KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ CHẤT KÍCH THÍCH TĂNG TRƯỞNG LÊN QUÁ TRÌNH TÁI SINH CÂY ĐẬU XANH (Vigna radiataL. Wilczek) TỪ RỄ in vitro

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ CHẤT KÍCH
THÍCH TĂNG TRƯỞNG LÊN QUÁ TRÌNH TÁI SINH CÂY
ĐẬU XANH (Vigna radiataL. Wilczek) TỪ RỄ in vitro

Ngành học

: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện

: MAI THỊ THÚY TÌNH

Niên khóa

: 2009 – 2013

Tháng 6/2013

 


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ CHẤT KÍCH
THÍCH TĂNG TRƯỞNG LÊN QUÁ TRÌNH TÁI SINH CÂY
ĐẬU XANH (Vigna radiataL. Wilczek) TỪ RỄ in vitro

Hướng dẫn khoa học

Sinh viên thực hiện

ThS. TÔN BẢO LINH

MAI THỊ THÚY TÌNH

Tháng 6/2013

 


TÓM TẮT
Cây đậu xanh là một loại cây đậu đỗ quan trọng của nền nông nghiệp. Đậu xanh
chủ yếu được trồng lấy hạt để chế biến thức ăn, ngoài ra đậu xanh còn được coi như
một thứ dược liệu có lợi cho sức khỏe con người. Đậu xanh đã được trồng từ lâu
đờinhưng bị xem là cây trồng phụ tận dụng đất đai, lao động nên năng suất rất khiêm
tốn. Bên cạnh đó, các giống đậu xanh trồng ở Việt Nam chủ yếu là các giống có khả năng
chịu hạn kém và thường bị nhiễm bệnh.
Hiện nay, công nghệ gen được sử dụng để tạo ra các giống đậu xanh có năng suất,
chất lượng tốt, chống chịu được điều kiện thời tiết khắc nghiệt bằng phương pháp
chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium. Vì thế cần có hệ thống tái sinh để tạo ra cây
trồng chuyển gen, đặc biệt là chuyển gen sử dụng vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes.

Nội dung nghiên cứu được thực hiện thông qua nuôi cấy chóp rễ, qua quá trình
cảm ứng tạo sẹo và khảo sát các chất kích thích tăng trưởng lên quá trình tạo chồi.Hạt
đậu xanh được nuôi cấy trên môi trường MS cơ bản, thu mẫu chóp rễ và đoạn rễ cây in
vitro 5 ngày tuổivà sử dụng cho quá trình cảm ứng tạo mô sẹo trên môi trường MS bổ
sung 0,2 mg/l 2,4D kết hợp với 0,5 mg/l kinetin. Mô sẹo phát sinh sau 3 tuần nuôi cấy
trong điều kiện tối hoàn toàn. Sau đó chuyển mô sẹo sang môi trường bổ sung chất
kích thích tăng trưởng với các nồng độ khác nhau để tạo chồi.

i

 


SUMMARY
Mung bean is an important legume crop of agriculture. The mung beanis grown
primarily for processing grain foods, besides thatmung bean is considered as a
valuable herb for health. Mung beans have been grown for a long time but were
considered secondary crops so that save land and labor productivity should be very
modest. Besides, mung bean varieties grown in Vietnam is mainly the same low
drought tolerant and often become infected.
To day, gene engenering be used to created mung bean genus with high yield,
good quality, can withstand harsh weather conditions by means of gene transfer by
Agrobacterium. So the regeneration system is need for gene modiflied plant, specialy
in gene modifly by using Agrobacterium rhizogenes.
The study is about root tip culture, processing of callus induction and surveyeffect
of plant growth regulators on the shoot formation of mung bean.
Mung bean were grown onMS medium, root tip samplesin vitro is used for callus
induction. Samples were cultured on MS medium supplemented 2,4D 0.2 mg/l+
kinetin 0.5 mg/l. Callus inducted from samples after 3 weeks in dark conditions. Then,
callus were cultured on the medium which supplementwith BA, NAA in different

concentrations for shoot formation.
Keywords: Mung bean,Vigna radiata L. Wilczek, root-tip, callus induction.

ii

 


MỤC LỤC
Trang
Tóm tắt .............................................................................................................................. i
Summary ..........................................................................................................................ii
Mục lục .......................................................................................................................... iii
Danh sách các chữ viết tắt ............................................................................................... v
Danh sách các bảng ........................................................................................................ vi
Danh sách các hình ........................................................................................................vii
Chương 1 MỞ ĐẦU ........................................................................................................ 1
1.1Đặt vấn đề .................................................................................................................. 1
1.2 Yêu cầu của đề tài...................................................................................................... 1
1.3 Nội dung thực hiện .................................................................................................... 2
Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP .................................................................. 3
2.1Thời gian và địa điểm nghiên cứu .............................................................................. 3
2.2 Vật liệu ...................................................................................................................... 3
2.2.1 Đối tượng nghiên cứu ............................................................................................. 3
2.2.2Hóa chất và thiết bị sử dụng cho thí nghiệm ........................................................... 3
2.2.3 Môi trường nuôi cấy ............................................................................................... 3
2.3. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................................... 4
2.3.1 Tạo cây đậu xanh in vitro ....................................................................................... 4
2.3.2Thí nghiệm 1 Khảo sát ảnh hưởng của 2,4D và kinetin đến sự cảm ứng tạo mô
sẹo từ chóp rễ và đoạn rễ cây đậu xanhin vitro ............................................................... 5

2.3.3Thí nghiệm 2 Khảo sát ảnh hưởng của BA và NAA đến khả năngtái sinh chồitừ
mô sẹo chóp rễ cây đậu xanh in vitro .............................................................................. 6
2.3.4 Xử lý số liệu ........................................................................................................... 6
Chương 3 Kết quả và thảo luận ....................................................................................... 7
3.1 Kết quả tạo cây đậu xanh in vitro .............................................................................. 7
3.2 Kết quả thu được khi khảo sát ảnh hưởng của 2,4Dvà kinetin đến sự cảm ứng tạo
mô sẹo từ chóp rễ và đoạn rễ cây đậu xanhin vitro ......................................................... 8
3.3 Kết quả thu được khi khảo sát ảnh hưởng của BA và NAA đến khả năngtái sinh
chồitừ mô sẹo chóp rễ cây đậu xanh in vitro ................................................................. 14
iii

 


Chương 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .......................................................................... 17
4.1 Kết luận.................................................................................................................... 17
4.2 Đề nghị .................................................................................................................... 17

iv

 


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
MS

: Murashige và Skoog.

