KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN NHÂN GIỐNG in vitro ĐẾN SỰ SINH TRƯỞNG, PHÁT TRIỂN VÀ HÀM LƯỢNG TINH DẦU, MENTHOL TRONG CÂY BẠC HÀ (Mentha arvensis L.)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN NHÂN GIỐNG
in vitro ĐẾN SỰ SINH TRƯỞNG, PHÁT TRIỂN
VÀ HÀM LƯỢNG TINH DẦU, MENTHOL
TRONG CÂY BẠC HÀ
(Mentha arvensis L.)

Ngành học

: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện

: LƯƠNG THIỆN KHÁNH

Niên khóa

: 2009 – 2013

Tháng 06/2013


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN NHÂN GIỐNG
in vitro ĐẾN SỰ SINH TRƯỞNG, PHÁT TRIỂN
VÀ HÀM LƯỢNG TINH DẦU, MENTHOL
TRONG CÂY BẠC HÀ
(Mentha arvensis L.)

Hướng dẫn khoa học

Sinh viên thực hiện

TS. TRẦN THỊ LỆ MINH

LƯƠNG THIỆN KHÁNH

KS. TÔ THỊ NHÃ TRẦM

Tháng 06/2013


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến Ban Giám Hiệu Nhà
Trường và Bộ môn Công nghệ Sinh học Trường Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí
Minh cùng toàn thể quý thầy cô đã chân thành giảng dạy và truyền đạt những kiến thức
bổ ích trong suốt những năm học tại trường.
Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến cô Trần Thị Lệ Minh, Tô Thị Nhã Trầm là
người trực tiếp hướng dẫn, tạo điều kiện thuận lợi và truyền đạt những kiến thức quý
báu cho tôi để thực hiện tốt việc nghiên cứu đề tài khóa luận này.
Chân thành cảm ơn đến chị Đỗ Ngọc Thanh Mai, Bùi Thị Hồng Gấm và
Nguyễn Thị Thúy Kiều đã giúp đỡ tận tình khi tôi gặp khó khăn trong việc thực hiện

khóa luận tốt nghiệp.
Xin gửi lời cảm ơn đến các bạn của tôi, cùng tập thể lớp DH09SH đã luôn ủng
hộ, giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài.
Cuối cùng con xin chân thành gửi lời cảm ơn sâu sắc đến ba mẹ, người thân
trong gia đình đã luôn bên cạnh, động viên, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho
con trong suốt quá trình học tập và trưởng thành.
Tp. Hồ Chí Minh, tháng 06 năm 2013
Lương Thiện Khánh

iii


TÓM TẮT
Hiện nay nhu cầu sử dụng tinh dầu bạc hà ngày càng gia tăng, song lượng tinh
dầu tự nhiên vẫn chưa đủ đáp ứng, dẫn đến việc sản xuất tổng hợp tinh dầu bằng
phương pháp hóa học và điều này đã phần nào ảnh hưởng đến sức khỏe người tiêu
dùng. Nguyên nhân chính xuất phát từ việc thiếu hụt nguồn cung cấp cây giống. Chính
vì thế, yêu cầu đặt ra là phải xây dựng một quy trình sản xuất cây giống bạc hà để cung
ứng cho thị trường số lượng cây giống tốt và có hiệu quả kinh tế. Do đó, việc xây dựng
quy trình nhân giống in vitro sản xuất cây giống bạc hà, không những đảm bảo khả
năng thích nghi cao khi cây được trồng trên đồng ruộng mà còn tăng hàm lượng tinh
dầu, menthol mang lại hiệu quả kinh tế cao cho nhà sản xuất là rất cần thiết.
Trong đề tài, tiến hành thử nghiệm nhân giống cây bạc hà gồm vào mẫu, tạo
callus, tái sinh chồi và tạo rễ trong ba điều kiện nuôi cấy: ánh sáng đèn neon, nhiệt độ
26 ± 20C; ánh sáng đèn neon, nhiệt độ phòng 29 ± 50C; ánh sáng tự nhiên, nhiệt độ 28 ±
60C. Sau giai đoạn nhân giống in vitro tiến hành thử nghiệm trồng cây bạc hà trên đồng
ruộng và ly trích tinh dầu, đánh giá hàm lượng menthol.
Kết quả đạt được sau khi tiến hành thí nghiệm cho thấy giai đoạn vào mẫu, tạo
callus và tái sinh chồi cho kết quả tốt nhất khi cây bạc hà được nuôi cấy trong điều kiện
sử dụng ánh sáng đèn neon, nhiệt độ 26 ± 20C. Giai đoạn tạo rễ, tái sinh cây hoàn chỉnh

thì điều kiện nuôi cấy tự nhiên, nhiệt độ 28 ± 60C là tốt nhất. Cây bạc hà được nuôi cấy
trong điều kiện tự nhiên, nhiệt độ 28 ± 60C có sự sinh trưởng và phát triển tốt hơn so
với cây bạc hà được nuôi cấy trong hai điều kiện phòng lạnh và phòng nóng. Hàm
lượng tinh dầu (4,36%) và menthol (73,32%) trong cây bạc hà được nuôi cấy trong điều
kiện tự nhiên, nhiệt độ 28 ± 60C cho kết quả cao nhất.

iv


SUMMARY
The thesis " Surveying the effects of in vitro propagation conditions on the
growth, development and content of oil, menthol in peppermint (Metha arvensis L.)”.
Currently, while demand for using oleum menthae is increasing, the amount of
natural oils is not enough to respond. So the oil is synthesised by chemically, this
affects the health of consumers. The main reason is the supply of seedling deficiency.
Therefore, construction a process to product peppermint seedlings is essential to
provide market the number of quality seeds and economic efficiency. So development a
mint cseedlings in vitro propagated process, not only highly adaptive when growing in
the field but also increased concentrations of synthetic oil and menthol, bring high
economic efficiency for producers is necessary.
The research focussed on: testing on the sample of mint, creating callus,
regenerating shoot and rooting of three culture conditions: neon light, temperature 26 ±
20C and neon light, room temperature 29 ± 50C and natural light, temperature 28 ± 60C.
After a period of in vitro propagation, mint is planted on the field, extracted oil,
evaluated menthol content.
The result showed that neon lights, temperature 26 ± 200C is optimal condition
to creating callus, regenerating shoot. Optimal temperature for Rooting phase, complete
regeneration is 28 ± 600C on natural culture conditions. Mint was grown in natural
conditions with temperature 28 ± 600C, had the growth and development of better than
peppermint was cultured in two conditions cold rooms and heat room. Mint was grown

in natural conditions, temperature 28 ± 600C had the best results with oil content
(4.36%) and menthol (73.32%).
Keywords: propagation condition, mint, menthol.

