PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ GEN ORF5 VÀ ORF7 CỦA VIRUS GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP (PRRSV) Ở MỘT SỐ TỈNH MIỀN NAM VIỆT NAM

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ GEN ORF5 VÀ ORF7 CỦA VIRUS
GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP (PRRSV)
Ở MỘT SỐ TỈNH MIỀN NAM VIỆT NAM

Ngành học

: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Niên khoá

: 2005 – 2009

Sinh viên thực hiện

: VÕ KHÁNH HƯNG

Tháng 8/2009
iv


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ GEN ORF5 VÀ ORF7 CỦA VIRUS
GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP (PRRSV)
Ở MỘT SỐ TỈNH MIỀN NAM VIỆT NAM

Giáo viên hướng dẫn:

Sinh viên thực hiện:

PGS.TS. NGUYỄN NGỌC HẢI

VÕ KHÁNH HƯNG

.

Thángv8/2009


LỜI CẢM ƠN
Trước tiên con xin gửi lời cám ơn đến ba mẹ đã luôn yêu thương và tạo mọi điều
kiện cho con học tập. Em cảm ơn anh hai đã luôn động viên và chỉ dạy em mọi điều.
Em xin chân thành cảm ơn:
Ban giám hiệu trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ
nhiệm Bộ Môn Công nghệ Sinh học, cùng tất cả quý thầy cô đã dạy những kiến thức
hay và phong cách làm việc tốt cho em trong suốt 4 năm học.
Tập thể cán bộ và quý Thầy - Cô Viện công nghệ sinh học và môi trường, Đại
học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện và giúp đỡ em trong suốt
thời gian thực tập.

Em xin trân trọng biết ơn Thầy PGS.TS Nguyễn Ngọc Hải hết lòng hướng dẫn
và tạo điều kiện tốt nhất cho em trong suốt quá trình thực hiện đề tài tốt nghiệp. Chị
Thuỳ Dương, cùng nhóm nghiên cứu, đã tận tình giúp đỡ và chỉ dẫn em trong lúc khó
khăn. Các bạn cùng nhóm nghiên cứu đã chia sẽ và động viên tôi trong quá trình làm
việc chung. Các bạn lớp DN05SH đã cùng nhau học tập suốt thời gian học.

Tp. Hồ Chí Minh, tháng 08 năm 2009

Võ Khánh Hưng

iii


TÓM TẮT
Việc xây dựng cây di truyền virus PRRS có ý nghĩa quan trọng trong dịch tễ
học. Từ cây di truyền ta có thể nhận biết được nguồn gốc phát sinh dịch bệnh, từ đó có
những biện pháp hữu hiệu để phòng chống và ngăn ngừa sự lây lan bệnh ở một số tỉnh
miền Nam Việt Nam. Do đó, đề tài “phân tích trình tự gen ORF5 và ORF7 của virus
gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp (PRRSV) ở một số tỉnh miền nam việt
nam” được thực hiện từ tháng 03/2009 đến tháng 07/2009 tại Viện Nghiên cứu Công
nghệ Sinh học và Môi Trường với kết quả đạt được như sau:
Ly trích và giải trình tự hai khung đọc mở ORF5 và ORF7 trên các chủng virus
tại Đồng Nai, Bà Rịa – Vũng Tàu, Tp.HCM và chủng virus vaccine BSL-PS100.
Trên cây di truyền dựa trên khung đọc mở ORF5 (phần mềm phân tích trình tự
MEGA4.1, nhóm virus PRRS tại Đồng Nai và Tp.HCM thuộc nhóm châu Mỹ, phân
nhóm 2.2, cùng nhóm với chủng virus PRRS độc lực cao của Trung Quốc (99%).
Virus vaccine BSL-PL100 thuộc nhóm châu Mỹ, phân nhóm 2.1. Độ tương đồng giữa
virus tại Đồng Nai và Tp.HCM với virus vaccine BSL-PS100 là 87,9 – 88,6 %.
Trên cây di truyền dựa trên khung đọc mở ORF7 (bằng phần mềm phân tích
trình tự MEGA4.1), nhóm virus PRRS tại Đồng Nai, Bà Rịa – Vũng Tàu và Tp.HCM

thuộc nhóm châu Mỹ, phân nhóm 2.1 và 2.2. Trong đó có hai chủng phân lập từ Bà
Rịa – Vũng Tàu có sự biến đổi lớn so với các chủng thực địa khác (89,5 – 90,3 %) và
chủng vaccine BSL-PS 100 (91,1 %).
Có sự khác biệt về trình tự amino acid trên hai protein, Glycoprotein 5 (ORF5
qui định) và Nucleocapsid protein (ORF7 qui định), giữa virus PRRS ở Đồng Nai, Bà
Rịa – Vũng Tàu và Tp.HCM so với chủng virus vaccine BSL-PS100.

iv


SUMMARY
A phylogenetic tree of porcine reproduction and respiratory virus is very
important to epidemiology. From phylogenetic tree, the origin of epidemic could be
known so that the effective policies established to control and protect the widespread
of reproduction and respiratory virus in Ho Chi Minh City. So, The study “genetic
analysis of porcine reproduction and respiratory virus in South Viet Nam” was carried
out from March 1st 2009 to August 15th 2009 at Research Institute for Biotechnology
and Environment, Nong Lam University. Results obtained from the study:
Isolating and sequencing two open reading frames (ORF) 5 and ORF7 of
porcine reproduction and respiatory virus isolated in Dong Nai, Ba Ria – Vung Tau,
Ho Chi Minh City and virus of vaccine BSL-PS100.
Groups of porcine reproduction and respiratory virus isolated in Dong Nai and
Ho Chi Minh city belong to subgroup 2.2 of North American group and separate from
others in ORF5 phylogenetic tree (use MEGA4.1 software package).
Groups of porcine reproduction and repiratory virus isolated in Dong Nai, Ba
Ria – Vung Tau and Ho Chi Minh city belong to subgroup 2.1, 2.2 of North American
group and separate from others in ORF7 phylogenetic tree (use MEGA4.1).
On Glycoprotein 5 (ORF5) and Nucleocapside protein (ORF7) regions, there
were differences between PRRSV isolated in Dong Nai, Ba Ria – Vung Tau, Ho Chi
Minh city and PRRSV in BSL-PS100 vaccine.