2,4 – D

: 2,4 – Dichlorophenoxyacetic Acid

Kinetin

: 6 – furfurylaminopurine

BA

: N6– Benzyladenine

NAA

: α–Naphthalene acetic acid

Cs

: Cộng sự

v

 


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng 2.1Các nghiệm thức khảo sát ảnh hưởng của 2,4D và kinetin đến sự cảm ứng tạo
mô sẹo trên chóp rễ cây đậu xanhin vitro ........................................................................ 5
Bảng 2.2Các nghiệm thức khảo sát ảnh hưởng của 2,4D và kinetin đến sự cảm ứng tạo
mô sẹo trên đoạn rễ cây đậu xanhin vitro ........................................................................ 5
Bảng 2.3Các nghiệm thức khảo sát ảnh hưởng của BA và NAA đến khả năng tái sinh
chồi từ mô sẹo chóp rễ cây đậu xanh in vitro .................................................................. 6

Bảng3.1 Kết quả tạo cây đậu xanh in vitro ..................................................................... 7
Bảng 3.2 Sự đáp ứng của mẫu chóp rễ trên môi trường nuôi cấy theo thời gian trong
điều kiện tối hoàn toàn .................................................................................................... 9
Bảng 3.3 Sự đáp ứng của mẫu đoạn rễ trên môi trường nuôi cấy theo thời gian trong
điều kiện tối hoàn toàn .................................................................................................. 10
Bảng 3.4Ảnh hưởng của 2,4D và kinetin đến số lượng và đường kính (ĐK) mô sẹo
của mẫu chóp rễ cây đậu xanh ....................................................................................... 12
Bảng 3.5Ảnh hưởng của 2,4D và kinetin đến số lượng và đường kính mô sẹo của mẫu
đoạn rễ cây đậu xanh ..................................................................................................... 13
 

vi

 


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Hình 2.1Hạt đậu xanh ..................................................................................................... 3
Hình 3.1 Hạt đậu xanh và cây đậu xanhin vitro ............................................................. 7
Hình 3.2 Các loại mô sẹo ................................................................................................ 8
Hình 3.3Mô sẹo mẫu chóp rễ sau 20 ngày nuôi cấy ở các nghiệm thức ........................ 8
Hình 3.4Mô sẹo mẫu chóp rễ sau 14 ngày nuôi cấy ở các nghiệm thức ...................... 10
Hình 3.5Mô sẹo mẫu đoạn rễ sau 14 ngày nuôi cấy ở các nghiệm thức ...................... 11
Hình 3.6Mô sẹo mẫu chóp rễ sau 30 ngày nuôi cấy trên môi trường tạo chồi ............. 16

vii

 

Chương 1 MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề
Cây đậu xanh (Vigna radiata L. Wilczek) là một loại cây đậu đỗ quan trọng của
nền nông nghiệp Châu Á. Cây đậu xanh chủ yếu được trồng lấy hạt để chế biến thức
ăn như giá đỗ, chè đậu xanh, dịch cốt đậu xanh, bánh đậu xanh. Bên cạnh đó đậu xanh
còn được coi như một thứ dược liệu có tác dụng giải độc thanh nhiệt, bớt sưng phù,
điều hòa ngũ tạng chữa bệnh cho con người. Hạt đậu xanh là một mặt hàng nông sản
có giá trị xuất khẩu. Ngoài hạt, lá non và ngọn của cây đậu xanh có thể làm rau, muối
dưa; thân lá xanh làm thức ăn chăn nuôi. Trồng cây đậu xanh còn có tác dụng chống
xói mòn và cải tạo đất.
Ở  Việt Nam, đậu xanh đã được trồng lâu đời, khắp nơi trong cả nước, nhưng bị
xem là cây trồng phụ tận dụng đất đai, lao động nên năng suất rất khiêm tốn. Chỉ trong
thời gian gần đây đậu xanh mới được quan tâm phát triển. Tuy nhiên, các giống đậu
xanh trồng ở Việt Nam chủ yếu là các giống có khả năng chịu hạn kém và thường bị nhiễm
một số bệnh.
Hiện nay, công nghệ gen được sử dụng để tạo ra các giống đậu xanhcó chất lượng
tốt, năng suất cao và ổn định, sinh trưởng mạnh, thời gian sinh trưởng ngắn, chín tập
trung, chất lượng hạt cao, có khả năng chống chịu hạn, úng, sâu bệnh tốt và chịu thâm
canh bằng phương pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium.Vì thế cần có hệ
thống tái sinh để tạo ra cây trồng chuyển gen, đặc biệt là chuyển gen sử dụng vi khuẩn
Agrobacterium rhizogenes do vi khuẩn này có khả năng tạo rễ tóc biến đổi gen dễ hơn
sử dụng Agrobacteriumtumefaciens.
Do đó, nghiên cứu “Khảo sát ảnh hưởng của một số chất kích thích tăng trưởng
lên quá trình tái sinh cây đậu xanh (Vigna radiata L. Wilczek) từ rễ in vitro” được
thực hiện là cơ sở đểtiến hành quá trình chuyển gen trên cây đậu xanh thông qua vi
khuẩn Agrobacterium rhizogeneses.
1.2 Yêu cầu của đề tài
Xác định nồng độ chất điều hòa sinh trưởng và vị trí lấy mẫu tốt nhất cho sự cảm
ứng tạo sẹo từ chóp rễ cây đậu xanh in vitro.
Xác định môi trường tối ưu cho quá trình phát sinh phôi vô tính và tái sinh chồi

con từ mô sẹo.
1

 


1.3 Nội dung thực hiện
Khảo sát ảnh hưởng của 2,4D và kinetin đến sự cảm ứng tạo mô sẹo từ chóp rễ và
đoạn rễ cây đậu xanh in vitro.
Khảo sát ảnh hưởng của BA và NAA đến sự phát sinh phôi vô tính và hình
thànhchồi con từ chóp rễ cây đậu xanh in vitro.