v


MỤC LỤC
Lời cảm ơn ...................................................................................................................... iii
Tóm tắt .......................................................................................................................... iii
Summary .......................................................................................................................... v
Mục lục .......................................................................................................................... vi
Danh sách các chữ viết tắt .............................................................................................. ix
Danh sách các bảng ......................................................................................................... x
Danh sách các hình ......................................................................................................... xi
Chương 1 MỞ ĐẦU ........................................................................................................ 1
1.1 Đặt vấn đề .................................................................................................................. 1
1.2 Mục tiêu đề tài .......................................................................................................... 2
1.3 Nội dung ................................................................................................................... 2
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................... 3
2.1. Giới thiệu về cây bạc hà châu Á (bạc hà Á) ............................................................. 3
2.1.1 Phân loại cây bạc hà .............................................................................................. 3
2.1.2 Đặc điểm hình thái cây bạc hà Á ........................................................................... .3
2.1.3. Đặc điểm sinh vật học cây bạc hà ......................................................................... 4
2.1.3.1 Các thời kì sinh trưởng của cây bạc hà................................................................ 4
2.1.3.2 Điều kiện sinh thái ............................................................................................... 4
2.1.4. Kỹ thuật trồng, chăm sóc và thu hoạch cây bạc hà .............................................. .5
2.1.4.1 Kỹ thuật trồng cây bạc hà .................................................................................... 5
2.1.4.2 Chăm sóc cây bạc hà ........................................................................................... 6
2.1.4.3 Thu hoạch cây bạc hà .......................................................................................... 7

2.2. Tinh dầu cây bạc hà .................................................................................................. 7
2.2.1 Giới thiệu về tinh dầu bạc hà .................................................................................. 7
2.2.2 Công dụng tinh dầu bạc hà ..................................................................................... 7
2.2.3 Tình hình sản xuất và tiêu thụ tinh dầu .................................................................. 8
2.3. Giới thiệu về nuôi cấy mô tế bào thực vật ................................................................ 8
2.3.1Nhân giống vô tính in vitro ..................................................................................... 8
2.3.1.1 Khái niệm nuôi cấy mô tế bào thực vật ............................................................... 8
2.3.1.2 Ý nghĩa và ứng dụng của phương pháp nuôi cấy mô .......................................... 8
2.3.2 Một số phương pháp nhân giống vô tính in vitro ................................................... 9
vi


2.3.3 Quá trình thực hiện nhân giống vô tính in vitro ..................................................... 9
2.3.4. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy trong nhân giống in vitr ............................... 10
2.3.4.1 Cường độ và chất lượng ánh sáng ..................................................................... 10
2.3.4.2 Sự thoáng khí và nồng độ khí CO2 và O2 lên sự sinh trưởng
và phát triển của cây cấy mô ......................................................................................... 12
2.3.4.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh trưởng và phát triển của cây cấy mô....... 15
2.3.4.4 Sự tương tác giữa nhiệt độ và ánh sáng ............................................................. 15
2.3.4.5 Độ ẩm tương đối trong bình nuôi cấy................................................................ 16
2.3.4.6 Thành phần và thể tích môi trường nuôi cấy ..................................................... 17
Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................................... 18
3.1 Thời gian và địa điểm làm đề tài ............................................................................. 18
3.2 Vật liệu nghiên cứu.................................................................................................. 18
3.3. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................................ 18
3.3.1 Tạo cây bạc hà in vitro ......................................................................................... 18
3.3.2 Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến sự hình thành callus .................... 18
3.3.3 Khảo sát sự ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến sự tái sinh chồi từ callus ..... 19
3.3.4 Khảo sát sự ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy trong giai tạo rễ.......................... 19
3.3.5 Khảo sát sự sinh trưởng và phát triển của cây bạc hà ex vivo .............................. 19

3.3.6 Đánh giá hàm lượng tinh dầu từ cây bạc hà trong 3 điều kiện nuôi cấy .............. 20
3.3.7 Đánh giá hàm lượng menthol bằng phương pháp đo OD .................................... 21
3.4 Phương pháp xử lý số liệu ....................................................................................... 21
Chương 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..................................................................... 22
4.1 Tạo cây bạc hà in vitro ............................................................................................ 22
4.2 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến sự hình thành callus .................................. 23
4.3 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến sự tái sinh chồi từ callus ........................... 25
4.4 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy trong giai đoạn tạo rễ ....................................... 27
4.5. Trồng thử nghiệm cây bạc hà in vitro .................................................................... 28
4.5.1 Thuần hóa cây con ngoài vườn ươm .................................................................... 28
4.5.2 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến sự sinh trưởng và phát triển
của cây bạc hà in vitro khi trồng ở ngoài đồng ruộng ................................................... 28
4.6. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy in vitro đến hàm lượng tinh dầu,
menthol của cây bạc hà .................................................................................................. 33
4.6.1 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy in vitro đến hàm lượng tinh dầu ................... 33
vii


4.6.2 Xác định hàm lượng menthol bằng phương pháp đo OD .................................... 34
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .......................................................................... 36
5.1 Kết luận.................................................................................................................... 36
5.2 Đề nghị .................................................................................................................... 36
Tài liệu tham khảo ......................................................................................................... 37
Phụ lục ...............................................................................................................................

viii


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ANOVA

: Analysis Of Variance

BA

: Benzyladenine

CTV

: Cộng tác viên

Kn

: Kinetin

LED

: Light Emitting Diode

MS

: Murashige - Skoog

NAA

: Naphthylacetic acid

NPR

: Net Photosynthetic Rate

NT

: Nghiệm thức

PPF

: Photosynthetic Photon Flux

ix


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Trang
Bảng 4.1 Kết quả mẫu bạc hà sau 3 tuần tái sinh mẫu................................................... 22
Bảng 4.2 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy lên khả năng hình thành callus ............... 24
Bảng 4.3 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến khả năng tái sinh chồi ...................... 26
Bảng 4.4 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy trong giai đoạn tạo rễ .............................. 27
Bảng 4.5 Tỉ lệ sống, chiều cao cây bạc hà trong giai đoạn vườn ươm .......................... 29
Bảng 4.6 Kết quả thống kê về chiều cao, số cành, trọng lượng tươi ............................. 30
Bảng 4.7 Hàm lượng tinh dầu và trọng lượng khô cây bạc hà ...................................... 33
Bảng 4.8 Hàm lượng menthol có trong tinh dầu ............................................................ 34
Bảng 4.9 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến năng suất bạc hà............................... 35

x


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Trang
Hình 2.1 Cây bạc hà 40 ngày tuổi. ................................................................................. 3

Hình 4.1 Mẫu bạc hà phát triển từ đốt thân mang chồi ngủ sau 3 tuần………………23
Hình 4.2 Mẫu callus được hình thành sau 30 ngày nuôi cấy………………………….25
Hình 4.3 Tái sinh chồi từ callus……………………………………………………….26
Hình 4.4 Rễ cây bạc hà in vitro sau 30 ngày………………………………………….28
Hình 4.5 Cây bạc hà in vitro sau 2 tuần trồng ở vườn ươm…………………………..29
Hình 4.6 Cây bạc hà sau 20 và 40 ngày trồng………………………………………...31
Hình 4.7 Đồng ruộng bạc hà sau 1 và 60 ngày trồng…………………………………32
Hình 4.8 Quy trình nhân giống in vitro cây bạc hà…………………………………...35

