NHÂN GIỐNG cây TRỒNG in vitro

Chủ đề 1:
NHÂN GIỐNG CÂY TRỒNG
I -Nhân giống truyền thống
1.
Giới
thiệu
chung:
Từ xa xưa ông cha ta đã biết nhân giống cây trồng bằng phương pháp vô
tính truyền thống như giâm cành, chiết cành, ghép cành ; phương pháp
hữu tính là gieo hạt… Đánh giá, nhận thức được vai trò, tầm quan trọng
của yếu tố giống trong việc góp phần nâng cao năng suất, chất lượng,
sản lượng và hiệu quả kinh tế của cây trồng mang lại.Ngày nay, người ta
đã biết cách giữ lại và nhân lên các cây có nhiều đặc tính tốt bằng nhiều
phương pháp khác nhau…Từ các cây lương thảo, cây ăn quả, cây gỗ quý
đến các cây có giá trị thẫm mỹ cao , cây thảo dược v.v.
2. Các phương pháp nhân giống truyền thống.
a) Nhân giống vô tính:
Nhân giống vô tính là phương pháp nhân lên hoặc tạo ra cơ thể mới dựa
theo sinh sản vô tính, nghĩa là phương pháp tạo nhân lên hoặc tạo ra cơ
thể mới từ tế bào, mô, cơ quan của cơ thể bố hoặc mẹ. Có hai loại sinh
sản vô tính: sinh sản vô tính tự nhiên và sinh sản vô tính nhân tạo.

Nhân
giống
vô
tính
tự
nhiên.
Trong tự nhiên, thực vật có khả năng tạo những cơ thể mới từ một bộ
phận của cây ban đầu như: thân bò (dâu tây, rau má...), thân rễ (cỏ
gấu...), thân củ (khoai tây...), lá cây (thuốc bỏng...), rễ củ (khoai lang...).

Đó là sự sinh sản vô tính tự nhiên.


Cơ
chế:
nguyên
phân
- Đặc điểm của cơ thể con: giống hoàn toàn cơ thể mẹ ( hình dạng, năng
suất,
phẩm
chất...)

Nhân
giống
vô
tính
nhân
tạo:
Là sự sinh sản, trong đó con người chủ động nhân lên hoặc tạo ra cơ thể
mới từ một bộ phận cắt rời của cơ thể bố hoặc mẹ. Các dạng sinh sản vô
tính nhân tạo gồm: chiết, ghép, giâm. Dựa vào đặc điểm phát triển của
từng cây mà người ta sẽ chọn các bộ phận thích hợp của cây đó để nhân
lên
tạo
ra
đời
con.
*
Cơ
sở

sinh
học
của
phương
pháp
Theo viện sĩ Maximop, mỗi bộ phận của cây, ngay đến mỗi tế bào, đều
có tính độc lập về mặt sinh lí rất cao. Chúng có khả năng khôi phục lại
các cơ quan, bộ phận không đầy đủ và trở thành một cá thể mới hoàn
chỉnh. Trong cơ thể thực vật, nước và các chất khoáng hoà tan được vận
chuyển từ rễ lên lá theo mạch gỗ, còn các sản phẩm hữu cơ sản xuất ở lá
được chuyển xuống gốc (rễ, củ, … ) theo mạch rây. Khi ta cắt đứt con
đường vận chuyển theo mạch rây, các sản phẩm hữu cơ sẽ tập trung ở
các tế bào vỏ của phần bị cắt (phía trên ). Các chất hữu cơ này cùng với
chất điều hoà sinh trưởng Axin nội sinh (được tổng hợp ở ngọn cây
chuyển xuống) sẽ kích thích sự hoạt động của tượng tầng và hình thành
mô sẹo, rồi sau đó hình thành rễ từ mô sẹo ở chỗ bị cắt, khi gặp điều
kiện
thuận
lợi.
Quá trình hình thành rễ bất định này có thể chia làm ba giai đoạn:
- Giai đoạn 1: Tái phân chia tượng tầng (mô phân sinh bên)
Giai
đoạn
2:
Xuất
hiện
mầm
rễ
- Giai đoạn 3: Sinh trưởng và kéo dài của rễ, rễ đâm qua vỏ ra ngoài.

*
-

tạo:
Chiết
Chiết cành là phương pháp nhân giống vô tính cây trồng bằng cách
cho một cành hay một đoạn cành ra rễ trên cây, sau đó tách khỏi cây mẹ,
đem
trồng
thành
cây
mới.
dễ sống, dễ làm cây con khỏe, mọc nhanh nhưng nhân được ít cây, tốn
công tốn của
Quy trình chiết cành:

-

Các

hình

thức

nhân

giống

vô

tính

nhân

Ghép
Là tách rời một mắt ghép, một chồi non vừa lú ra ở nách lá hoặc một
đoạn thân non của cây có những đặc tính nổi bật đặt vào một cây khác
có
đặc
tính
sống
khỏe
và
phát
triển
tốt.
Ở thực vật ghép cây là một kĩ thuật quan trọng trong nghề làm vườn,
trong đó một phần (cành ghép) của một cá thể này được đem phối hợp
(ghép áp, ghép nối, ghép nêm, ghép dưới vỏ gần gốc) với một phần cây
khác (gốc ghép) có thể cùng loài hoặc khác loài .Sau một thời gian chỗ
ghép sẽ liền lại và gốc ghép sẽ nuôi cành ghép lớn lên thành một cá thể
mới mang đặc tính chung của hai cá thể gốc ghép và cành ghép
Ghép cành:


Ghép mắt:


Giâm

Giâm cành là phương pháp dùng một đoạn của cành gọi là “hom” giâm
cho ra rễ thành cây con. Sự thành công của một cành giâm phụ thuộc rất
nhiều yếu tố như tình trạng dinh dưỡng của cây mẹ, tuổi của cành dâm,
ẩm độ, nhiệt độ và bản chất của môi trường cắm hom.
Cành nên lây trên các cây mẹ tốt, tuổi từ 10-15 năm trở lại. Cây mẹ sống
trong điều kiện đầy đủ dinh dưỡng thường cho hom ra rễ dễ hơn.
Hom lấy trên cành không quá già mà cũng không quá non, tốt nhất là lấy
các cành đâm ra ở đợt gần nhất. Có đường kính từ 0,5 -1 cm (tùy loại).
Cành được cắt thành từng đoạn ngắn 10-30 cm để làm hom, mỗi hom có
ít nhất 2-5 lá hau 2-3 mầm ngủ, chân hom được cắt theo một mặt
nghiêng, có thể rạch thêm 2-4 đường dọc ở chân hom dài 0,5 cm để kích
thích hom thành lập mô sẹo giúp ra rễ tốt.


* Ưu điểm và nhược điểm của các phương pháp giâm, chiết, ghép
- Ưu điểm và nhược điểm của phương pháp giâm cành:
+
Hệ
số
nhân
cao
+ Cây con giữ nguyên đặc tính di truyền của bố mẹ
+
Cây
sớm
ra
hoa,
kết
quả
+ Cần chăm sóc chu đáo trong thời gian đưa từ vườn ươm vào sản xuất

đại
trà.
- Ưu điểm và nhược điểm của phương pháp chiết cành
+ Cây con giữ nguyên đặc tính di truyền của bố mẹ
+ Thời gian có cây giống nhanh, cây sớm ra hoa, kết quả
+
Cây
thấp,
tán
gọn
+ Hệ số nhân thấp
Ưu
điểm
nhược
điểm
của
ghép
gốc:
+ Cây ghép sinh trưởng phát triển tốt nhờ sự phát triển, hoạt động tốt
của bộ rễ gốc ghép , khả năng thích nghi với điều kiện khí hậu, đất đai
cao
hơn
cây
chiết.
+ Cây ghép giữ được các đặc tính của giống muốn nhân (cây mẹ).
+
Hệ
số
nhân
giống

cao.
+ Giống làm gốc ghép sớm cho ra hoa kết quả vì mắt ghép chỉ tiếp tục
giai
đoạn
phát
dục
của
cây
mẹ..


+ Giống làm gốc ghép phải có khả năng tiếp hợp tốt với thân cành ghép;
gốc
ghép
phải
khỏe,
không
bị
sâu
bệnh.
+ Việc chăm sóc cây ghép mất nhiều công sức. Vậy nên thường chỉ các
vườn ươm mới nhân giống bằng phương pháp này.
2.
Nhân
giống
hữu
tính
Là kiểu sinh sản trong đó có sự hợp nhất của giao tử đực và giao tử cái
tạo nên hợp tử phát triển thành cơ thể mới.
- Có quá trình hình thành và hợp nhất của giao tử đực và giao tử cái

- Có sự trao đổi và tái tổ hợp của 2 bộ gen.
- Luôn gắn liền với quá trình giảm phân tạo giao tử.
- Bao gồm : Quá trình hình thành hạt phấn và túi phôi, thụ phấn và thụ
tinh, hình thành hạt, quả.Có những cách thụ phấn chính như sau:
a) Tự thụ phấn: Là cách thụ phấn cho một hoa bằng hạt phấn của chính
nó, hay của một hoa khác trên cùng một cành, một cây, hoặc trong cùng
một dòng đã được nhân giống vô tính. Sự tự thụ phấn có ưu điểm là cơ
chế của chúng rất đơn giản, không đòi hỏi một sự thích nghi đặc biệt nào
và do đó cách thụ phấn khá đảm bảo, sự tự thụ phấn có thể xảy ra với
mọi
điều
kiện
thời
tiết.
Nhược điểm của sự tự thụ phấn là cả 2 giao tử tham gia vào quá trình
sinh sản đều thuộc cùng một cây và phát triển trong cùng một hoa. Vì
vậy những đặc điểm di truyền của chúng mang tính chất đơn điệu, các
thể hệ con cái sinh ra từ sự tự thụ phấn ít có sự biến đổi và ít có sự mềm
dẻo về sự thích nghi.
Người ta mở rộng khái niệm tự thụ phấn giữa các cá thể của cùng một
loài tự nhiên sang cả việc tự thụ phấn của các giống đã được lai
tạo.Trong trường hợp đầu, con cái phép tự thụ phấn ấy thường ít khác
biệt nhau. Còn trường hợp sau không ai có thể dự đoán nổi mức độ sai
khác của chúng. Để phân biệt trường hợp này, người ta gọi là sự tự thụ
phấn ở cây lai.


