KHẢO SÁT TÌNH HÌNH NHIỄM VIRUS GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP TRÊN ĐÀN HEO Ở THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔUUNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT TÌNH HÌNH NHIỄM VIRUS GÂY HỘI CHỨNG
RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP TRÊN ĐÀN HEO Ở
THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

Ngành học

: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện

: TRẦN THẾ ANH KHOA

Niên khóa

: 2005 – 2009

Tháng 08/2009


BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT TÌNH HÌNH NHIỄM VIRUS GÂY HỘI CHỨNG
RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP TRÊN ĐÀN HEO Ở
THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

Hướng dẫn khoa học

Sinh viên thực hiện

PGS.TS NGUYỄN NGỌC HẢI

TRẦN THẾ ANH KHOA

Tháng 08/2009

ii


LỜI CẢM ƠN
Đầu tiên con xin cảm ơn chân thành đến bố mẹ, bố mẹ đã luôn dành những điều
tốt đẹp nhất cho con
Tôi cũng chân thành cảm ơn
-

Ban giám hiệu trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, Ban

Chủ nhiệm Bộ môn Công nghệ Sinh học cùng tất cả quý Thầy Cô đã truyền đạt
kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tập tại trường
-

Các anh chị tại phòng xét nghiệm Siêu vi – Huyết thanh thuộc trạm Chẩn

đoán – Xét nghiệm - Điều trị, chi cục Thú y thành phố Hồ Chí Minh đã tạo mọi
điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài tốt nghiệp
-

Các bạn Trần Thị Bình Minh và Hàn Yến Phương, sinh viên lớp Thú y

30 đã luôn giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài
-

Các bạn lớp Công nghệ Sinh học 2005 – 2009 luôn giúp đỡ tôi trong quá

trình học tập cũng như hoạt động tại trường
Đặc biệt, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến PGS.TS.Nguyễn Ngọc Hải, chị
Huỳnh Thị Thu Hương và chị Đặng Thị Thu Hường đã luôn quan tâm, hướng dẫn
nhiệt tình cho đề tài của tôi
Tôi cũng muốn gửi lời cảm ơn đến Điền Thị Tuyết Nhung, người bạn thân thiết
luôn cùng tôi học tập, vui chơi, chia sẻ buồn vui trong suốt 4 năm của thời sinh viên và
cả quá trình thực hiện đề tài
Thành phố Hồ Chí Minh, 08/2008

iii


TÓM TẮT
Đề tài “Khảo sát tình hình nhiễm virus PRRS trên đàn heo ở Thành phố Hồ
Chí Minh” được thực hiện từ tháng 02/2009 – 07/2009 tại Trạm Chẩn đoán, Xét
nghiệm và Điều trị, chi cục Thú y Thành phố Hồ Chí Minh. Mục tiêu của đề tài là
đánh giá mức độ nhiễm virus PRRS trên heo tại thành phố Hồ Chí Minh.
Nội dung nghiên cứu của đề tài được chia làm hai gia đoạn. Giai đoạn 1: tiến

hành khảo sát tỷ lệ nhiễm PRRS bằng phương pháp ELISA. Giai đoạn 2: đánh giá sự
thống nhất giữa kết quả phát hiện virus bằng phương pháp ELISA và phương pháp
RT-PCR nhằm có kết quả chính xác hơn về tình hình nhiễm virus PRRS trên đàn heo.
Với 512 mẫu huyết thanh được thu nhận trên địa bàn thành phố, tôi tiến hành
kiểm tra tỷ lệ nhiễm virus PRRS. Kết quả cho thấy tỷ lệ nhiễm virus PRRS chung cho
toàn bộ số mẫu kiểm tra là 61,72%. Trên địa bàn khảo sát, tất cả các quận huyện đều
có heo nhiễm virus PRRS với tỷ lệ khá cao. Trong số đó, cao nhất là huyện Nhà Bè
với tỷ lệ nhiễm là 76,67%, kế đến là huyện Củ Chi với tỷ lệ 67,77%, Thủ Đức
(54,95%), Bình Chánh (53,13%), Cần Giờ (52,78%) và thấp nhất Quận 8 (36,67%).
Ngoài ra khi đánh giá tỷ lệ nhiễm virus PRRS trên từng nhóm heo, kết quả cho thấy tỷ lệ
nhiễm cao nhất là nhóm heo hậu bị (72,22%) và thấp nhất là nhóm heo nái (55,96%)
Dựa trên nghiên cứu của Gene, khi đánh giá về mức độ kháng thể kháng virus
PRRS trên các mẫu khảo sát, tôi nhận thấy mức độ kháng thể kháng virus PRRS với tỷ số
S/P >2,25 là phổ biến, xuất hiện trên tất cả các nhóm heo khảo sát.
Khi khảo sát sự tồn tại của kháng nguyên PRRS trong mẫu huyết thanh, kết quả
RT-PCR cho thấy chỉ có 13 mẫu dương tính trong 96 mẫu huyết thanh khảo sát. Mẫu
huyết thanh dương tính chủ yếu thuộc nhóm heo nọc (11/13 mẫu). Kết quả này khẳng
định khả năng phát hiện virus PRRS bằng phương pháp ELISA và phương pháp RTPCR không có sự thống nhất cao (K=0,14)
Tóm lại, tình hình nhiễm virus PRRS trên địa bàn thành phố đang ở mức khá cao
và có khả năng lây lan trong các trại chăn nuôi tập trung do có mức độ kháng thể cao
trên mẫu khảo sát.

iv


SUMMARY
Graduating thesis “Examining the infected rate of PRRS virus on porcine herds
in Ho Chi Minh city”. The thesis has been studied from February to July, 2009 at
Room Virology and Serology, Veterinary Diagnostic Laboratory, Sub. Department of
Animal health of HCMC. Purpose of this research: evaluating the infected rate of

PRRSV on porcine herds in Ho Chi Minh city
The content is concerned about
1.

To determine the infected rate of PRRSV by ELISA from serum

2.