xi


Chương 1 MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề
Trong những năm gần đây nền công nghiệp về mỹ phẩm, dược phẩm và thực
phẩm có xu hướng phát triển mạnh mẽ nên nhu cầu sử dụng tinh dầu, hương liệu tăng
cao. Một số loại tinh dầu được ứng dụng rộng rãi hiện nay như là: tinh dầu cam,
chanh, sả, hồi, lài, hoa hồng, nổi bật nhất phải kể đến tinh dầu bạc hà. Tinh dầu từ cây
bạc hà rất được quan tâm do có công dụng chữa cảm sốt, nhức đầu, sổ mũi, đau họng,
khản tiếng, kích thích tiêu hóa, chữa các bệnh đường ruột, sát trùng, giảm đau và
những ứng dụng khác trong các ngành kỹ nghệ, thực phẩm và mỹ phẩm (Chu Thị
Thơm và ctv, 2006).
Ở nước ta, Hưng Yên là tỉnh trồng và chưng cất tinh dầu bạc hà lớn nhất nước
nhưng chỉ đạt khoảng 1.500 lít/tháng. Với sản lượng này thì chỉ đáp ứng rất nhỏ nhu
cầu sử dụng tinh dầu bạc hà trong nước. Chính vì thế, cần phải có những vùng chuyên
canh trồng cây bạc hà nhằm đáp ứng được nhu cầu trong nước và xuất khẩu. Với dự án
mở rộng vùng chuyên canh trồng cây bạc hà thì việc thiếu hụt cây giống là điều đáng
quan tâm. Chính vì thế, để có thể cung cấp một sản lượng cây giống bạc hà đáp ứng đủ
nhu cầu thực tế thì phương pháp nhân giống in vitro được xem là có hiệu quả nhất.
Tuy nhiên một thực tế là cây bạc hà in vitro được nhân giống trong điều kiện ổn

định về dinh dưỡng, ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm,… khi trồng trên đồng ruộng, với điều
kiện tự nhiên có dinh dưỡng thấp, ánh sáng có cường độ mạnh, nhiệt độ cao, ẩm độ
thấp, cây con dễ dàng bị stress, dễ mất nước mau héo và chết hàng loạt gây thiệt hại rất
lớn. Theo công bố của Nguyễn Trường Giang (2012) tỷ lệ chết này lên đến 32,1%. Do
đó, trên nhiều bài báo gần đây đã có nhiều nghiên cứu nhằm mục đích “ rèn luyện” cây
in vitro khi trồng ra vườn ươm có tỷ lệ sống cao, phát triển tốt khi chuyển từ môi
trường nhân tạo ổn định trong bình cấy mô ra ngoài đồng ruộng.
Xuất phát từ nhu cầu thực tế, đề tài “Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện nhân
giống in vitro đến sinh trưởng, phát triển và hàm lượng tinh dầu, menthol trong cây
bạc hà (Metha arvensis L.)” được thực hiện nhằm đưa ra quy trình nhân giống cây bạc
hà có hiệu quả kinh tế cao nhất.

1


1.2 Yêu cầu đề tài
 Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện nhân giống in vitro đến sự sinh trưởng, phát
triển và hàm lượng tinh dầu, menthol trong cây bạc hà.
 Đưa ra quy trình nhân giống cây bạc hà có hiệu quả kinh tế cao nhất.
1.3 Nội dung
Thực hiện nhân giống in vitro cây bạc hà và tiến hành khảo sát khả năng sinh
trưởng, phát triển của cây bạc hà in vitro trong những điều kiện nuôi cấy được bố trí.
Sau đó tiến hành trồng cây bạc hà in vitro từ những nghiệm thức được bố trí để khảo
sát sự sinh trưởng, phát triển của cây bạc hà khi trồng ngoài đồng ruộng. Cuối cùng là
tiến hành ly tích, xác định hàm lượng tinh dầu và menthol trong cây bạc hà.

2


Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. Giới thiệu về cây bạc hà Châu Á (bạc hà Á)
2.1.1 Phân loại cây bạc hà Á
Giới: Plantae
Ngành: Magnoliophyta
Lớp: Magnoliopsida
Bộ: Lamioles
Họ : Lamiaceae (Hoa môi)
Chi: Mentha
Tên khoa học: Mentha arvensis L.
Hình 2.1 Cây bạc hà 40 ngày tuổi

Tên khác: Bạc hà nam - Nhân đơn thảo

(Trung Quốc) - Mentha (Pháp) - Peppermint (Anh).
2.1.2 Đặc điểm hình thái cây bạc hà Á
Cây bạc hà là cây thân thảo, sống lâu năm, cao 10 - 60 cm, thân vuông, mọc
đứng hay hơi bò, có khi phân nhánh, trên thân và lá có nhiều lông. Lá mọc đối, chéo
chữ thập, cuống dài, rộng 2 - 3 cm, dài 3 - 5 cm, mép có răng cưa, mặt trên và mặt
dưới đều có lông che chở và lông bài tiết. Hoa mọc vòng ở kẽ lá, màu tím hay hồng
nhạt, có khi màu trắng. Mùa hoa tháng 7 - 10, tất cả thân, cây, lá, hoa đều có mùi thơm
(Savithri Bhat, 2000).
Rễ bạc hà: Cấu tạo từ thân ngầm dưới đất, phân bố lớp đất từ 30 - 40 cm phân
nhánh như rễ phụ. Thân ngầm không chứa tinh dầu.
Thân bạc hà: Rỗng ruột khi già, trên thân có đốt, mỗi đốt mọc hai mầm đối
xứng nhau và các rễ bất định. Giữa hai đốt là các lóng, độ dài ngắn phụ thuộc vào các
giống và điều kiện trồng trọt, chứa hàm lượng tinh dầu tương đối thấp khoảng 0,3% tỷ
lệ tinh dầu.
Lá bạc hà: Lá là cơ quan dinh dưỡng quan trọng nhất có nhiệm vụ quang hợp,
hô hấp, thoát hơi nước và mang tinh dầu, chiếm khoảng 2,4 - 2,7% tỷ lệ tinh dầu.
Hoa bạc hà: Cụm hoa bồng hình chóp, trên hoa có cuốn ngắn, 5 đài cánh hợp

thành hình chuông. Mặt ngoài đài hoa có lông bao phủ. Chiếm khoảng 4 - 6% tỷ lệ
tinh dầu (Đỗ Tất Lợi, 1987).
3