2

 


Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Đề tài được thực hiện từ tháng 12 năm 2012 đến hết tháng 6 năm 2013 tại Phòng
thí nghiệm Nuôi cấy mô thực vật, Bộ môn Công Nghệ sinh học, Trường Đại học Nông
Lâm TP. Hồ Chí Minh.
2.2. Vật liệu
2.2.1 Đối tượng nghiên cứu
Hạt giống đậu xanh TN 182 sản xuất bởi Công ty TNHH– TM Trang Nông, Bình
Chánh, TP.HCM được sử dụng là những hạt to, tròn, đẹp, có kích thước tương đối đều
nhau để thực hiện đề tài.

Hình 2.1 Hạt đậu xanh

2.2.2 Hóa chất và thiết bị sử dụng cho thí nghiệm
Hóa chất: Môi trường MS, 2,4D, NAA, BA, kinetin, các khoáng chất đa lượng, vi
lượng, vitamine, ethanol, Javen, xà phòng và nhiều hóa chất thông dụng khác.
Thiết bị: Nồi hấp (Tomy, Nhật Bản), tủ cấy vô trùng (Thiên Trường, Việt Nam),
máy đo pH (HANA Instruments), cân điện tử (XT 220 – Precisa, Thụy Sỹ), tủ sấy
(Memmert, Đức), tủ lạnh (Toshiba, Nhật Bản) và nhiều dụng cụ khác.
2.2.3. Môi trường nuôi cấy
Môi trường sử dụng trong các thí nghiệm là môi trường MS (Murashige and
Skoog, 1962) (thành phần môi trường xem ở phụ lục) có bổ sung 30 g/l sucrose, 8 g/l
agar.
Trong các thí nghiệm khác nhau, tùy vào từng mục đích mà môi trường MS được
bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng (2,4D, kinetin, BA và NAA) ở những nồng độ
khác nhau. Môi trường nuôi cấy được chứa trong các chai thủy tinh loại 500ml,
3

 


250ml(thể tích môi trường lần lượt là 50ml, 25 ml). Môi trường được điều chỉnh đến
pH 5,8 bằng NaOH 1N hoặc HCl 10% trước khi hấp khử trùng trong autoclave tại
nhiệt độ 121oC, áp suất 1 atm trong 25 phút. Các mẫu cấy trên môi trường được đặt
trong phòng tăng trưởng với nhiệt độ trung bình luôn ổn định khoảng 25 + 2oC, cường
độ chiếu sáng là 2000 – 3000 lux và thời gian chiếu sáng là 16 giờ/ ngày.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Tạo cây đậu xanh in vitro
Giai đoạn vô mẫu được thực hiện theo qui trình củaNguyễn Thị Luyện(2009).
Khử trùng ngoài phòng cấy: Hạt đậu xanh được rửa sạch bằng nước máy, sau đó
rửa sạch bằng xà phòng, cuối cùng tráng lại nhiều lần bằng nước cất cho đến khi sạch
xà phòng.
Khử trùng trong phòng cấy: Hạt đậu xanh được khử trùng trong điều kiện vô trùng

bằng cồn 70% trong thời gian 1 phút, tráng lại bằng nước cất khử trùng 1 đến 2 lần.
Thêm dung dịch Javen60% lắc đều trong 20 – 25 phút, sau đó rửa bằng nước cất khử
trùng 3 đến 4 lần. Ngâm hạt đã được khử trùng trong nước cất vô trùng trong thời gian
5 giờ.
Sau 5 giờ, lấy hạt đậu xanh cấy vào các chai thủy tinh đã chứa sẵn môi trường
nuôi cấy MS.
Chỉ tiêu theo dõi:
-

Tỉ lệ (%) mẫu sống: là tỉ lệ phần trăm hạt nuôi cấy nảy mầm thành cây con và
không bị nhiễm nấm, khuẩn sau thời gian nuôi cấy so với tổng số hạt cấy ban
đầu.
Tỉ lệ mẫu sống =

-

Tổng số hạt nảy mầm và không bị nhiễm x 100
Tổng số hạt trong thí nghiệm

Tỉ lệ (%) mẫu chết: là tỉ lệ phần trăm hạt nuôi cấy không nảy mầm, chếthoặc bị
nhiễm nấm, khuẩn sau thời gian nuôi cấy so với tổng số hạt cấy ban đầu.
Tỉ lệ mẫu chết =

Tổng số hạt không nảy mầm, chết x 100
Tổng số hạt trong thí nghiệm

4

 

2.3.2Thí nghiệm 1Khảo sát ảnh hưởng của 2,4D và kinetin đến sự cảm ứng tạo
mô sẹo từ chóp rễ và đoạn rễ cây đậu xanhin vitro
Mẫu chóp rễ và mẫu đoạn rễ của cây đậu xanh in vitro sau khi nuôi cấy5 ngày
được sử dụng làm vật liệu cho thí nghiệm này. Chóp rễ được cắt với kích thước 0,5 –1
cm, mẫu đoạn rễ được cắt tiếp sau khi cắt xong chóp rễ với kích thước 1 – 1,5 cm. Các
mẫu được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 2,4D và kinetin với các nồng độ
được nêu ởbảng 2.1 và bảng 2.2.
Bảng 2.1Các nghiệm thức khảo sát ảnh hưởng của 2,4D và kinetin đến sự cảm ứng tạo
mô sẹo trên chóp rễ cây đậu xanhin vitro 
Nghiệm
thức

Môi trường

2,4D (mg/l)

Kinetin (mg/l)

Số
mẫu/chai

Tổng mẫu

DKC

MS

0

0

4

12 

DK0.3C

MS 

0,2

0,3

4 

12 

DK0.5C

MS 

0,2 

0,5

4 

12 

DK0.7C

MS 

0,2 

0,7

4 

12 

DK1C

MS 

0,2 

1,0

4 

12 

 
Bảng 2.2Các nghiệm thức khảo sát ảnh hưởng của 2,4D và kinetin đến sự cảm ứng tạo
mô sẹo trên đoạn rễ cây đậu xanhin vitro
Nghiệm
thức