v


MỤC LỤC
TRANG
Lời cảm ơn....................................................................................................................... iii
Tóm tắt............................................................................................................................. iv
Summary........................................................................................................................... v
Danh sách các chữ viết tắt ............................................................................................. viii
Danh sách các bảng ......................................................................................................... ix
Danh sách các hình ........................................................................................................... x
Chương 1 MỞ ĐẦU ......................................................................................................... 1
1.1. Đặt vấn đề.................................................................................................................. 1
1.2. Mục tiêu và yêu cầu................................................................................................... 2
1.2.1. Mục tiêu.................................................................................................................. 2
1.2.2. Yêu cầu ................................................................................................................... 2
1.2.3 Nội dung nghiên cứu ............................................................................................... 2
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU................................................................................ 3
2.1. Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn............................................................. 3
2.2. Virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (prrsv) ................................. 3
2.2.1. Các chủng virus PRRS và sự phân bố của chúng................................................... 3
2.2.2. Cấu trúc phân tử của virus PRRS ........................................................................... 5
2.2.2.1. Cấu trúc virion ..................................................................................................... 5
2.2.2.2. Tổ chức bộ gen của virus PRRS.......................................................................... 6
2.2.2.3. Protein không cấu trúc......................................................................................... 7
2.2.2.4. Protein cấu trúc.................................................................................................... 8
2.3. Một sồ phương pháp chẩn đoán trong phòng thí nghiệm........................................ 11
2.4. Sơ lược các nghiên cứu có liên quan....................................................................... 11
2.4.1. Trên thế giới ......................................................................................................... 11

2.4.2. Trong nước ........................................................................................................... 13
Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU....................................... 14
3.1. Thời gian và địa diểm .............................................................................................. 14
3.2. Vật liệu và hóa chất ................................................................................................. 14
3.2.1. Vật liệu nghiên cứu............................................................................................... 14
vi


3.2.2. Hóa chất................................................................................................................ 14
3.3. Phương pháp tiến hành ............................................................................................ 15
3.3.1. Thu nhận mẫu ....................................................................................................... 15
3.3.2. Ly trích RNA từ huyết thanh................................................................................ 15
3.3.3. Thực hiện phản ứng RT-PCR............................................................................... 16
3.3.4. Điện di sản phẩm PCR ......................................................................................... 18
3.3.5. Giải và phân tích trình tự...................................................................................... 19
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN....................................................................... 23
4.1. Ly trích RNA và RT-PCR từ vaccine BSL-PS100 ................................................. 23
4.2. Thiết lập cây di truyền của virus PRRS dựa trên khung đọc mở ORF5 ................. 24
4.3. Thiết lập cây di truyền của virus PRRS dựa trên khung đọc mở ORF7 ................. 29
4.4. Sự khác biệt về trình tự aa trên GP5 giữa các chủng virus PRRS........................... 34
4.5. Sự khác biệt về trình tự aa trên N protein giữa các chủng virus PRRS .................. 39
4.6. Nhận định chung về dịch tễ PRRSV theo phân tích di truyền trên virus PRRS
ở Đồng Nai, Bà Rịa – Vũng Tàu và Tp.HCM............................................................... 43
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ........................................................................... 45
5.1. Kết luận.................................................................................................................... 45
5.2. Đề nghị .................................................................................................................... 46
5.3. Tài liệu tham khảo ................................................................................................... 47
PHỤ LỤC

vii

DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT
5’NTR
aa
BRVT
cDNA
ctv
DN
dNTP
EAV
EU
GP
LDHV
M protein
MLV
mRNA
N protein
NA
NLS
Nsp
nt
ORF
PCP
PRRS
PRRSV
QN
RNA
RT-PCR
sg mRNAs

SHFV
SP
Tp.HCM
TRS
Ts/Tv
UI
UTR
UV

: 5’ nontranslated region
: amino acide
: Bà Rịa Vũng Tàu
: Complementary deoxyribonucleotide acid
: cộng tác viên
: Đồng Nai
: Deoxyribonucleoside triphosphate
: Equine Arteritis Virus
: Europe
: Glycoprotein
: Lactate Dehydrogenase Elevating Virus
: Membrane protein
: Modified Live Virus
: messenger RNA
: Nucleocapside protein
: North American
: Nuclear Localization Signal
: Non-structural protein
: nucleotide
: Open Reading Frame
: Papain like Cystein Protease

: Porcine Respiratory and Reproductive Syndrome
: Porcine Respiratory and Reproductive Syndrome Virus
: Quảng Nam
: Ribonucleic acid
: Reverse transcriptase – polymerase chain reaction
: subgenomic mRNAs
: Simian Hemorrhagic Fever Virus
: Serine Protease
: Thành phố Hồ Chí Minh
: Transcriptional Regulatory Sequence
: Transition/transvertion
: Unit
: Untranlated Region
: Ultra Violet

viii


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Trang
Bảng 2.1 Tỉ lệ tương đồng về trình tự gen của một số chủng PRRSV ..................... 4
Bảng 3.1 Thành phần hóa chất phản ứng RT-PCR................................................. 17
Bảng 3.2 Các chủng virus trong bệnh phẩm được giải trình tự .............................. 20
Bảng 3.3 Chủng Virus tham chiếu từ Việt Nam ..................................................... 20
Bảng 3.4 Các chủng virus tham khảo trên thế giới ................................................. 21
Bảng 4.1 Phần trăm tương đồng giữa các chủng PRRSV trên ORF5 và ORF7 ..... 34

DANH SÁCH CÁC HÌNH
TRANG
Hình 2.1 Cây phân bố giống, loài của một số chủng PRRSV ................................. 4

Hình 2.2 Cấu trúc virus PRRS .................................................................................. 5
Hình 2.3 Tổ chức genome và mô hình nhân bản của virus PRRS............................ 7
Hình 2.4 Vùng chức năng và vị trí cắt trên ORF1a và ORF1b ................................ 8
Hình 3.1 Sản phẩm sau điện di của phản ứng RT-PCR.......................................... 18
Hình 4.1 Kết quả RT-PCR 2 đoạn gen ORF5 và ORF7......................................... 23
Hình 4.2 Cây di truyền vùng ORF5 dạng không gốc ............................................. 25
Hình 4.3 Cây di truyền vùng ORF5 dạng cây......................................................... 26
Hình 4.4 Cây di truyền vùng ORF7 dạng không gốc ............................................ 30
Hình 4.5 Cây di truyền vùng ORF7 dạng cây........................................................ 31
Hình 4.6 Bảng sắp gióng hàng trình tự amino acid GP5 ........................................ 36
Hình 4.7 Sự đa dạng của các acid amin trong vùng GP5 ....................................... 37
Hình 4.8 Bảng Sắp gióng hàng trình tự aa N protein của các chủng PRRSV ........ 40
Hình 4.9 Đồ thị biểu hiện tính hiếu nước của các aa trên vùng N protein ............. 40
Hình 4.10 Sự đa dạng của các acid amin trong vùng N Protein ............................. 42
Hình 4.11 Tình hình bệnh PRRS tại Việt Nam 2007-2008 .................................... 44
ix