2.1.3. Đặc điểm sinh vật học cây bạc hà
2.1.3.1 Các thời kì sinh trưởng của cây bạc hà
Thời kì mọc: thời kì mọc được xác định từ lúc trồng đến khi cây mọc lên định
rõ hàng, điều kiện bình thường thời kì này kéo dài từ 10 - 15 ngày, sau khi trồng một
thời gian các đốt thân ngầm mọc rễ, phát triển mầm trong điều kiện nhiệt độ < 100C,
ẩm độ < 60%.
Thời kì phân cành: sau khi mọc từ 45 - 55 ngày, bộ rễ đã phát triển đầy đủ, các
cây con phát triển mạnh về chiều cao, các cành hai bên nách lá phát triển ra các cành
mới. Sự phân cành theo thứ tự từ các đốt thân chính xuất hiện mầm từ dưới gốc lên,
các đốt trên cao sẽ ngắn lại tạo cho dáng cây có dạng hình chóp. Trong thời kỳ này tốc
độ sinh trưởng và khối lượng chất xanh tăng mạnh, quyết định đến năng xuất cây bạc
hà sau này.
Thời kì ra nụ: thời kì này kéo dài 10 - 15 ngày, biểu hiện tốc độ ra lá của cây
chậm lại, tuy nhiên cây vẫn phát triển kích thước thân lá, tại đỉnh sinh trưởng thân
chính xuất hiện mầm hoa, ở thời kì này khối lượng chất xanh vẫn tăng và sự tích lũy
tinh dầu vẫn diễn ra. Trong thời kì này phải chú ý về dinh dưỡng, phải giảm hàm
lượng đạm, tăng lượng phân lân và các yêu cầu về ánh sáng, nhiệt độ trong giai đoạn
này đòi hỏi cao nhất.
Thời kì nở hoa: đây là giai đoạn khối lượng chất xanh và hàm lượng tinh dầu
bạc hà cao nhất (trong một ngày có thể tạo ra 280 kg chất xanh/ha). Vào thời kì hoa nở
50% trên đồng ruộng là lúc hàm lượng tinh dầu trong cây đạt cao nhất, đây là thời
điểm thu hoạch tốt nhất. Nếu hoa nở 100% thì năng xuất tinh dầu giảm do lá rụng bớt
đi. Trong thời kì này chú ý đến các điều kiện ngoại cảnh như: nhiệt độ cao, gió mạnh,
khô hạn, úng sẽ làm cho hàm lượng tinh dầu giảm (Chu Thị Thơm và ctv, 2006).
2.1.3.2 Điều kiện sinh thái

Ánh sáng: bạc hà là cây ngày dài, ưa ánh sáng. Điều kiện ngày dài từ 14 - 16
giờ, cây sẽ chuyển từ sinh trưởng sinh dưỡng sang sinh thực và ra hoa. Thời gian chiếu
sáng từ 8 - 10 giờ cây sẽ không chuyển giai đoạn được, năng suất chất xanh giảm, tỷ lệ
thân ngầm tăng. Cây bạc hà là cây ưa sáng và phát triển tốt trong điều kiện ánh sáng
trực xạ. Trong quá trình trồng bạc hà phải chú ý đến thời vụ trồng mật độ trồng, không
trồng xen kẽ để dảm bảo ánh sáng hợp lí cho chúng sinh trưởng và phát triển tốt.

4


Nhiệt độ: cây bạc hà sinh trưởng tốt trong điều kiện nhiệt độ mát mẻ từ 18 270C, còn thời kì ra hoa nhiệt độ thích hợp nhất là từ 25 - 270C. Tuy nhiên trong điều
kiện nhiệt độ > 100C cây vẫn có thể sinh trưởng được. Trong thời kì tiềm sinh, cây bạc
hà có thể chịu đựng được nhiệt độ rất thấp dưới -10C. Như vậy tùy theo nhiệt độ trong
vùng trồng mà người ta bố trí thời vụ cho thích hợp. Thời gian sinh trưởng của cây bạc
hà từ 80 - 90 ngày khi nhiệt độ trung bình từ 18 - 190C và 90 - 100 ngày khi nhiệt độ
trung bình từ 15 - 160C. Vì vậy để có sinh khối về tỉ lệ tinh dầu cao cần bố trí thời vụ
thích hợp. Nhiệt độ trung bình ngày đêm càng cao, cây nở hoa càng nhanh. Nếu nhiệt
độ trung bình trong ngày thấp, kết hợp với điều kiện ngày ngắn thì cây sẽ không ra hoa.
Độ ẩm: cây bạc hà có lượng bộ phận khí sinh tương đối lớn, bộ rễ kém phát
triển, lại phân bố trên lớp đất nông là những lý do làm cây bạc hà cần nước (cả độ ẩm
trong đất và độ ẩm trong không khí). Nhìn chung trong thời gian sinh trưởng, nước
càng đầy đủ bao nhiêu, khối lượng và chất lượng thu hoạch càng cao bấy nhiêu.
Ngược lại hạn hán xảy ra, khối lượng và chất lượng thu được đều kém. Độ ẩm trong
đất thích hợp nhất với bạc hà là 80% (độ ẩm tương đối). Bộ rễ của cây bạc hà phân bố
nông và kém phát triển nên sức hút và giữ nước kém, mẫn cảm với hạn. Trong thời kì
sinh trưởng, nếu độ ẩm cao, bạc hà sẽ đạt được năng suất chất xanh cực đại nhưng hàm
lượng tinh dầu sẽ giảm.
Đất đai và dinh dưỡng: cây bạc hà ưa đất tơi xốp, có thành phần cơ giới nhẹ,
giàu dinh dưỡng, giữ nước và thoát nước tốt. Các loại đất phù sa ven sông suối, các
loại đất đen có tầng canh tác tương đối dày, mực nước ngầm thấp thích hợp cho cây

bạc hà. Độ pH thích hợp cho cây bạc hà là 6 - 7,5 trên các loại đất trồng liên tục từ 2 3 năm nên phá đi để trồng lại, nên tiến hành luân canh với các loại cây trồng khác để
giảm tỉ lệ sâu bệnh hại, không ảnh hưởng đến năng suất. Trong từng giai đoạn sinh
trưởng bạc hà cần lượng dinh dưỡng khác nhau. Chú ý bón phân vào các thời kì: khi
cây cao 10 cm, khi phân cành và khi nụ hoa bắt đầu phát sinh. Nguyên tố kali cần bón
kết thúc sớm (vào lúc cây phân cành) để không ảnh hưởng đến quá trình tích lũy tinh
dầu (Chu Thị Thơm và ctv, 2006).
2.1.4. Kỹ thuật trồng, chăm sóc và thu hoạch bạc hà
2.1.4.1 Kỹ thuật trồng bạc hà
Theo Nguyễn Thị Thanh Bình (2004), kỹ thuật trồng gồm có: trồng bằng hạt,
bằng thân ngầm, trồng bằng thân bò trên mặt đất, trồng bằng cành, trồng bằng cây con,
5


trồng bằng cây nuôi cấy mô. Trồng bằng hạt: có thể gieo thẳng hay ươm rồi nhổ cây đi
trồng. Trồng bằng thân ngầm: có thể trồng vào mùa đông và mùa xuân; ở miền Nam
khí hậu ấm áp nên phần lớn là trồng vào mùa xuân (tháng 3 - 4). Trước khi trồng nên
chọn những đoạn thân ngầm tốt, cắt thành đoạn từ 7 - 10 cm, cứ cách 23 - 33 cm thì
đánh một rãnh, nếu trồng theo từng lỗ (hốc) cứ cách 23 - 27 cm đào một lỗ sâu 7 cm,
mỗi lỗ trồng 2 - 3 hom. Trồng bằng thân, cành: bạc hà thường được trồng vào tháng 6,
7. Người ta cắt những đoạn thân, cành bánh tẻ để trồng. Thân bạc hà được cắt thành
đoạn dài 10 cm và được đặt sâu xuống 2/3, khoảng cách trồng từ 5 - 7 cm, trồng xong
phải che phủ để giữ ẩm. Sau khi trồng được 2 - 3 tuần thì cây mọc mầm và khi mọc
cao được 10 - 13 cm thì có thể nhổ để trồng chỗ khác.
2.1.4.2 Chăm sóc bạc hà
Làm cỏ và vun xới: trồng bằng thân ngầm và bằng hạt khi cây đã mọc cao 7 10 cm, hoặc bằng những đoạn thân cành, nếu vườn có cỏ, cần làm cỏ và phá váng. Khi
cây đã cao 17 - 20 cm thì xới đất lần thứ hai. Khi cây đã mọc cao 27 - 33 cm, thì vun
xới lần thứ ba. Sau khi đã thu hoạch lần thứ nhất, cần phải vun xới kết hợp nhổ những
cây có nhiều cành đâm rễ xuống đất. Ngoài ra trên những ruộng bạc hà trồng để hai
năm thường có rất nhiều cây con mọc lên trong năm thứ hai, lúc làm cỏ và vun xới lần
thứ nhất cần phải nhổ bỏ đi, làm cho khoảng cách các cây có cự ly thích hợp, không

