PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH CHỦNG NẤM MEN THAM GIA VÀO QUÁ TRÌNH LÊN MEN HẠT CA CAO

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
***************

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH CHỦNG NẤM MEN
THAM GIA VÀO QUÁ TRÌNH LÊN MEN HẠT CA CAO

Ngành học

: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện

: NGUYỄN THỊ KIỀU OANH

Niên khóa

: 2009 – 2013

Tháng 6/2013


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH CHỦNG NẤM MEN
THAM GIA VÀO QUÁ TRÌNH LÊN MEN HẠT CA CAO

Hướng dẫn khoa học

Sinh viên thực hiện

ThS. VÕ THỊ THÚY HUỆ

NGUYỄN THỊ KIỀU OANH

KS. TRẦN THỊ QUỲNH DIỆP

Tháng 6/2013


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu Trường Đại học Nông
Lâm, Ban chủ nhiệm Bộ môn Công nghệ Sinh học cùng toàn thể quý thầy cô đã tận
tình giảng dạy và truyền đạt kiến thức cho tôi trong thời gian học tập tại trường.
Cô Võ Thị Thúy Huệ, chị Trần Thị Quỳnh Diệp đã tận tình hướng dẫn, truyền
đạt những kinh nghiệm quí báu cũng như tạo mọi điều kiện cho tôi hoàn thành luận
văn tốt nghiệp đúng thời gian quy định.
Quý thầy cô thuộc Bộ môn Công nghệ sinh học, Viện Nghiên cứu Công nghệ
Sinh học và Môi trường Trường Đại học Nông Lâm đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho
tôi thực hiện đề tài.
Chị Nguyễn Trương Ngọc Tú, chị Trương Thị Ngọc Hân cùng các bạn làm việc
tại công ty TNHH Công nghệ Nông Lâm đã hướng dẫn và giúp đỡ tôi.
Thân ái gửi đến các bạn lớp DH09SH đã cùng học tập với tôi trong suốt 4 năm
qua lời cảm ơn và lời chúc sức khỏe, đạt nhiều thành công trong cuộc sống.
Cuối cùng, con xin gửi lời cảm ơn chân thành đến ba mẹ, người đã sinh ra con,
nuôi nấng con nên người và luôn bên cạnh con những lúc khó khăn, giúp con vượt qua

tất cả.
Tp Hồ Chí Minh, tháng 6 năm 2013

NGUYỄN THỊ KIỀU OANH

i


TÓM TẮT
Lên men hạt ca cao là một trong những yếu tố quan trọng, quyết định đến chất
lượng hạt ca cao thương phẩm. Trong đó, vi sinh vật (nấm men và vi khuẩn) chịu trách
nhiệm về quá trình lên men ở lớp vỏ nhầy cũng như môi trường lên men.
Việc phân lập và định danh các chủng nấm men hiện diện trong quá trình lên
men giúp hiểu rõ hơn về quá trình lên men và đánh giá được ảnh hưởng của các loài
nấm men ưu thế trong quá trình lên men. Từ đó đề tài: “Phân lập và định danh các
chủng nấm men trong quá trình lên men hạt ca cao” đã được thực hiện.
Tiến hành phân lập, định danh các chủng nấm men và vi khuẩn hiện diện trong
quá trình lên men hạt ca cao. Đồng thời, khảo sát những biến đổi lý, hóa của hạt ca cao
và những diễn biến của hệ vi sinh vật trong quá trình lên men hạt ca cao bằng phương
pháp ủ tự nhiên, chọn ra chủng nấm men thích hợp bổ sung vào quá trình lên men. Bố
trí nghiệm thức ủ ca cao ở quy mô phòng thí nghiệm với các chủng nấm men đã chọn.
Tiếp tục khảo sát và đánh giá ảnh hưởng của việc bổ sung nấm men đến các thành
phần lý, hóa của hạt ca cao và hệ vi sinh vật tham gia vào quá trình lên men hạt ca cao.
Kết quả phân lập và định danh được 5 chủng nấm men Hanseniaspora uvarum,
Debaryomyces hanseni, Candida orthopsilosis, Candida tropicalis,Candida theae và 3
chủng vi khuẩn thuộc họ Lactobacillus và Bacillus, trong đó các chủng nấm men
Hanseniaspora uvarum, Debaryomyces hanseni, Candida tropicalis là các chủng tối
ưu nhất làm giảm nhanh khối lượng cơm nhầy và làm tăng giá trị pH của hạt nhân sau
lên men có bổ sung nấm men hơn so với lên men tự nhiên.

ii


SUMMARY
The fermentation of Cocoa is one of the important factors that determine the
quality of the commercial cocoa. The microorganisms responsible for the fermentation
originate from the surface of the pulps, as well as the fermenting environment.
The isolation and identification of yeast strains present in the process help
decipherdeeper and determine the impact of the dominant species yeast in the
fermentation process. Hence, we carry out the thesis: "Isolation and identification of
yeast strains from the process of cocoa beans fermentation."
This reseach focus on the isolation of yeast, and bacteria through out process.
The survey on physical, chemical changes within the beans and the microbial ecology
of fermentation, then selecting the appropriate yeast strains which were to the
fermentation. Fermentation in laboratory scale supplemented with selected yeast
strains. Continue to survey and assess the impact of the addition of yeast to the
physical, chemical of cocoa beans and the microbiology of fermentation.
As the result, 5 yeast strains including Hanseniaspora uvarum, Debaryomyces
hanseni, Candida orthopsilosis, Candida tropicalis,Candida theae; and 3 bacteria
strains, belong to Lactobacillus and Bacillus farmily were isolated. Among these,
Hanseniaspora uvarum, Debaryomyces hanseni, Candida tropicalis are the most
optimal yeast strains to increase the quality of cocoa beans.
Key word: Fermentation of cocoa.

iii


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN...................................................................................................................i
TÓM TẮT....................................................................................................................... ii

SUMMARY................................................................................................................... iii
MỤC LỤC ..................................................................................................................... iv
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ......................................................................... vii
DANH SÁCH CÁC BẢNG ........................................................................................ viii
DANH SÁCH CÁC HÌNH ............................................................................................ ix
Chương 1 MỞ ĐẦU ........................................................................................................1
1.1.