Chương 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Trong cơ cấu kinh tế nông nghiệp ở nước Việt Nam, chăn nuôi chiếm hơn 21%
giá trị sản xuất nông nghiệp, trong đó chăn nuôi heo chiếm 60% giá trị sản xuất toàn
ngành. Tổng đàn heo Đông Nam Bộ là 2,63 triệu con, trong đó Đồng Nai chiếm
41,83% (hơn 1 triệu con) và TP.HCM chiếm 12,05% (hơn 317 ngàn con) (Cục Chăn
nuôi, 2008).
Dịch bệnh hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp trên heo (PRRSV) (hay còn
gọi là bệnh heo tai xanh) ảnh hưởng nghiêm trọng đến ngành chăn nuôi, vì đối tượng
mắc bệnh PRRS tập trung nhiều vào heo nái (Nguyễn Thanh Sơn - phó cục trưởng Cục
Chăn nuôi) (Nguồn: VietNamNet.vn 17/04/08). Trong năm 2009, dịch bệnh bùng phát

trở lại ở cả 3 miền với không dưới 10 địa phương, trong đó phía Nam có 5 tỉnh: Bạc
Liêu, Vĩnh Long, Sóc Trăng, Bà Rịa – Vũng Tàu, Bình Phước. Trong bối cảnh phần
lớn các sản phẩm động vật tiêu thụ tại TPHCM là từ các tỉnh lân cận nên nguy cơ dịch
bệnh xảy ra trên địa bàn TP HCM và các tỉnh lân cận hiện tại là rất cao và khó kiểm
soát (Huỳnh Hữu Lợi, Chi cục trưởng Chi cục Thú y TPHCM) (Nguồn: SGGP,
17/07/2008).
Việc phân tích di truyền giúp hiều rõ hơn về nguồn gốc căn bệnh, các yếu tố
nguy cơ dẫn đến sự phát sinh và lan truyền của dịch bệnh (Nguyễn Ngọc Hải, 2007).
Qua đó, quan sát sự biến đổi và phân loại các chủng virus PRRS và giúp đánh giá
được hiệu quả sử dụng vaccine và công tác phòng chống bệnh.
Do tầm quan trọng của việc đánh giá sự biến đổi của virus PRRS, chúng tôi
thực hiện đề tài “phân tích trình tự gen ORF5 và ORF7 cỦa virus gây hội chứng rối
loạn sinh sản và hô hấp (PRRSV) ở một số tỉnh miền nam việt nam” tạo tiền đề cho
các nghiên cứu sâu về dịch tễ học phân tử virus PRRS, đóng góp vào chiến lược phòng
và trừ bệnh.

1


1.2. Mục tiêu và yêu cầu
1.2.1. Mục tiêu
Bước đầu xác định sự hiện diện, phân bố chủng, và sự biến đổi di truyền của
virus PRRS tại một số tỉnh phía Nam Việt Nam dựa trên phân tích trình tự nucleotide
và trình tự acid amin (aa) trên các khung đọc mở ORF5 và ORF7.
1.2.2. Yêu cầu
Thu nhận mẫu bệnh phẩm.
Nắm vững các nguyên lý, quy tắc ly trích RNA, phản ứng RT-PCR
Xử lý số liệu trình tự khung đọc mở ORF5 và ORF7 bằng phần mềm tin sinh học, đưa
ra ý kiến nhận xét về các số liệu trên.
1.2.3. Nội dung nghiên cứu

Nghiên cứu trình tự khung đọc mở ORF5 và ORF7 của virus PRRS phân lập tại
Đồng Nai, Bà Rịa – Vũng Tàu, Tp.HCM và vaccine PRRS, BSL-PS100.
Phân tích di truyền của các chủng virus trên dựa vào khung đọc mở ORF5 và
ORF7 và so với virus trong vaccine BSL-PS100.
Phân tích trình tự amino acid, vùng chức năng, đặc tính kháng nguyên của các
protein, do 2 khung đọc mở ORF5 và ORF7 qui định, của virus PRRS thực địa và so
với chủng virus vaccine BSL-PS100.

2


Chương 2
TỔNG QUAN
2.1. Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn
Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp (PRRS) là bệnh xảy ra trên lợn với đặc
điểm gây sảy thai ở lợn nái và rối loạn đường hô hấp trên lợn sơ sinh và lợn choai
(Christianson và ctv, 1992). Bệnh được phát hiện lần đầu tiên ở Bắc Mỹ vào khoảng
năm 1987, sau này được tìm thấy ở Châu Âu (Albina, 1997), Pháp, Tây Ban Nha,
Canada và ở Châu Á vào đầu những năm 1990 (Murakami và ctv, 1994; Shimizu và
ctv, 1994). Cho đến nay, PRRS đã lan rộng trên các vùng khắp thế giới với những
đặc trưng của từng chủng khác nhau trên từng vùng, gây ra những thiệt hại kinh tế
nặng nề hàng năm (Albina, 1997; Blaha, 2000; Gao, 2004). Ở Việt Nam, bệnh được
phát hiện vào năm 1997 trên đàn lợn nhập từ Mỹ (10/51 con có huyết thanh dương
tính). Các nghiên cứu về bệnh trên những trại lợn giống tại các tỉnh phía Nam cho thấy
tỷ lệ lợn có huyết thanh dương tính với bệnh rất khác nhau, từ 1,3% cho tới 68,29%. Ở
các nước khác, tỷ lệ đàn trong vùng bệnh có huyết thanh dương tính rất cao, như ở
Anh là 60-75%, Mỹ là 36% (Phòng Dịch Tễ – Cục Thú y, 2007)
2.2. Virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (PRRSV)
PRRS do Arterivirus gây nên – loại virus này được phân lập và định loại vào
năm 1991, được xếp vào loài Nidovirales, họ Arteriviridae, giống Arterivirus, gần với

equine arteritis virus (EAV), Lactic Dehydrogenase virus (LDHV) và simian
hemorrhagic fever virus (SHFV) (Dea và ctv, 2000), có kích thước vào khoảng 5070nm, chịu được nhiệt độ thấp (tồn tại 4 tháng dưới nhiệt độ -70oC).
2.2.1. Các chủng virus PRRS và sự phân bố của chúng
Hiện nay, virus PRRS đã được xác lập với 2 kiểu gen chính là kiểu gen có
nguồn gốc từ châu Âu (EU) và kiểu gen có nguồn gốc từ châu Mỹ (NA) (Meulenberg
và ctv, 1993). Việc so sánh trình tự gen đã cho thấy sự khác biệt di truyền quan trọng
giữa hai nhóm này. Ở Bắc Mỹ chỉ tìm thấy kiểu gen NA, mặc dù cũng có một số báo
cáo đã cô lập được kiểu gen EU (Ropp, 2004). Ở Châu Âu thì kiểu gen EU trội hơn và
cho đến năm 1998 vẫn chưa có chủng nào thuộc kiểu gen NA được xác lập ở phía Tây
Châu Âu (Madsen và ctv, 1998). Ở Châu Á và Nam Mỹ cả hai kiểu gen trên đã được
3


xác lập. Tuy nhiên bên trong mỗi kiểu gen lại có sự khác nhau giữa các chủng. Sự
khác nhau giữa các chủng được cho thấy trong Bảng 2.1 và Hình 2.1 bên dưới.
Bảng 2.1 Tỉ lệ tương đồng về trình tự gen của các chủng virus PRRS
Chủng
Nguồn gốc
Tỉ lệ
VR2332
Mỹ
100
Taiwan
Đài Loan
97
807/94
Canada
92
Olot
Tây Ban Nha