b) Giao phấn (thụ phấn chéo): Là quá trình hạt phấn của hoa này rơi vào
núm nhụy của hoa khác.Sự giao phấn xảy ra bắt buộc đối với hoa đơn
tính và cả với những hoa lưỡng tính khi nhị và nhụy không chín cùng

một
lúc.
Khác với sự tự thụ phấn, trong trường hợp giao phấn các giao tử được
hình thành ở những hoa khác nhau và thường ở những cây khác nhau
nên chúng có sự khác nhau về chất, chúng đảm bảo cho thế hệ con cháu
có sức sống cao hơn về chất, kết hợp được những đặc tính tốt của cơ thể
bố
và
mẹ.
Tính biến dị cá thể của chúng biểu hiện rõ ràng hơn và dễ dàng thích
nghi với những biến đổi của điều kiện sống. Giá trị sinh học của sự giao
phấn còn thể hiện ở chỗ: tuyệt đại đa số cây mọc tự nhiên đều thích nghi
theo lối thụ phấn này và có những thích nghi rất đa dạng với việc giao
phấn. Như vậy, sự giao phấn có ưu thế hơn so với sự tự thụ phấn, tuy
nhiên nó có một nhược điểm cơ bản là không phải lúc cũng thực hiện
được, vì còn phụ thuộc vào các điều kiện bên ngoài, đôi khi là ngẫu
nhiên trong đó các tác nhân truyền phấn rất quan trọng.
*Các
tác
nhân
giúp
cho
sự
giao
phấn:
Hiện tượng giao phấn được thực hiện nhờ một trong các tác nhân sau
đây:
- Thụ phấn nhờ gió: những cây có kiểu thụ phấn nhờ gió là cây có hoa
tương đối nhỏ, bao hoa tiêu giảm, hoặc hong có vòng bao hoa. Số lượng
hoa trong cụm hoa nhiều và lượng hạt phấn trong mỗi hoa cũng rất

nhiều, nhỏ, nhẹ, đôi khi mang thêm túi khí để dễ bay xa (hạt phấn
Thông). Cấu tạo của bộ nhị cũng thích với việc dễ dàng phát tán hạt
phấn (bao phấn lắc lư ở các cây họ Lúa (Poaceae); bộ nhuỵ cũng có cấu
có các vòi nhuỵ rất dài, xoè rộng, có lông).
- Thụ phấn nhờ nước: hình thức này thường gặp ở những cây mọc chìm
trong nước, có hoa nở dưới nước. Cấu tạo của bộ nhị và bộ nhuỵ cũng


thích nghi theo lối thụ phấn này. Ví dụ: Rong mái chèo (Vallisneria
spiralis) có hoa đơn tính khác gốc. Hoa đực đựng trong một cái bọc
chung khi chín sẽ đứt cuống nổi lên mặt nước. Hoa cái có cuống dài,
lúc đầu xoắn lại, khi nở thì cuống hoa duỗi thẳng ra để đưa hoa lên
c) Sinh sản bằng bào tử:
Đây là một hình thức sinh sản ở rêu, dương xỉ. Trong sinh sản bằng bào
tử, cơ thể mới được phát triển từ bào tử, bào tử lại hình thành trong túi
bào tử từ thể bào tử.
Thể bào tử được sinh ra từ hợp tử và mang các túi bào tử. Lúc chín, các
túi bào tử của thực vật có lá, phát tán các bào tử giảm nhiễm và chúng
nẩy mầm tạo ra nguyên tản lưỡng tính hoặc đơn tính. Nó cũng giống như
túi bào tử của thể sinh túi của ngành Rêu. Chu trình phát triển cá thể của
chúng là lưỡng di truyền nhưng thể bào tử chiếm ưu thế (Lưỡng – Đơn
bội)
I -Nhân giống in vitro:
1. Định nghĩa:
Nuôi cấy mô tế bào thực vật (nuôi cấy in vitro) là phạm trù khái niệm để
chỉ chung cho tất cả các loại nuôi cấy nguyên liệu thực vật hoàn toàn
sạch các vi sinh vật trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo trong điều kiện
vô
trùng
2. Các phương pháp:

1/ Nuôi cấy mô:
a/ Mẫu trực tiếp tạo chồi và cây hoàn chỉnh:
b/ Mẫu mô phát sinh callus và callus tạo chồi:
c/ Mẫu mô phát sinh phôi soma và phôi thu được từ cây hoàn chỉnh:
2/ Vi nhân giống quan tự dưỡng:


III/ Quy trinh nhân giống in vitro:
1/ Nuôi cấy mô:

Bước 1: Chuẩn bị mẫu nuôi cấy:
- Mẫu được thu ở các cây được chọn lọc:
+ Sạch bệnh, đặc biệt là bệnh virus và ở giai đoạn sinh trưởng
mạnh


+ Có thể trồng cây lấy mẫu trong điều kiện thích hợp với chế độ
chăm sóc và phòng trừ sâu bệnh hiệu quả trước khi lấy mẫu sẽ làm giảm
tỉ lệ mẫu nhiễm, tăng khả năng sống và sinh trưởng của mẫu
Bước 2: Xây dựng hệ thống nuôi cấy vô trùng
- Vệ sinh khu nuôi cấy.
- Khử trùng bề mặt mẫu vật và chuẩn bị môi trường nuôi cấy
- Cấy mẫu vô trùng vào môi trường nhân tạo trong ống nghiệm hoặc
bình nuôi. * Phương pháp lấy mẫu và chuẩn bị môi trường tùy thuộc vào
ý muốn:
+ Mẫu trực tiếp tạo chồi và cây hoàn chỉnh: Mô sẹo, cơ quan sinh
sản, chổi ngủ. Môi trường : MS + BAP
+ Mẫu mô phát sinh callus và callus tạo chồi: Callus ( mô sẹo ) là
khối tế bào không có tổ chức hình thành từ các mô và các cơ quan phân
hóa dưới các điều kiện đặc biệt ( có vết thương và xử lý chất điều hòa