Đặt vấn đề ...........................................................................................................1

1.2.

Yêu cầu của đề tài ..............................................................................................1

1.3.

Nội dung thực hiện .............................................................................................1

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...............................................................................3
2.1.

Tổng quan về ca cao ...........................................................................................3

2.1.1.

Tình hình sản xuất ca cao ...................................................................................3

2.1.2.

Đặc điểm của cây ca cao ....................................................................................4

2.1.3.

Thành phần hóa học của hạt ca cao ....................................................................6

2.2.

Tổng quan về nấm men ......................................................................................6

2.2.1.

Phân loại .............................................................................................................6

2.2.2.

Đặc điểm hình thái .............................................................................................8

2.2.3.

Đặc điểm cấu tạo ................................................................................................8

2.2.4.

Đặc điểm sinh thái ..............................................................................................9

2.2.5.

Sự sinh sản của tế bào nấm men.........................................................................9

2.2.6.

Sinh trưởng của nấm men.................................................................................10

2.3.

Lên men hạt ca cao ...........................................................................................11

2.3.1.

Các phương pháp ủ hạt ca cao ..........................................................................11

2.3.2.

Quá trình lên men hạt ca cao ............................................................................12

2.3.2.1 Sự lên men của lớp thịt bao quanh hạt. ............................................................12
2.3.2.2 Những nội phản ứng xảy ra trong các mô của phôi nhũ ..................................13
2.4

Một số công trình nghiên cứu trong và ngoài nước .........................................14

2.4.2

Nghiên cứu trong nước .....................................................................................14
iv


2.4.3

Nghiên cứu của nước ngoài ..............................................................................15

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................................17
3.1.

Thời gian và địa điểm nghiên cứu ....................................................................17

3.2.

Vật liệu .............................................................................................................17

3.3.

Phương pháp thí nghiệm ..................................................................................17

3.3.1.

Ủ ca cao ............................................................................................................17

3.3.2.

Phân lập nấm men và vi khuẩn .........................................................................17

3.3.3.

Quan sát hình thái tế bào nấm men và vi khuẩn dưới kính hiển vi ..................18

3.3.4.

Thử nghiệm khả năng lên men đường ..............................................................19

3.3.5. Phương pháp xác định mật độ tế bào bằng phương pháp đếm sống nhỏ giọt
(Drop plate Cout) ...........................................................................................................19
3.3.6. Khảo sát sự thay đổi nhiệt độ, pH, tỷ lệ hạt nhân/cơm nhầy của ca cao trong
suốt quá trình ủ tự nhiên ................................................................................................20
3.3.7. Khảo sát mật độ các chủng nấm men và vi khuẩn trong quá trình lên men tự
nhiên theo thời gian. ......................................................................................................21
3.3.8.

Khảo sát quá trình lên men hạt ca cao có bổ sung nấm men............................22

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................................23
4.1.

Kết quả phân lập và làm thuần nấm men .........................................................23

4.2.

Kết quả thử nghiệm lên men đường của các chủng nấm men..........................25

4.3.

Kết quả phân lập vi khuẩn hiện diện trong quá trình lên men ca cao ..............27

4.4.

Kết quả quá trình lên men ca cao bằng phương pháp ủ tự nhiên .....................28

4.4.1.

Nhiệt độ khối ủ ca cao trong quá trình lên men tự nhiên .................................28

4.4.2.

pH hạt ca cao trong quá trình lên men tự nhiên ...............................................29

4.4.3.

Khối lượng hạt ca cao trong quá trình lên men ................................................30

4.4.4.

Mật số các chủng nấm men trong quá trình lên men hạt ca cao tự nhiên ........30

4.4.5.

Mật độ vi khuẩn trong quá trình lên men hạt ca cao tự nhiên ..........................31

4.5.

Kết quả quá trình lên men ca cao có bổ sung nấm men ...................................32

4.5.1.

pH hạt ca cao trong quá trình lên men có bổ sung nấm men ...........................32

4.5.2.

Nhiệt độ thúng ủ ca cao trong quá trình lên men có bổ sung nấm men ...........32

4.5.3.

Khối lượng hạt ca cao trong lên men có bổ sung nấm men .............................33

4.5.4.

Mật số vi khuẩn trong quá trình lên men ca cao có bổ sung nấm men ............34

4.5.5.

Mật số nấm men trong quá trình lên men ca cao có bổ sung nấm men ...........35

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..........................................................................36
v


5.1.

Kết luận ............................................................................................................36

5.2.

Đề nghị .............................................................................................................36

TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................37 

vi


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DRBC

Dichoran Rose Bengal Chloramphenicol

ĐC

Đối chứng

ICCO

International Cocoa Organization

Lll

Lần lặp lại

MAE

Malt Extract Agar

MRS

De Man, Rgosa, Sharpe

MT

Môi trường

NN&PTNT

Nông nghiệp và Phát triển nông thôn

NT

Nghiệm thức

PP

Phương pháp

vii


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Trang
Bảng 2.1 Sản lượng ca cao trên thế giới (ngàn tấn) …………………………………. 3
Bảng 2.2 Thành phần hóa học của hạt ca cao tươi …………………………………… 6
Bảng 2.3 Các loài nấm men phân lập từ quá trình ủ hạt ca cao ở một số quốc gia … 16
Bảng 3.1 Bố trí thí nghiệm ………………………………………………………….. 22
Bảng 4.1 Đặc điểm khuẩn lạc nấm men và hình thái tế bào nấm men dưới kính
hiển vi ...……………………………………..……………………………………… 23
Bảng 4.2 Kết quả lên men đường của các chủng nấm men ……………………….. 25
Bảng 4.3 Đặc điểm khuẩn lạc và tế bào của vi khuẩn …............................................ 27
Bảng 4.4 Kết quả thử nghiệm sinh hóa của các chủng vi khuẩn …………………… 28
Bảng 4.5 Nhiệt độ của khối ủ hạt ca cao trong quá trình lên men tự nhiên ..……….. 29
Bảng 4.6 Khối lượng nguyên hạt, cơm nhầy, hạt nhân và tỷ lệ hạt nhân/cơm nhầy
của hạt ca cao trong quá trình lên men ca cao tự nhiên ……………………………... 30
Bảng 4.7 Nhiệt độ khối ủ hạt ca cao trong quá trình lên men có bổ sung nấm men ... 32
Bảng 4.8 Khối lượng nguyên hạt, cơm nhầy, hạt nhân và tỷ lệ hạt nhân/cơm nhầy
của hạt ca cao trong quá trình lên men ca cao có bổ sung nấm men ……………….. 33

