XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHUYỂN GEN KHÁNG THUỐC DIỆT CỎ VÀO CÂY Jatropha curcas L.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HÒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHUYỂN GEN
KHÁNG THUỐC DIỆT CỎ VÀO
CÂY Jatropha curcas L.

Ngành học:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện:

TRẦN NGUYỄN NHƯ THỦY

Niên khóa:

2011 – 2013

Tháng 01/2013


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHUYỂN GEN
KHÁNG THUỐC DIỆT CỎ VÀO

CÂY Jatropha curcas L.

Hướng dẫn khoa học

Sinh viên thực hiện

TS. BÙI MINH TRÍ

TRẦN NGUYỄN NHƯ THỦY

ThS. VÕ THỊ THÚY HUỆ

Tháng 01/2013


LỜI CẢM ƠN
Để trưởng thành và đạt được kết quả như ngày hôm nay, trước tiên con xin gửi
lòng biết ơn sâu sắc đến Ba - Mẹ, anh hai và em trai đã luôn bên cạnh, động viên, cảm
ơn cả đại Gia đình luôn quan tâm, lo lắng cho con, là điểm tựa lớn nhất của con.
Xin cảm ơn Ban Giám Hiệu Trường đại học Nông Lâm Tp.HCM đã tạo điều kiện
cho em trong bốn năm học tập tại Trường. Các Thầy - Cô đã từng dạy dỗ và Quí Thầy
- Cô thuộc Bộ môn Công Nghệ Sinh Học đã truyền đạt cho em những kiến thức
chuyên môn bổ ích.
Em xin chân thành gởi lời biết đến Thầy Bùi Minh Trí đã quan tâm, tận tình chỉ
bảo và cho em những định hướng đề tài, tạo mọi điều kiện tốt nhất cho em trong quá
trình làm đề tài, là người chỉ đường tận tâm cho em trong một giai đoạn quan trọng của
cuộc đời.
Em cũng xin gửi lời biết ơn đến cô Võ Thị Thúy Huệ đã trực tiếp hướng dẫn tận
tình, luôn có những lời khuyên khi em cần giúp đỡ và những lời động viên nhẹ nhàng
giúp em vững tâm hơn mỗi lúc em thấy thật khó khăn.

Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn đến một người chị, một người bạn, một người
hướng dẫn đã giúp đỡ em rất nhiều trong thời gian thực hiện khóa luận. Là người luôn
có mặt khi em cần giúp đỡ, từ lúc em bắt đầu làm quen với phòng thí nghiệm đến khi
em hoàn thành đề tài.
Em cũng xin cảm ơn thầy Phạm Thành Hổ, viện Sinh Học Nhiệt Đới – thành phố
Hồ Chí Minh đã giúp đỡ em khi em gặp khó khăn trong giai đoạn quan trọng nhất để
hoàn thành đề tài.
Cảm ơn các anh, chị, các bạn và các em cùng làm việc với tôi trong thời gian qua
tại Bộ môn Công Nghệ Sinh Học Thực Vật - Viện Nghiên cứu Công Nghệ Sinh Học
và Môi Trường, Trường Đại học Nông Lâm Tp. HCM đã hỗ trợ tôi trong quá trình làm
đề tài.
Cảm ơn tập thể lớp LT11SH nói chung và những người bạn cùng phòng nói riêng
đã cho mình những kỷ niệm đẹp của thời sinh viên và luôn quan tâm, động viên nhau
trong lúc làm đề tài.