Using RT-PCR to reexamine the result of ELISA and compare
two examining methods

Finally, after had studied total numbers of 512 samples on six diferent districts,
we have following results. The rate of infected pigs on HCMC was 61,72%. Among
distrists had been studied, Nha Be was the district which had the infected rate highest
(76,67%). Next was Cu Chi (67,77%), Thu Duc (54,95%), Binh Chanh (53,13%), Can
Gio (52,78%) and the lowest was Eight District (36,67%). Otherwise, the highest
infected rate was reserved pigs (72,22%) and the lowest was sow (55,96%).
Based on Gene about the ratio S/P of samples (1999), we received that the ratio
S/P > 2,25 was usually seen. It appeared on all kind of samples had been tested.
When detect antigen of PRRS virus in serum samples, the result of RT-PCR
gave only 13 positive samples on 96 samples tested. Most of them was samples from
boar (11/13 positive saples). This result can be used to prove that the detection PRRS
virus by ELISA and by RT-PCR is not the same. They have many differences.
However, we need more research to confirm the result
In conclusion, the infected rate of PRRS virus on porcine herds in HCMC is
quite high. It can make an outbreak to other herds in a porcine farm because of the pigs
which had the ratio S/P > 2,25

v

MỤC LỤC
Trang
Lời cảm ơn..................................................................................................................... iii
Tóm tắt............................................................................................................................iv
Summary..........................................................................................................................v
Mục lục ...........................................................................................................................vi
Danh sách chữ viết tắt ....................................................................................................ix
Danh sách các bảng .........................................................................................................x
Danh sách các hình và sơ đồ .........................................................................................xi

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU .............................................................................................1
1.1. Đặt vấn đề.................................................................................................................1
1.2. Yêu cầu của đề tài.....................................................................................................2
1.3. Nội dung nghiên cứu ................................................................................................2
1.4. Giới hạn đề tài ..........................................................................................................2

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................3
2.1. Giới thiệu hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp (PRRS) trên heo ........................3
2.1.1. Virus PRRS ........................................................................................................3
2.1.1.1. Hình thái và cấu trúc..................................................................................3
2.1.1.2. Phân dòng virus .........................................................................................4
2.1.1.3. Các protein cấu trúc ...................................................................................5
2.1.1.4. Tính chất kháng nguyên và tính sinh miễn dịch........................................6

vi


2.2. Chẩn đoán .................................................................................................................7
2.2.1. Các phương pháp phát hiện kháng nguyên ...........................................................7

2.2.1.1. Phân lập virus PRRS..................................................................................7
2.2.1.2. Phương pháp kháng thể huỳnh quang và hóa mô miễn dịch....................8
2.2.1.3. Phương pháp RT-PCR ..............................................................................9
2.2.2. Các phương pháp huyết thanh học phát hiện kháng thể .................................10
2.2.2.1. Phương pháp kháng thể huỳnh quang gián tiếp ......................................10
2.2.2.2. Xét nghiệm tế bào một lớp với peroxidase miễn dịch...........................112
2.2.2.3. Phương pháp ELISA................................................................................12
2.2.2.4. Phương pháp trung hòa virus...................................................................15
2.3. Diễn biến hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp trên heo và nghiên cứu..............15
2.3.1. Trên thế giới .....................................................................................................15
2.3.2. Tại Việt Nam....................................................................................................16

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................19
3.1. Thời gian, địa điểm và đối tượng khảo sát .............................................................19
3.2. Kít, hoá chất và trang thiết bị .................................................................................19
3.2.1. Kít ELISA ........................................................................................................19
3.2.2. Kít, hóa chất ly trích RNA và RT-PCR ...........................................................19
3.2.3. Trang thiết bị ....................................................................................................20
3.3. Nội dung và phương pháp nghiên cứu ...................................................................20
3.3.1. Nội dung 1: Khảo sát tỷ lệ nhiễm bằng phương pháp ELISA .........................20
3.3.1.1. Bố trí mẫu khảo sát ..................................................................................20
3.3.1.2. Phương pháp lấy mẫu xét nghiệm ...........................................................20
3.3.1.3. Các chỉ tiêu theo dõi ................................................................................20
3.3.2. Nội dung 2 Đánh giá sự thống nhất giữa phương pháp RT-PCR và ELISA ...20
3.3.2.1. Bố trí mẫu khảo sát ..................................................................................21

vii


3.3.2.2. Phương pháp xét nghiệm .........................................................................21

3.3.2.3. Chỉ tiêu theo dõi.......................................................................................21
3.4. Phương pháp xét nghiệm ........................................................................................21
3.4.1. ELISA phát hiện kháng thể kháng virus PRRS trong huyết thanh ..................21
3.4.2. Phương pháp RT-PCR phát hiện virus trong huyết thanh và máu...................25
3.4.2.1. Các bước ly trích RNA ............................................................................26
3.4.2.2. Quy trình thực hiện phản ứng ..................................................................27
3.4.3 Đánh giá kết quả ...................................................................................................28
3.5. Xử lý số liệu ...........................................................................................................28

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .........................................................29
4.1. Tỷ lệ huyết thanh dương tính với virus PRRS trên heo............................................... 29
4.2. Tỷ lệ nhiễm virus PRRS trên từng quận, huyện ở thành phố Hồ Chí Minh............... 29
4.3. Tỷ lệ nhiễm virus trên heo theo từng nhóm heo .......................................................... 31
4.4. Tỷ lệ kháng thể kháng virus PRRS .............................................................................. 32
4.5. Kết quả phát hiện RNA của virus PRRS trên mẫu huyết thanh.................................. 33
4.5.1. Kết quả RT-PCR trên mẫu huyết thanh heo nái..................................................... 34
4.5.2. Kết quả RT-PCR trên heo nọc ................................................................................ 35
4.5.3. Khả năng hiện diện của virus PRRS trong huyết thanh khi có kháng thể............. 35

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN .......................................................................................37
5.1. Kết luận.......................................................................................................................... 37
5.2. Tồn tại.....................................................................................................................37
5.3. Đề nghị ...................................................................................................................38