sinh trưởng ). Môi trường: MS + 2,4-D ( Tạo callus ) MS + BAP ( Tạo
chồi từ callus )
+ Mẫu mô phát sinh phôi soma và phôi thu được từ cây hoàn
chỉnh: Hạt. các tế bào sinh dưỡng. Môi trường: MS
- Các mẫu nuôi cấy nếu không bị nhiễm khuẩn, nấm hoặc virus sẽ được
lưu lại trong phòng với điều kiện nhiệt độ, ánh áng phù hợp. Sau một


thời gian nuôi cấy, từ một mẫu nuôi cấy ban đầu xuất hiện các cụm tế
bào và cơ quan ( chồi, cụm chồi, rễ) hoặc phôi vô tính có đặc tính gần
như phôi hữu tính. Giai đoạn hai thường yêu cầu từ 2-12 tháng hoặc ít
nhất 4 lần cấy chuyển.
* Đưa mẫu vật vào nuôi cấy vô trùng phải đảm bảo các yêu cầu sau:
- Tỷ lệ nhiễm thấp
- Tỷ lệ sống cao
- Tốc độ sinh trưởng nhanh
=> Kết quả bước cấy gây này phụ thuộc rất nhiều vào cách lấy mẫu.
Quan trọng nhất là đỉnh sinh trưởng, chồi nách, đoạn hoa tự, đoạn
thân, mảnh lá, rễ... Chọn đúng phương pháp khử trùng sẽ đưa lại tỷ lệ
sống cao và môi trường dinh dưỡng thích hợp sẽ đạt tốc độ sinh
trưởng nhanh
Bước 3: Nhân nhanh số lượng chồi: Môi trường bổ sung BAP
- Thành phần và điều kiện môi trường phải đạt điều kiện tối ưu hóa
nhằm đạt mục đích nhân nhanh
- Trong giai đoạn này cần nghiên cứu các tác nhân kích thích cơ quan,
đặc biệt là chồi như :
+ Bổ sung bổ hợp phytohormone mới (tăng cytokin giảm axin).
Tăng tỷ lệ auxin/cytokinin sẽ kích thích mô phát triển tạo rễ và ngược lại
sẽ kích thích phát sinh chồi.
+ Tăng cường thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày, tối thiếu 1000lux.

Trong thời gian nuôi cấy người ta nhận thấy khó có thể tách biệt ảnh


hưởng của chu kỳ chiếu sáng và cường độ chiếu sáng. Ánh sáng tím là
điều kiện quan trọng nhất kích thích sự phân hóa mạnh. Ánh sáng đỏ có
ảnh hưởng giống cytokinin, nó tạo nên sự tích lũy cytokinin này đã kích
thích qua trình phát sinh cơ quan và tạo chồi từ những mô nuôi cấy in
vitro.
+ Đảm bảo chế độ nhiệt độ trong khoảng 20-30 0C. Trường hợp
các loài hoa có nguồn gốc nhiệt đới, nhiệt độ nuôi cấy thích hợp vào
khoảng 32-350C. Ngược lại, đối với các loài hoa có nguồn gốc ôn đới
nhiệt độ thích hợp cho quá trình tạo cụm chồi phải <300C.
- Quy trình cấy chuyển để nhân nhanh chồi là từ 1-2 tháng tùy thuộc loại
cây. Hệ số nhân nhanh là từ 2-8 lần trên một lần cấy chuyển. Nhìn chung
giai đoạn 3 thường yêu cầu 10-36 tháng và cũng không nên kéo dài quá
lâu. Ví dụ từ đỉnh sinh trưởng của cây con chuối chọn lọc ban đầu, người
ta chỉ nên nhân khoảng 2000-3000 chồi sau 7-8 lần cấy chuyển để tránh
biến dị soma. Đối với các cây khác như mía, hoa cúc, phong lan sau một
năm có thể nhân lên 1 triệu chồi từ một cây mẹ ban đầu. Những khả
năng tạo cây đó là:
+ Phát triển chồi nách
+ Tạo phôi vô tính
+ Tạo đỉnh sinh trưởng mới
Bước 4: Tạo rễ: Môi trường bổ sung NAA
- Để tạo rễ cho chồi, người ta chuyển chồi từ môi trường nhân nhanh
sang môi trường tạo rễ. Môi trường tạo rễ thường được bổ sung một
lượng nhỏ auxin. Một số chồi có thể phát sinh rễ ngay sau khi chuyển từ
môi trường nhân nhanh giàu cytokinin sang môi trường không chứa chất
điều tiết sinh trưởng.

- Đối với các phôi vô tính thường chỉ cần gieo chúng trên môi trường
không có chất điều tiết sinh trưởng hoặc môi trường có chứa nồng độ
thấp của cytokinin để phôi phát triển thành phôi hoàn chỉnh
Bước 5: Đưa cây ra thích nghi vói môi trường tự nhiên:
- Để đưa cây từ ống nhiệm ra vườn ươm với tỉ lệ sống cao, cây sinh
trưởng tốt cần đảm bảo một số yêu cầu:
+ Cây trong ống ngiệm đã đạt những tiêu chuẩn hình thái nhất định
( số lá, số rễ, chiều cao cây).
+ Có giá thể tiếp nhận cây in vitro thích hợp: giá thể sạch, tơi xốp,
thoát nước.
+ Phải chủ động điều chỉnh được độ ẩm, sự chiếu sang của vườn
ươm cũng như có chế độ dinh dưỡng phù hợp.