i


Em rất trân trọng sự giúp đỡ của ban lãnh đạo Viện cùng các Thầy – Cô, Anh Chị làm việc tại Viện Nghiên cứu Công Nghệ Sinh học và Môi Trường đã tạo điều
kiện cho em hoàn thành khóa luận này.
Tp. Hồ Chí Minh, ngày 23 tháng 12 năm 2013
Trần Nguyễn Như Thủy

ii


TÓM TẮT
Jatropha curcas L. là đối tượng đang được quan tâm ở nhiều nước trên thế giới
và ở Việt Nam do khả năng ứng dụng của nó trong việc phát triển nhiên liệu sinh học
và nhiều mục đích khác. Đề tài: “Xây dựng quy trình chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ

vào cây Jatropha cursas L.” được thực hiện với mục đích xác định một kỹ thuật phù
hợp để chuyển nạp gen vào cây Jatropha.
Hạt giống Jatropha trồng tại vườn thực vật, Bộ môn Công Nghệ Sinh Học Thực
Vật - Viện Nghiên cứu Công Nghệ Sinh Học và Môi Trường, Trường Đại học Nông
Lâm Tp. HCM được sử dụng làm nguồn vật liệu ban đầu cho chuyển gen. Mẫu phôi
Jatropha thu nhận từ hạt được tiến hành xâm nhiễm vi khuẩn A. tumefaciens chủng
EHA101 mang plasmid pGII0229 Trgus cp 148 luc do Giáo sư Jacobsen (Đại học
Tổng hợp Hannover, Đức) thiết kế. Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả chuyển gen
như kháng sinh diệt khuẩn, nguồn mẫu, thời gian ngâm mẫu, thời gian đồng nuôi cấy
đã được khảo sát với mục đích tìm ra được quy trình chuyển gen hiệu quả.
Kết quả cho thấy sử dụng kết hợp hai loại kháng sinh meropenem 50 mg/l và
cefotaxime 700 mg/l cho hiệu quả diệt khuẩn đạt 48 %, trong khi sử dụng riêng lẻ 2
loại kháng sinh này không có khả năng loại bỏ vi khuẩn một cách hữu hiệu dẫn đến
tình trạng tái nhiễm
Kết quả bước đầu nhuộm GUS cho tỷ lệ dương tính đối với thuốc thử X-gluc khá
cao, ở tất cả các nghiệm thức biến thiên từ 33,33 – 100%. Thời gian đồng nuôi cấy 2
ngày và ngâm mẫu 30 phút cho biểu hiện GUS đạt 100% và ít ảnh hưởng đến sức sống
của mẫu. Mẫu phôi tiền nuôi cấy 2 ngày trên môi trường cảm ứng mô sẹo cho tỷ lệ
biểu hiện GUS (66,67%) cao hơn so với mẫu phôi tiền nuôi cấy 4 ngày trên cùng môi
trường (33,33%) và mẫu phôi tiền nuôi cấy 20 ngày trên môi trường cảm ứng tạo phôi
vô tính. Đồng thời đây cũng là nghiệm thức ít ảnh hưởng đến sức sống của mẫu nhất.
Tuy nhiên ở tất cả các thí nghiệm mức độ biểu hiện GUS không cao, chỉ phát hiện biểu
hiện GUS ở phần ngoài rìa của mẫu.

iii


SUMMARY
Jatropha curcas, a multipurpose, drought tolerant, perennial plant belonging to
Euphorbiaceae family is considered as an important candidate for the production of

biodiesel. The use genetic engineering to transfer genes into Jatropha in order to
improve agronomic traits is a new and promising method. Present study was aimed to
standardize some transformation conditions for Jatropha curcas L. using
Agrobacterium tumefaciens strain EHA 101 harboring vector pGII0229 Trgus cp148
luc, including bacteria antibiotic, preculture coditions, infection and co – cultivation
time. Embryo explants of Jatropha seeds were infected with Agrobacterium
tumefaciens.
It was found that combination of meropenem and cefotaxime at the concentation
of 50mg/l and 700 mg/l, respectively, was more effetive in disinfection of
Agrobacterium (48 %) compared to using these individally which could not remove
bacteria effectively and lead to re – infection. Infection for 30 min and co – cultivation
of embryo explants with Agrobacterium for two days was found optimum (100 %).
Preculture of embryo explants in callus regeneration medium for two days
showed better results (66.67 %) as compared with four-day explants in the same
medium (33.33 %) and after 20 days in somatic embryo regeneration medium
42.86 %).
However, the GUS expression level was not high in all treatments. The
expression was only found in the surface of the explants.