TÀI LIỆU THAM KHẢO .....................................................................................38

viii


DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT

cDNA: Complement Deoxynucleotide Acid
CL–2621
DNA : Deoxynucleotide Acid
dNTP : Deoxynucleotide Triphosphate
EDTA : Ethylene Diamine Tetra Acetate
ELISA : Enzyme Linked Immunosorbent Assay
FA: Florescent Antibody Staining
HRPO: Horseadish Peroxidase
IFA : Immuno Florescent Assay
IHC : Immunohistochemistry Staining
IPMA : Immuno Peroxidase Monolayer Assay
MA–104
MARC–145
OD: Optical Density
ORF: Open Reading Frame
PAM: Porcine Alveolar Macrophage
PBS: Phosphate Buffer Saline
PBSA: Phosphate Buffer Saline Solution A
PCR: Polymerase Chain Reaction
PRRS: Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome
PRRSV: Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus
RNA : Ribonucleotide Acid
RT-PCR : Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction
S/P : Sample/Positive
SN : Serum Neutralization
TBE: tris Borate EDTA
TCID50: 50 percent Tissue Culture Infective Dose
TE : Tris EDTA
µl : Micro lit

ix


DANH SÁCH BẢNG
Trang
Bảng 2.1 Bệnh phẩm dùng trong các phương pháp chẩn đoán bệnh PRRS ................16
Bảng 3.1 Trình tự các đoạn mồi sử dụng phát hiện virus PRRS ..................................21
Bảng 4.1 Tỷ lệ nhiễm virus PRRS trên heo khảo sát....................................................31
Bảng 4.2 Số liệu về quy mô chăn nuôi của các quận huyện được khảo sát..................32
Bảng 4.3 Tỷ lệ nhiễm virus PRRS theo từng quận, huyện ở thành phố Hồ Chí Minh.32
Bảng 4.4 Tỷ lệ nhiễm virus trên heo theo từng nhóm heo ở thành phố........................33
Bảng 4.5 Phân bố mức độ kháng thể kháng virus PRRS..............................................35
Bảng 4.6 Kết quả phát hiện RNA của virus PRRS trên mẫu huyết thanh ....................36
Bảng 4.7 Bảng đối chiếu kết quả phát hiện virus bằng kỹ thuật ELISA và RT-PCR ..38

x


DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ SƠ ĐỒ
Trang
Hình 2.1 Bộ gene của virus PRRS..................................................................................4
Hình 2.2 Độ tương đồng của trình tự acid amin của các dòng virus ..............................5
Hình 2.3 Mô hình các protein cấu trúc của virus PRRS.................................................6
Hình 2.4 Các chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR .............................................................11
Hình 2.5 Các bước thực hiện phản ứng ELISA gián tiếp.............................................14
Hình 2.6 Các bước thực hiện phản ứng Blocking ELISA ............................................15
Hình 3.1 Bộ kít phát hiện kháng thể kháng virus PRRS – Idexx laboratories .............22
Hình 3.2 Các bước thực hiện phản ứng ELISA............................................................25
Hình 3.3 Hóa chất dùng để ly trích RNA .....................................................................26
Hình 4.1 Kết quả phát hiện RNA của virus trong huyết thanh.....................................34

Sơ đồ 3.1 RT-PCR phát hiện virus PRRS.....................................................................27

b)

d)

xi


Chương 1
MỞ ĐẦU
1.1.

Đặt vấn đề
Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) là tác nhân gây

hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở heo – PRRS (porcine reproductive and
respiratory syndrome). Đây là một bệnh mới, phức tạp. Đặc trưng của bệnh là gây sẩy
thai ở giai đoạn cuối, chết thai và thai khô hoặc heo con sinh ra yếu, bệnh biểu hiện ở
hệ hô hấp của heo con theo mẹ và heo cai sữa, bệnh còn làm trì hoãn sự động dục và
những khó khăn về hô hấp ở heo (dẫn liệu Trần Thanh Phong, 1996).
Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp lần đầu tiên được phát hiện tại Mỹ năm
1987, lan rộng sang các nước Châu Âu và hiện nay bệnh có mặt trên khắp thế giới.
Bệnh được phát hiện lần đầu tiên tại Việt Nam năm 1997 trên đàn heo nhập từ Mỹ
(10/51 con có huyết thanh dương tính). Các nghiên cứu về bệnh trên những trại heo
giống tại các tỉnh phía Nam cho thấy tỷ lệ heo có huyết thanh dương tính với bệnh rất
khác nhau, từ 1,3% cho tới 68,29% (Cục Thú y, 2007). Kết quả nghiên cứu của Trần
Thị Bích Liên và Trần Thị Dân (2007) tại 21 trại chăn nuôi heo ở miền Đông Nam bộ
cho thấy có sự hiện diện của cả hai dòng Châu Âu và Bắc Mỹ. Từ đầu năm 2006 đến
nay, tại Trung Quốc đã phát hiện nhiều heo bệnh, chết, nguyên nhân do

virus PRRS dòng Bắc Mỹ thể cường độc làm chết cả heo trưởng thành và có tỷ lệ chết
lên đến 20%. Từ đầu năm 2007 đến nay bệnh đã xảy ra ở nước ta tại nhiều địa phương
từ Bắc vào Nam gây thiệt hại đáng kể, và theo kết quả xét nghiệm do tổ chức Lương
nông thế giới (FAO) cho thấy chủng virus phát hiện trên các đàn bệnh là virus PRRS
phát hiện ở Trung Quốc (Báo Sài Gòn giải phóng, 2007).
Do tính chất nghiêm trọng và khả năng lây lan rộng của bệnh, Bộ Nông nghiệp
và phát triển nông thôn đã ra quy định về “Phòng chống Hội chứng rối loạn sinh sản
và hô hấp ở heo” ngày 15/07/2008. Trong đó có quy định phải xây dựng kế hoạch
giám sát dịch bệnh và tổ chức lấy mẫu để chẩn đoán, giám sát dịch bệnh đột xuất hoặc
thường xuyên. Điều này cho thấy việc chẩn đoán và phát hiện bệnh sớm là rất quan
trọng. Tuy nhiên việc phát hiện theo phương pháp nuôi cấy truyền thống thì lại rất khó
khăn và mất nhiều thời gian. Cho đến những năm gần đây, kỹ thuật sinh học phân tử
1