Môi trường

2,4D (mg/l)

Kinetin (mg/l)

Số
mẫu/chai

Tổng mẫu

DKR

MS

0

0

4

12 

DK0.3R

MS 

0,2

0,3

4 

12 

DK0.5R

MS 

0,2 

0,5

4 

12 

DK0.7R

MS 

0,2 

0,7

4 

12 

DK1R

MS 

0,2 

1,0

4 

12 

Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với ba lần lặp lại, mỗi lần lặp lại
gồm 12 mẫu cho một nghiệm thức. Các mẫu cấy được nuôi với điều kiện nhiệt độ tối
hoàn toàn 25 + 2oCtrong thời gian 2 tuần để cảm ứng tạo mô sẹo, sau đó chuyển mô
sẹo sang nuôi cấy dưới ánh sáng trắng trong thời gian 2 tuần để tái sinh hình thái từ mô
sẹo.
Chỉ tiêu theo dõi gồm: sự đáp ứng tạo sẹo của các mẫu chóp rễ và mẫu đoạn rễ
trên các môi trường nuôi cấy, số mẫu tạo sẹo, đường kính mô sẹo (mm, là đường kính
5

 


trung bình của mô sẹo), màu sắc và hình thái của mô sẹo.So sánh sự cảm ứng tạo mô
sẹo từ mẫu chóp rễ và mẫu đoạn rễ.
2.3.3Thí nghiệm 2Khảo sát ảnh hưởng của BA và NAA đến khả năngtái sinh
chồitừ mô sẹo chóp rễ cây đậu xanh in vitro
Bảng 2.3Các nghiệm thức khảo sát ảnh hưởng của BA và NAA đến khả năng tái sinh
chồi từ mô sẹo chóp rễ cây đậu xanh in vitro.
Nghiệm

thức

Môi trường

BA (mg/l)

NAA (mg/l)

Số
mẫu/chai

Tổng mẫu

BN

MS

0,0

0,0

4 

12

B0.5N0
B0.5N0.3

MS

0,5

0,0

4 

12

MS

0,5

0,3

4 

12

B0.5N0.5

MS

0,5

0,5

4 

12

B0.5N1

MS

0,5

1,0

4 

12

B1N0
B1N0.3

MS

1,0

0,0

4 

12

MS

1,0

0,3

4 

12

B1N0.5

MS

1,0

0,5

4 

12

B1N1

MS

1,0

1,0

4 

12

Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với ba lần lặp lại, mỗi lần lặp lại

gồm 12 mẫu cho một nghiệm thức. Vật liệu dùng cho thí nghiệm này là các mẫu cảm
ứng mô sẹo từ nghiệm thức cho kết quả tốt nhất ở thí nghiệm 1.
Chỉ tiêu theo dõi gồm: Sự phát sinh chồi từ mô sẹo; tỉ lệ (%) mẫu hình thành chồi
con sau thời gian nuôi cấy; số rễ, chiều dài rễ và chiều cao của chồi (cm).
2.4 Xử lý số liệu
Số liệu được thu thập, mã hoá bằng phần mềm Excel và xử lí thống kê bằng phần mềm
MSTATC, trắc nghiệm phân hạng kiểu LSD phân tích kết quả dựa vào kết quả từ bảng
ANOVA.

6

 


Chương 3KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1Kết quả tạo cây đậu xanh in vitro
Hạt đậu xanh được chọn lựa với các kích thước tương đối đều nhau (hình 3.1a),
sau khi được khử trùng tiến hành nuôi cấy trong môi trường MS cơ bản (thành phần ở
phụ lục), tạo thành cây đậu xanhin vitro (hình 3.1b) và thu được kết quả ở bảng 3.1.

(a)

(b)

Hình 3.1 Hạt đậu xanh (a), cây đậu xanhin vitro sau 5
ngày nuôi cấy(b)

Bảng3.1 Kết quả tạo cây đậu xanh in vitro
Tổng số mẫu

Số mẫu sống

Số mẫu chết

Tỉ lệ mẫu sống
(%)

Tỉ lệ mẫu chết
(%)

200

191

9

95,5

4,5

Kết quả vô mẫu tạo cây đậu xanh in vitrođược ghi nhận trong bảng 3.1. Kết quả
cho thấy số mẫu sống rất cao (191/200 hạt nảy mầm tạo thành cây con và không bị
nhiễm), đạt tỉ lệ 95,5%. Số mẫu chết thấp (9/200 hạt không nảy mầm và nhiễm
nấm),chỉ đạt tỉ lệ 4,5%.
Các bước khử trùng cho quá trình vô mẫu hạt tạo cây đậu xanh in vitro được thực
hiện theo quy trình của Nguyễn Thị Luyện (2009). Theo nghiên cứu của tác giả thì cồn
70% và javen 60% đảm bảo cho hạt nảy mầm cao, khả năng bị nhiễm và bị thối rất
thấp. Do đó, khi thức hiện theo thời gian và nồng độ trên đã cho kết quả tạo cây đậu
xanh khá tốt (bảng 3.1). Tuy nhiên, trong quá trình thực hiện khử trùng hạt ngoài
phòng cấy rồi di chuyển vào trong phòng cấy, ngoài ra thao tác thực hiện chưa tốt nên

vẫn có những hạt bị nhiễm và chết, nhưng tỉ lệ này rất thấp (chỉ 4,5%).

7

 


3.2Kết quả thu được khi khảo sát ảnh hưởng của 2,4D và kinetin đến sự cảm ứng
tạo mô sẹo từ chóp rễ và đoạn rễ cây đậu xanhin vitro
Mẫu chóp rễ và mẫu đoạn rễ của cây đậu xanh in vitro sau khi nuôi cấy 5 ngày
đượcsử dụng và tiến hành nuôi cấy trên các môi trường bổ sung chất điều hòa sinh
trưởng khác nhau.
Trong quá trình nuôi cấy ở điều kiện tối, các loại mô phản ứng đáp ứng khác nhau
với các môi trường khác nhau do đó các loại mô sẹo hình thành cũng khác nhau. Loại
mô sẹo tốt (hình 3.2a) là các mô sẹo có kích thước lớn, chắc và sẹo lan rộng hết toàn
bộ mẫu chóp rễ cũng như mẫu đoạn rễ. Loại mô sẹo xấu (hình 3.2b) là các mô sẹo có
kích thước nhỏ, sẹo chỉ xuất hiện ở các đầu vết cắt và một phần nhỏ trên mẫu. Cuối
cùng là mô sẹo chết (hình 3.2c), là các mẫu có cảm ứng tạo sẹo nhưng sau một thời
gian (sau 2 tuần) thì hóa nâu và chết dần.