viii


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Trang
Hình 2.1 Sơ đồ phân loại nấm men …………………………………………………... 7
Hình 2.2 Sơ đồ sự chuyển hóa đường của cơm nhầy trong quá trình lên men ……... 13
Hình 2.3 Qua trình biễn đổi các chất trong nội nhũ hạt ca cao ……………………... 14
Hình 4.1 Kết quả lên men đường glucose và sucrose của chủng A1 ……………….. 27
Hình 4.2 Diễn biến pH hạt ca cao trong quá trình lên men ...………………………. 29
Hình 4.3 Diễn biến mật số các chủng nấm men trong quá trình lên men hạt
ca cao ……………………………………………………………………………….. 31
Hình 4.4 Diễn biến mật số vi khuẩn trong quá trình lên men hạt ca cao …………… 31
Hình 4.5 Diễn biến pH trong quá trình lên men có bổ sung nấm men ……………... 34
Hình 4.6 Mật số vi khuẩn trong quá trình lên men có bổ sung nấm men …………... 34
Hình 4.7 Mật số các chủng nấm men trong quá trình lên men ca cao không có bổ sung
nấm men …………………………………………………………………………….. 35

ix


Chương 1 MỞ ĐẦU
1.1.

Đặt vấn đề
Có mặt từ rất lâu đời, ca cao đi vào cuộc sống của những người dân vùng Châu

Mỹ Latin như một loại thức uống tuyệt hảo mà thượng đế đã ban tặng cho họ. Đến đầu
thế kỷ 20, ca cao đã trở thành một nét văn hóa ẩm thực đặc trưng của toàn châu Âu và
là một loại thức uống phổ biến trên toàn Thế giới. Bờ Biển Ngà, Ghana, Indonesia,

Brazil là những quốc gia đứng đầu thế giới về sản lượng và chất lượng hạt ca cao. Việt
Nam cũng là nước có nhiều tiềm năng để phát triển cây ca cao do có thể trồng xen với
nhiều loại cây khác nhau như dừa, điều, cà phê, nhãn. Theo thống kê của Bộ
NN&PTNT năm 2011, tổng diện tích trồng ca cao tại Việt Nam đạt khoảng 20.100 ha,
tập trung chủ yếu tại các tỉnh phía Nam, với năng suất trung bình 1,13 tấn/ha. Trên thế
giới nói chung và tại Việt Nam nói riêng, ca cao sau thu hoạch được lên men bằng
phương pháp tự nhiên truyền thống. Tuy nhiên, hạn chế của phương pháp lên men này
cho chất lượng không đồng đều và ổn định, dẫn đến việc giảm giá trị kinh tế hạt ca cao
sau lên men.
Lên men hạt ca ca cao là một trong những yếu tố quan trọng, quyết định đến
chất lượng ca cao thương phẩm và vi sinh vật đóng một vai trò hết sức to lớn trong quá
trình lên men hạt ca cao. Theo M. Ardhana, Graham H.Flect (2003), có khoảng 124
loài vi sinh vật hiện diện trong quá trình lên men hạt ca cao bao gồm các loài: nấm
men, vi khuẩn, nấm mốc. Nhưng chỉ có một số loài đóng vài trò quyết định trong quá
trình lên men. Trên cơ sở đó chúng tôi tiến hành đề tài “Phân lập và định danh các
chủng nấm men trong quá trình lên men hạt ca cao” nhằm xác định các chủng nấm
men hiện diện và chiếm ưu thế trong quá trình lên men hạt ca cao.
1.2.

Yêu cầu của đề tài
Phân lập và định danh được các chủng nấm men hiện diện trong quá trình lên

men hạt ca cao.
1.3.

Nội dung thực hiện
Nội dung 1: Thực hiện lên men hạt ca cao bằng phương pháp ủ thúng tự nhiên.

-

Phân lập và làm thuần các chủng nấm men và vi khuẩn hiện diện trong quá

trình lên men hạt ca cao tự nhiên.
1


-

Quan sát hình thái khuẩn lạc và hình thái tế bào các chủng nấm men và vi

khuẩn đã phân lập.
-

Thực hiện một số phản ứng sinh hóa đối với nấm men và vi khuẩn.

-

Định danh nấm men bằng kỹ thuật sinh học phân tử.
Nội dung 2: Khảo sát những biến đổi lý, hóa của hạt ca cao trong quá trình lên

men bằng phương pháp ủ tự nhiên
-

Khảo sát sự thay đổi về pH của cơm nhầy và hạt nhân.

-

Khảo sát sự thay đổi về nhiệt độ của đống ủ.

-

Khảo sát sự thay đổi về tỷ lệ cơm nhầy : hạt nhân.
Nội dung 3: Khảo sát diễn biến của nấm men và vi khuẩn hiện diện trong quá

trình lên men hạt ca cao bằng phương pháp ủ tự nhiên.
-

Khảo sát mật số các chủng nấm men theo thời gian lên men.

-

Khảo sát mật số vi khuẩn theo thời gian lên men.
Nội dung 4: Tiến hành lên men hạt ca cao bằng phương pháp ủ thúng có bổ

sung nấm men.
-

Tiến hành nhân sinh khối các chủng nấm men.

-

Tiến hành ủ hạt ca cao với các chủng nấm men.

-

Khảo sát sự thay đổi lý, hóa của hạt ca cao trong quá trình lên men hạt ca cao

có bổ sung nấm men (pH, nhiệt độ, tỷ lệ cơm nhầy: hạt nhân).
-

Khảo sát diễn biến của nấm men và vi khuẩn hiện diện trong quá trình lên men

hạt ca cao có bổ sung nấm men.

2


Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1.