66
110
Newtherland
66
Dòng châu Mỹ (VR2332, Taiwan, 807/94) và dòng chủng châu Âu (Olot, I10)

( />
Hình 2.1 Cây phân bố di truyền của một số chủng PRRSV dòng Châu Âu và châu Mỹ
( />Hình 2.1 mô tả cây phân bố giống, loài của PRRSV theo số liệu trong bảng 2.1
trên. Trong đó có hai kiểu gen dòng châu Mỹ (với chủng VR2332 phân lập tại Mỹ,
chủng 807/ 94 Canada và Taiwan Đài Loan) và kiểu gen châu Âu (với chủng I10 ở
Hàlan và chủng Olot Tây ban nha). Sự khác nhau giữa các chủng phụ thuộc vào sự
khác nhau trong chuỗi trình tự nuceotide hay chuỗi hợp chất hữu cơ của protein trong
từng chủng virus.
2.2.2. Cấu trúc phân tử của virus PRRS
2.2.2.1. Cấu trúc virion
PRRSV là virus có vỏ bao, đường kính khoảng 50-70 nm. Virion của PRRSV
gồm 3 cấu phần, khác nhau về hình thái. Thứ nhất, bộ gen là RNA sợi đơn (+) nằm
4


trong nhân. Thứ hai là vỏ capsid bao bọc bộ gen của virus. Cấu trúc thứ ba là vỏ bao
ngoài, đây là màng lipid chứa glycoprotein virus và phức hợp protein (Conzelmann,
1993) gồm: protein xuyên màng M (integral membrane protein) tạo phức hợp với
glycoprotein virus chính - GP5 (major viral glycoprotein- GP5) xung quanh nhân. Hai
glycoprotein virus khác (GP2 và GP4) cũng đựơc gắn với màng và hiện diện ít hơn so
với GP5 (Nelson và ctv, 1995). Một glycoprotein virus thứ tư (GP3) được mô tả như
một phần của cấu trúc virion trên dòng virus PRRS dòng châu Âu Lelytad (Nieuwstadt
và ctv, 1996) trong khi chủng virus PRRS dòng châu Mỹ tại Quebec người ta cho rằng
GP3 được biểu hiện như protein không cấu trúc hoà tan (Mardassi và ctv, 1998).

Hình 2.2 Cấu trúc virus PRRS (LEE, KANG MI, 2007)
2.2.2.2. Tổ chức bộ gen của virus PRRS
Chuỗi hệ gen đầy đủ của virus PRRS được xác lập vào năm 1993, nó có kích
thước khoảng 15,1 đến 15,5 kb và chứa 8 khung đọc mở nằm bên sườn hai vùng
không dịch mã (untranslate region - UTR) 5’UTR và 3’UTR, và có cấu trúc mũ methyl
tại đầu 5’ và đuôi poly (A) tại đuôi 3’ (hình 2.2). Ngoài ra, một khung đọc mở bên
trong (internal ORF) được tìm thấy trên ORF2 của virus PRRS (Snijder và ctv, 1999).
ORF 1a và 1b định vị xuôi dòng từ đầu 5’-UTR, nó chiếm giữ khoảng 75% của bộ
gene và ghi mã protein không cấu trúc, liên quan đến sự nhân bản của virus
(Meulenberg và ctv., 1997; Dinten và ctv., 1999). ORF1a được dịch mã trực tiếp
trong khi ORF1b được dịch bởi khung dịch chuyển ribosomal. Chuỗi protein ORF1ab
liên quan đến sự sao chép virus và bộ phận bản sao (Allende và ctv, 1999). ORF 2-7
5


định vị ngược dòng từ 3'-UTR, mã hóa một loạt các protein cấu trúc của virus như:
protein vỏ ngoài (E) và protein vỏ nhân capsid (N) (Nucleocapside protein) (Nelson và
ctv, 1995). Các protein này đều được dịch mã từ một 3’ UTR được định vị cố định trên
các đoạn subgenomic mRNAs (sg mRNAs) (Eric và Janneke, 1998). Các sg mRNAs
đựơc sản xuất thông qua sự sao mã mRNA không liên tục. Trình tự “leader” chung thu
được từ đầu 5’ của genomic mRNA được gắn với trình tự thân 3’ (3' terminal body
sequence), đây là trình tự không liên tục trong bộ gen (Meulenberg và ctv., 1993). Sự
liên kết giữa “leader” và vùng thân của sg mRNA được hình thành nhờ “trình tự điều
hoà dịch mã” liên ứng (consensus “transcriptional regulatory sequence” - TRS) đây là
yếu tố điều khiển quan trọng cho biểu hiện gen cấu trúc. Sg mRNA chia sẻ đuôi 3’ của
nó, nhưng chỉ ORF đầu tiên tại đầu 5’ của mỗi bản sao được dịch mã bằng việc dùng
TRS như một promoter (Yuan và ctv., 2004).

Hình 2.3 Tổ chức bộ gen và mô hình nhân bản của virus PRRS

(Nguồn: Snijder, 1998). (a) Bộ cấu trúc lồng vào nhau của RNA
arterivirus; (b) sự sao mã không liên tục xảy ra trong quá trình tổng
hợp RNA sợi (+); (c) mô hình khác kết hợp chặt chẽ với sự tổng hợp
RNA sợi (-) không liên tục. (+) sợi dương; (-) sợi âm.

2.2.2.3. Protein không cấu trúc
Sản phẩm của ORF1 được phát hiện trong tế bào nhiễm virus nhưng không tìm
thấy trong virion, vì vậy chúng được xem là những protein không cấu trúc. ORF1a và
ORF1b chiếm 75 % vùng 5’ terminal của bộ gen, ghi mã protein không cấu trúc, trong
khi những ORF còn lại ghi mã protein cấu trúc. ORF1a và ORF1b được dịch mã thành
6


2 polyprotein lớn như mô hình của EAV (Dinten và ctv, 1999), những polyprotein này
lần lượt bị cắt tại 10 vị trí và sau cùng tạo thành 12 sản phẩm, gồm nsp1-nsp8 và nsp9nsp12. Những nsp này có hoạt tính protease (Snijder và Meulenberg, 1998; Ziebuhr
và ctv., 2000) và những hoạt tính liên quan đến sự sao chép. Những vùng protease nằm
trên Nsp1, Nsp2 và Nsp4 và vị trí cắt của nó đựơc bảo tồn giữa những chủng thuộc họ
Arteriviruses (Allende và ctv., 1999).
Nsp1 protease đuợc xếp như cystein protease giống papain (papain like cystein
protease - PCP). Nsp2 protease tương tự như nhóm protease giống papain (papain like
protease) nhưng nó có những đặc tính riêng biệt như hoạt tính protease systeine tự
phân cắt (Snijder, 1998) nên được xếp vào nhóm

