BÀI GIẢNG BẢO QUẢN ĐÔNG LẠNH TẾ BÀO

12/2/17

TS. Vũ Bích Ngọ

1


Dịch vụ làm đông lạnh cơ thể
người chết để chờ hồi sinh
•  Gần 1000 người trên thế giới đã chọn
cách bảo quản lạnh cơ thể sau khi chết để
chờ cơ hội tái sinh trong tương lai.
Khi "khách hàng" đã chết về mặt pháp y, nhân viên Alcor
chuyển họ lên giường lạnh và dùng thiết bị hồi sức tim
phổi làm cho máu lưu thông khắp cơ thể một lần nữa.
Sau đó, họ sử dụng 16 loại thuốc khác nhau để giúp cho
tế bào không bị hư tổn sau khi chết trước khi rút hết máu
và dịch cơ thể rồi bơm chất lỏng bảo vệ nội tạng vào thay
thế.
Cuối cùng, các nhân viên tiến hành làm lạnh
thi thể 0,5 độ C mỗi giờ cho đến khi đạt tới
nhiệt độ của nitơ lỏng -160 độ C sau 2 tuần.
Tiếp đó, họ cho các thi thể vào tủ đông lạnh
hình trụ trong tư thế đầu lộn xuống.


Bọ cánh
cứng
Alaskan

•  Sản xuất chất chống đông sugary

carbohydrate có tên xylomannan
(polymer đường của xylose và
mannose sugars).
•  chịu được nhiệt -100 0C


1949 Polge, Parks và Smith
Sperm

1959 Lovelock and Bishop

GLYCEROL

1950 Smith
Human red blood cells

Dimethyl sulfoxideDMSO
TĂNG CƯỜNG TÍNH THẤM



•  là quy trình sinh học nhằm đảm bảo tính
ổn định về mặt di truyền và cấu trúc
nguyên vẹn của các tế bào sống; đảm
bảo các thành phần như nucleic acid và
protein của tế bào không thay đổi.
•  Quá trình ổn định vật liệu sinh học ở nhiệt
đô cực thấp được gọi là bảo quản đông
lạnh.

Hoạt động biến dưỡng tế bào ngưng lại là một điều kiện tiên quyết trong quy
trình bảo quản tế bào
Tất cả nước trong hệ thống bị chuyển đổi thành đá THÌ hoạt động biến
dưỡng ngưng
Nguyên tắc bảo quản đông lạnh tế bào là làm cho tế bào mất đi một lượng
nước nhất định nhằm hạn chế tình trạng đóng băng trong quá trình làm lạnh.

Sử dụng chất bảo quản đông lạnh


•  Áp lực chọn lọc khiến dòng tế bào bất ổn về
đặc tính
•  Sự giới hạn về khả năng tăng sinh của tế bào
•  Sự bất ổn trong kiểu gen và kiểu hình
•  Sự nhiễm chéo, nhiễm khuẩn trong nuôi cấy
•  Sự tương đồng trong thí nghiệm
•  Tiết kiệm thời gian và vật liệu



Nhiệt độ

Chất bảo
quản

Tốc độ
làm lạnh

YẾU TỐ ẢNH

HƯỞNG
ĐẾN SỐNGCHẾT CỦA
TẾ BÀO

Quy trình
đông lạnhrã đông


Môi trường đông lạnh-chất bảo quản
! Môi trường cơ bản:
DMEM, IMDM,
RPMI, ….
! Huyết thanh
! Kháng sinh
! Chất bảo quản
(CPA): glycerol,
DMSO
VD: DMEM/F12; 20-40%FBS, 5-10%
DMSO, 1% Antibiotic-antimycotic


Chất bảo quản đông lạnh (CPA)
•  là chất được dùng để bảo vệ mô/tế bào
khỏi các tổn thương do đông lạnh (tổn
thương do tạo đá ).
•  Các chất có thể thâm nhập dễ dàng vào tế
bào và thường không độc hại cho tế bào.
–  glycerol và DMSO được sử dụng rộng rãi
–  giảm nồng độ các chất điện giải trong suốt quá
trình đóng băng

