mảng tế bào trên môi trường MARC145 và PAM. Một nghiên cứu khác của Bloemraad và cs (1994) cho thấy sau 40 giờ
nuôi cấy, gần 40% tế bào trên môi trường PAM có bệnh tích. Tuy nhiên, kết quả
này có thể khác nhau giữa các phòng thí nghiệm (dẫn liệu Trần Thị Bích Liên,

2008).

8


Sự nhân lên của virus ở các tế bào dòng CL 2621 hoặc MA-104 còn chưa
được nghiên cứu chi tiết. Trong những dòng tế bào này, bệnh tích tế bào phát triển
chậm hơn, xuất hiện 2-6 ngày sau khi cấy truyền, đầu tiên tế bào tròn lại, tập trung
thành cụm, sau đó dày lên, nhân co lại và cuối cung bong ra.
2.1.5. Sức đề kháng
Virus PRRS không bền với nhiệt độ và pH. Ở nhiệt độ cao virus bất hoạt rất
nhanh: bất hoạt hoàn toàn ở 370C trong 48 giờ và 45 phúc ở 560C. Benfield và ctv
(1992) cũng chứng minh rằng virus PRRS chịu đựng được pH 6,5-7,5 nhưng khả
năng gây nhiễm sẽ mất nhanh chóng ở pH <6 và pH>7.
Ngoài ra, virus PRRS dễ bị hủy diệt bởi chất sát trùng và tia cực tím, dễ dàng
bị vô hoạt trong các dung môi lipid như chloroform, ether (dẫn liệu của Trần Thanh
Phong, 1996). Nói chung, các dung dịch có tính tẩy sẽ dễ dàng phá vỡ lớp vỏ bọc và
phóng thích phần lõi không thể gây nhiễm, vì vậy, làm giảm khả năng lây nhiễm
của virus.
Virus gây nhiễm bị bất hoạt rất nhanh trong điều kiện khô hạn ở môi trường
bên ngoài, nhưng tồn tại 9 ngày trong nước giếng và 11 ngày trong nước máy (dẫn
liệu Trần Thị Bích Liên, 2008).
2.1.6. Loài mắc bệnh
Heo (heo nhà và heo rừng) là động vật nhạy cảm nhất đối với virus PRRS,
ngoài ra còn có vịt trời (dẫn liệu Hoàng Thanh Hải, 2005)
Virus PRRS không lây qua người.
2.1.7. Chất chứa virus PRRS
Ở thú nhiễm bệnh, virus sẽ có trong nước bọt, dịch tiết mũi, nước tiểu, tinh
dịch và có thể trong phân. Heo nái nhạy cảm thường nhiễm ở giai đoạn cuối của kỳ
mang thai và có thể có virus trong dịch tiết của tuyến vú. Trên heo nhiễm bệnh, máu

chứa virus rất sớm, trong vòng 12-24 giờ sau khi nhiễm. Hạch amidan và hạch bạch
huyết chứa nhiều virus vì đây là nơi nhân lên đầu tiên của virus PRRS. Virus có thể
tồn tại trong vùng hầu họng đến vài tháng sau khi nhiễm. Virus cũng có thể được

9


phát hiện từ mẫu ngoáy mũi từ 9-21 ngày sau khi gây bệnh (Benfield 1994; Rossow,
1994).
2.1.8. Cơ chế sinh bệnh
Khoảng 12 giờ sau khi nhiễm qua bề mặt màng nhầy, virus PRRS có trong đại
thực bào của niêm mạc mũi, phổi và bạch hầu. Sự nhân lên đầu tiên xảy ra ở đây,
sau đó, virus đi vào đường tuần hoàn (virus nhiễm huyết), nhân lên lần hai ở phổi,
hạch lâm ba, tim, tuyến ức, lách và những nơi khác. Đối với thú mang thai, virus đi
qua nhau và gây nhiễm phôi (dẫn liệu Trần Thị Bích Liên, 2008).
Như vậy, nếu những đại thực bào bị phá hủy thì sẽ làm giảm khả năng của vật
chủ chống lại vi khuẩn kế phát hoặc sự xâm nhập của các virus khác. Hầu hết nhiễm
kế phát được quan sát sau ổ dịch PRRS là bệnh đường hô hấp (dẫn liệu Hoàng Văn
Năm, 2001).