“chymotrypsin-like (3C-like)

cysteine protease” (Snijder và ctv, 1995). Theo Pedersen và ctv (1999) nsp2 và nsp3
liên quan đến sự cảm ứng hình thành những túi màng kép (double-membrane vesicle).
Hơn nữa, theo Oleksiewicz và ctv, (2001) nsp2 và nsp3 mang tính kháng nguyên cao.
Gene nsp2 cho thấy sự đa dạng di truyền cao nhất trong bộ gen virus, cũng như tính đa
hình về kích thuớc đáng kể, gồm sự xen vào 108 base và sự mất 3-333 base (Fang và

ctv, 2004). Điển hình, theo Tian và ctv. (2007) những chủng Trung Quốc mang mầm
bệnh cao, có sự mất không liên tục 90 base được báo cáo như là một chỉ thị phân tử
(marker) di truyền dịch tễ. Theo Gorbalenya và Snijder (1996), báo cáo Nsp4 có
những đặc điểm giống “3C-like serine protease” (SP).

Hình 2.4 Vùng chức năng và vị trí cắt trên ORF1a và ORF1b dòng PRRSV
1624B ( Nguồn: Snijder, 1998). ( )Vị trí cắt dự đoán bên trong ORF; (Nsp1)
Papain-like protein; (C) Chymotrypsin-like serine protease; (Zf) Zinc finger; (H)
Helicase; (*) Codon kết thúc.

7


2.2.2.4. Protein cấu trúc
Hạt virus của PRRSV đuợc cấu thành từ 7 protein gồm 4 protein vỏ (envelope
glycoprotein) là GP2a (ghi mã bởi ORF2a); GP3 (ORF3); GP4 (ORF4) và GP5
(ORF5); protein màng, M (ORF6); protein vỏ nucleocapsid, N (ORF7); và protein vỏ
ngoài, E (ORF2b) (Hình 2.2). Thành phần protein cấu trúc chính trong hạt virus là
protein N (14-15 kDa), M (18-19 kDa) và GP5 (24-26 kDa) (Dea S và ctv, 2000;
Rowland, 2003).
Protein vỏ nucleocapsid, N (14–15 kDa) của PRRSV, được qui định bởi ORF7,
là non-glycosylated protein, không chứa peptide tín hiệu (signal peptide), có 123 hay
128 aa tương ứng với 2 chủng của PRRSV: VR2332 hay Lelystad (Mardassi và ctv,
1996). Protein N của virus PRRS dòng châu Mỹ và dòng châu Âu chỉ giống nhau
khoảng 63 % về mặt aa, nhưng chúng có vùng kháng nguyên chung giữa aa vị trí 52
và 69 (Meulenberg và ctv, 1998; Wootton và ctv, 1998). Protein N mang tính kháng
nguyên cao và là protein đa dạng nhất trong hạt virus, và đựơc dùng trong chuẩn đoán
(Casal và ctv., 1998; Yang và ctv., 2000). Protein N mang vùng chức năng gắn RNA
đuợc xem là giữ vai trò quan trọng trong sự sao chép (Rowland, 2003). Phân tích tình
tự N protein của các chủng dòng châu Mỹ xác định 2 trình tự tín hiệu định vị nhân

(nuclear localization signal - NLS) nằm tại vị trí aa 10-13 và 41-42, đựơc đánh dấu
theo thứ tự là NLS-1 và LNS-2. Sự thay thế aa lysine quan trọng với những aa không
mang điện tích trong NLS-2 dẫn đến khoá sự định vị nhân hay hạch nhân. Vùng aa
E51KPHFP LA58 được xem là mang tính trội miễn dịch cao, và bảo tồn giữa các chủng
dòng châu Mỹ và dòng châu Âu.
Protein GP5 (~ 26 kDa), do ORF5 qui định, là protein biến đổi nhiều nhất giữa
các chủng PRRSV. Dù có sự biến đổi giữa các chủng, nhưng dữ liệu tính kị nước của
protein GP5 giống nhau (Andreyev, 1997). Vùng N-terminus của GP5 dự đoán chứa
peptide tín hiệu, theo sau vùng hiếu nước. Vùng chức năng này nằm trên bề mặt ngoài
của virion và gồm 40 aa đầu tiên. Ostrowski và ctv (2002) xác định vùng chức năng
trung hoà (neutralizing epitope) và không trung hoà (non-neutralizing epitope) nằm
trên vùng bề mặt (ectodomain) thuộc GP5 của virus PRRS. Vùng chức năng không
trung hoà được xem như là một vùng chức năng bẫy (decoy epitope) (aa vị trí 27 đến
30), gây ra đáp ứng miễn dịch không phòng vệ sớm và mạnh, ảnh hưởng đến đáp ứng
với vùng chức năng trung hoà (aa vị trí 37 đến 45). Vùng ectodomain, theo sau bởi
8


vùng kị nước, chứa 2 đến 4 vị trí N-linked glycosylation. Sự N-linked glycosylation
của protein màng có chức năng khác nhau trong glycoprotein virus như sự gắn với
receptor (receptor binding), dung hợp màng (membrane fusion), sự xâm nhập vào tế
bào, và sự sinh sôi của virus ( Braakman, 2000; Doms, 1993). Cụ thể, theo Wissink và
ctv (2004) nghiên cứu 2 vị trí N-linked glycosylation (N46 và N53) trên GP5 của virus
PRRS dòng châu Âu, Lelystad, tương đương với vị trí N44 và N51 trên các chủng
thuộc dòng châu Mỹ, sự glycoside hoá của aa vị trí N46 được yêu cầu mạnh mẽ cho
việc sản xuất hạt virus. Cụ thể, những đột biến trong đó những codon cho mỗi aa
asparagine tương ứng được thay thế bởi codon cho aa glutamine: GP5-N46Q, GP5N53Q và GP5 - đột biến với cả hai vị trí trên. Kết quả là, đột biến GP5-N46Q giảm sự
hình thành hay phóng thích những hạt virus. Số lượng virus giảm khoảng 100 lần nếu
đột biến tại vị trí N46. Cụ thể, thể đột biến GP5-N53Q cho thấy giảm nhẹ số đại thực
bào dương tính (tương đương 70% so với thể PRRSV không đột biến). Trong khi đó,