nên để quá dày, nếu để dày thì sẽ thiếu ánh sáng, ảnh hưởng rất lớn đến sinh trưởng
của bạc hà.
Bón phân: bộ phận thu hoạch là thân và lá cho nên bón phân chủ yếu là dùng
phân đạm và phân kali. Loại phân dùng bón lót chủ yếu là phân chuồng, phân rác, bùn
ao. Phân dùng bón thúc thì dùng sulfat đạm, phân chuồng ủ hoai hay khô đầu trâu. Lúc
làm đất ngoài việc bón phân lót ra, sau khi cây đã mọc thì phải bón phân thúc nhiều
lần, có như thế mới đảm bảo tăng thu hoạch.
Tưới nước và tháo nước: bạc hà ưa đất ẩm vừa phải, nếu gặp phải đất quá khô
hay sau khi bón phân thúc đều cần phải tưới nước. Nhưng gặp phải trời mưa quá
nhiều, không tháo nước được, thì bất lợi cho cây bạc hà sinh trưởng. Việc tháo nước
và tưới nước cần phải đặc biệt chú ý làm kịp thời và đúng mức. Sau khi thu hoạch lần
thứ nhất, nếu đất quá khô, cần kết hợp với bón phân có tưới nước, như vậy cây sẽ đâm
chồi rất mạnh và cho sản lượng/năng suất thu hoạch lần thứ hai cao hơn (Nguyễn Thị
Thanh Bình, 2004).
6


2.1.4.3 Thu hoạch bạc hà
Bạc hà trồng 2 - 3 tháng có thể thu hoạch. Dùng liềm cắt sát gốc, thu hoạch toàn
bộ thân lá để cất lấy tinh dầu. Cây thu hoạch xong cần chuyển ngay đến nơi cất tinh
dầu. Nếu chưa kịp cất tinh dầu ngay thì cần trãi mỏng ở những nơi râm mát, tuyệt đối
không đánh đống hoặc bó chặt cây sẽ làm tăng độ ẩm nóng, cây dễ bị thối hỏng, tinh
dầu giảm sút nghiêm trọng. Phơi nắng hàm lượng tinh dầu cũng bị giảm sút.
Để có năng suất cao và phẩm chất tinh dầu tốt thì phải thu hoạch đúng thời vụ,
chưng cất kịp thời. Để thu hoạch bạc hà đúng lúc người ta dựa vào căn cứ sau: giống
và thời điểm thu hoạch, thời tiết, tuổi cây (Nguyễn Thị Thanh Bình, 2004).
2.2. Tinh dầu bạc hà
2.2.1 Giới thiệu về tinh dầu bạc hà
Hàm lượng tinh dầu trong cây bạc hà thường từ 1,5 - 4%. Sự biến động này tùy
thuộc vào giống và điều kiện ngoại cảnh. Tinh dầu là chất lỏng không màu hay vàng

nhạt, có mùi thơm đặc biệt, vị cay, rất dễ tan trong dung môi ethanol 900, tan trong 2 3 thể tích ethanol 700.
Tính chất vật lý: lỏng ở nhiệt độ thường, có mùi thơm không màu hoặc màu
nhạt. Chỉ số khúc xạ cao, có năng suất quay cực. Ít tan trong nước, tan trong dung môi
hữu cơ, este, cồn, có tính sát trùng mạnh. Dễ bay hơi, khuếch tán mạnh ở nhiệt độ bình
thường, nhẹ hơn nước. Tinh dầu dễ bị biến mùi khi có tác động của ánh sáng, nhiệt độ.
Thành phần hoá học: tinh dầu bạc hà bao gồm menthol (51,8%); menthone
(19,8%); neomentol (7,65%); β-pinen (1,1%); limonen (2,87%); acetat mentil (2,53%)
(Nguyễn Kim Phi Phụng, 2009).
2.2.2 Công dụng tinh dầu bạc hà
Tinh dầu bạc hà được sử dụng khá rộng rãi trong tất cả các loại hương liệu cho
bánh kẹo, thực phẩm, nước giải khát, thuốc lá, xà phòng, kem đánh răng,… có tác
dụng sát khuẩn, gây tê tại chỗ, trị viêm thần kinh, trị các bệnh tai mũi họng, các bệnh
cảm cúm, nhức đầu, đầy bụng,…
Dùng chiết xuất menthol được dùng nhiều trong nhiều ngành kỹ nghệ: kỹ nghệ
dược phẩm (1.550 tấn/năm), kỹ nghệ bánh kẹo (570 tấn/năm), kỹ nghệ sản xuất thuốc
lá (1.350 tấn/năm), sản xuất thuốc đánh răng (1.800 tấn/năm), sản phẩm cạo râu (250
tấn/năm),… (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2009).

7


2.2.3 Tình hình sản xuất và tiêu thụ tinh dầu
Theo Lawrence (2006), trong năm 1961, thế giới đã sản xuất và sử dụng 1.500 1.600 tấn tinh dầu bạc hà từ loài M. piperita Hud., 3000 tấn lấy từ loài M. arvensis L.
và 700 tấn từ loài M. spicata L., Ngày nay, số lượng tinh dầu Bạc hà sản xuất hàng
năm là hơn 23.000 tấn với trị giá hơn 400 triệu USD. Ấn Độ là nước sản xuất tinh dầu
bạc hà lớn nhất thế giới chiếm khoảng 80 - 85%, các nước còn lại là: Trung Quốc,
Brazil, Mỹ và Nhật Bản. Menthol là thành phần chính trong tinh dầu bạc hà và được
tiêu thụ mạnh trong các ngành công nghiệp Ấn Độ đã được ước tính khoảng 10.000 15.000 tấn, Trung Quốc 3.500 tấn và Châu Âu 1.900 tấn.
2.3. Giới thiệu về nuôi cấy mô tế bào thực vật
2.3.1. Nhân giống vô tính in vitro