(b)

(a)

(c)

Hình 3.2 Mô sẹo tốt (a), Mô sẹo xấu (b), mô sẹo chết (c)

Sau 10 ngày nuôi cấy trong điều kiện tối hoàn toàn, các mẫu chóp rễ có hiện tượng
phình lên và cảm ứng tạo mô sẹo ở phần vết cắt sau đó lan dần đến vùng giữa.Ở phần

chóp rễngoài hiện tượng như phần vết cắt thì còn thấy chóp rễ dài ra thêm từ 0,5 – 1,5
mm, có màu trắng đục, rõ rệt nhất là ở nghiệm thức DK0.3C (hình 3.3a) và DK0.7C
(hình 3.3b). Các mô sẹo tiếp tục phát triển, tăng trưởng và có màu vàng trong 2 tuần
tiếp theo khi nuôi cấy ở điều kiện tối.

a)

b)

Hình 3.3Mô sẹo mẫu chóp rễ sau 20 ngày nuôi cấy ở các nghiệm thức
(a)Nghiệm thức DK0.3C: MS+ 0,2 mg/l 2,4D + 0,3 mg/l kinetin;
(b) Nghiệm thức DK0.7C MS+ 0,2 mg/l 2,4D + 0,7 mg/l kinetin.
8

 


Cũng như mẫu chóp rễ, các mẫu đoạn rễ sau 12 ngày có hiện tượng phình lên và
cảm ứng tạo mô sẹo ở hai đầu vết cắt sau đó lan đến vùng giữa. Tuy nhiên, các mẫu
đoạn rễ cảm ứng tạo mô sẹo chậm hơn và có kích thước nhỏ hơn mẫu chóp rễ. Ở một
tuần tiếp theo các mô sẹo tiếp tục phát triển và tăng trưởng. Khi tiếp tục theo dõi thêm
từ một tuần trở đi, các mô sẹo chuyển sang màu nâu ở các vết cắt và sau đó màu nâu
dần chiếm vào phần trong đoạn rễ, làm cho cả đoạn rễ hóa nâu và chết dần theo thời
gian nuôi cấy.
So với nghiên cứu của Đỗ Ngọc Thanh Mai (2012) trên chóp rễ cây tỏi ta
(Allium sativum L.) có sự khác biệt rõ ràng. Trên chóp rễ cây tỏi ta cũng có hiện tượng
cảm ứng tạo mô sẹo tuy nhiên trên đoạn rễ thì không có hiện tượng này. Hai đầu vết
cắt trên mẫu đoạn rễ chuyển sang màu nâu rồi lan dần vào trong đoạn rễ và theo thời
gian thì mẫu chết dần.
Bảng 3.2 Sự đáp ứng của mẫu chóp rễ trên môi trường nuôi cấy theo thời gian trong

điều kiện tối hoàn toàn
Nghiệm thức

Trạng thái của mẫu chóp rễ sau thời gian nuôi cấy
2 tuần
Phần chóp kéo dài, có màu trắng
đục, phần vết cắt có màu vàng

DKC

nâu, mọc thêm nhiều rễ nhỏ dọc
theo chiều dài mẫu cấy

DK0.3C

DK0.5C

DK0.7C

DK1C

chia rễ thành 2 màu khác nhau.
Phần chóp màu trắng đục, phần
vết cắt có dấu hiệu chết và hóa
nâu

Chóp rễ phình lên, dài ra, tạo sẹo,

Chóp rễ phình lên, có cảm ứng

có màu vàng nhạt

tạo sẹo nhưng ít hơn chóp rễ 

Chóp rễ phình lên, tạo sẹo, có

Chóp rễ phình lên, có cảm ứng

màu vàng sáng

tạo sẹo, có màu nâu vàng 

Chóp rễ phình lên, dài ra, tạo sẹo,

Chóp rễ phình lên, có cảm ứng

có màu vàng nhạt

tạo sẹo, có màu nâu vàng 

Chóp rễ phình lên, tạo sẹo, có

Chóp rễ phình lên, có cảm ứng

màu vàng nhạt

tạo sẹo nhưng rất ít 

9

 

3 tuần
Phần chóp rễ tiếp tục kéo dài,


Hình 3.4Mô sẹo mẫu chóp rễ sau 14 ngày nuôi cấy ở các nghiệm thức
(a)Nghiệm thức đối chứng ĐK: MS + 0 mg/l 2,4D + 0 mg/l kinetin; (b) Nghiệm thức
DK0.3C:MS+ 0,2 mg/l 2,4D + 0,3 mg/l kinetin; (c) Nghiệm thức DK0.5C:MS+ 0,2
mg/l 2,4D + 0,5 mg/l kinetin; (d) Nghiệm thức DK0.7C:MS+ 0,2 mg/l 2,4D + 0,7
mg/l kinetin;(e) Nghiệm thức DK1C: MS+ 0,2 mg/l 2,4D + 1,0 mg/l kinetin.