Tổng quan về ca cao

2.1.1. Tình hình sản xuất ca cao
Cây ca cao là cây công nghiệp dài ngày sống ở vùng nhiệt đới, thuộc loài thân
mộc, sống đa niên. Cây ca cao có nguồn gốc từ vùng Amazone. Vùng Mayas của
Yucatan và Aztecs của Mexico là các vùng trồng ca cao lâu đời cách đây khoảng 500
năm trước công nguyên. Người Mayas là những người đầu tiên trên trái đất này sử
dụng ca cao làm thực phẩm bằng cách nướng lên, nghiền nhuyễn pha với bột ngô và
sử dụng hạt ca cao trong một số loại nước uống cao cấp. Ngày nay ca cao là một trong
những mặt hàng xuất khẩu mang lại nhiều ngoại tệ cho một số nước.
Bảng 2.1 Sản lượng ca cao trên thế giới (ngàn tấn)
Quốc gia

2008 - 2009

2009 - 2010

2010 – 2011

Châu Phi

2516

2486

3226

Cameroon

224

209

229

Bờ Biển Ngà

1223

1242

1511

Ghana

662

632

1025

Nigeria

250

235

240

Các nước Châu Phi khác

157

168

221

Châu Mỹ

478

516

559

Brazil

157

161

200

Cộng Hòa Dominican

135

150

161

Các nước Châu Mỹ khác

186

205

199

598

633

524

Indonesia

490

550

440

Malaysia

59

39

47

Các nước Châu Á khác

48

44

37

3593

3635

4309

Châu Á và Thái Bình Dương

Tổng sản lượng thế giới

(Nguồn: ICCO Annual Report 2010/2011)

Ở Việt Nam, ca cao được xem như một mặt hàng nông sản tiềm năng với giá
bán gấp 2-3 lần so với cà phê. Theo số liệu thống kê của Cục Trồng trọt, Bộ Nông
nghiệp – Phát triển Nông thôn cho thấy ngành ca cao Việt Nam có tốc độ phát triển
3


khá nhanh: năm 2003 diện tích trồng ca cao chỉ đạt 3.000 ha nhưng đến cuối năm
2011, tổng diện tích ca cao trên cả nước ước tính đạt 20.100 ha với sản lượng đạt
5.500 tấn/năm. Dự kiến đến năm 2015 diện tích ca cao sẽ được mở rộng lên 35.000 ha
với sản lượng 26.000 tấn, và đạt khoảng 50.000 ha, sản lượng 52.000 tấn vào năm
2020. Phần lớn ca cao được trồng xen trong các vườn dừa, vườn cây ăn trái ở vùng
Đồng bằng sông Cửu Long và trong các vườn cây công nghiệp ở vùng Đông Nam Bộ
và Tây Nguyên.
2.1.2. Đặc điểm của cây ca cao
 Thực vật học
Theo phân loại truyền thống, ca cao (Thebroma ca cao) thuộc chi Theobroma,
họ Sterculioidea còn theo phân loại của hệ thống APG II thì thuộc phân họ
Byttnerioideae của họ Malvaceae (Alvenson et al., 1999). Theo Opeke (1992),
Theobroma ca cao là cây có hoa và kết trái trực tiếp từ thân và thuộc dạng nửa rụng lá.
Có khoảng 20 loài Theobroma nhưng quan trọng nhất là các loại Criollo, Forastero và
Trinitario.
Criollo có nguồn gốc từ Trung Nam Mỹ. Hạt ca cao Criolo có hương vị đặc
biệt, độ mịn cao và ít đắng. Tuy nhiên, cây thường cho sản lượng kém, khả năng kháng
bệnh thấp, trồng từ 4 – 5 năm mới có trái. Do đó, Criollo không được trồng phổ biến.
Forastero chiếm 80% lượng ca cao trên thế giới. Được trồng rộng rãi cả trong
canh tác, hoang dã và bán hoang dã. Thường gặp ở Brazil, Tây phi, Trung nam Mỹ,
Malaysia, Indonesia v.v. Sản lượng tương đối cao, kháng sâu bệnh nhưng chất lượng
trung bình.
Trinitario là giống tương đối mới được cấy ghép bởi Criollo và Forastero, nó có

mùi thơm đặc biệt của Criollo và sản lượng cao như Forastero. Trinitario bắt đầu được
trồng ở Trinidad, lan sang Venezuela và Ecuador, Cameroon, Samoa, Sri Lanka, Java
và Papua New Guinea. Đây là giống mới nên ngày nay sản lượng trên thị trường thế
giới còn ít, chỉ chiếm 15% sản lượng chế biến của thế giới.


Đặc điểm hình thái
Ca cao là loài cây thân gỗ có thể cao đến 10 – 20 m nếu để mọc tự nhiên. Tuy

nhiên, trong sản xuất cây thường chỉ cao khoảng 4 – 8 m do mật độ trồng dày và chiều
cao được khống chế qua việc tỉa cành. Chu kỳ sinh trưởng của cây ca cao trên 40 năm.

4


Hạt sau khi nảy mầm, rễ trụ mọc rất nhanh và có nhiều rễ ngang mọc thẳng góc
quanh trụ. Khi cây được 3 năm tuổi, rễ trụ dài khoảng 1 – 1,5 m, có nhiều rễ ngang
mọc ra, phân nhánh và có nhiều rễ con tập trung ở vùng phía dưới cổ rễ 20 cm (vùng
đất mặt).
Thân ca cao phát triển theo hướng thẳng đứng và khi thân phát triển trung bình
được từ 1 m đến 1,5 m sẽ tự phân làm 3 – 5 cành ngang. Sự phát triển của tầng cành
sẽ được lập lại tạo nên cây ca cao phát triển từ hạt có 3 – 5 tầng cành.
Màu sắc lá non thay đổi tuỳ theo giống từ màu xanh nhạt đến vàng, từ màu
hồng đến đỏ đậm. Khi trưởng thành lá có màu xanh thẫm, cứng cáp hơn và nằm
ngang. Lá trên thân mọc từ hạt hoặc cành vượt có cuống dài từ 7 – 9 cm và mọc theo
hình xoắn ốc. Lá trên cành ngang hay trên cây ghép có cuống ngắn từ 2 – 3 cm, mọc
đối cách trên cành và chịu được cường độ ánh sáng cao hơn lá trên thân chính.
Sau khi thụ phấn trái tăng trưởng chậm trong khoảng 40 ngày đầu và đạt tốc độ
tối đa sau 75 ngày. Sau khi thụ phấn 85 ngày sự tăng trưởng của trái chậm lại, trong
khi hạt bên trong của trái bắt đầu tăng trưởng, đây là thời kỳ hạt tích lũy chất béo. Mỗi