2.3.1.1 Khái niệm nuôi cấy mô tế bào thực vật
Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật bắt đầu từ một mảnh nhỏ thực vật
không bị nhiễm vi sinh vật, được đặt trong môi trường dinh dưỡng thích hợp. Chồi
mới hay mô sẹo mà mẫu cấy này sinh ra bằng sự tăng sinh được phân chia và cấy
chuyền để nhân giống (Murashige, 1977).
2.3.1.2 Ý nghĩa và ứng dụng của phương pháp nuôi cấy mô
Ý nghĩa: nuôi cấy mô tế bào thực vật ngày nay có ý nghĩa cực kì quan trọng
trong phát triển công nghệ sinh học. Khi tiến hành các kĩ thuật chuyển gen tạo ra các
loại giống cây trồng mới cũng như tìm cách nhân nhanh các giống mới đó, chúng ta
đều cần đến kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật. Sự phát triển kĩ thuật này đến nay đã
góp phần quyết định vào sự thành công của công nghệ sinh học thực vật (Nguyễn Văn
Uyển, 1996).
 Một số ưu điểm của nuôi cấy mô tế bào thực vật:
+ Không phụ thuộc vào thời tiết, thời vụ, không chiếm nhiều diện tích trong quá
trình tiến hành, có thể tiến hành ở bất kì thời điểm nào. Phục tráng được các giống cây
đã bị nhiễm, thoái hóa. Hệ số nhân cao, nhân nhanh. Có thể đáp ứng nhu cầu số lượng
lớn trong thời gian ngắn
+ Bảo quản giống dễ dàng. Tiết kiệm chi phí vận chuyển giống từ nơi này đến nơi
khác. Vật liệu để nhân giống dồi dào, phong phú mà tiết kiệm chi phí, hiệu quả kinh tế
cao cho người sản xuất. Góp phần tích cực cho công tác giống cây trồng. Dễ dàng trao
đổi công nghệ với các nước.
8


Ứng dụng: tạo ra những giống cây trồng sạch bệnh, sản xuất cây đơn bội, lai xa,
bảo quản nguồn gen (Dương Công Kiên, 2002).
2.3.2 Một số phương pháp nhân giống vô tính in vitro
Nhân giống thông qua giai đoạn callus: callus là một khối tế bào phát triển vô tổ
chức, hình thành do sự tái biệt hóa của tế bào đã phân hóa. Callus sẽ phát triển nhanh
khi môi trường có sự hiện diện của auxin. Khối callus có khả năng tái sinh thành cây

hoàn chỉnh trong môi trường không có chất kích thích tạo mô sẹo. Cây tái sinh từ
callus có đặc tính giống như cây mẹ. Từ một cụm tế bào callus có thể tái sinh cùng
một lúc nhiều chồi hơn là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, tuy nhiên mức độ biến dị tế bào
soma cao hơn.
Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng: sau khi vô trùng mẫu và được nuôi cấy trên môi
trường thích hợp. Từ một đỉnh sinh trưởng sau một thời gian nuôi cấy nhất định phát
triển thành một chồi hay nhiều chồi. Sau đó chồi tiếp tục phát triển vươn thân, ra lá và
rễ trở thành cây hoàn chỉnh. Cây con được chuyển ra đất có điều kiện sinh trưởng phát
triển bình thường. Đây là một chu trình ngắn nhất và tiện lợi hơn các phương thức
nhân giống thông thường được thực hiện bằng kỹ thuật nhân giống vô tính (in vitro)
thông qua nuôi cấy đỉnh sinh trưởng (Dương Công Kiên, 2002).
2.3.3 Quá trình thực hiện nhân giống vô tính in vitro
Thiết lập sự nuôi cấy vô trùng: các mẫu chọn được khử trùng và cấy vào trong
môi trường thích hợp. Thời gian nuôi cấy khác nhau tùy loại cây, thường là 4 - 6 tuần.
Khi đó mẫu cấy mọc thành cây con cao khoảng 1cm.
Nhân vô tính in vitro: mẫu cấy được chia ra và được cấy chuyền vào môi
trường mới. Tại môi trường mới các mẫu cấy sẽ phát triển thành những chồi nách và
chồi bất định, môi trường nhân chồi thường có sự hiện diện của cytokinin. Giai đoạn
này kéo dài từ 2 - 4 tuần.
Tạo rễ: cây in vitro tái tạo hoàn chỉnh được đưa từ ống nghiệm ra môi trường
bên ngoài thường khá yếu nên cần thiết lập môi trường bên ngoài để cho cây làm quen
và thuần hóa cây in vitro. Giai đoạn này nếu không có sự nhân giống liên tục thì kéo
dài khoảng 30 - 45 ngày. Sau đó có thể đem trồng ra đồng ruộng sản xuất. Nếu ở giai
đoạn vườn ươm dùng để sản xuất giống thương mại thì có thể kéo dài giai đoạn này 5 7 năm (Dương Công Kiên, 2002).

9


2.3.4. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy trong nhân giống in vitro
2.3.4.1 Cường độ và chất lượng ánh sáng

Mẫu cấy được đặt trên môi trường chứa nguồn năng lượng có sẵn là đường nên
mẫu ít tùy thuộc vào quá trình quang tổng hợp. Tuy nhiên nhiều nghiên cứu cho thấy
ánh sáng hấp thụ có vai trò quan trọng trong phản ứng phát sinh hình thái cây nuôi cấy
mô, đặc biệt ánh sáng là nhân tố quan trọng tham gia trực tiếp vào quá trình quang hợp
và có vai trò quyết định đến quá trình quang hợp, đặc biệt ánh sáng đỏ và xanh của
quang phổ trông thấy ảnh hưởng đến việc nuôi cấy in vitro (Dương Tấn Nhựt, 2007).
Ánh sáng tác động lên sự sinh trưởng và phát triển của thực vật do ảnh hưởng
của quang kỳ, sự quang hợp và phát sinh hình thái. Quang kỳ đã cho thấy tác động
mạnh mẽ lên sự sinh trưởng của mẫu cấy in vitro (Debergh và Maene, 1977; Hughes,
1981; Economou và Read, 1987). Quang kỳ tác động lên những loài cây khác nhau
theo những cách rất khác nhau, một số cây đáp ứng rất tốt trong điều kiện tối, một số
trong ánh sáng liên tục và những cây khác dưới điều kiện trung gian. Thông thường,
điều kiện tốt nhất cho sự sinh trưởng của hầu hết cây là từ 16 - 18 giờ sáng hay ít hơn
1 chút (Morini và ctv, 1987). Đối với đỉnh chồi của cây khô (Azalea) thuộc họ đỗ
quyên (Economou và Read, 1986) và nhiều giống táo (Yae và ctv, 1987) sự kéo dài
thời gian chiếu sáng là từ 16 – 24 giờ đã giảm tỉ lệ nảy chồi. Ở những loài khác cho
thấy có sụ khác nhau về sự sinh trưởng để đáp ứng với sự thay đổi của quang kỳ. Sự
nảy chồi của cây mận sau 45 ngày sinh trưởng không có gì khác nhau về mặt thống kê
giữa hai chu kỳ 12 và 16 giờ sáng, trong khi đó chu kỳ 8 giờ sáng cho tỉ lệ hình thành
chồi thấp hơn rất nhiều (Morini và ctv, 1991).
Cournac và ctv (1992), đã nhận thấy được sự gia tăng hàm lượng protein và
hoạt động của enzyme Rubisco khi cây con khoai tây được nuôi cấy trong điều kiện
ánh sáng cao và sự sinh trưởng của cây đáp lại tương đồng với sự phát triển của quang
hợp biến dưỡng carbon. Mặc dù đòi hỏi về ánh sáng của cây in vitro thì thấp hơn trong
điều kiện in vivo, nhưng thời gian chiếu sáng, cường độ chiếu sáng và chất lượng
quang phổ rất quan trọng cho sự điều hòa của quá trình quang phát sinh hình thái mẫu
nuôi mô nuôi cấy ( Ziv, 1991). Hasegawa và ctv (1973) đã thu được số lượng cây
măng tây cao nhất dưới điều kiện 1000 lux lại hạn chế sự hình thành cơ quan. Hunter
và ctv (1983) ghi nhận sự sống sót và sinh trưởng tối ưu của mẫu cây dâu tây tại điều
kiện chiếu sáng 4.000 lux, đạt được sự sinh trưởng và phát triển tối đa trong điều kiện