2/ Vi nhân giống quan tự dưỡng:
- Vi nhân giống quang tự dưỡng là phương pháp nuôi cấy mô dựa vào
khả năng quang tự dưỡng của mô thực vật. Trong phương pháp này, cây
sẽ thu nhận CO2 trong không khí làm nguồn carbon thông qua quá trình
quang hợp như cây sống ngoài tự nhiên mà không cần dùng đường,
vitamin, đồng thời hạn chế dùng các chất kích thích sinh trưởng thực vật
trong môi trường nuôi cấy. Điều này làm giảm sự nhiễm khuẩn và nấm ở
cây cấy mô; cây sẽ quang hợp và hô hấp tốt hơn; hệ thống rễ phát triển
tốt hơn, hấp thu muối khoáng dễ dàng hơn.


- Phương pháp này đã được nghiên cứu từ những năm cuối thập niên
1980, và ngày càng có nhiều nghiên cứu chứng minh tính hiệu quả cao
trong việc ứng dụng phương pháp này vào nhân giống những cây trồng
lá rộng như cây cà phê, chuối,…
- Việc loại bỏ đường và vitamin - cơ chất dinh dưỡng của đa số vi sinh

vật gây nhiễm - trong môi trường nuôi cấy giúp tỷ lệ nhiễm khuẩn và vi
nấm trong quá trình nuôi cấy giảm hẳn. Điều này rất có ý nghĩa kinh tế
vì chi phí công lao động và chi phí nguyên vật liệu giảm. Bên cạnh đó,
loại bỏ đường tức loại bỏ sự kìm hãm của enzym rubisco, dẫn đến quá
trình quang hợp và hô hấp của cây tốt hơn. Áp suất thẩm thấu của môi
trường giảm do không có đường và vitamin, làm rễ cây hấp thu nước và
chất khoáng dễ dàng hơn giúp cây nuôi cấy mô phát triển tốt hơn.
- Ngày nay, phương pháp nuôi cấy mô quang tự dưỡng đã thu được
những kết quả nhất định trên nhiều loại cây và cần tiếp tục nghiên cứu
trên các cây khác nhằm góp phần nhân giống cây nhanh, khỏe, hạ giá
thành sản phẩm cây giống
IV/ Ứng dụng
1. Trong nông nghiệp
- Sản xuất nhanh chóng các cây trồng đáp ứng được nhu cầu về cây
giống cao trong trồng trọt.
- Giống là một khâu rất quan trọng trong sản xuất nông nghiệp. Công tác
giống chủ yếu bao gồm các hâu thu thập nguồn gen, bảo quản quỹ gen,
lai tạo, tuyể chọn, thử nghiệm giống và nhân giống.
- Nhờ phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật nên ngày nay phần lớn
các công việc này được thực hiện một cách khá thuận lợi và nhanh
chóng.


VD: chuối, khoai tây…
- Nhân giống ổn định chất lượng, năng suất cao phẩm chất tốt
VD: Các cây trồng chuyển gen, con lai F1…
- Tạo giốn sạch bệnh chống chịu với môi trường
VD: khoai tây sạch virus, hoa lily sạch bệnh…
2. Trong công nghiệp
- Dây chuyền sản xuất nhân nhanh các giống hoa cây cảnh phục vụ cho

thị trường.
VD: Nhờ nuôi cấy mô vào sản xuất các giốn hoa như: tuylip, đồng tiền,
hoa ly ở Hà Lan.Sản xuất hoa lan ở Trung Quốc, đồng tiền ở Việt Nam,
Cẩm Chướng …
3. Trong y học
- Ứng dụng sản xuất nhanh sinh khối các cây dược liệu bằng thu sinh
khối callus hoặc thể huyền phù.
VD: nhân nhanh sâm Triều Tiên…nhân sâm Ngọc Linh
4. Trong nghiên cứu khoa học
- Phục tráng các giống cây quý hiếm nằm trong sách đỏ
- Nuôi cấy mô tế bào thực vật không chỉ góp phần giải quyết một cách
có hiệu quả công tác giống cây trồng mà còn mở ra một cgaan trời mới
trong nghiên cứu di truyền thực vật, các cơ chế sinh tổng hợp ở thực vật,
sinh lý phát triển, vai trò của phytohormone trong đời sống thực vật và
nhiều vấn đề sinh học cơ bản khác.
- Khắc phục các hiện tượng bất thụ trong lai xa


- Bảo quản nguồn gen bằng nuôi cấy trong ống nghiệm
- Tồn trữ các tế bào thực vật sống trong thời gian dài ở nhiệt độ thấp mà
không mất tính toàn thế của tế bào.
- Làm cơ sở cho các kỹ thuật di truyền khác la khâu cuối cùng cho các
công tác đánh giá giống
5. Ứng dụng nuôi cấy sâm Ngọc Linh:
5.1.

Chuẩn

bị:

-Mẫu lá sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) do Trung
tâm Nghiên cứu trồng và chế biến cây thuốc Đà lạt - Công ty
Vimedimex cung cấp.
5.2. Khử trùng mẫu, chuẩn bị mẫu cấy và tạo mô sẹo xốp từ lá cây in
vivo
Lá chét của cây sâm 6 tháng tuổi (từ củ) ở vườn ươm được rửa sạch
bằng nước máy trong 10 phút, sau đó được khử trùng lần lượt bằng cồn
70% trong 1 phút, nước Javel thương mại 20% (v/v, có bổ sung Tween
20 - hai giọt/100ml dung dịch) trong 10 phút và dung dịch HgCl2 0,1%
(w/v) trong 5 phút. Lá đã khử trùng được cắt thành các mảnh kích thước
0,5 x 0,5cm và cấy trên môi trường thạch MS (Murashige and Skoog,
1962) có 1 mg/l 2,4-D; 0,2 mg/l kinetin theo chiều mặt trên của lá hướng
lên để tạo mô sẹo. Ghi nhận kết quả thí nghiệm sau khoảng 1,5 tháng
nuôi. Sau đó, cấy chuyển mô sẹo trong khoảng 4 tháng (1 lần/tháng) trên
cùng môi trường để tạo mô sẹo xốp.