đã phát triển một cách mạnh mẽ và chứng minh được vai trò ưu việt, trong đó kỹ thuật
ELISA và RT-PCR ngày càng được ứng dụng rộng rãi hơn. Đây là những kỹ thuật có
độ chính xác cao, ít tiêu tốn thời gian và về mặt chi phí thì có thể chấp nhận được.
Vì vậy, tôi tiến hành thực hiện đề tài “Khảo sát tình hình nhiễm virus gây hội
chứng rối loạn hô hấp và sinh sản trên đàn heo ở thành phố Hồ Chí Minh” nhằm có
một đánh giá chung về tình hình dịch bệnh hiện nay.
1.2. Yêu cầu của đề tài
Khảo sát tỷ lệ nhiễm virus PRRS. Qua đó phân tích một số yếu tố liên quan đến
tỷ lệ nhiễm virus PRRS trên heo ở thành phố Hồ Chí Minh.
1.3. Nội dung nghiên cứu
Đề tài được tiến hành qua các giai đoạn:
 Khảo sát tỷ lệ nhiễm và dòng virus PRRS bằng phương pháp ELISA
 Đánh giá sự thống nhất giữa kết quả phát hiện virus trong huyết thanh
và trong máu bằng phương pháp RT-PCR
1.4. Giới hạn đề tài

Vì thời gian cũng như kinh phí thực hiện đề tài có hạn nên chúng tôi chỉ tiến
hành thu mẫu trên 6 địa bàn quận huyện trong thành ph với số lượng là 512 mẫu để
đánh giá mức độ nhiễm virus PRRS trên đàn heo..

2


Chương 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1.

Giới thiệu hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp (PRRS) trên heo
Bệnh PRRS là bệnh truyền nhiễm, do virus Arterivirus thuộc bộ Nidovirales, họ

Arteriviridae gây nên. Có 2 dòng virus PRRS nhưng có rất nhiều chủng, khả năng biến
dị cao và tính gây miễn dịch chéo không cao.
Hạch lympho là nơi virus nhân lên, gây hư hại hệ thống miễn dịch dẫn đến tính
trạng nhiễm thứ cấp trầm trọng trên heo đã nhiễm virus PRRS trước đó, và cũng nhờ
đặc điểm này virus tồn tại trong đàn trong thời gian dài. Triệu chứng trên thú mắc
bệnh rất đa dạng nhưng biểu hiện rõ trên nái dẫn đến sảy thai và chậm động dục, gây
bệnh hô hấp trên heo con, tỷ lệ chết cao trên heo cai sữa.
Bệnh lây lan mạnh và gây thiệt hại lớn về kinh tế. Theo quyết định số
1037/2007/QĐ-BNN của Bộ Nông nghiệp – Phát triển nông thôn, bệnh chứng rối loạn
sinh sản và hô hấp trên heo (porcine reproductive and respiratory syndrome – PRRS)
là bệnh phải công bố dịch.
2.1.1. Virus PRRS
2.1.1.1. Hình thái và cấu trúc
PRRS virus (PRRSV) thuộc nhóm RNA virus mạch đơn, sợi dương, có vỏ bao
bên ngoài. Virus có đường kính 50 – 60 nm, có vỏ mặt tương đối phẳng, chứa lõi
nucleocapsid hình khối có đường kính 25 – 35 nm (Zimmerman và cộng sự, 2006).

Virus dài khoảng 15kb và gồm 8 khung đọc mở (open reading frame: ORF). Cho đến
nay, người ta đã xác định các cấu trúc chính của PRRSV là :
-

Gene mã hóa protein vỏ glycoprotein (ORF 5, khoảng 24-25 kDa)

-

Gene mã hóa protein nhân nucleocapsid (ORF7, khoảng 15 kDa)

-

Gene mã hóa protein màng (ORF6, khoảng 19 kDa).

3


Hình 2.1 Bộ gene của virus PRRS. GP: Protein của màng
(glycoprotein); M : Protein gian màng (a membrance – spanning
protein); N: Protein của capsid (nucleocapsid protein); E:Protein của vỏ
ngoài ( />
ORF1a và ORF1b chiếm khoảng 80% bộ gen và mã hóa cho enzym RNAdependent RNA polymerase, đây là một enzym sao chép (replicase). ORF 1a và ORF
1b mã hóa các polyprotein để hình thành các protein không cấu trúc (nonstructural
proteins - nsp). Có khoảng 12 protein không cấu trúc được tạo ra từ ORF1. Sáu ORF
nhỏ hơn (ORF2 đến ORF7) ở đầu 3’ của bộ gen mã hóa cho những protein cấu trúc
của virus là GP2, GP3, GP4, GP5, M, N.
2.1.1.2. Phân dòng virus
Dựa vào sự khác biệt về trình tự gene, virus PRRS được chia thành dòng Châu
Âu và dòng Bắc Mỹ. Các nghiên cứu phân tử cho thấy giữa virus gây PRRS tại Châu
Âu và Mĩ chỉ tương đồng 60% về bộ gene. Trình tự ORF5 của 2 dòng virus có sự

khác biệt lớn nhất, do đó protein GP5 là protein cấu trúc khác biệt rất lớn và chỉ có 51
-55% acid amin tương đồng. Trong khi đó, protein M là protein cấu trúc ổn định nhất
có 78 – 81% acid amin tương đồng. So sánh trình tự gen ORF1 của 2 dòng cũng cho
thấy có sự khác nhau. Sự khác biệt lớn nhất là ở trình tự acid amin của nsp2. Protein
nsp2 của các chủng virus dòng Châu Mỹ có trình tự gen dài hơn các chủng dòng Châu
Âu 102 acid amin và chỉ có 32% acid amin tương đồng (Meulenberg, 2000).