–  giảm mức độ co tế bào do thẩm thấu ở nhiệt độ
thấp


•  Các chất tan không thấm qua màng:
đường và các hợp chất có phân tử lượng
cao như polyvinylpyrrolidone, hydroxyethyl
starch, polyethylen glycol và dextrans.
•  chất bảo quản không thấm có thể góp
phần tăng cường sự thuỷ tinh hoá dung
dịch, ổn định protein và màng, ngăn chặn
sự tiến triển trong hình thành tinh thể đá


4oC ——> 2 giờ
-40oC ——> Một vài ngày
-80oC ——> Một vài tháng
-196oC " một vài thế kỷ
Nhiệt độ thấp có khả năng "làm chậm thời gian" hoặc thậm chí
dừng lại thời gian” sinh học.


•  -50C, cả tế bào và môi trường quanh nó chưa
bị đóng băng.
•  -50C đến -150C, đá ngoại bào hình thành. Tế
bào ở trạng thái “siêu lạnh” (supercool)
•  Ở thấp hơn -1200C, phản ứng hoá học không
thể xảy ra đối với cơ thể sống.
•  Ở -1960C, phản ứng liên quan đến nhiệt
không thể xảy ra vì năng lượng nhiệt không

đủ, do đó, tế báo có thể được lưu trữ ở nhiệt
độ này trong nhiều thế kỷ.


Tốc độ làm lạnh
Chuẩn hoá thời gian hạ nhiệt


Bảo quản đông lạnh
Bổ sung CPA

Đông lạnh
Kiểm soát tốc độ
Vận chuyển của nước

Kiểm soát 2
tiêu chí

Kết quả đông lạnh
tốt nhất

Cách tiếp cận hiệu quả
để tối ưu hoá
bảo quản đông lanh

2 tiêu chí: (1) sự tạo tinh thể đá và (2)thay đổi thể tích tế bào


Optimal

You hurt
me.

Quy trình đông lạnh quá chậm
Tế bào sẽ mất nhiều nước
Thể tích tế bào trở nên quá nhỏ
Tế bào sẽ bị tổn thương nghiêm trọng


Optimal

Why
it’s me?

Nếu đông lạnh quá nhanh, tế bào mất rất ít nước
nước được giữ trong tế bào trở thành tinh thể đá,
thể tích tế bào có thể không đổi, thậm chí lớn hơn
Tế bào chịu tổn thương nghiêm trọng do sự tạo đá nội bào


Optimal

I am
Lucky.

Thời gian đông lạnh phù hợp, tế bào giữ
được điều kiện tốt nhất cho sự sống sót


/> />

Tốc độ làm lạnh có ảnh hưởng
lớn đến sự hình thành đá nội bào


Nuôi cấy/chuẩn bị tế bào
Bổ sung chất bảo quản
Làm lạnh
Lưu trữ
Rã đông phục hồi tế bào
Nuôi tăng sinh


• 
• 
• 
• 
• 
• 
• 

Kính hiển vi đảo ngược
Tủ thao tác an toàn sinh học cấp II
Máy ly tâm
Tủ ủ nuôi tế bào (370C, 5% CO2)
Tủ mát 2-80C
Tủ âm 00C đến -200C
Bình chứa nitơ lỏng

•  Tế bào được nuôi cấy trong Flask hoặc dụng
cụ nuôi phù hợp
•  Trypsin/EDTA 0,25%
•  PBS không Ca2+ và Mg 2+ (PBS-)
•  Môi trường đông lạnh tế bào: bao gồm môi
trường cơ bản (RPMI, DMEM/F12, IMDM…)
bổ sung 40-50% huyết thanh thai bò (FBS),
5-10% dimethylsulphoxide (DMSO)
•  ống bảo quản đông lạnh (cryovial) 1,5-2 ml
•  Ống ly tâm 15ml hoặc 50 ml vô trùng