thể đột biến GP5-N46Q và thể đột biến ở cả hai vị trí (N46Q và N53Q) giảm đáng kể
số đại thực bào dương tính (tương đương 1 – 2 % so với thể PRRSV không đột biến)
cho thấy những đột biến này ảnh hưởng đến khả năng sinh sản của virus gây nhiễm.
Protein GP5 và M (18–19 kDa) kết hợp chặt chẽ với nhau và tạo ra phức hợp
“heterodimeric” được liên kết bằng cầu nối disulfide trong hạt virion (Mardassi, 1996).
Người ta cho rằng sự hình thành “heterodimer” này cần thiết cho sự lắp ráp của virus
PRRS, vì khi không có sự tạo thành phức hợp này do sự vắng mặt hoặc là protein GP5
hoặc là protein M thì không có những hạt virus được giải phóng. Tuy nhiên, sự phá vỡ
cấu trúc “dimer” giữa protein GP5 và M không giảm tính gây nhiễm của virus giống
như LDV và EAV (Lee C và ctv, 2005). Protein M được xem là có vai trò thiết yếu
cho miễn dịch tế bào đối với virus PRRS vì nó gây ra đáp ứng mạnh nhất trong tất cả
protein cấu trúc của virus PRRS trong đáp ứng kháng nguyên đặc hiệu (antigenspecific proliferation responses) (Bautista, 1999).
Qua phân tích gen và theo dõi sự thay đổi trình tự nucleotide của các dòng virus
PRRS người ta đã xác định rằng ở virus PRRS dòng châu Mỹ, các khung đọc mở
ORF7 và ORF6 có tính ổn định rất cao, chúng gần như không thay đổi trong suốt quá
trình tiến hoá của các dòng virus này. Tuy nhiên sự khác biệt giữa dòng virus PRRS
châu Âu và Châu Mỹ ở 2 khung đọc mở này là rất rõ, cụ thể, sự tương đồng về trình tự
aa của ORF7 giữa 2 dòng virus này chỉ vào khoảng 57 đến 59% và của ORF6 là 70
9


đến 81%. Trong khi đó khung đọc mở ORF5 lại biến đổi nhiều giữa các chủng trong
cùng một dòng châu Mỹ (giống nhau chỉ từ 88 đến 97%) và chỉ tương đồng với dòng
châu Âu khoảng từ 51 đến 59% (Nguyễn Ngọc Hải, 2007).
Thành phần protein cấu trúc khác trong hạt virion PRRSV là protein GP2 (29–
30 kDa), GP3 (41–50 kDa), và GP4 (31–35 kDa) và protein vỏ E (10 kDa). Protein
GP2, GP3 và GP4 được nhận định là tương tác với những protein cấu trúc khác và
được lắp ráp vào hạt virion như phức hợp “multimeric” (Lee và ctv., 2005). Cấu trúc
phức hợp này mang chức năng xâm nhập của virus vì những hạt virus thiếu protein vỏ
này không thể gây nhiễm (Wissink, 2005). Lee và ctv (2006) cho rằng protein E cùng

với những protein vỏ thứ yếu khác hình thành một kênh làm cho việc cỡi áo của virus
trở nên dễ dàng, giúp phóng thích bộ gen của virus vào tế bào chất vật chủ. Protein
GP3 của dòng châu Âu kết hợp chặt chẽ vào virion, trong khi protein GP3 của dòng
Châu Mỹ là một protein ẩn và có thể hoà tan (Mardassi, 1998). Sự tương đồng về trình
tự aa qui định bởi các khung đọc mở ORF 2, 3 và 4 giữa các dòng châu Mỹ và châu Âu
tương ứng chỉ ở mức độ từ 63, 58 và 68 % (Nguyễn Ngọc Hải, 2007).
2.3. Một số phương pháp chẩn đoán trong phòng thí nghiệm
Chẩn đoán PRRSV trên môi trường nuôi cấy tế bào.
Phương pháp kháng thể huỳnh quang (Fluorescent Antibody Staining - FA) và
hoá mô miễn dịch (immunohistochemistry staining - IHC).
Kỹ thuật miễn dịch peroxidase một lớp(Immunoperoxidase Monolayer Asssay)
Kỹ thuật huỳnh quang gián tiếp (Indirect Immunoflourescence assay – IFA)
Kỹ thuật RT-PCR chẩn đoán PRRSV
Kỹ thuật RT-PCR có độ đặc hiệu và độ nhạy cao, thời gian cần thiết thực hiện
xét nghiệm ngắn vì thế đựơc dùng rộng rãi trong chẩn đoán phát hiện PRRSV. Để gia
tăng độ nhạy trong chẩn đoán PRRSV có thể dùng kỹ thuật nestesd RT-PCR (RTnPCR). RT-PCR được thực hiện với các cặp mồi khác nhau cho phép phát hiện gen
của các ORF7, ORF6 hay ORF1b của PRRSV. Virus PRRSV có 2 dòng: Châu Âu và
Châu Mỹ. Hai dòng này có độ tương đồng về gen khoảng 52 đến 81 %. Dựa trên cở sở
đó nhiều cặp mồi đã được thiết kế đề phát hiện PRRSV nói chung và để phân biệt
dòng virus PRRS châu Mỹ với châu Âu (Nguyễn Ngọc Hải, 2007).

10


2.4. Sơ lược các nghiên cứu có liên quan
2.4.1. Trên thế giới
Youjun và ctv (2007) xác định những chủng PRRSV phân lập từ vùng dịch ở
Việt Nam và Trung Quốc năm 2007. Năm chủng PRRSV gồm một chủng từ Việt Nam
(07QN) và bốn chủng phân lập từ Trung Quốc năm 2007 (07HEBTJ, 07BJ, 07HEN,
07NM) đã được giải trình tự toàn bộ bộ gen. Phân tích quan hệ di truyền cho thấy

chủng 07QN giống nhau 99% với PRRSV phân lập tại Trung Quốc về trình tự
nucleotide. Mối quan hệ di truyền dựa trên toàn bộ bộ gen của các chủng trên cho thấy
rằng tất cả chủng virus phân lập này thuộc cùng nhóm trong nhóm 2 (dòng châu Mỹ)
và tương đồng với các chủng phân lập tại Trung Quốc trước đó.
Năm 2002, Ostrowski và ctv xác định vùng chức năng trung hoà và không trung
hoà trên vùng ectodomain GP5 của PRRSV. Vùng chức năng không trung hoà được
xem như là một vùng chức năng bẫy (decoy epitope) (aa vị trí 27 đến 30), gây ra đáp
ứng miễn dịch không phòng vệ sớm và mạnh và giấu hay làm yếu đáp ứng với vùng
chức năng trung hoà (aa vị trí 37 đến 45).
An và ctv. (2007) phân tích và so sánh những trình tự aa trên GP5 của 42 chủng
virus PRRS phân lập tại Trung Quốc năm 1996 và 2006. Đã phát hiện rằng tất cả các
chủng phân lập tại Trung Quốc đều thuộc dòng châu Mỹ. Giữa chúng có 2 phân nhóm
có sự thay đổi cao và phân biệt rõ trên cây di truyền của dòng châu Mỹ. Tất cả phân
nhóm 2 của dòng châu Mỹ đều đa dạng cao trên vùng chức năng trung hoà sơ cấp và
những chủng virus này giới hạn trong phía Nam Trung Quốc. Những chủng thuộc
phân nhóm 1 của dòng châu Mỹ giống nhau cao với chủng vaccine RespPRRSV MLV
và chủng gốc của vaccine MLV, VR-2332.
Wissink và ctv (2004) nghiên cứu vai trò của N-linked glycosylation trên
protein GP2a và GP5 của chủng PRRSV LV. Cả hai glycoprotein đều được dự đoán
chứa vị trí N-glycosylation và bảo tồn cao giữa chủng. Kết quả cho thấy
oligosaccharide liên kết với N46 của protein GP5 cần cho sự sản xuất hạt virus và hoạt
tính gây nhiễm. Thiếu một hoặc cả hai oligosaccharide trên GP2a hay oligosaccharide
gắn với N53 của GP5 không ảnh đáng kể đến hoạt tính gây nhiễm của virus.
Nghiên cứu sự ảnh hưởng của N-Linked glycosylation trên GP5 của virus
PRRS trên tính gây nhiễm, tính sinh kháng nguyên, và khả năng kích ứng tạo kháng
thể trung hoà. Ba vị trí N-linked glycosylation (N34, N44, và N51) nằm trên
11