4


Theo Kegong (2006), virus PRRS chủng Trung Quốc, nguyên nhân gây dịch
PRRS không điển hình, thuộc dòng Bắc Mỹ và có cấu trúc protein nsp2 mất 30 acid
amin không liên tục so với cấu trúc protein nsp2 dòng Bắc Mỹ.

Hình 2.2 Độ tương đồng của trình tự acid amin được mã hoá từ các khung đọc mở
ORF1 đến ORF7 của các dòng virus thuộc dòng Châu Âu và dòng Bắc Mỹ
(Meulenberg, 2000).
2.1.1.3. Các protein cấu trúc
Virus PRRS có từ 5 đến 7 protein cấu trúc. Những protein cấu trúc chính gồm
GP5, M và N được mã hóa từ ORF 5, ORF 6, ORF 7. Protein N có trọng khối phân tử
nhỏ (15 kDa) và là protein cơ bản nhất của virus, được phát hiện với lượng lớn trong
các tế bào bị nhiễm và chiếm khoảng 20 - 40% lượng protein có trong hạt virus.

Hình 2.3 Mô hình các protein cấu trúc của virus PRRS
( />
5


Protein M (18 kDa) không liên kết với phân tử đường, là protein ổn định nhất
của virus PRRS. Protein này có cấu trúc nhọn, có thể đóng vai trò gắn kết và nảy chồi.

Protein M có rất nhiều trong lưới nội chất, hình thành các phân tử dị hợp liên kết với
glycoprotein GP5 (25 kDa) bằng cầu nối disulfide (disulfide-linked heterodimers).
Các phân tử dị hợp này không liên kết chặt chẽ trong hạt virus và được cho là protein
cần thiết cho sự gây nhiễm của virus.
Protein GP5 có đầu tận cùng là N, được cho là có liên quan đến sự nhận biết
điểm tiếp nhận. Protein GP2 (29-30 kDa) và GP4 (31-35 kDa) là các glycoprotein
màng. Hiện nay có các dữ liệu khác nhau về sự hiện diện của glycoprotein GP3 được
mã hóa từ ORF3 trong hạt virus. Nieuwstadt phát hiện protein GP3 (45-50 kDa) bằng
phương pháp Western blot trên virus Lelystad đã tinh sạch với các kháng thể đơn dòng
đặc hiệu nhưng không phát hiện được protein GP3 của virus dòng Canadian IAFklop
bằng phương pháp khuếch tán trên thạch. Các protein GP3, GP4, GP5, M, N là các
protein mang tính kháng nguyên (Meulenberg, 2000).
2.1.1.4. Tính chất kháng nguyên và tính sinh miễn dịch
Thí nghiệm trên chuột cho thấy các protein GP3, GP4, GP5, M và N đều tạo
các kháng thể đơn dòng riêng biệt. Phần lớn các kháng thể đơn dòng kháng lại protein
N cho thấy đây là protein sinh miễn dịch mạnh nhất. Trên tế bào vật chủ có một số
điểm tiếp nhận đặc hiệu cho các chủng thuộc dòng Châu Âu hay các chủng thuộc dòng
Bắc Mỹ, trong khi đó một số điểm tiếp nhận có thể chung cho cả 2 dòng. Các kháng
thể đơn dòng kháng protein GP4 và GP5 có thể trung hòa virus trong phòng thí
nghiệm cho thấy 2 protein này có vai trò tiếp cận tế bào vật chủ. Kháng thể kháng
protein vỏ GP5 có khả năng trung hòa virus mạnh hơn kháng thể kháng protein GP4.
Các protein này cũng tạo đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào, và trên heo nhiễm
virus PRRS có sự tăng sinh các tế bào T chủ yếu kháng các protein M, GP2 và GP5
(Meulenberg, 2000).
Kháng thể IgM kháng virus PRRS xuất hiện trong huyết thanh 5-7 ngày sau khi
heo nhiễm virus và không phát hiện được sau 2-3 tuần. Kháng thể IgG phát hiện được
trong máu heo 7-10 ngày sau nhiễm và đạt đỉnh cao nhất ở 4 tuần sau nhiễm, kéo dài
nhiều tháng và giảm trong khoảng 300 ngày (Zimmerman, 2006).

6

Kháng thể kháng protein N có giá trị chẩn đoán nhưng không phải là kháng thể
trung hòa. Kháng thể trung hòa xuất hiện trong huyết thanh 3 tuần sau nhiễm và duy trì
trong thời gian dài nhưng ở mức độ thấp (Loemba và cộng sự, 1996). Kháng thể trung
hòa kháng lại các glycoprotein GP4, GP5 và protein matrix (M) (Ostrowski và cộng sự,
2002).
Theo báo cáo của AUSVETPLAN (2006), sự bảo hộ chéo giữa các serotype
của virus PRRS không cao. Đáp ứng miễn dịch của heo với virus PRRS rất thay đổi
tùy độc lực virus. Theo Johnson và cộng sự (2004), với bộ kít HerdCheck® ELISA
2XR phát hiện được kháng thể trên heo con 2 – 3 tuần tuổi nhiễm các dòng virus
PRRS có độc lực cao và trung bình sau 15 ngày; đối với heo được gây nhiễm với các
dòng virus nhược độc có thể phát hiện được kháng thể sau 21 – 28 ngày hoặc có thể
không phát hiện được kháng thể 42 ngày sau khi nhiễm.
2.2. Chẩn đoán
Các loại bệnh phẩm xét nghiệm bệnh PRRS gồm phổi, hạch bạch huyết, tim,
não, tuyến ức, lách, thận, máu, cuống rốn, máu cuống rốn.
Các phương pháp chẩn đoán bệnh PRRS bao gồm: phân lập virus, huỳnh quang,
hoá mô miễn dịch, RT-PCR, ELISA, huỳnh quang gián tiếp, trung hòa
virus. Tóm tắt các phương pháp và loại mẫu sử dụng chẩn đoán bệnh PRRS thể hiện
trong bảng 2.1 (Zimmerman, 2006).
2.2.1. Các phương pháp phát hiện kháng nguyên
2.2.1.1. Phân lập virus PRRS
Có thể phân lập virus PRRS trên môi trường tế bào đại thực bào phế nang heo
(PAM: porcine alveolar marcrophage), các tế bào CL-2621và MARC-145 thuộc dòng
tế bào thận khỉ Châu Phi MA-104 (Benfield và cộng sự, 1992; Kim và cộng sự, 1993).
Phương pháp huỳnh quang trực tiếp và nhuộm vi thể để phát hiện kháng nguyên virus
sau khi nuôi cấy.Tùy lượng virus có trong mẫu mà kết quả chẩn đoán có sau một hay
nhiều ngày. Phân lập virus trên môi trường PAM có độ nhạy cao hơn môi trường
MARC-145 và điểm tiếp nhận Fc của tế bào PAM làm tăng khả năng phân lập virus