5.3. Tạo huyền phù tế bào và huyền phù phôi dạng cầu (phôi sơ cấp)
Để tạo huyền phù tế bào (HPTB), nuôi lắc 2g mô sẹo xốp trong bình tam
giác (250ml) chứa 50ml môi trường MS có 1 mg/l 2,4-D; 0,2 mg/l
kinetin (Duong Tan Nhut et al., 2011, nhưng thay TDZ bằng kinetin) và
500 mg/l casein hydrolysate. Dùng que cấy ép nhẹ mô sẹo vào thành
bình tam giác để mô rã và treo vào môi trường thành huyền phù
(suspension) tế bào khởi nguyên. Sau 2 tháng nuôi, huyền phù tế bào
được chuyển sang nuôi cấy trong môi trường B5 (Gamborg, 1968) lỏng
lắc có 3 mg/l IBA (Mai Trường và cs., 2013) để tạo và nhân huyền phù
phôi cầu (HPPC). Ghi nhận sự hình thành phôi cầu đồng thời loại bỏ dần
tế bào/cụm tế bào không sinh phôi theo thời gian từ 2 tháng nuôi cấy trở
đi. Phôi dạng cầu có thể phát triển thành phôi trưởng thành và tạo chồi
khi được cấy chuyển sang môi trường thạch 1/2MS + 0,5 mg/l BA + 1

mg/l GA3 ; môi trường nuôi cấy từ phôi: 1/2MS có bổ sung 0,5 mg/l
BA, 1 mg/l IBA và 500 mg/l than hoạt tính (Mai Trường và cs., 2013).
5.4. Tạo mô sẹo sinh phôi và phôi từ nuôi cấy lá màm (cotyledon) và
phôi non
Cấy các mảnh lá mầm (dài ≈ 0,8cm) từ cây mầm (phôi có đầy đủ chồi
và rễ) và phôi non in vitro (dài ≈ 1cm, có rễ nhưng chưa có lá mầm) trên
môi trường thạch MS có 10% nước dừa, có và không có 0,2 mg/l IBA.
Theo dõi, ghi nhận sự hình thành mô sẹo sinh phôi và phôi (có hai lá
mầm) sau 3 tháng nuôi. Nội dung thực hiện này nhằm mục đích tạo


nguồn vật liệu mô sẹo sinh phôi cho nghiên cứu nuôi nhân bằng môi
trường lỏng.
5.5. Nuôi phôi dạng cầu trong môi trường lỏng tạo sinh khối cụm phôi
trưởng thành (có lá mầm và rễ mầm)
Cấy 2 g mô phôi cầu vào bình tam giác 250ml chứa 50ml môi trường SH
(Schenk and Hildebrandt, 1972) có NAA (1 và 2 mg/l) và IBA (1 và 2
mg/l). Ghi nhận kết quả sau 2,5 tháng nuôi. Cụm mô phôi có rễ tạo được
dùng làm vật liệu nuôi cấy bằng bioreactor.
. Nuôi nhân mô sẹo sinh phôi trong bình tam giác và bằng bioreactor:
Cấy nuôi 5g (5% - w/v) mô sẹo sinh phôi vào bình tam giác 250ml chứa
100ml môi trường 1/2SH không có và có 10% nước dừa. Cấy nuôi 50g
mô vào bioreactor dạng cầu/trụ (3 và 10 lít) với dung tích (2 lít và 5,5 lít,
theo thứ tự) môi trường 1/2SH có 10% nước dừa. Ghi nhận kết quả sau 1
tháng nuôi trong bioreactor bằng cách cân trọng lượng tươi (g).
5.6. Nuôi nhân cụm phôi có rễ bằng bioreactor
Cấy 50 g mô cụm phôi trưởng thành vào bioreactor dạng cầu (3 và 5 lít)
chứa 2 lít - 2,5% (w/v) và 3,5 lít - 1,5% (w/v), theo thứ tự, môi trường
SH có 1 mg/l và 2 mg/l IBA. Ghi nhận kết quả sau 1 tháng nuôi cấy.
5.7. Điều kiện nuôi cấy

Để ở điều kiện sáng (10 giờ chiếu sáng/ngày; cường độ sánh sáng ≈
2.000 - 3.000lux tùy trường hợp), nhiệt độ 25 - 28 οC đối với nuôi mô
sẹo sinh phôi, cụm phôi có rễ, chồi
và cây. Để tối ở nhiệt độ 24 οC trong tủ nuôi đối với nuôi tạo và nhân
mô sẹo. Nuôi lắc được thực hiện ở tốc độ 110 vòng/phút. Nuôi
bioreactor dùng tốc độ thổi khí 0,1vvm
6 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
a. Tạo huyền phù tế bào và huyền phù phôi dạng cầu Các mảnh lá (sau
khử trùng) được nuôi cấy trên môi trường MS có 1 mg/l 2,4-D; 0,2 mg/l
kinetin để tạo mô sẹo. Kết quả nuôi cấy cho thấy mô sẹo hình thành trên
khắp bề mặt phiến lá và rìa lá sau khoảng 1,5 tháng nuôi. Qua nhiều lần
cấy chuyền nhân sinh khối trên cùng môi trường nhận thấy mô sẹo dần
hóa xốp (friable), có màu trắng hơi ngà và loại mô này được sử dụng để
tạo huyền phù tế bào (HPTB). Trạng thái xốp của mô tạo thuận lợi cho
sự hình thành HPTB mịn chỉ sau khoảng 1 tháng nuôi cấy. Sau đó HPTB
được duy trì ổn định qua cấy chuyền 15 - 20 ngày/lần trong cùng môi
trường .Sự tăng sinh khối của HPTB là do sự phân chia tế bào của quần
thể cụm tế bào nuôi cấy với hình dạng cụm đa bào đặc trưng . Để tạo
huyền phù phôi soma dạng cầu, sau 2 tháng nuôi cấy trong môi trường
như trên, HPTB được chuyển sang nuôi cấy trong môi trường B5 có bổ
sung 3 mg/l IBA. Sau khoảng 1,5 tháng nuôi nhận thấy có sự hình thành
nhiều cụm đa bào ở đáy bình nuôi - tiền đề thuận lợi cho sự hình thành