Bảng 3.3 Sự đáp ứng của mẫu đoạn rễ trên môi trường nuôi cấy theo thời gian trong
điều kiện tối hoàn toàn
Nghiệm thức

Trạng thái của mẫu đoạn rễ sau thời gian nuôi cấy
2 tuần
Chiều dài đoạn rễ không thay đổi,

DKR

mọc thêm các rễ nhỏ dọc theo
chiều dài mẫu cấy, hai đầu vết cắt
chuyển sang màu nâu

DK0.3R

DK0.5R

DK0.7R
DK1R

Chiều dài đoạn rễ không thay
đổi, toàn bộ đoạn rễ hóa nâu và
có dấu hiệu chết

Đoạn rễ phình lên, cảm ứng tạo

Mô sẹo hóa nâu, có dấu hiệu

sẹo, có màu nâu 

chết 

Đoạn rễ phình lên, có cảm ứng tạo Mô sẹo hóa nâu, có dấu hiệu
sẹo, có màu nâu vàng 

chết 

Đoạn rễ phình lên, có cảm ứng tạo Mô sẹo hóa nâu, có dấu hiệu
sẹo, có màu nâu vàng 

chết 

Đoạn rễ phình lên, có cảm ứng tạo Mô sẹo hóa nâu, có dấu hiệu
sẹo nhưng rất ít, có màu nâu vàng  chết nhiều 

10

 

3 tuần


Hình 3.5Mô sẹo mẫu đoạn rễ sau 14 ngày nuôi cấy ở các nghiệm thức
(a) Nghiệm thức đối chứng DR: MS + 0 mg/l 2,4D + 0 mg/l kinetin; (b) Nghiệm
thức D0.3R:MS+ 0,2 mg/l 2,4D + 0,3 mg/l kinetin; (c)Nghiệm thức D0.5R:MS+
0,2 mg/l 2,4D + 0,5 mg/l kinetin;(d) Nghiệm thức D0.7R:MS+ 0,2 mg/l 2,4D +
0,7 mg/l kinetin; (e) Nghiệm thức D01R:MS+ 0,2 mg/l 2,4D + 1,0 mg/l kinetin.

Đường kính mô sẹo và số lượng mẫu tạo sẹo ở các nghiệm thức của mẫu chóp rễ
đều khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức p < 0,01(Bảng 3.4).
Trên môi trường có bổ sung 0,2 mg/l 2,4Dvà kinetin với mức nồng độ từ 0,3 đến
0,5 mg/l thì đường kính cũng như số lượng mô sẹo của mẫu chóp rễ tăng nhưng khi
tiếp tục gia tăng nồng độ kinetin lên 0,7 mg/l thì đường kính và số lượng mô sẹo giảm
(tuy không có sự khác biệt về mặt thống kê giữa hai nghiệm thức 0,5 và 0,7 mg/l) và
tiếp tục giảm khi nồng độ kinetin là 1 mg/l. Đường kính trung bình khá lớn ở nghiệm
thức DK0.5C (3,5 mm) và nghiệm thức DK0.7C (3,2 mm), đường kính trung bình nhỏ
hơn ở nghiệm thức DK0.3C (2,9 mm) và nhỏ nhất ở nghiệm thức DK1C (2,7 mm).
Theo kết quả thí nghiệm từ bảng 3.4 cho thấy nghiệm thức DK0.3C (0,2 mg/l
2,4D + 0,3 mg/l kinetin) cho số lượng mẫu tạo sẹo tương đối nhiều (9,3/12 mẫu cấy),
đạt tỉ lệ 77,5%. Ở nghiệm thứcDK0.5C (0,2 mg/l 2,4D + 0,5 mg/l kinetin) số lượng
mẫu tạo sẹo là nhiều nhất (11/12 mẫu cấy), đạt tỉ lệ 91,67%. Đối với nghiệm thức
DK0.7C (0,2 mg/l 2,4D + 0,7 mg/l kinetin) số lượng mẫu tạo sẹo là 10,3/12 mẫu cấy,
đạt tỉ lệ 85,8%. Do sự chênh lệch không đáng kể nên không có sự khác biệt về mặt
thống kê giữa hai nghiệm thứcDK0.5C và DK0.7C. Ở nghiệm thức DK1C (0,2 mg/l
2,4D + 1,0 mg/l kinetin) số lượng mẫu tạo sẹo bằng với nghiêm thức DK0.3C (9,3/12
mẫu cấy), đạt tỉ lệ 77,5%.
11

 


Như vậy, từ kết quả ở bảng 3.4 cho thấy nghiệm thức DK0.5C (0,2 mg/l 2,4D +
0,5 mg/l kinetin) vàDK0.7C (0,2 mg/l 2,4D + 0,7 mg/l kinetin)có số lượng mẫu tạo sẹo
nhiều nhất và đường kính lớn nhất. Nghiệm thức có số lượng tạo sẹo thấp nhất, đường
kính nhỏ nhất là DK0.3C (0,2 mg/l 2,4D + 0,3 mg/l kinetin) và DK1C (0,2 mg/l 2,4D
+ 1,0 mg/l kinetin).
Bảng 3.4Ảnh hưởng của 2,4D và kinetin đến số lượng và đường kính (ĐK) mô sẹo
của mẫu chóp rễ cây đậu xanh
Nghiệm
thức
DK0.3C
DK0.5C
DK0.7C
DK1C
ANOVA
CV (%)

Kích thích tăng trưởng (mg/l)
2,4D
Kinetin
0,2
0,3
0,2
0,5
0,2
0,7
0,2

1,0

ĐK mô sẹo
(mm)
2,9b ± 0,2
3,5a ± 0,3
3,2ab ± 0,2
2,7b ± 0,1
**
6,8

Số lượng mẫu tạo
sẹo+ SD
9,3b ± 0,6
11,0a ± 0,00
10,3ab ± 0,6
9,3b ± 0,6
**
5,0

**: khác biệt có ý nghĩa ở mức p ≤ 0,01.
Trong cùng một cột, các giá trị trung bình có kí tự giống nhau không có sự khác biệt về mặt
thống kê.