ectodomain GP5 của những chủng dòng châu Mỹ. Kết quả cho thấy N44 là aa thiết

yếu nhất cho tính lây nhiễm. Những virus mang đột biến tại N34, N51, và N34/N51
phát triển ở nồng độ thấp hơn so với chủng PRRSV không đột biến. Trong phân tích
trung hoà huyết thanh, virus đột biến nhạy với sự trung hoà bằng kháng thể đặc hiệu
PRRSV hoang dại. Việc mất những vị trí glycan này trên ectodomain của GP5 làm
tăng độ nhạy của những virus này với sự trung hoà in vitro và tính sinh miễn dịch của
vùng chức năng trung hoà gần đó (Israrul và ctv, 2006) .
Nghiên cứu sự biến đổi về mặt phân tử trên protein vỏ capsid (ORF7) của virus
PRRS cho thấy hai dòng virus PRRS, châu Âu và châu Mỹ khá giống nhau. Các chủng
thuộc dòng châu Âu bảo tồn cao giữa các chủng. Phân tích sự thay thế aa và nt trên
ORF7 của virus PRRS cho thấy có bốn vùng bảo tồn cao. Không có đột biến cố định
nào trên ORF7 được xác định (Gall và ctv, 1998).
Raymond và ctv (2003) phân tích trình tự aa N protein của các chủng dòng châu
Mỹ và xác định hai trình tự tín hiệu định vị nhân (nuclear localization signal (NLS)
nằm trên vị trí aa 10-13 (NLS-1) và 41-72 (NLS-2). Đồng thời tiến hành thay thế vị trí
aa quan trọng lysine với aa không mang điện tích trong NLS-2 dẫn đến khoá sự định vị
nhân và hạch nhân. Trình tự bên trong NLS-2, KKNKK, hình thành vùng định vị lõi
bên trong của NLS-2.
2.4.2. Trong nước
Xác định tỷ lệ nhiễm virus PRRS tại một số cơ sở chăn nuôi heo miền Đông
Nam Bộ. Khảo sát tiến hành trên 1082 mẫu huyết thanh thu thập từ 21 trại chăn nuôi
công nghiệp và hộ chăn nuôi của hai tỉnh/thành thuộc miền Đông Nam bộ trong các
năm 2003 – 2005. Xác định tỷ lệ nhiễm và chủng PRRS dựa vào sự phát hiện kháng
thể kháng vi rut PRRS bằng kỹ thuật ELISA (Trần Thị Dân và ctv, 2007).
Khảo sát bước đầu các biểu hiện lâm sàng và bệnh tích đại thể bệnh tai xanh ở
lợn (PRRS) tại một số địa phương vùng đồng bằng Bắc bộ (Lê Văn Năm, 2007)
Nguyễn Ngọc Hải và ctv (2007 ) chẩn đoán virus gây hội chứng rối loạn sinh
sản và hô hấp trên heo (PRRS) bằng kỹ thuật RT – PCR, thực hiện với cặp mồi Rovira
1 và Rovira 2 (Rovira, 2000), và cặp mồi P1, P2 (Donadeau, 1999) nhằm phát hiện
virut PRRS trong huyết thanh, tinh dịch, mô phổi, mô hạch.

12


Chương 3
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Thời gian và địa điểm
Đề tài được thực hiện từ tháng 05/2009 đến tháng 08/2009 tại Viện nghiên cứu
Công nghệ Sinh học và Môi trường Đại học Nông lâm Tp Hồ Chí Minh.
3.2.3. Vật liệu và hóa chất
3.2.1. Vật liệu nghiên cứu
Mẫu huyết thanh từ những cá thể heo nghi ngờ bị nhiễm virus PRRS tại
Tp.HCM Đồng Nai, Bà Rịa – Vũng Tàu.
Vaccine PRRSV BSL-PS 100 của hãng Besta, Singapor.
3.2.2. Hóa chất
Hoá chất dùng trong ly trích RNA tổng số:
Bộ kit QIAamp Viral RNA Mini Kit gồm: Cột lọc RNA, ống thu nhận (2 ml),
dung dịch đệm AVL, dung dịch đệm AW1, dung dịch đệm AW2, dung dịch đệm
AVE, carrier RNA (poly A)
Hoá chất và dụng cụ trong điện di gel TBE:
Dung dịch đệm TBE 10X (Promega)
Agarose (Promega)
Dung dịch nạp mẫu (loading dye) 6X (Promega)
Dung dịch ethidium bromide (invitrogen).
Thang DNA chuẩn.
Hoá chất dùng trong phản ứng RT-PCR:
Bộ kit QIAGEN OneStep RT-PCR gồm: QIAGEN OneStep RT-PCR Enzyme
Mix, QIAGEN OneStep RT-PCR Buffer 5X, dNTP Mix, RNase-free water
Thiết bị và dụng cụ:
Tủ cấy vô trùng
Máy ly tâm (Mikro Z2K/ Sigma 3K30C)