PRRS khi có kháng thể (Yoon và cộng sự, 2003). Hầu hết các virus PRRS dòng Châu
Âu chỉ phát triển được trên môi trường PAM (Christopher-Hennings và cộng sự, 2002).

7


Mẫu phổi, huyết thanh, hạch bạch huyết, hạch amidan lấy từ heo nhiễm virus 428 ngày là nguồn mẫu tốt cho việc phân lập virus. Khả năng phát hiện virus từ bệnh
phẩm lấy trên heo sống trong các trường hợp sảy thai giai đoạn cuối hay sinh sớm có
kết quả tốt hơn mẫu lấy trên thai lưu hay thai gỗ. Trong bệnh mãn tính, hạch amidan,
mảnh nạo hầu họng, và hạch bạch huyết cho kết quả tốt hơn mẫu huyết thanh và phổi.
Trong thực nghiệm có thể phát hiện virus trong hạch amidan, mảnh nạo hầu họng ở
ngày thứ 130 và 170 sau nhiễm (Rowland và cộng sự, 2003; Wills và cộng sự, 2003;
trích dẫn Zimmerman, 2006).
Bệnh phẩm phân lập cần giữ ở 40C hay thấp hơn. Nếu mẫu lưu trữ một thời
gian dài phải bảo quản mẫu ở nhiệt độ -700C và tránh rã đông nhiều lần (Van Alstine
và cộng sự, 1993).
2.2.1.2. Phương pháp kháng thể huỳnh quang (FA: fluorescent antibody) và hóa
mô miễn dịch (IHC: immunohistochemistry staining)
Người ta thường dùng các phản ứng miễn dịch hóa mô (IHC :
immunohistochemistry staining) để phát hiện PRRSV trong các mẫu được đông lạnh
hoặc mẫu được cố định bằng formol. Các phản ứng thường dùng là xét nghiệm miễn
dịch gắn vàng, hoặc gắn bạc hoặc kỹ thuật miễn dịch peroxidase. Tuy nhiên hầu hết
các kỹ thuật này chỉ được sử dụng cho mục đích nghiên cứu (Pol và cộng sự, 1991;
Magar và cộng sự, 1993).
Ngoài ra, ta còn có thể sử dụng phương pháp kháng thể huỳnh quang (FA :
fluorescent antibody staining). FA có thể thực hiện trực tiếp trong các mẫu đông lạnh.
Phương pháp này cho kết quả nhanh và chi phí thấp, tuy nhiên lại có độ nhạy và độ
đặc hiệu không cao. Để đảm bảo kết quả, mẫu cần được lấy và làm lạnh nhanh
Mẫu mô thực hiện phương pháp này gồm Tim, thận, phổi, hạch bạch huyết, lách,
tuyến ức, hạch amidan, tuyến thượng thận, ruột, và não (Halbur và cộng sự, 1995;

Rossow và cộng sự, 1999). Khi thực hiện 2 phương pháp này, tùy hướng muốn phát
hiện virus thuộc dòng Châu Âu hay Bắc Mỹ để sử dụng hóa chất phù hợp.

8


2.2.1.3. Phương pháp RT-PCR (Reverse transcriptase polymerase chain reaction)
RT-PCR là một phương pháp hữu dụng cho việc phát hiện PRRSV (Van
Woensel và cộng sự, 1994; Suarez và cộng sự 1994). Bằng cách thiết lập các cặp mồi
chuyên biệt, RT-PCR có thể phân biệt gữa dòng virus châu Mĩ và dòng virus châu Âu
(Mardassi và cộng sự, 1994).
RT-PCR được thực hiện với nhiều cặp mồi khác nhau, cho phép phát hiện gene
của các ORF7, ORF6 hay ORF1b của virus. RT-PCR có thể được thực hiện với nhiều
loại mẫu khác nhau: máu, huyết thanh, mô, tinh dịch, dịch phế quản, dịch phổi…trên
cơ thể thú sống hoặc thú chết. Đây là ưu điểm quan trọng của RT-PCR.
So với các phương pháp phân lập virus, hóa mô miễn dịch và kháng thể huỳnh
quang, phương pháp RT-PCR có các ưu điểm như: độ nhạy và độ đặc hiệu cao hơn,
phát hiện được virus trên heo nhiễm bệnh cấp tính và mãn tính, phát hiện được RNA
virus trong thai tự tiêu, các loại mẫu gây độc cho tế bào nuôi cấy như mẫu tinh dịch và
phân, nhanh (1-3 ngày) khi so sánh với các phương pháp khác (nhiều ngày hay nhiều
tuần), sản phẩm PCR có thể được sử dụng để giải trình tự.
Hạn chế của phương pháp này là không phân biệt được virus gây bệnh và
không gây bệnh. Tuy nhiên, trong thực nghiệm cho thấy sự tương đồng lên đến 94%
và 81% giữa kết quả PCR của tinh dịch và dịch nạo hầu họng so với kết quả gây nhiễm
heo bằng virus có 2 bệnh phẩm này (Christopher-Hennings và cộng sự, 1995; Horter
và cộng sự, 2002). Phương pháp này cũng có thể dẫn đến kết quả dương tính giả. Tuy
vậy, RT-PCR vẫn là một công cụ hiệu quả trong việc xét nghiệm PRRSV từ các mẫu
tinh dịch và các mẫu mà hoạt động lây nhiễm của virus đã bị suy yếu.
Nguyên lý của phương pháp RT-PCR
Phương pháp RT-PCR kết hợp phản ứng phiên mã ngược (reverse transcription)

tổng hợp DNA bổ sung từ mẫu RNA nhờ enzyme reverse transcriptase với phản ứng
khuếch đại DNA từ DNA bổ sung nhờ enzyme polymerase. Một phản ứng khuếch đại
DNA (PCR) cần: trình tự 2 nucleotide mồi cho đoạn DNA cần khuếch đại, một
enzyme tổng hợp DNA chịu nhiệt, 4 loại nucleotide (dNTP), dung dịch đệm cho phản
ứng và magnesium. Máy luân nhiệt kiểm soát phản ứng thông qua một chuỗi các nhiệt
độ khác nhau trong những lượng thời gian khác nhau.