Đường kính mô sẹo và số lượng mẫu tạo sẹo ở các nghiệm thức của mẫu đoạn rễ
đều khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức p < 0,01(Bảng 3.5).
Trên môi trường có bổ sung 0,2 mg/l 2,4Dvà kinetin với mức nồng độ từ 0,3 đến
0,5 mg/l thì đường kính cũng như số lượng mô sẹo của mẫu đoạn rễ tăng nhưng khi
tiếp tục gia tăng nồng độ kinetin lên 0,7 mg/l thì đường kính và số lượng mô sẹo giảm
và tiếp tục giảm khi nồng độ kinetin là 1 mg/l. Đường kính trung bình lớn nhất ở

nghiệm thức DK0.5R (2,8 mm), nhỏ hơn ở nghiệm thức DK0.3R (1,9 mm) và DK0.7R
(2,0 mm) và nhỏ nhất ở nghiệm thức DK1R (1,2 mm).
Theo kết quả thí nghiệm từ bảng 3.5 cho thấy nghiệm thức DK0.5R (0,2 mg/l
2,4D + 0,5 mg/l kinetin) có số lượng mẫu tạo mô sẹo tương đối nhiều (9/12 mẫu cấy)
đạt tỉ lệ 75%. Số lượng mẫu tạo sẹo ít hơn ở 2 nghiệm thức DK0.3R (0,2 mg/l 2,4D +
0,3 mg/l kinetin) với 7/12 mẫu cấy đạt tỉ lệ 58,3% và nghiệm thức DK0.7R (0,2 mg/l
2,4D + 0,7 mg/l kinetin) với 6,7/12 mẫu cấy đạt tỉ lệ 55,8%. Tuy nhiên không có sự
khác biệt về mặt thống kê giữa hai nghiệm thức này. Nghiệm thức có số lượng mẫu tạo
mô sẹothấp nhất (4,7/12 mẫu cấy) là DK1R (0,2 mg/l 2,4D + 1,0 mg/l kinetin), đạt
39,2%.

12

 


Như vậy, nghiệm thức DK0.5R có số lượng mẫu tạo sẹo nhiều nhất và đường kính
lớn nhất. Nghiệm thức có số lượng tạo sẹo thấp nhất và đường kính nhỏ nhất là DK1R
(bảng 3.5).
Bảng 3.5Ảnh hưởng của 2,4D và kinetin đến số lượng và đường kính mô sẹo của mẫu
đoạn rễ cây đậu xanh
Nghiệm
thức
DK0.3R
DK0.5R
DK0.7R
DK1R
ANOVA
CV (%)

Kích thích tăng trưởng (mg/l)
2,4D
Kinetin
0,2
0,3
0,2
0,5
0,2
0,7
0,2
1,0

ĐK mô sẹo
(mm)
1,9b± 0,1
2,8a ± 0,1
2,0b ± 0,1
1,2c ± 0,2
**
6,3

Số lượng mẫu tạo
sẹo+ SD
7,0b ± 0,0
9,0a ± 0,0
6,7b ± 0,6
4,7c ± 0,6
**
6,0

**: khác biệt có ý nghĩa ở mức p ≤ 0,01.
Trong cùng một cột, các giá trị trung bình có kí tự giống nhau không có sự khác biệt về mặt
thống kê.

Như vậy, từ kết quả của bảng 3.4 và bảng 3.5 với cùng nồng độ tương ứng với các
nghiệm thức thì đường kính mô sẹo ở mẫu chóp rễ (đường kính lớn nhất ở nghiệm
thức DK0.5C là 3,5 mm) lớn hơn so với mẫu đoạn rễ (2,8 mm ở nghiệm thức DK0.5R).
Bên cạnh đó số lượng mẫu tạo sẹo ở nghiệm thức DK0.5C là 11/12 mẫu cấy từ chóp rễ
cũng nhiều hơn so với mẫu đoạn rễ là 9/12 mẫu cấy ở nghiệm thức DK0.5R. Ngoài ra,
chất lượng sẹo trên chóp rễ cũng tốt hơn so với mẫu đoạn rễ.
Cytokinin có tác dụng kích thích sự phân chia tế bào, tuy nhiên, cytokinin lại dễ
bịphân giải do hoạt động của enzyme cytokinin oxydase. Để khắc phục, cytokinin cần
kết hợp với auxin trong sự hình thành và tăng sinh mô sẹo, vì auxin cũng có tác dụng
giúp phân chia tế bào và giảm hoạt tính enzyme cytokinin oxydase (Mai Trần Ngọc
Tiếng, 2010). Rao và cs (2005) đã sử dụng 2,4D kết hợp kinetine với nồng độ 9,05 +
4,60 µM/lcho sự cảm ứng tạo mô sẹo của trụ dưới lá mầm trên cây đậu xanh cũng cho
kết quả tốt.
Do đó, việc kết hợp giữa 2,4D và kinetin trong thí nghiệm giúp việc hình thành mô
sẹo tốt hơn.
Tuy nhiên, Mai Trần Ngọc Tiếng (2001) cũng cho rằng sự tăng trưởng của tế bào
chậm dần hoặc ngưng tăng trưởng thường do các yếu tố cần thiết trong môi trường
dinh dưỡng đã bị cạn kiệt hoặc môi trường có chứa các thành phần trở thành độc tố đối
với tế bào. Trong thí nghịêm này, kinetin được bổ sung trong giai đoạn đầu có tác
13

 


dụng kích thích tế bào phân chia hình thành mô sẹo, tuy nhiên do thời gian cảm ứng
quá lâu và nồng độ cytokinin cao quay lại ức chế sự tăng trưởng.Mặt khác, Gaspar và