10


6000 lux và hình thành rễ và phát triển tốt nhất trong điều kiện 7.000 lux. Cường độ
ánh sáng thấp (1.000 đến 3.000 lux) cần thiết cho việc nhân chồi và gia tăng sự ra rễ ở
cây Zzalea (Economou và Read, 1986) và cường độ cao hơn (7.000 đến 10.000 lux)
được đề nghị cho việc ra rễ (Murashige, 1977).
Điều khiển sự kéo dài chồi in vitro là một nhiệm vụ quan trọng trong vi nhân
giống để đạt được những chồi hay cây con mong muốn. Độ dài lóng cần được điều
khiển khác nhau tại những pha sinh trưởng và phát triển khác nhau. Chồi với thân
ngắn, to khỏe và lá to là những cây thích hợp cho việc chuyển ra vườn và bước thích
nghi sau nuôi cấy. Mặt khác, chồi với lóng thân dài thường được dùng trong pha nhân
chồi để dễ dàng thu nhận các đốt cắt. Ảnh hưởng của ánh sáng lên sự sinh trưởng và
phát sinh hình thái của cây được miêu tả bởi Hart (1988) Sự phân bố quang phổ của
ánh sáng từ những nguồn sáng khác nhau thì không giống nhau, cũng như cung cấp
những dòng bức xạ khác nhau.
Chất lượng ánh sáng được điều khiển bằng cách bổ sung thêm nguồn sáng như
đèn huỳnh quang đơn sắc kết hợp với bộ lọc ánh sáng. Đèn đi-ốt phát sáng đơn sắc
(LEDs) có tiềm năng trong việc cung cấp một nguồn sáng với chất lượng mong muốn
mà không có tác động rõ ràng lên sự quang hợp bởi vì chúng đóng góp một phần khá
nhỏ vào tổng năng lượng bức xạ. Mỗi đèn LEDs là một nguồn sáng hình thành bán cầu
nhỏ (đường kính 2 mm) có khả năng cung cấp chỉ một lượng bức xạ đơn sắc nhỏ. Để
điều khiển sự quang phát sinh hình thái thực vật, sử dụng những loại LEDs khác nhau
có thể phát ra ánh sáng màu đỏ, đỏ xa và xanh với chi phí thấp. Ứng dụng đèn LEDs
cho sự sinh trưởng thực vật đã được nghiên cứu và có thể ứng dụng vào thực tế (Bula
và ctv, 1991; Iwanami và ctv, 1992; Dương Tấn Nhựt, 2007).
Đối với các mô nuôi cấy, quang tổng hợp không phải là hoạt động cần thiết, vì
năng lượng được cung cấp dưới dạng glucid (đường) có trong môi trường nuôi cấy.
Theo một vài quan sát, sự quang tổng hợp dường như không bị hủy bỏ, nhưng lại bị
giảm mạnh, có thể là do sự hiện diện của đường trong môi trường. Trái lại ánh sáng lại

cần thiết để điều hòa vài quá trình phát sinh hình thái cây như người ta đã chứng minh
ở nhiều nghiên cứu khác nhau (Dương Công Kiên, 2002).
Ảnh hưởng của ánh sáng đến quang hợp vừa phụ thuộc vào cường độ ánh sáng
vừa phụ thuộc chất lượng ánh sáng. Ánh sáng sử dụng trong nuôi cấy in vitro có
cường độ thay đổi từ 100 đến 5.000 lux, và phổ biến nhất là 1.000 đến 3.000 lux.
11


Trong giai đoạn chuẩn bị cây in vitro trước khi đem trồng ngoài vườn ươm, cần cường
độ ánh sáng tăng khoảng 3.000 lux đến 10.000 lux. Cường độ ánh sáng tác động đến
quang hợp khá rộng, quang hợp có thể tiến hành ngay ở điều kiện ánh sáng có cường
độ thấp như ánh sáng trắng, ánh sáng đèn dầu, tuy nhiên, ở điều kiện ánh sáng yếu thì
sản phẩm tạo ra sẽ không đủ bù cho lượng chất hữu cơ bị hô hấp phân hủy. Ngược lại,
nếu cường độ ánh sáng quá cao thì lại ức chế quá trình quang hợp, đặc biệt là cây ở
giai đoạn in vitro cây có sức sống kém, do đó cần phải bố trí cho cây một cường độ
chiếu sáng thích hợp. (Dương Tấn Nhựt, 2007).
Cường độ ánh sáng mà thực vật sử dụng trong quang hợp có bước sóng từ 400 700 nm với đỉnh từ 660 - 680 nm. Sự phát sinh hình thái do ánh sáng (sự nảy mầm, sự
kéo dài đốt thân) xảy ra ở những bước sóng từ 400 - 500 nm (xanh lục), 600 - 700 nm
(đỏ) và 700 - 800 nm (siêu đỏ). Các công trình nghiên cứu đáng lưu ý của (Seibert,
1975), chứng tỏ là trên mô sẹo thuốc lá ánh sáng xanh (giải phổ giữa khoảng 467 nm)
hoặc tím (giải phổ giữa 419 nm) kích thích việc tạo chồi và ánh sáng đỏ (giải phổ 660
nm) cảm ứng việc tạo rễ.. Sự phân phối phổ của ánh sáng (spectral distribution of
light), thời gian chiếu sáng (photoperiod) và hướng chiếu sáng cũng đóng vai trò quan
trọng trong sự tăng trưởng của thực vật nuôi cấy mô. Thời gian chiếu sáng dường như
không ảnh hưởng đến việc tạo hình dạng của mô mà chính cường độ ánh sáng nhận
được là quan trọng. Trong thực tế, phần lớn các phòng nuôi cấy có thời gian chiếu
sáng từ 16 đến 18 giờ/ngày. Có thể để ánh sáng liên tục, điều này sẽ cho phép gia tăng
sự tăng trưởng của mô.
Các loại tia sáng khác nhau có tác dụng lên quang hợp không giống nhau, ánh
sáng đỏ và xanh của quang phổ trông thấy ảnh hưởng đến việc nuôi cấy in vitro. Hầu

hết các cây trồng nuôi cấy, xử lý ánh sáng 660 nm kích thích chồi trong khi ánh sáng
740 nm kích thích rễ (Seibert, 1975).
2.3.4.2 Sự thoáng khí và nồng độ khí CO2 và O2 lên sự sinh trưởng
và phát triển của cây cấy mô
Nồng độ CO2 cao sẽ tác động có lợi trên sự kéo dài chồi và sự phát triển của lá
trên sự tháo gỡ sự ngủ của chồi ngủ và đốt đơn cây Theobroma cacao, một loài rất khó
nhân giống bằng hệ thống vi nhân giống truyền thống. Figucira và Janick (1994) nhận
thấy tính gia tăng của việc kéo dài chồi, số lá, diện tích lá, trọng lượng khô và tươi của
chồi cây Theobroma cacao khi nồng độ CO2 xung quanh lên đến 24.000 pm.
12