9


Giai đoạn tạo DNA bổ sung (cDNA) từ RNA của virus (RT: Reverse
transcription): Giai đoạn này thường có nhiệt độ 50oC, ở nhiệt độ này, nhờ có enzyme
reverse transcriptase và sự có mặt của 4 loại nucleotide hình thành cDNA. Sau quá
trình tạo cDNA, tăng nhiệt độ lên 94oC trong khoảng 5-15 phút để bất hoạt enzyme
reverse transcriptase.
Giai đoạn khuếch đại DNA từ cDNA gồm nhiều chu kỳ (không vượt quá 40)
(McPherson và Moller, 2000). Mỗi chu kỳ gồm 3 bước:
Bước 1 (giai đoạn biến tính - denaturation): 2 mạch đơn của DNA tách rời nhau
để đoạn mồi có thể dò tìm và gắn vào.
Bước 2 (giai đoạn bắt cặp - annealing): Nhiệt độ được giảm xuống 40 - 600C. Ở
nhiệt độ này, các đoạn nucleotide mồi sẽ bắt cặp với từng mạch đơn của DNA nhờ một
enzyme chịu nhiệt.
Bước 3 (giai đoạn tổng hợp hay kéo dài - elongation): Sự tổng hợp một đoạn
DNA mới bắt đầu khi nhiệt độ phản ứng nâng lên để enzyme polymerase chịu nhiệt
hoạt động tối ưu. Đối với hầu hết các DNA polymerase thì nhiệt độ này khoảng 720C,
trong vòng 1 đến 2 phút. Bước này sẽ hoàn tất một chu kỳ. Chu kỳ tiếp theo với sự trở
lại của bước biến tính ở 950C, bước bắt cặp 40 - 600C, bước kéo dài 720C, và lập lại
như vậy cho đến hết số chu kỳ đã định.
2.2.2. Các phương pháp huyết thanh học phát hiện kháng thể
2.2.2.1. Phương pháp kháng thể huỳnh quang gián tiếp (IFA: indirect flourescent

antibody)
Phương pháp IFA phát hiện kháng thể IgM và IgG 5 vào ngày và 9 - 14 ngày
sau nhiễm. IgM tồn tại 21-28 sau nhiễm. Lượng IgG cao nhất ở 30-50 ngày sau nhiễm
và có thể phát hiện được sau 3-5 tháng sau nhiễm. Độ nhạy của phương pháp phụ
thuộc kỹ năng xét nghiệm, sự khác biệt về kháng nguyên của virus sử dụng trong
phương pháp IFA và kháng nguyên của virus thực địa tạo kháng thể trên heo. Không
có phản ứng chéo giữa các chủng dòng Châu Âu và Bắc Mỹ (Christopher-Hennings và
cộng sự, 2002).
Theo Yoon và cộng sự (1992), độ đặc hiệu của phương pháp IFA là 99,5%
nhưng độ nhạy khác nhau giữa các cá thể. Phương pháp này xác định được hiệu giá
kháng thể, và hiệu giá kháng thể từ 1/16 – 1/20 được đánh giá dương tính; đây là
10


phương pháp đáng tin cậy để phát hiện kháng thể đặc hiệu đối với heo đã nhiễm virus
2 – 3 tháng (Frey và cộng sự, 1992; Yoon và cộng sự, 1995, trích dẫn Yoon và cộng sự,
2003). Phương pháp này được sử dụng để xác nhận kết quả ELISA nghi ngờ.
Lưu ý, kết quả xét nghiệm IFA chỉ được công nhận khi không có bất kỳ sự phát
quang nào từ các mẫu đối chứng huyết thanh âm và đối chứng huyết thanh dương trên
tế bào không bị gây nhiễm PRRSV. Trong trường hợp mẫu huyết thanh đối chứng
dương không phát huỳnh quang, cần tiến hành xét nghiệm lại. Việc xét nghiệm được
thực hiện bắt đầu ở độ pha loãng tối thiểu 1/20.