trái chứa từ 30 – 50 hạt. Khoảng 140 ngày sau thụ phấn lớp cơm nhầy được hình thành
bao quanh hạt. Từ khi hoa nở đến trái chín khoảng 5 – 6 tháng, thời gian này khác
nhau tuỳ theo giống. Trái có hình dạng, kích thước và màu sắc khá đa dạng. Trái chưa
chín có màu xanh, tím hoặc xanh phơn phớt tím khi chín chuyển sang màu vàng, vàng
cam hoặc đỏ cam. Trái ca cao có thể đạt chiều dài 10 – 30 cm, đường kính 7 – 9 cm,
cân nặng từ 200 – 1000 g.
 Đặc điểm sinh thái
Cây ca cao thường được trồng trong khoảng từ đường xích đạo đến vĩ độ 20,
nơi có khí hậu nhiệt đới nóng ẩm mưa nhiều. Nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trưởng và
phát triển của cây ca cao khoảng 25oC, độ ẩm 70 – 80%, lượng mưa bình quân trên
1500 mm/năm. Cây ca cao là cây ưa ánh sáng tán xạ (50 – 60% cường độ ánh sáng tự
nhiên) nên thích hợp trồng dưới tán cây ăn trái hoặc được che bóng.
Cây ca cao thích hợp với nhiều loại đất khác nhau như đất đỏ, đất xám, đất phù
sa cổ song thích hợp nhất với đất có thành phần cơ giới trung bình đến nhẹ, pH từ 5,5
– 5,8, tầng canh tác dày 1 – 1,5 m, dễ thoát nước, có khả năng giữ nước cao, giàu chất
hữu cơ.

5


2.1.3. Thành phần hóa học của hạt ca cao
Tính chất hóa học của hạt ca cao rất phức tạp, chúng thay đổi theo tuổi thọ của
hạt và phụ thuộc vào quá trình chế biến.
Bảng 2.2 Thành phần hóa học của hạt ca cao tươi
Chất nhầy

Vỏ hạt

Phôi nhũ

(Mucilage/Sweating)

(Shell/Testa)

(Cotyledon/Kernel)

84,5

9,4

35

-

3,8

31,3

+ Cellulose

-

13,8

3,2

+ Tinh bột

-

46,0

4,5

+ Pentosan

2,7

-

4,9

+ Sucrose

0,7

-

-

+ Glucose

10,0

-

1,1

0,6

18,0

8,4

+ Theobromine

-

-

2,4

+ Enzyme

-

-

0,8

+ Polyphenol

-

0,8

5,2

Axit hữu cơ (Citric,

0,7

-

0,6

0,8

8,2

2,6

100,0

100,0

100,0

Thành phần
Nước
Chất béo (Bơ ca cao)
Carbohydrates

+ Fructose
Nitrogen
+ Protein

Axêtic và oxalic)
Muối khoáng
Tổng số

Các thành phần được tính theo% trọng lượng tươi. (Nguồn: F.Hardy, 1960)

2.2.

Tổng quan về nấm men

2.2.1. Phân loại
Nấm men là tên chung để chỉ nhóm nấm thường có cấu tạo đơn bào và thường
sinh sản vô tính theo lối nảy chồi. Nấm men không thuộc về một taxon phân loại nào
nhất định, chúng có thể thuộc về hai nhóm nấm: nhóm nấm túi tạo thành bào tử được
gộp chung vào lớp nấm túi (Ascomycetes) và nhóm nấm không tạo thành bào tử - lớp
6


nấm không hoàn thiện (Fungi imperfect) hay còn gọi là lớp nấm bất toàn (Lương Đức
Phẩm, 2006).
Dựa trên bảng phân loại nấm men cho đến hiện nay thì số lượng loài nấm men
được biết đến không ngừng tăng lên. Lodder J. (1970) đã xác định có 349 loài nấm
men, thuộc 39 chi khác nhau. Barnett J.A., Payne R.W. và Yarrow D. (1983) xác định
có 483 loài nấm men thuộc 66 chi khác nhau.
Eumycophyta (nấm)

Giới

Ascomycetes

(Fungi imperfect)
Deuteromycetes

Lớp

Endomycetes

Moniliales

Bộ

Endomycetacea Saccharomycetacea

Endomyces

Cryptoccacea Rhodotorulacea

Saccharomyces

Schizosacchoromyces Zygosaccharomyces

Crytococus

Họ

Rhodotorula

Giống

Kloeskera 2

Toruiaspora

Mycoderma

Pichia 1

Candida 1

Hasenula 1

Georichum 3

Debaryomyces

X

X

X

X

Loài

X

X

X

X

Chủng (loài)

Hình 2.1 Sơ đồ phân loại nấm men
1. Nấm men tạo thành màng
2. Nấm men hình chùy
3. Nấm men tạo thành khuẩn ty thật hoặc khuẩn ty giả

7


Rất nhiều loài nấm men đã được ứng dụng rộng rãi trong sản xuất: công nghiệp
sản xuất bia, rượu, nước giải khát, sinh khối phục vụ chăn nuôi và cao nấm men; lipid
nấm men, các enzyme như amylase, invertase, lactase, uricase, v.v. sản xuất
esgosterol, axít ribonucleic, các vitamin như methionine, lizin, cisterin. Loài
Saccharomyces cerevisiae hiện đang được sử dụng phổ biến nhất trong sản xuất.
Tuy nhiên bên cạnh các nấm men có ích cũng có không ít các nấm men có hại,
chúng gây ra hiện tượng làm hư hỏng thực phẩm tươi sống hoặc thực phẩm chế biến.
Có khoảng 13-15 loài nấm men có khả năng gây bệnh cho người vầ động vật chăn
nuôi. Đáng chú ý nhất là các loài Candida albicans, Cryptococcus neoforman, v.v.
2.2.2. Đặc điểm hình thái
Hình dạng tế bào nấm men thường thay đổi tùy theo loài, ngoài ra một phần còn
phụ thuộc vào tuổi giống và điều kiện ngoại cảnh. Nói chung, thường nấm men có
hình trứng hay bầu dục (Saccharomyces cerevisiae), hình cầu (Candida utilis), hình
ống (Pychia), hình bình, hình quả chanh, hình tam giác và một số dạng đặc biệt.
Một số tế bào nấm men có hình dài nối tiếp nhau thành những dạng sợi gọi là
khuẩn ty (Mycelium) hoặc khuẩn ty giả (Pseudomycelium). Thường gặp ở các giống
Endomycopsis, Candida, Trichosporon. Nhiều loài nấm men chỉ sinh khuẩn ty giả khi
không được cung cấp đầy đủ oxy.
Kích thước tế bào nấm men thay đổi rất nhiều, theo từng giống, từng loài. Nói
chung thường to hơn tế bào vi khuẩn gấp 10 lần. Các loài nấm men đơn bào trong