Tủ -700C ( Sanyo Ultra Low)
Tủ mát 40C, tủ -20oC
Máy chụp gel (Biorad)
13


Máy PCR (BioRad)
Bộ nguồn và bồn điện di
Micropipet, đầu tip và eppendorf
3.3. Phương pháp tiến hành
3.3.1. Thu nhận mẫu
Mẫu máu được thu nhận từ những heo có biểu hiện lâm sàng nghi nhiễm virus
PRRS (sẩy thai, heo con sinh ra chết, heo sau cai sữa có biểu hiện sốt cao, bỏ ăn). Sau
đó, mẫu máu được để đông tự nhiên và thu lấy phần huyết thanh bên trên. Phần huyết
thanh được trữ đông ở -700C cho đến khi ly trích.
3.3.2. Ly trích RNA từ huyết thanh
Quy trình ly trích RNA theo bộ kit QIAamp Viral RNA Mini Kit
Ổn định mẫu ở điều kiện nhiệt độ phòng (15 – 250C)
Ổn định buffer ở nhiệt độ phòng.
Kiểm tra buffer AW1 và AW2 đã pha và để ổn định ở nhiệt độ phòng.
Hoà tan lại khối kết tủa Buffer AVL/Carrier RNA bằng nhiệt nếu cần thiết và
giữ ở nhiệt độ phòng trước khi sử dụng.
Tất cả các bước ly tâm đều thực hiện ở nhiệt độ phòng.
Bước 1: Cho 560 µl Buffer AVL có chứa Carrier RNA vào một tube 1.5 ml.
Bước 2: Cho 140 µl mẫu vào tube có chứa buffer ở trên. Vortex nhẹ để trộn đều
trong 15 giây. Nếu mẫu cần phải rã đông thì chỉ nên rã đông một lần.
Bước 3: Ủ ở nhiệt độ phòng (15-250C) trong vòng 10 phút (thời gian hơi kéo
dài hơn một chút).
Bước 4: Ly tâm nhẹ.
Bước 5: Thêm 560 µl ethanol (96-100%), vortex nhẹ trong 15 giây, sau đó ly

tâm nhẹ để mẫu dính bên trên rơi xuống.
Bước 6: Hút 630µl dịch ở trên cho vào QIAamp spin column (trong một tube
2ml). Chú ý không làm dính vành, đóng nắp, ly tâm với tốc độ 6000 x g (8000 vòng)
trong 1 phút. Cho QIAamp spin column vào một tube 2 ml sạch và loại bỏ tube có
chứa dịch lọc. (có thể ly tâm với tốc độ cao hơn ).
Bước 7: Mở QIAamp spin column và lặp lại bước 6.
Bước 8: Mở nắp QIAamp spin column một cách cẩn thận và thêm 500 µl
Buffer AW1, đóng nắp lại và tiến hành ly tâm với tốc độ 6000 x g (8000 vòng) trong 1
14


phút. Lấy QIAamp spin column và cho vào một tube 2 ml mới. Bỏ tube có chứa dịch
đi.
Bước 9: Mở nắp QIAamp spin column một cách cẩn thận, thêm 500 µl buffer
AW2, đóng nắp lại và ly tâm với tốc độ 20000 x g (14000 vòng) trong 3 phút. Có thể
thực hiện ngay bước 10 hay thực hiện bước 9a.
Bước 9a: Chuyển QIAamp spin column vào một tube 2 ml mới, loại bỏ tube cũ
có chứa dịch lọc. Ly tâm với tốc độ 14000 vòng trong một phút.
Bước 10: Chuyển QIAamp spin column vào một tube ly tâm 1,5 ml mới. Loại
bỏ tube cũ có chứa dịch lọc. Cẩn thận mở nắp QIAamp spin column và thêm 60 µl
AVE. Đóng nắp lại, giữ ở nhiệt độ phòng trong 1 phút. Sau đó ly tâm với tốc độ 6000
x g (8000 vòng) trong 1 phút.
3.3.3. Thực hiện phản ứng RT-PCR
Phản ứng RT-PCR khuếch đại các đoạn gen chứa khung đọc mở ORF5, ORF7
được thực hiện với bộ kit QIAGEN® OneStep RT-PCR.
Cặp primer trong phản ứng khuếch đại ORF5: (Key (2001)) thiết kế dựa vào
trình tự của vùng đọc mở từ ORF4 đến ORF6
Mồi xuôi (F5):

5’-GGTGGGCAACKGTTTTAGCCTGTC-3’ nằm

ở vị trí 37bp bên ngoài của codon bắt đầu của ORF5
Mồi ngược (R5):

5’-GGTAATAGARAAYGCCAAAAGCACC-3’ nằm ở

vị trí 34bp bên ngoài của codon kết thúc của ORF5
Sản phẩm RT-PCR khuếch đại đoạn gen chừa toàn bộ ORF5 kích thước 723bp
(Larochelle và Magar, 1997).
Cặp primer trong phản ứng khuếch đại đoạn gen chứa ORF7.
Mồi xuôi (F7):

5'-GTACATTCTGGCCCCTGCCC-3' (Suarez và ctv,

(1996) nằm ở vị trí 14524 trên bộ gen của chủng VR2332.
Mồi ngược (R7): 5’-TCGCCCTAATTGAATAGGTG-3’(Mardassi và ctv.,
1994) nằm ở vị trí 15183 trên bộ gen của chủng VR2332.
Phản ứng RT-PCR trên cho ra sản phẩm: 660 bp
Các bứơc tíên hành:
Làm tan RNA khuôn, primer, dNTP mix, 5x QIAGEN OneStep RT-PCR
Buffer, và RNase-free water, và đặt chúng trong đá.
Chuẩn bị hỗn hợp hoá chất cho phản ứng RT-PCR (Bảng 3.1)
15


Trộn hỗn hợp hoá chất kỹ, phân bố lượng phù hợp vào các PCR tube.
Thêm RNA khuôn: Tùy theo lượng RNA tổng số thu nhận được mà thể tích
RNA cho vào phản ứng là khác nhau, thông thường 5 µl (khoảng 1 pg đến 1
µg RNA).
Bảng 3.1 Thành phần và nộng độ hóa chất phản ứng RT-PCR

Liều lượng phản
Thành phần
Nồng độ đầu
ứng (l)

Nồng độ cuối

Rnase free water

28

__

__

QIAGEN OneStep RTPCR buffer *

10

5X

1X

dNTP Mix

2

10 mM mỗi
dNTP

400 µM mỗi
dNTP

Foward primer

1.5

20 M

0,6 M

Reverse primer

1.5

20 M

0,6 M

QIAGEN OneStep RTPCR Enzyem Mix

2

5 U/l

__

DNA template

1

__

50-100 ng

* Chứa 12.5 mM MgCl2

Qui trình nhiệt của phản ứng RT-PCR đoạn ORF5
Bước 1: 50 C - 30 phút, 1 chu kỳ; bước 2: 94 C – 15 phút, 1 chu kỳ; bước 3: 94oC - 1
phút, 53 C – 30 giây, 72 C - 1 phút, 35 chu kỳ; bước 3: 72 C - 7 phút, 1 chu kỳ.
Qui trình nhiệt của phản ứng RT-PCR đoạn ORF7
Bước 1: 50 C - 30 phút, 1 chu kỳ; bước 2: 94 C – 15 phút, 1 chu kỳ; bước 3: 94oC - 1
phút, 55 C - 1 phút, 72 C - 1 phút, 35 chu kỳ; bước 3: 72 C - 7 phút, 1 chu kỳ.
3.3.4. Điện di sản phẩm PCR
Cách tiến hành:
 Pha dung dịch TBE 0,5X.
 Pha gel agarose với nồng độ 1% : cân 0,15 g agarose cho vào 15 ml dung
dịch TBE 0,5X. Đun sôi bằng lò vi ba ở 550W trong 3 phút để agarose tan
đều.

16