Hình 2.4 Các chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR
( />
11


2.2.2.2. Xét nghiệm tế bào một lớp với peroxidase miễn dịch (IPMA:
immunoperoxidase monolayer assay)

IPMA là phương pháp xét nghiệm đầu tiên được thực hiện để xét nghiệm
PRRSV trong huyết thanh (Wensvoort và cộng sự., 1991). Ban đầu IPMA sử dụng các
tế bào PAM nhưng sau này, các mẫu tế bào chính được sử dụng để xét nghiệm là tế
bào CL 2621 và Marc-145. Tế bào sau khi nuôi cấy 24 giờ sẽ được gây nhiễm với
PRRSV liều 105 TCID50, ủ ở 370C trong 24 giờ. Tế bào gây nhiễm được cố định và
cho tác dụng với huyết thanh mẫu, ủ khoảng 1 giờ ở 370C và được cho tác dụng tiếp
với kháng kháng thể heo cộng hợp HRPO (horseradish peroxidase).
Kết quả được đánh giá thông qua sự hiện màu trên lớp tế bào khi cho tác dụng
với dung dịch chromogen (AEC) trong 30 phút. Nếu mẫu huyết thanh có chứa kháng
thể kháng PRRSV, 30-50% tế bào sẽ có màu đỏ. Trường hợp âm tính, màu của tế bào
được giữ nguyên. Những mẫu có tế bào bị nhuộm màu hoàn toàn, phản ứng không đặc
hiệu. Kết quả IPMA còn dựa trên hiệu giá kháng thể ở độ pha loãng lớn nhất mẫu cho
kết quả nhuộm màu 50% tế bào. Những mẫu có hiệu giá kháng thể ở mức <10 cho kết
quả màu dương tính được đánh giá là âm tính với xét nghiệm bằng kỹ thuật IPMA.
Những mẫu có hiệu giá dương tính với phản ứng màu ở mức từ 10-40 được đánh giá là
dương tính yếu. Những mẫu có hiệu giá dương tính với phản ứng màu ở mức từ >160
được đánh giá là dương tính.
2.2.2.3. Phương pháp ELISA (enzyme linked immunosorbent assay)
Phương pháp ELISA gián tiếp được phát triển bởi Albina và cộng sự (1992) để
phát hiện kháng thể của PRRSV. Phương pháp xét nghiệm được thực hiện bằng cách
sử dụng tế bào PAM nhiễm virus như một kháng nguyên và các tế bào PAM chưa
nhiễm là kháng nguyên điều chỉnh. Các tác giả cho rằng phương pháp ELISA có mức
độ chuyên biệt như IPMA và nhạy cảm hơn trong việc phát hiện sớm các kháng thể.
Houben và cộng sự đưa ra kỹ thuật blocking ELISA (1995), cũng dựa trên
kháng nguyên là các tế bào PAM bị xâm nhiễm nhưng lại sử dụng các kháng thể đa
dòng để phát hiện kháng nguyên. Ông cho rằng phương pháp này đặc hiệu và nhạy
hơn so với kỹ thuật IPMA. Hơn nữa, những rắc rối xảy ra trên nền nhuộm khi sử dụng
kỹ thuật IPMA và ELISA gián tiếp không xảy ra đối với kỹ thuật blocking ELISA.

12

Kỹ thuật ELISA là một phương pháp kinh tế và có thể tự động hóa khi thực
hiện những cuộc xét nghiệm trên quy mô lớn.
Kít ELISA HerdCheck 2XR ELISA của công ty IDEXX, Mỹ có thể được xem
là tiêu chuẩn vàng phát hiện kháng thể kháng virus PRRS, nhạy, đặc hiệu, chuẩn và
nhanh. Kít phát hiện kháng thể kháng nucleocapsid của 2 dòng Châu Âu và Bắc Mỹ.
Phương pháp này có thể phát hiện được kháng thể trên thú 9 ngày sau nhiễm và đạt
ngưỡng cao nhất ở 30-50 ngày sau nhiễm, sau đó giảm dần và không phát hiện được
sau 4-12 tháng (trích dẫn Zimmerman và cộng sự, 2006).
Theo Erickson (1995), trong xét nghiệm kháng thể bằng kỹ thuật ELISA, tỷ số
S/P lớn hơn 2,25 thì heo đang trong tình trạng virus trong máu. Đối với các bầy heo đã
chủng ngừa thì tỷ số S/P từ 0,2 – 2,0.
Hạn chế của phương pháp này là không chẩn đoán được bệnh bằng các phương
pháp huyết thanh học trên những đàn đã nhiễm virus trước đó hay đã tiêm phòng.
Những kết quả huyết thanh học dương tính trên heo có biểu hiện lâm sàng bệnh PRRS
không đủ cơ sở cho việc chẩn đoán virus trên một cá thể (Van Alstine và cộng sự,
1993b). Albina và cộng sự (1994) phát hiện được kháng thể mẹ truyền trên heo 4 ngày
tuổi đến khi heo 3 tuần tuổi. Một nghiên cứu khác của Goyal (1993) cho thấy kháng
thể tồn tại trong cơ thể heo con từ 4 đến 10 tuần sau sinh và đôi khi heo con bú mẹ có
miễn dịch kháng thể tồn tại 16 tuần (Van Alstine và cộng sự, 1993).
2.2.2.3.1. ELISA gián tiếp (Indirect ELISA)
Trong kỹ thuật này, các kháng thể trong mẫu xét nghiệm bị kẹp giữa kháng nguyên
phủ trên giếng và enzyme đánh dấu. Thêm dung dịch chất nền chứa chromogen sẽ gây
ra phản ứng tạo màu. Mật độ màu phụ thuộc vào lượng kháng thể của mẫu xét nghiệm
gắn trong giếng. Lượng kháng thể càng nhiều, sự phát màu càng mạnh trong các giếng
thí nghiệm. Phương pháp này phù hợp để đánh giá tổng số kháng thể trong mẫu.
2.2.2.3.2. Blocking ELISA
Trong kỹ thuật này, các kháng thể trong mẫu phải cạnh tranh với enzyme đánh
dấu (chính là các kháng thể chuyên biệt trong dung dịch conjugate). Thêm dung dịch

nền sẽ gây ra phản ứng tạo màu. Mật độ màu tỷ lệ nghịch với lượng kháng thể của
mẫu gắn trên giếng. Lượng kháng thể càng nhiều, sự phát màu càng yếu.

13


Hình 2.5 Các bước thực hiện phản ứng ELISA gián
tiếp (ELISA Technical Guide, IDEXX Laboratories).

Hình 2.6 Các bước thực hiện phản ứng Blocking ELISA
(ELISA Technical Guide, IDEXX Laboratories).

2.2.2.3.3. ELISA trực tiếp/ELISA bắt kháng nguyên (Antigen-capture (Direct)
ELISA)
Trong kỹ thuật này, kháng nguyên trong mẫu bị kẹp giữa kháng thể phủ trên bề mặt
giếng và enzyme đánh dấu trong conjugate. Kháng thể trong dung dịch conjugate có
thể là kháng thể đơn dòng, cũng có thể là kháng thể đa dòng. Thêm dung dịch nền sẽ
gây ra phản ứng tạo màu. Mật độ màu tỷ lệ thuận với lượng kháng nguyên của mẫu
gắn trên giếng.
14