công nghiệp thường có kích thước 3 – 5 x 5 – 10 µm (Lâm Thanh Hiền, 2006).
2.2.3. Đặc điểm cấu tạo
Nấm men thuộc nhóm Eukaryote do đó nó có những đặc điểm khác so với vi
khuẩn.
Tế bào nấm men cũng như nhiều loại tế bào khác được cấu tạo chủ yếu từ các
thành phần cơ bản sau:
-

Thành tế bào nấm men trong suốt, nhờn và dày khoảng 1000 Ao, chiếm khoảng

25 – 30% trọng lượng khô tế bào. Thành tế bào có 3 lớp được cấu tạo từ nhiều thành
phần khác nhau. Trong đó chủ yếu là glucan, manan, protein, lipit và một số thành
phần nhỏ khác như kitin, volutin, v.v. Thành tế bào giúp duy trì hình thái và áp suất
thẩm thấu của tế bào.

8


-

Màng nguyên sinh chất gồm các hợp chất phức tạp như protein, phospholipid,

enzyme permeaza, v.v. Chiều dày của màng nguyên sinh chất khoảng 200 Ao. Màng
nguyên sinh chất thường ăn sâu vào chất nguyên sinh tạo thành mạng lưới nội chất.
-

Chất nguyên sinh: thành phần cấu tạo chủ yếu là nước, protid, glucid, lipid và

các muối khoáng, enzyme. Khi tế bào nấm men còn non, chất nguyên sinh là đồng
nhất và độ nhớt thấp hơn so với tế bào trưởng thành. Ở tế bào già, tế bào chất không

đồng nhất do xuất hiện không bào, các thể ẩn nhập và các cơ quan khác.
-

Nhân tế bào: tế bào nấm men có nhân thực. Nhân có hình bầu dục hay hình

tròn, nằm gần không bào trung tâm với kích thước từ 1 – 2 µm. Nhân tế bào nấm men
chứa protein, axít nucleic, nhiều hệ men và ribosome. Lượng nhiễm sắc thể của nhân
rất khác nhau tùy loài nấm men và chúng có thể phân chia theo kiểu gián phân hoặc
đôi khi theo kiểu trực phân.
-

Những thành phần – cơ quan khác: không bào, ty thể, ribosome v.v.

2.2.4. Đặc điểm sinh thái
Nấm men phân bố hết sức rộng rãi trong tự nhiên: đất, nước, lương thực, thực
phẩm, rau quả. Đặc biệt chúng thường được phân lập từ các nguyên liệu giàu đường.
Ví dụ như các nấm men tự nhiên được tìm thấy trên lớp vỏ ngoài của trái cây chín,
mọng nước (nho, táo, đào v.v.) hay dịch tiết từ cây ( nhựa cây). Một số loài nấm men
còn được tìm thấy trong đất và ở côn trùng. So với các vi sinh vật khác, đặc điểm sinh
thái của nấm men không biểu hiện rõ ràng.
Nấm men phát triển tốt nhất ở môi trường có pH trung tính hoặc hơi chua.
2.2.5. Sự sinh sản của tế bào nấm men
Ở nấm men có 3 hình thức sinh sản chính: sinh sản bằng cách nảy chồi, sinh
sản bằng cách phân đôi, sinh sản bằng bào tử.
-

Sinh sản bằng cách nảy chồi: Đây là hình thức sinh sản phổ biến nhất của nấm

men. Khi tế bào trưởng thành, nhân sẽ dài ra và bắt đầu thắt lại ở chính giữa. Trên tế
bào mẹ bắt đầu phát triển một chồi non hoặc cùng một lúc tế bào mẹ có thể tạo ra

nhiều tế bào con ở nhiều hướng khác nhau (tùy theo giống, loài). Mỗi chồi con sẽ nhận
một phần chất nhân và chất nguyên sinh từ tế bào mẹ. Khi chồi con trưởng thành, nó
sẽ hình thành một vách ngăn để tách khỏi tế bào mẹ và sống độc lập. Kiểu sinh sản này
thường gặp ở nấm men giống Saccharomyces, Candida, Torulopsis.

9


-

Sự phân chia tế bào: Sinh sản bằng cách phân đôi thường gặp ở nấm men có

dạng sợi dài, giống Schizosaccharomyces, giống Endomyces. Quá trình phân chia
giống như ở tế bào vi khuẩn. Lúc đầu tế bào dài ra và thắt lại ở chính giữa. Nơi thắt
nhỏ dần tới khi đứt hẳn tạo thành tế bào con.
-

Sinh sản bằng bào tử và sự hình thành bào tử: Nhiều loài nấm men có khả năng

hình thành bào tử. Nấm men thường hình thành bào tử sau 5 – 10 ngày nuôi cấy trong
môi trường mạch nha. Có 2 dạng bào tử:
Bào tử túi (ascospore) thường được sinh ra trong những cái túi nhỏ gọi là nang
hay là túi. Mỗi túi chứa tù 1 – 8 bào tử túi, thường là 1 – 4 , hiếm sẽ có 16 bào tử hay
nhiều hơn. Bào tử túi có hình dạng và kích thước khác nhau tùy theo loài nấm men. Có
thể là hình bầu dục, hình bán cầu, hình thoi, v.v. Túi có thể được sinh ra theo một
trong ba công thức sau: tiếp hợp đẳng giao, tiếp hợp dị giao, sinh sản đơn tính.
Bào tử bắn (ballistospore) là loại bào tử chỉ thấy ở các loài trong giống Brillera,
Spodiobolus, Sporoliomyces và Aessaspora. Sau khi hình thành bào tử này có thể bắn
mạnh ra phía đối diện.
2.2.6. Sinh trưởng của nấm men