Hình 2.4. Đại thực bào bình thường Hình 2.5. Đại thực bào bị nhiễm
virus PRRS
(Nguồn: )

2.1.9. Triệu chứng
Thời gian ủ bệnh thường từ 4-8 ngày, tuy nhiên trong thực tế một số ổ dịch có
thời gian ủ bệnh dài hơn (có thể tới 37 ngày) (AHA, 2004). Sự khác nhau về thời
gian ủ bệnh có thể phản ánh sự khác nhau về độc lực giữa các chủng virus, sự khác
nhau về mật độ heo ở đàn bị bệnh, …
Triệu chứng bệnh khác nhau tùy theo từng nhóm heo, lứa tuổi nhiễm, độc lực

của chủng virus nhiễm…. Nhưng triệu chứng chung thường thấy là rối loạn sinh sản

10


trên heo nái và hô hấp trên heo con, biểu hiện tai xanh do tím tái, da xuất huyết, …
Đặc biệt, heo cai sữa bị nhiễm virus PRRS thường biểu hiện các triệu chứng như :
sốt trên 400C, tần suất hô hấp tăng cao, ho nhẹ, lông xác xơ, biếng ăn, … Ở thể mãn
tính, heo còi cọc và giảm tăng trọng (dẫn liệu Trần Thị Bích Liên, 2008). Ngoài ra,
trong trường hợp ghép với bệnh khác có thể thấy viêm phổi lan toả cấp tính, hình
thành nhiều ổ áp-xe, thể trạng gầy yếu, da xanh, tiêu chảy, hắt hơi, chảy nước mắt,
thở nhanh, tỷ lệ chết có thể tới 15% (dẫn liệu Hoàng Văn Năm, 2001).
2.2. Các phương pháp chẩn đoán
2.2.1. Chẩn đoán lâm sàng
Chẩn đoán lâm sàng được thực hiện qua việc quan sát triệu chứng lâm sàng
và bệnh tích trên heo bị bệnh đồng thời phân biệt với những bệnh khác về hô hấp và
sinh sản ở heo.
Tuy nhiên, do sự đa dạng về dấu hiệu lâm sàng của bệnh, cũng như sự giống
nhau khi heo nhiễm virus PRRS và các nguyên nhân do virus, vi khuẩn gây bệnh
khác nên heo bệnh đôi khi chưa thể hiện rõ những triệu chứng đặc trưng của PRRS.
Vì vậy, việc chẩn đoán trong phòng thí nghiệm là rất cần thiết để xác định chính xác
căn bệnh, đó cũng là cơ sở cho công tác kiểm soát và phòng chống hiệu quả.
2.2.2. Chẩn đoán phi lâm sàng
2.2.2.1. Phát hiện kháng thể
 Kỹ thuật miễn dịch peroxidase một lớp (IPMA : Immunoperoxidase
monolayer assay)
Dùng virus PRRS gây nhiễm trên đại thực bào phế nang của heo (pig alveolar
macrophages-PAM), dòng tế bào CL2621 và MARC-145 như là kháng nguyên để
chẩn đoán (dẫn liệu Trần Thị Bích Liên, 2008). Kết quả được đánh giá thông qua sự
hiện màu trên lớp tế bào và hiệu giá kháng thể.