Quang hô hấp thường hạn chế năng suất của cây C3, gia tăng nồng độ CO2 (500
đến 2.000 μmol.s-1.m-2) tạo ra một sự suy giảm đều đặn và sự hạn chế của O2 lên
quang hợp của thực vật đã hoàn toàn bị loại bỏ bởi CO2. Tuy nhiên, quang hô hấp hầu
như bị cản dưới điều kiện O2 2%, trong khi đó tỷ lệ quang hợp thực (NPR) tăng gấp
đôi nếu so với điều kiện 21% O2 trong môi trường ex vivo (Zelitch, 1975). Shimada và
ctv (1988) đã nghiên cứu ảnh hưởng của ba loại nồng độ O2 trong bình nuôi cấy hai
loại cây C3 Primula malacoides và Chrysanthemum morifolium được nuôi cấy dưới
điều kiện PPF bằng 110 μmol.s-1.m-2 và nhận thấy rằng tỉ lệ quang hợp thực (NPR) của
những loại này đã được gia tăng gấp 3 lần (ở nồng độ 1% O2) và gấp 1,5 lần (ở nồng
độ 10% O2 nếu so với nghiệm thức đối chứng ở nồng độ 21% O2). Thêm vào đó sự
cản hô hấp và gia tăng NPR, giảm nồng độ O2 trong bình nuôi cấy sẽ có ích trong việc
ngăn ngừa sự sinh trưởng của vi khuẩn và nấm. Những đặc điểm vừa nêu trên cho thấy
sự phát triển và tăng trưởng của mô cấy không chỉ phụ thuộc vào thành phần dinh
dưỡng mà còn phụ thuộc vào thành phần không khí bên trong các bình nuôi cấy (Ziv,
1991). Fujiwara và ctv (1988) cho rằng tốc độ quang hợp thấp và sự kém phát triển
của cây in vitro là do nồng độ CO2 trong bình nuôi cấy thấp nhất trong quá trình quang
hợp. Nói cách khác, nồng độ CO2 thấp trong bình nuôi cấy trong gần hết quang kỳ sẽ
ức chế khả năng quang hợp của cây, từ đó buộc cây phải sinh trưởng theo phương thức

dị dưỡng hay dị - tự dưỡng nhờ vào sự thu đường từ môi trường như là nguồn carbon
chủ yếu của cây (Kozai, 1991). Khi cường độ quang hợp của cây in vitro được gia tăng
sẽ làm tăng tỷ lệ sống sót của cây in vitro khi đưa ra vườn ươm. Các nhà nghiên cứu
gần đây cho rằng cây trồng chứa diệp lục có khả năng quang hợp tăng khi nuôi cấy
trên môi trường chứa CO2 (Kozai, 1991).
Bình nuôi cấy được thiết kế ngăn chặn vi khuẩn nhưng hạn chế sự trao đổi
không khí giữa bên trong và bên ngoài bình nuôi cấy, từ đó dẫn tới sự ảnh hưởng đến
thành phần các khí trong bình nuôi cấy. Thông thường, việc đậy kín bình nuôi cấy
ngăn ngừa sự xâm nhiễm của các vi sinh vật và sự thoát hơi nước quá mức từ môi
trường và mẫu cấy. Dạng bình nuôi cấy kín làm ảnh hưởng đến thành phần các khí
(Lentini và ctv, 1988) cũng như ánh sáng, vì vậy sự tích lũy nước quá mức và sự sinh
trưởng của mô cấy như sự kéo dài chồi, sự nảy chồi và trọng lượng tươi gia tăng nhận
thấy rằng kích cỡ của bình nuôi cấy có ảnh hưởng rõ rệt đến sự sinh trưởng của cây
dâu tây và tái sinh chồi của cây Vitis vinifera. Blazkova và ctv (1989) đã quan sát sự
13


khác nhau về sinh trưởng và phát triển của cây Chenpodium rubrum nuôi cấy in vitro
trong những bình nuôi cấy khác nhau và lý do cho sự khác nhau này là sự thay đổi
thành phần môi trường khí trong bình nuôi cấy như hàm lượng CO2 giảm và hàm
lượng ethylene gia tăng (De Proft và ctv, 1985).
Những đặc điểm trao đổi khí trong bình có thể được diễn ra tốt nhất bởi số lần
trao đổi khí trên một giờ. Số lần trao đổi khí trong một giờ (N) là tính chất vật lý của
bình nuôi cấy và không thay đổi. N có thể gia tăng từ 3 đến 6 lần bằng cách sử dụng
màng film polypropylen có khả năng cho khí thấm qua (Kozai và Sekimoto, 1988).
Một hệ thống bình nuôi cấy kín nhưng được làm thông thoáng để giảm hiện
tượng thủy tinh thể ở hoa cây bi bi (Gypsophyla paniculata) (Dillen và Buysens, 1989)
và cây hoa cẩm chướng (Hakkaart và Versluijs, 1983) và để nâng cao sự sinh trưởng
của cây dâu tây (Kozai và Sckimoto, 1988). Cuối cùng, việc tăng cường trao đổi
không khí giữa bình nuôi cấy và môi trường bên ngoài nhằm:

 Tăng hàm lượng CO2 ở mức tối ưu trong bình nuôi cấy nhằm tăng cường khả
năng quang hợp của cây in vitro (Tanaka và ctv, 1991). Giảm hàm lượng ethylene và
độc tố (De Proft và ctv, 1985). Giảm hàm lượng O2 trong bình nuôi cấy xuống khoảng
10% (Tanaka và ctv, 1991).
 Giải quyết vấn đề thủy tinh thể của cây do độ ẩm trong bình nuôi cấy cao
(Ohki và ctv, 1991). Dương Tấn Nhựt và ctv (2007) đã chứng minh rằng trong điều
kiện nuôi cấy thoáng khí cây có khả năng hình thành hệ rễ thứ cấp ngay trong giai
đoạn in vitro, điều này sẽ cải thiện tỷ lệ sống sót của cây khi đưa ra vườn ươm.
Việc cải thiện chế độ không khí trong bình nuôi cấy có thể đạt được thông qua
việc sử dụng màng lọc thoáng khí được gắn lên các lỗ của mỗi bình để ngăn bụi, vi
khuẩn và nhờ sự khuếch tán mà CO2 từ bên ngoài sẽ di chuyển vào bên trong các hệ
thống nuôi cấy, thành phần khí trong bình sẽ dần dần thay đổi bằng với thành phần khí
bên ngoài bình. Nồng độ CO2 còn có thể gia tăng nhờ việc bơm trực tiếp khí CO2 vào
bình hoặc bình nuôi cấy được chế tạo bằng vật liệu thoáng khí kết hợp với tăng áp lực
khí CO2 trong phòng nuôi. Ngoài ra, các bình nuôi cấy có dung tích lớn nhằm làm gia
tăng lượng không khí trong bình cũng đã được sử dụng. Việc sử dụng các bình lớn sẽ
đạt hiệu quả cao khi áp dụng phương pháp bơm không khí vào thẳng bình nuôi cấy để
cây trong bình không thiếu CO2 trong suốt quá trình tăng trưởng.

14