Quá trình sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật nói chung, trong đó có nấm
men được chia làm 4 pha: pha tiềm phát, pha logarit, pha ổn định và pha suy thoái.
Pha tiềm phát là giai đoạn nấm men mới được cấy vào môi trường còn chưa
sinh sản. Trong giai đoạn này nấm men còn thích nghi với môi trường mới, một số tế
bào bị ức chế thậm chí còn có thể chết. Số lượng tế bào nấm men không tăng hay tăng
không đáng kể, nhưng sự trao đổi chất của chúng lại xảy ra mạnh mẽ. Tế bào có kích
thước tăng lên đáng kể, hàm lượng các chất protein, axít nucleic đều tăng lên, các
enzyme thích ứng đều được tổng hợp mành mẽ.
Ở pha logarit, số lượng và sinh khối nấm men tăng theo cấp số nhân. Khả năng
thích ứng với điều kiện môi trường tăng lên rõ rệt và xuất hiện hiện tượng lên men.
Nhìn chung, kích thước của tế bào nấm men ở pha này là nhỏ nhất vì chúng còn phải
sinh sản từ nguồn tế bào chất và vỏ tế bào.
Trong pha ổn đinh, tế bào nấm men ổn định và mật độ quần thể là tối đa, có sự
cân bằng giữa tế bào sống và tế bào chết. Kích thước tế bào tăng lên.

10


Pha suy thoái, các tế bào sống giảm dần và tế bào chết tăng dần. Các tế bào
sống trở nên già đi, kích thước nhỏ lại, biến dạng và tế bào chất xuất hiện dạng hạt
(Lương Đức Phẩm, 2006).
2.3.

Lên men hạt ca cao
Hạt ca cao là nguyên liệu quan trọng trong sản xuất bột ca cao và sô cô la.

Chính vì vậy mà khâu lên men (ủ) hạt ca cao là khâu quan trọng nhất ảnh hưởng đến
chất lượng của các sản phẩm làm từ hạt ca cao. Mục đích của việc lên men hạt ca cao
nhằm gây ra những thay đổi sinh hóa trong phôi nhũ để làm giảm vị đắng và chát trong
hạt ca cao. Ngoài ra việc lên men còn giúp hóa lỏng và loại bỏ hết lớp nhầy bao quanh

hạt ca cao tươi tạo thuận lợi cho quá trình sấy hạt tiếp theo.
2.3.1. Các phương pháp ủ hạt ca cao
-

Ủ đống:
Đây là phương pháp lên men đơn giản nhất và phổ biến ở vùng Tây Phi. Hạt ca

cao được đổ thành đống hình nón trên lớp lá chuối được xếp tròn trên mặt đất. Bên
dưới một lớp lá chuối kê các cành cây để tạo độ thoáng và giúp dịch nhầy chảy ra dễ
dàng. Các lá chuối sẽ được cuộn lên để bao kín khối hạt nhằm giữ hơi nóng trong suốt
quá trình ủ. Đống hạt có thể từ 25 - 2500 kg hạt tươi. Hai hoặc ba ngày sau khi ủ phải
được đảo trộn đều và giữ kín bằng lá chuối cho đến khi quy trình hoàn tất. Tuỳ theo
nhiệt không khí (tuỳ mùa) mà thời gian ủ kéo dài 5 đến 7 ngày. (Michael P.Doyle và
ctv, 2001).
-

Ủ thúng:
Lót lá chuối xung quanh thúng tre, đổ đầy hạt và đậy thúng lại bằng lá chuối. Hai

ngày sau khi ủ trộn đều hạt bằng cách đổ từ thúng này sang thúng khác. Kích thước
thúng tuỳ theo khối lượng hạt để có thể chứa từ 10 - 150 kg hạt ca cao tươi. Thời gian
ủ từ 5 - 7 ngày.
Trong cách ủ đống và ủ thúng, ở lớp trên khối hạt luôn duy trì nhiệt độ khoảng
45-50oC. Nếu hạt dưới 10kg thì phải ủ kỹ đống ủ sau khi nén thật chặt. cần thiết phải
duy trì nhiệt độ đống ủ nếu thời tiết lạnh.
Sau 5 - 7 ngày ủ, nếu ủ đúng cách và đúng mức thì các hạt ca cao đều có màu
sậm. ngược lại thì các hạt ở phía bên ngoài có màu nâu, phía trong hơi trắng và giữa
đống ủ các hạt trắng hơn. Có thể hạt còn có màu đen, nấm mốc phát triển và hạt xuất
hiện mùi amoniac khi thời gian ủ quá mức.
11

-

Ủ thùng:
Ca cao được chứa trong thùng gỗ có đục lỗ ở đáy. Kích thước chiều dài và

chiều rộng của thùng có thể thay đổi tùy theo lượng hạt nhưng chiều cao khối hạt
không nên vượt quá 50 cm. Khối lượng ủ từ 50 - 1000 kg. Đảo trộn hạt sau hai ngày ủ.
Thời gian ủ từ 5 - 7 ngày.
-