phôi soma sau đó .Theo thời gian nuôi, sự hình thành cụm mô sinh phôi
ngày càng nhiều; quá trình cấy chuyền nhân sinh khối mô sinh phôi
đồng thời với việc loại bỏ dần các cụm tế bào không có khả năng sinh
phôi. Sự hình thành huyền phù phôi cầu (HPPC) có thể được hoàn thành

sau 4 - 6 tháng nuôi với huyền phù toàn phôi cầu, không còn tế bào chưa
biệt hóa
Hiện diện trong HPPC còn có dạng phát triển khác của phôi như dạng
tim, thủy lôi và dạng có rễ khá phát triển .Hầu hết các phôi của huyền
phù đều có khả năng phát triển thành phôi trưởng thành, tạo chồi và
thành cây mầm, cây con hoàn chỉnh với đầy đủ rễ thân và lá . Kết quả
này có thể được sử dụng nhằm mục đích nhân giống.
b. Tạo mô sẹo sinh phôi và phôi thứ cấp từ nuôi cấy lá mầm và phôi non
Các lá mầm, cắt ra từ cây mầm in vitro (Hình 4a) được nuôi cấy trên môi
trường MS có 10% nước dừa và môi trường MS có 10% nước dừa và
0,2 mg/l IBA nhằm tạo mô sẹo sinh phôi và phôi; kết quả nuôi cấy ược
trình bày ở bảng 1. Sau khoảng 1/2 tháng nuôi nhận thấy lá mầm phát
triển to ra (đến cuối giai đoạn nuôi có thể đạt kích thước 1,5 - 2cm), trên
bề mặt hình thành nhiều cụm mô nhỏ và rất nhiều các phôi đơn - sau đó
tạo cụm phôi sau khoảng 3 tháng nuôi trên môi trường không có IBA.
Trên môi trường có IBA, ghi nhận ngoài sự tạo phôi còn có hiện tượng
hình thành mô sẹo sinh phôi (MSSP) chủ yếu ở gốc lá mầm, theo chúng
tôi, kết quả này là do ngoài tác động của auxin tự nhiên có trong nước


dừa (Yong et al., 2009) còn có tác động của IBA bổ sung và việc sử
dụng nước dừa trong nuôi cấy (Nguyễn Việt Cường và cs., 2013). Nhìn
chung, số lượng phôi hình thành/mẫu trên môi trường không có IBA
nhiều hơn trên môi trường có IBA. Bởi vì, trên môi trường không có
IBA, ở lá mầm cũng có sự hình thành mô sẹo và chúng nhanh chóng
chuyển sang trạng thái phôi sau đó.
Bảng 1. Kết quả tạo mô sẹo sinh phôi và phôi từ nuôi cấy lá mầm, sau 3
tháng

Đối với thể nuôi cấy là phôi non, kết quả tạo phôi được trình bày ở bảng

2. Tương tự trường hợp trên, số phôi hình thành/mẫu cũng nhiều hơn
trên môi trường chỉ có nước dừa và không có IBA. Trên môi trường có
nước dừa và 0,2 mg/l IBA, sau giai đoạn thân phôi non phù ra, cũng ghi
nhận được sự hình thành MSSP và các ‘nốt’ mô nhỏ dạng cầu MSSP với
phôi cầu nhỏ ở vị trí đầu phôi sau 1,5 tháng nuôi cấy. Phôi cũng có thể
hình thành ở cả vị trí đầu phôi và thân phôi, ở đầu phôi và rễ phôi; phôi
hình thành ở dạng đơn và dạng cụm nhỏ. Trên môi trường không có 0,2
mg/l IBA, sự đáp ứng với nuôi cấy có khuynh hướng tạo thành cụm phôi
to sau nhiều tháng nuôi cấy Cụm phôi có thể phát triển tạo lá mầm hoàn