11


 Kỹ thuật kháng thể huỳnh quang gián tiếp (IFA: indirect fluorescent
antibody)
Cũng sử dụng nuôi cấy tế bào, tùy theo dòng virus cần chẩn đoán mà sử dụng
loại tế bào khác nhau. Khi quan sát trên kính hiển vi huỳnh quang, sự hiện diện của
màu huỳnh quang trong mẫu xét nghiệm chứng tỏ mẫu có kháng thể kháng virus,
hiệu giá kháng thể tùy thuộc vào cường độ phát huỳnh quang của mẫu dương tính
(dẫn liệu Nguyễn Ngọc Hải, 2007).
 Phương pháp miễn dịch hấp phụ gắn men (ELISA: Enzyme linked
immunosorbent assay)
Nguyên tắc: Sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể.
Thông thường, sự kết hợp kháng nguyên - kháng thể không được phát hiện
bằng mắt thường, kỹ thuật ELISA đã lợi dụng đặc tính hấp phụ tự nhiên của protein
lên polyethylen để gắn kháng nguyên lên giá rồi cho huyết thanh vào ủ ở nhiệt độ
và thời gian thích hợp.Sau khi rửa để loại bỏ những thành phần không kết hợp, cho
thể kết nối là kháng thể khác loài có gắn enzyme, ủ ở nhiệt độ và thời gian thích hợp.
Cuối cùng, rửa và cho vào dung dịch chất hiện màu.
Nếu kháng thể có huyết thanh, sự kết hợp kháng nguyên - kháng thể sẽ xảy ra
và tiếp theo, thể kết nối sẽ kết hợp với phức hợp này. Trong hỗn dịch sẽ có enzyme
để giải phóng [O] từ H2O2, [O] sẽ oxy hóa chất hiện màu làm thay đổi màu của hỗn
dịch. Ngược lại, nếu không có kháng thể trong huyết thanh thì màu của hỗn dịch sẽ
không thay đổi.
Như vậy, kỹ thuật ELISA gồm 3 thành phần tham gia phản ứng: kháng
nguyên; kháng thể; chất hiện màu, và 2 bước:
-

Phản ứng miễn dịch học: sự kết hợp kháng nguyên - kháng thể .

-

Phản ứng hóa học: nhờ hoạt tính của enzyme để giải phóng [O], và
chính [O] này sẽ oxy hóa chất chỉ thị màu. Chất chỉ thị thay đổi màu có
nghĩa là chứng minh sự kết hợp giữa kháng nguyên - kháng thể.

12


Ưu điểm:
-

Độ đặc hiệu và độ nhạy cao, đặc biệt là ở đầu ổ dịch. (Albina và cs,
1992).

-

Khả năng phát hiện kháng thể sớm: trong vòng 3 tuần sau khi nhiễm
bệnh (dẫn liệu Trần Thị Bích Liên, 2008).

-

Thực hiện đơn giản hơn so với IFA và IPMA.

-

Có thể tự động hóa và thực hiện một cách kinh tế cho việc kiểm tra với
quy mô lớn.

-

ELISA thương mại có thể phát hiện được các dòng virus của cả hai
chủng châu Âu và châu Mỹ.

Hạn chế :
-

Phương pháp huyết thanh học như ELISA đôi khi không phải là 1 chẩn
đoán chính xác hoàn toàn, vì giá trị của chỉ số S/P có thể được thay đổi
từ 0,4 đến thấp hơn trên những thú mới nhiễm bệnh (dẫn liệu Trần Thị
Bích Liên, 2008).

-

Không phân biệt được kháng thể mẹ truyền qua sữa đầu hay kháng thể
do nhiễm virus, vì kháng thể mẹ truyền có thể được phát hiện tới khi
heo được 5-6 tuần tuổi, nên không thể dễ xác định bệnh PRRS trên heo
con nhỏ hơn 6 tuần tuổi nếu những heo con này đã bú sữa từ heo nái
nhiễm hoặc đã bị nhiễm từ trước sớm (dẫn liệu Trần Thị Bích Liên,
2008).

 Phản ứng trung hòa virus (SVN: serum virus neutralization)
Được sử dụng để phát hiện và định hiệu giá kháng thể kháng virus. Kết quả
của phản ứng với hiệu giá > 4 được xem là dương tính.

13


Hạn chế :

-

Ít nhạy hơn so với IFA và ELISA (dẫn liệu Trần Thị Bích Liên, 2008),
do ảnh hưởng của sự hình thành kháng thể chống lại virus PRRS trễ,
phải tới 1-2 tháng sau khi nhiễm (dẫn liệu Trần Thị Bích Liên, 2008).

-

Đắt tiền.

-

Khó thực hiện và tốn thời gian vì kháng thể trung hoà xuất hiện chậm
(1-2 tháng sau khi nhiễm).

-

Thường được dùng trong nghiên cứu hơn là dùng trong chẩn đoán.