Ủ khay:
Khay gỗ có kích thước 1,2 m x 0,9 m x 0,13 m, lót đáy bằng vạt tre cho dễ thoát

nước. Ca cao đổ vào khay một lớp 10 cm. Chồng các khay lên với nhau sau đó dùng
vải, bao bì trùm kín lại để giữ nhiệt. Không đảo trộn hạt khi ủ. Thời gian ủ kéo dài 3
đến 4 ngày.
2.3.2. Quá trình lên men hạt ca cao
2.3.2.1 Sự lên men của lớp thịt bao quanh hạt
Lớp thịt bao quanh hạt (lớp cơm nhầy) chiếm 15 – 20% trọng lượng hạt ca cao
tươi. Theo Schwan, R.F (1998) cơm nhầy chứa 14% đường, 1,5% pectin và pH thấp
khoảng 3,5 nhờ sự có mặt của axít citric là môi trường rất thích hợp cho sự phát triển
của nấm men. Trong 24 giờ đầu của quá trình lên men, các vi sinh vật chuyển hóa
đường có trong lớp nhầy trong điều kiện yếm khí thành rượu etylic và khí carbonic.
C6H12O6  2C2H5OH + 2 CO2
Ngoài ra còn có một số sản phẩm phụ khác như axít lactic, axít oxalic, enzyme
ngoại bào, hợp chất hữu cơ dễ bay hơi v.v.
Ở 24 giờ tiếp theo, thịt quả sẽ bị thủy phân và chiết rút ra ngoài tạo điều kiện
thông thoáng cho khối ủ, độ axít giảm, pH tăng đạt khoảng 5.0. Sau 2-3 ngày đầu tiên

thường tiến hành trộn khối ủ làm cho không khí thâm nhập vào khối ủ. Sự có mặt của
oxi làm gia tăng lượng axit axêtic do sự oxi hóa ethanol.
C2H5OH + O2  CH3COOH + H2O + Q
Cuối quá trình lên men, lượng ethanol và axít lactic giảm dần, chỉ còn axit
axêtic.
Theo Kenten và Powell (1960), các phản ứng do hoạt động của vi sinh vật làm
cho nhiệt độ khối ủ tăng lên, có thể đạt 50oC. Nhiệt độ tăng đều trong suốt 48 giờ và
đạt khoảng 42 - 48oC vào cuối quá trình lên men.
Nhờ axit axêtic và nhiệt độ cao làm cho màng tế bào bị phá vỡ, hạt chết không
còn khả năng nảy mầm và các chất dễ hòa trộn vào nhau. Điều này cho phép một số
12


chất phức tạp chuyển sang trạng thái hoạt động, đây là yếu tố quyết định đến màu và
mùi của bột ca cao sau này.

Trong phần cơm nhầy
CƠM NHẦY
Nước

Citric

Pectin

Đường

Nấm men phát triển
Hô hấp yếm khí

Enzyme pectinolytic

Rượu

Hô hấp hiếu khí

Vi khuẩn axêtic
phát triển

Vi khuẩn lactic
phát triển

Axit axêtic

Axít lactic

Hình 2.2 Sơ đồ sự chuyển hóa đường của cơm nhầy trong quá trình lên men
(Nguồn: Hylayat, 2007)

2.3.2.2 Những nội phản ứng xảy ra trong các mô của phôi nhũ
Sự lên men bên trong hạt ca cao bao gồm một loạt phản ứng phức tạp, các tử
diệp co rút lại từ áo hạt và biến đổi màu sắc, bên cạnh đó nhiệt độ tăng có tác dụng diệt
chết phôi hạt, từ đó bắt đầu các phản ứng lên men trong phôi nhũ. Quá trình này diễn
ra có mãnh liệt hay không phụ thuộc vào hàm lượng axit axêtic và axít lactic trong quá
trình lên men lớp cơm nhầy. Khi các axít này thấm vào nội nhũ sẽ gây hiện tượng vỡ
các thành tế bào.
Các mô của phôi nhũ do 2 tế bào tạo thành là tế bào sắc tố chứa polyphenol, các
purin và các tế bào dự trữ không có màu sắc chứa những tinh thể bơ ca cao, protein,
các enzyme.
Khi hạt ca cao chết, phôi nhũ sẽ hút ẩm làm cho vách tế bào dự trữ thấm nước,
nội chất của tế bào khuếch tán qua các mô. Các enzyme của tế bào dự trữ sẽ được tiếp
xúc với polyphenol của tế bào sắc tố. Hoạt động thủy phân protein sẽ xảy ra trong các

polyphenols sẽ bị thủy phân hóa cho ra cyanidin và hai đường khử. Anthocyanin, là
các chất không màu khi bị oxy hóa sẽ có màu nâu đặc biệt (màu nâu ca cao). Những
polyphenols khác sẽ tản di một phần hoặc chịu những biến đổi hóa học làm giảm vị
13


đắng và chát của hạt. Các phản ứng trên xảy ra cho tới cuối đợt lên men và còn tiếp tục
trong quá trình phơi khô.
Trong quá trình lên men lượng đạm tổng số giảm do theobromine bị hao hụt,
các chất protein bị phá hủy. Khoảng 40% theobromine khuếch tán vào các mô và di
chuyển vào vỏ làm giảm vị đắng. Còn các protein sẽ bị tủy phân thành các amino axít,
peptid v.v. phản ứng với polyphenol tạo thành các chất không hòa tan là các vị hương
và màu sắc của hạt.
Hương vị ca cao được quyết định bởi các tiền chất tạo hương sô cô la (đường
khử, aminoaxít, polyphenol, v.v. ) nên lượng các tiền chất này càng nhiều thì quá trình
tạo ra hương vị ca cao càng tốt và hạt ca cao càng có chất lượng cao.
Trong nội nhũ
NỘI NHŨ
Protein

Đường đa

Amino axít

Đường đơn

Tiền hương vị chocolate

Polyphenol

Chất thải

Hình 2.3 Quá trình biến đổi các chất trong nội nhũ hạt ca cao
(Nguồn: Hylayat, 2007)

2.4

Một số công trình nghiên cứu trong và ngoài nước

2.4.2 Nghiên cứu trong nước
Năm 2002, nhóm tác giả Trần Xuân Ngạch và ctv đã phân lập được 4 chủng
nấm men trong quá trình lên men hạt ca cao Quãng Ngãi: Hansenia sporauvarum,
Galatomyces resii, Candida Sorboxylosa, Candida fructus.
Theo Vương Thanh Tùng và Hà Thanh Toàn (2006) đã tiến hành khảo sát chất
lượng hạt ca cao lên men trong điều kiện tự nhiên, những biến đổi sinh hóa và mật số
các vi sinh vật chủ yếu trong quá trình lên men. Kết quả cho thấy lên men hạt ca cao là
một chuỗi các quá trình lên men của các nhóm vi sinh vật nối tiếp nhau. Đầu tiên là sự
phát triển của nấm men, tiếp theo là vi khuẩn, cuối cùng là sự phát triển của một số
14