chỉnh và tạo chồi sau giai đoạn chuyển sang nuôi cấy trên môi trường
1/2MS có bổ sung 0,5 mg/l IBA và 1 mg/l GA3
c. Nuôi phôi dạng cầu trong môi trường lỏng tạo sinh khối cụm mô phôi
có rễ
Huyền phù phôi cầu sau giai đoạn nhân sinh khối được sử dụng để tạo
và nhân cụm phôi ở giai đoạn biệt hóa phát triển hơn - có rễ. Trong môi
trường SH có 1 mg/l NAA, phôi có rễ hình thành nhiều, rễ phôi trắng
hơi phù; đầu phôi tăng sinh khối tạo cụm mô phôi - kích thước ≈ 0,5mm;
trong môi trường có 2 mg/l NAA, phôi có rễ ít hình thành, cụm mô ở
đầu phôi có kích thước rất to - gần 1cm Các cụm mô này có khả năng
tăng sinh khối nhanh; trọng lượng tươi mô ở hai môi trường trên đạt
11,2g và 12,8g theo thứ tự sau 2,5 tháng nuôi. Trong môi trường có 1
mg/l và 2 mg/l IBA, rễ phôi mảnh hơn, ở đầu phôi cũng có hiện tượng
tạo cụm mô nhưng có kích thước nhỏ hơn so với ở môi trường có NAA;
trọng lượng tươi mô ở hai môi trường trên đạt 12,4g và 15,3g theo thứ tự
sau 2,5 tháng nuôi. Ở nghiệm thức không bổ sung chất điều hòa sinh
trưởng (ĐHST), rễ phôi dài, đầu phôi không có/biểu hiện ít hiện tượng
tạo cụm mô; sinh khôi mô tươi đạt khoảng 13g. Các cụm mô phôi có rễ
tạo được trong môi trường có IBA được dùng làm vật liệu nuôi cấy bằng

bioreactor ở giai đoạn tiếp theo.
d. Nuôi nhân mô sẹo sinh phôi trong bình tam giác và bằng bioreactor


Các cụm MSSP hình thành từ nuôi cấy lá mầm và phôi non được dùng
để nuôi nhân trong môi trường lỏng 1/2SH không có/có 10% nước dừa
(không dùng chất ĐHST tổng hợp) chứa trong bình tam giác. Kết quả
bước đầu cho thấy MSSP có thể tăng sinh khá tốt trong môi trường có và
không có nước dừa; cũng ghi nhận được phôi có rễ hình thành trong quá
trình nuôi cấy. Tuy nhiên cần nuôi với mật độ cao (10g mô/100ml môi
trường trong bình tam giác 250ml) ở trường hợp môi trường không bổ
sung nước dừa; ngược lại, mô phát triển kém khi nuôi với mật độ thấp
(5g/100ml). Ở trường hợp có nước dừa, mô chuyển sang màu vàng và
tăng sinh khối nhanh so với mô nuôi trong môi trường không có nước
dừa - mô có màu hơi xanh lục. Trọng lượng tươi mô ở môi trường có
nước dừa đạt 29,7g sau 2 tháng nuôi. Theo chúng tôi, nước dừa với
thành phần dinh dưỡng và chất ĐHST tự nhiên (Yong et al., 2009) đã tạo
kích thích cho mô tăng sinh khối. Về mặt mô học, cơ sở của sự tăng sinh
khối ở cả hai trường hợp trên là do có sự hình thành các ‘nốt’ mô tròn
nhỏ - tương tự tiền phôi trên khắp bề mặt cụm MSSP (Hình 6g) và phôi
đơn/kép. Nếu dùng cụm mô phôi giai đoạn có lá mầm, mô tăng sinh
nhanh, tạo nhiều rễ phôi; mô có màu xanh hơn ở trường hợp không có
nước dừa so với môi trường có nước dừa; trọng lượng tươi mô ở hai môi
trường không có và có nước dừa lần lượt là 40,3g và 44,5g sau 2 tháng
nuôi. Ở cây họ Sâm, nghiên cứu nuôi nhân mô phôi soma sâm Triều
Tiên không dùng chất ĐHST đã được thực hiện thành công qua sử dụng
môi trường khoáng đơn giản 1/3MS (Choi et al., 2003; Kim et al., 2012).


Tuy nhiên, trong nước và quốc tế chưa ghi nhận công bố nào về kết quả

nghiên cứu nuôi nhân mô phôi soma sâm Ngọc Linh không dùng chất
ĐHST tổng hợp ở các quy mô khác nhau. Việc nuôi cấy có kết quả loại
mô này, đặc biệt nuôi bằng hệ thống bioreactor, không dùng chất ĐHST
mở ra triển vọng tạo được ‘sản phẩm sạch’ dư lượng MSSP từ nuôi cấy
trong môi trường có nước dừa được dùng để nuôi nhân sinh khối trong
cùng môi trường bằng bioreactor thể tích 3 lít và 10 lít. Kết quả cho thấy
mô tăng sinh khối rất nhanh chỉ sau một thời gian ngắn nuôi cấy. Với
trọng lượng mô tươi cấy ban đầu là 50g, mô tăng sinh khối trong
bioreactor 3 lít và 10 lít - đạt lần lượt gần 150g (gấp ≈ 3 lần) và 252g
(gấp ≈ 5 lần) sau 1 tháng nuôi. 3.5. Nuôi nhân cụm phôi có rễ bằng
bioreactor Như đã trình bày, cụm phôi có rễ từ nuôi cấy phôi dạng cầu
trong môi trường có 1 mg/l và 2 mg/l IBA được sử dụng trong nuôi cấy
bằng bioreactor 3 lít và 5 lít trong môi trường tương ứng. Kết quả bước
đầu cho thấy, trong môi trường SH có 1 mg/l và 2 mg/l IBA, mô tăng
sinh khối rất nhanh và có kết cấu hình thái tương tự như được nuôi trong
bình tham giác. Kết quả bước đầu cho thấy trong môi trường có 2 mg/l
IBA với lượng mô cấy ban đầu 50g, sinh khối mô tăng gần 7 lần sau 2
tháng nuôi cấy (≈ 350g). Kết quả này tạo tiền đề cho việc triển khai nuôi
nhân với quy mô lớn hơn. Kiểm tra hợp chất thứ cấp saponin đang được
thực hiện. Dưới đây là sơ đồ tóm tắt hai mảng nội dung nghiên cứu đã
trình bày ở trên.
7. KẾT LUẬN