2.2.2.2. Phát hiện virus hoặc kháng nguyên virus PRRS
 Phương pháp phân lập virus trên môi trường tế bào


Tổng quan về nuôi cấy tế bào

Thuyết tế bào của Schleiden và Schwan đã mở ra khả năng nuôi cấy tế bào ở
thực và động vật: tế bào là đơn vị cấu trúc cơ bản, là đơn vị chức năng của sự sống,
các tế bào sẽ có được bằng sự phân chia từ các tế bào có trước.
Năm 1855, Roux đã chứng minh được khả năng giữ toàn vẹn đặc tính sinh
học của tế bào phôi gà trong dung dịch nước muối sinh lý. Điều này có ý nghĩa rất

lớn trong việc nhận thức sự sống của tế bào bên ngoài cơ thể, đồng thời, mở ra khả
năng phát triển sự sống bên ngoài cơ thể đa bào.
Năm 1907, Harrison lần đầu tiên tiến hành kỹ thuật nuôi cấy tế bào với tế bào
thần kinh ếch.
Năm 1913, Carrel đặt nền tảng cho công nghệ nuôi cấy tế bào động vật : tế
bào động vật hoàn toàn có thể sống trong một khoảng thời gian dài trong điều kiện
in vitro nếu ta thường xuyên cung cấp các chất dinh dưỡng vô trùng cần thiết.
Năm 1948, Earle tiến hành phân lập các tế bào và nuôi chúng trong những
điều kiện môi trường đặc biệt, tác giả đã thu nhận được những dòng tế bào biệt lập.
Kỹ thuật này mở ra khả năng tách tế bào của từng loại mô và phát triển chúng trong
những môi trường nhân tạo.

14


Như vậy, nuôi cấy tế bào là kỹ thuật duy trì và phát triển các tế bào được tách
từ mô hay tách trực tiếp từ cơ quan động vật ở ngoài cơ thể sống, nhưng vẫn đảm
bảo trong điều kiện phòng thí nghiệm, khi được cung cấp các chất dinh dưỡng hoặc
một số yếu tố tăng trưởng, các tế bào vẫn tự phân chia, thực hiện đầy đủ các chức
năng biến dưỡng và những chức năng chuyên biệt của tế bào (dẫn liệu Nguyễn
Ngọc Hải, 2007).
Do thuận lợi nổi bật là tăng nhanh số lượng tế bào theo ý muốn, nên ngày nay
kỹ thuật nuôi cấy tế bào đã được ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực thú y, nhân y,
sinh học để nghiên cứu tác động của các chất lên tế bào hay nghiên cứu virus để
phân lập, giám định, chuẩn độ virus, xác định tính chất huyết thanh học, quan sát
hình thái siêu cấu trúc của virus, đặc biệt là sản xuất vaccine, sản xuất kháng thể
đơn dòng, chẩn đoán và điều trị ung thư, chẩn đoán các tác nhân gây bệnh, chẩn
đoán biến đổi gen và sản xuất các sản phẩm sinh học.
 Một số đặc điểm của tế bào động vật


Sự điều hòa trao đổi chất

Quá trình trao đổi chất của cơ thể tập trung chủ yếu trong từng tế bào, và
quyết định sự tồn tại của cơ thể sống, bao gồm: sự điều khiển của enzyme, hệ dịch
bao quanh tế bào, và sự điều khiển của hệ thần kinh.


Tính cơ học yếu

Tế bào động vật không vách, chỉ được bao bọc bởi một màng tế bào - thành
phần duy nhất ngăn cách giữa tế bào với tế bào trong mô. Kích thước tế bào động
vật lại khá lớn (trung bình khoảng 10 µm). Kích thước lớn, lại không có vách nên
tính bền cơ học yếu. Do đó, khi nuôi cấy, tế bào động vật rất dễ vỡ do các lực tác
động khi thao tác trên tế bào như khuấy trộn để tách tế bào, di chuyển mẫu tế bào,
thời gian thao tác kéo dài.


Tăng trưởng và phân chia chậm

Chu kỳ sinh sản của một tế bào động vật trung bình khoảng 20-30 giờ sau khi
nuôi cấy. Trong khi đó thời gian này của vi khuẩn chỉ khoảng 20-30 phút. Do đó, tế

15