iv


MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM ƠN ................................................................................................................... i
TÓM TẮT....................................................................................................................... iii
SUMMARY.................................................................................................................... iii
MỤC LỤC ...................................................................................................................... iv
DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT ............................................................................... viiiii
DANH SÁCH BẢNG ..................................................................................................... ix

DANH SÁCH HÌNH ....................................................................................................... x
Chương 1 MỞ ĐẦU ......................................................................................................... i
1.1. Đặt vấn đề ................................................................................................................. 1
1.2. Yêu cầu ..................................................................................................................... 2
1.3 Nội dung thực hiện ................................................................................................... 2
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................... 3
2.1. Giới thiệu về cây Jatropha curcas L. ....................................................................... 3
2.1.1. Đặc điểm thực vật học và sinh lý cây Jatropha curcas L. .................................... 4
2.1.2. Sự phân bố của Jatropha curcas L. ....................................................................... 4
2.1.3. Các ưu điểm sinh học đáp ứng tiêu chí một cây nhiên liệu sinh học
tại Việt nam của Jatropha curcas L. ..................................................................... 5
2.2. Sơ lượt về phương pháp chuyển gen ở thực vật ....................................................... 6
2.2.1. Khái niệm chuyển gen thực vật ............................................................................. 6
2.2.2. Thành phần của gen chuyển nạp ........................................................................... 6
2.2.2.1. Trình tự khởi động và kết thúc phiên mã (Promoter và terminator) .................. 6
2.2.2.2. Gen thông báo (reporter gene) ............................................................................ 7
2.2.2.3. Chỉ thị chọn lọc (selectable marker) ................................................................... 7
2.2.3. Một số phương pháp chuyển nạp gen vào thực vật ............................................... 8
2.2.3.1. Chuyển nạp gen bằng phương pháp PEG (polyethylene glycol) ....................... 8
2.2.3.2. Chuyển nạp gen bằng phương pháp sử dụng xung điện
(electroporation) .................................................................................................. 8
2.2.3.3. Chuyển nạp gen bằng phương pháp bắn gen (biolistic) ..................................... 9
v


2.2.3.4. Chuyển nạp gen bằng phương pháp vi tiêm ....................................................... 9
2.2.3.5. Phương pháp chuyển gen gián tiếp sử dụng vi khuẩn
Agrobacterium với sự hỗ trợ sóng siêu âm – SAAT (Sonication-assisted
Agrobacterium mediated transformation) ............................................................ 9
2.3. Phương pháp chuyển gen gián tiếp bằng vi khuẩn Agrobacterium........................ 10

2.3.1. Vi khuẩn Agrobacterium ..................................................................................... 10
2.3.1.1. Phân loại vi khuẩn Agrobacterium ................... Error! Bookmark not defined.
2.3.1.2. Đặc điểm sinh học của vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens ......................... 10
2.3.1.3. Các thành phần của Ti-plamid ......................................................................... 12
2.3.2. Cơ chế xâm nhiễm và gây bệnh thực vật của vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens .................................................................................. 12
2.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình gen gián tiếp bằng vi khuẩn
Agrobacterium ......................................................................................................... 14
2.4.1. Ảnh hưởng của vật liệu gây nhiễm ...................................................................... 15
2.4.2. Ảnh hưởng của thành phần và điều kiện môi trường .......................................... 16
2.4.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ ...................................................................................... 16
2.4.4. Ảnh hưởng của ồng độ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens
và thời gian lây nhiễm ......................................................................................... 17
2.4.5. Ảnh hưởng của dòng vi khuẩn Agrobacterium ................................................... 18
2.5. Các phương pháp kiểm tra cây chuyển gen dựa trên plasmid
pGII0229 Trgus cp 148 luc ..................................................................................... 18
2.5.1. Phương pháp thử GUS......................................................................................... 19
2.5.2. Phương pháp thử khả năng kháng thuốc diệt cỏ (PPT) của cây tái sinh ............. 19
2.6. Một số nghiên cứu trong và ngoài nước về chuyển gen trên cây Jatropha ........... 19
Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ................................................................ 24
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu .......................................................................... 24
3.2. Vật liệu thí nghiệm ................................................................................................. 23
3.2.1. Đối tượng nghiên cứu .......................................................................................... 23
3.2.2. Chủng vi khuẩn tái tổ hợp ................................................................................... 23
3.2.3. Hoá chất và thiết bị .............................................................................................. 23
3.2.3.1. Hoá chất ............................................................................................................ 23
3.2.3.2 Thiết bị ............................................................................................................... 23
vi