cs (1996) còn cho rằng auxin hiện diện ở một mức độ nào đó sẽ làm giảm tích lũy của
cytokinin, ngược lại cytokinin cũng ức chế vài hoạt tính của auxin. Điều đó giải thích
cho việc khi tăng nồng độ Kinetin lên 0,7 và 1,0 mg/l thì đường kính mô sẹo lại giảm.
Như vậy, từ bảng 3.4 và bảng 3.5 cũng cho thấy các mẫu chóp rễ cảm ứng tạo mô
sẹo tốt hơn, theo thời gian nuôi cấy mô sẹo tăng trưởng nhiều hơn. Trong khi đó mẫu
đoạn rễ cảm ứng tạo mô sẹo ít hơn và sau thời gian nuôi cấy (sau 3 tuần) thì các mô
sẹo chuyển sang màu nâu và chết dần. Do đó, lấy mẫu chóp rễ có nồng độ 0,2 mg/l
2,4D + 0,5 mg/l kinetin (nghiệm thức DK0.5C) để tiến hành thí nghiệm 2.
3.3 Kết quả thu được khi khảo sát ảnh hưởng của BA và NAA đến khả năngtái
sinh chồitừ mô sẹo chóp rễ cây đậu xanh in vitro
Thí nghiệm được thực hiện với vật liệu là mẫu mô sẹo đã được nuôi cấy trong thí
nghiệm 1. Các mô sẹo sau khi được nuôi cấy trong môi trường MS + 0,2 mg/l 2,4D +
0,5 mg/l kinetin được chuyển sang môi trường nuôi cấy tạo chồi.
Sau 30 ngày nuôi cấy cho thấy các mô sẹo ở tất cả các nghiệm thức (hình 3.6) đều
tiếp tục phát triển và tăng sinh tạo thêm lượng mô sẹo mới (riêng với nghiệm thức đối
chứng BN các mô sẹo không tăng sinh và chết dần). Cụ thể, ở nghiệm thức B0.5N0
mô sẹo tiếp tục phát triển tăng sinh nhưng sau 3 tuần mô sẹo bắt đầu hóa nâu, có mô
sẹo tạo các rễ màu trắng. Cũng giống như nghiệm thức B0.5N0, mô sẹo ở B0.5N0.3
tiếp tục tăng sinh và hóa nâu nhiều hơn theo thời gian nuôi cấy, có tạo rễ, nhưng sự
hóa nâu của một phần mô sẹo làm mẫu kém phát triển. Ở các nghiệm thức B0.5N0.5
và B0.5N1 mô sẹo tăng sinh và tiếp tục phát triển, mô sẹo ở các nghiệm thức đều có
màu xanh, bóng nhưng không có khả năng cảm ứng tạo chồi. Mô sẹo tăng sinh, có
màu xanh, xốp, một phần hóa nâu ở nghiệm thức B1N0, làm cho mô sẹo ở nghiệm
thức này kém phát triển. Với nghiệm thức B1N0.3, mô sẹo có tăng sinh và hóa nâu gần
hết mẫu và chết dần, nên không có khả năng tái sinh. Nghiệm thức B1N0.5, mô sẹo
tiếp tục tăng sinh, có màu xanh, bóng nhưng mô sẹo cứ tiếp tục tăng sinh và không có
khả năng tái sinh. Ở nghiệm thức B1N1, các mô sẹo tăng sinh và hóa nâu gần hết mẫu
dẫn đến mô sẹo có khả năng chết và không thể tái sinh.
Kết quả từ thí nghiệm trên nhận thấy rằng khi nuôi cấy mô sẹo từ chóp rễ cây đậu
xanh in vitro ở môi trường nghiệm thức B0.5N0 (0,5 mg/l BA) vàB0.5N0.3 (0,5 mg/l

14

 


BA + 0,3 mg/l NAA) các mô sẹo tăng sinh và tạo rễ. Còn các nghiệm thức còn lại
không có khả năng tái sinh chồi.
Hiện tượng mẫu mô sẹo bị hóa xanh, có thể giải thích mô sẹo được tạo ra từ những
mô hay cơ quan có chứa diệp lục có khả năng quang hợp (Street, 1969). Mô sẹo chứa
diệp lục tố phụ thuộc vào lượng đường bổ sung trong môi trường nuôi cấy và cường
độ ánh sáng (Vasil và Hildebrandt, 1966). Do đó sự hóa xanh của mô sẹo trong thí
nghiệm có thể là do cường độ ánh sáng cao kích thích sự hình thành diệp lục tố làm
biến đổi về độ cứng, màu sắc và cấu trúc của mô sẹo, từ vàng, mềm, ướt sang xanh,
cứng, chắc. Điều này cũng được đề cập đến trong nuôi cấy mô sẹo lá cây Salvia
officinalis L., một loại cây thuộc họ hoa môi (Oana-Maria, 2010).
Nguyễn Bá Nam và cs (2010) cho rằng ở một số loài cây, khi nuôi cấy mô sẹo
dưới điều kiện ánh sáng sẽ xảy ra hiện tượng tiết phenol ra môi trường, chính những
hợp chất này sẽ ngăn cản sự hấp thụ các chất điều hòa sinh trưởng thực vật của tế bào.
Do đó, nồng độ BA và NAA bổ sung trong thí nghiệm này có thể bị mất một phần do
hiện tượng trên dẫn đến việc chưa có sự kích ứng tạo chồi. Ngoài ra, có thể do nồng độ
kết hợp giữa hai chất trên chưa thích hợp nên chưa thể tái sinh chồi.
Trong quá trình thực hiện thí nghiệm chỉ sử dụng BA có nồng độ từ 0,5 đến 4 mg/l
để tái sinh chồi từ mô sẹo trên chóp rễ cây đậu xanh. Kết quả cho thấy các mô sẹo lại
tăng sinh rất ít và có dấu hiệu chết dần. Tuy nhiên, Nguyễn Thị Luyện (2009) chỉ sử
dụng BA cho sự tái sinh cây đậu xanh từ mô sẹo phôi đậu xanh lại cho kết quả tốt ở
nồng độ 2, 3 và 4 mg/l.
Vì thế, đối với sự tái sinh chồi từ mô sẹo trên chóp rễ cây đậu xanh cần nghiên cứu
thêm để kết hợp BA (hoặc chất khác thuộc nhóm cytokinin) với một loại chất kích
thíchtăng trưởng thuộc nhóm auxin giúp cho quá trình tạo chồi.

15

 


Hình 3.6Mô sẹo mẫu chóp rễ sau 30 ngày nuôi cấy trên môi trường tạo chồi ở các nghiệm
thức. (a)B0.5N0: MS+ 0,5 mg/l BA + 0 mg/l NAA; (b) B0.5N3: MS+ 0,5 mg/l BA + 0.3 mg/l
NAA; (c) B0.5N0.5: MS+ 0,5 mg/l BA + 0.5 mg/l NAA; (d) B0.5N1: MS+ 0,5 mg/l BA + 1.0
mg/l NAA;(e) B1N0: MS+ 1.0 mg/l BA + 0 mg/l NAA; (f) B1N0.3: MS+ 1.0 mg/l BA + 0.3
mg/l NAA; (g) B1N0.5: MS+ 1.0 mg/l BA + 0.5 mg/l NAA; (h) và (i) B1N1: MS+ 1.0 mg/l BA
+ 1.0 mg/l NAA.

16