3.3. Phương pháp thí nghiệm......................................................................................... 24
3.3.1. Phương pháp chuẩn bị dịch vi khuẩn, khử trùng hạt
và thu nhận mẫu phôi .......................................................................................... 25
3.3.1.1. Chuẩn bị dịch vi khuẩn ..................................................................................... 25
3.3.1.2. Khử trùng hạt .................................................................................................... 25
3.3.1.3 Thu nhận mẫu phôi ............................................................................................ 25
3.3.2. Thí nghiệm khảo sát khả năng diệt khuẩn của 2 loại kháng sinh
meropenem và cefotaxime và lên vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens
chủng EHA101 ..................................................................................................... 24
3.3.2. Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nguồn mẫu cấy đến khả năng
chuyển gen của vi khuẩn Agrobacterium tumerfaciens ...................................... 26
3.3.3. Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của thời gian ngâm mẫu và thời gian
đồng nuôi cấy đến khả năng chuyển gen của vi khuẩn A.tumerfaciens .............. 27
3.4. Xử lý số liệu ........................................................................................................... 30
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................................... 31
4.1. Kết quả khảo sát khả năng diệt khuẩn của hai loại kháng sinh
cefotaxime và meropenem ...................................................................................... 29
4.2. Kết quả phân tích ảnh hưởng của nguồn mẫu cấy đến khả năng
chuyển gen của vi khuẩn Agrobacterium tumerfaciens ......................................... 33
4.3 Kết quả ảnh hưởng của thời gian ngâm mẫu và thời gian đồng nuôi cấy
đến khả năng chuyển gen của vi khuẩn A.tumerfaciens .......................................... 37
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .......................................................................... 40
5.1. Kết luận................................................................................................................... 40
5.2 Đề nghị .................................................................................................................... 40
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................. 41

vii


DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT

AS

Acetosyringone

PAT

phosphinothricin acetyl transferase

PEG

polyethylene glycol

IBA

Indolebutyric acid

BA

6-benzyl adenin

NT

Nghiệm thức

Ti-plasmid

Tumor-inducing plasmid

vir

Virulence

OD

Mật độ quang (Optical density)

PPT

DL–homoalanin–4-yl (methyl) phosphinic acid

gusA

β–glucuronidase

X-gluc

5–bromo–4–chloro–3–indolyl glucuronide

DNA

Deoxiribonucleic Acid

viii


DANH SÁCH BẢNG
Trang
Bảng 3.1 Bố trí thí nghiệm khảo sát khả năng diệt khuẩn của 2 loại
kháng sinh cefotaxime và meropenem lên chủng vi khuẩn........................................... 26
Bảng 3.2 Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nguồn mẫu cấy

đến khả năng chuyển gen của vi khuẩn Agrobacterium tumerfaciens. ......................... 28
Bảng 3.3 Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của thời gian ngâm mẫu
và thời gian đồng nuôi cấy đến khả năng chuyển gen của vi khuẩn
A. Tumerfaciens ............................................................................................................. 29
Bảng 4.1 Kết quả diệt khuẩn với hai loại kháng sinh cefotaxime và
meropenem ở các nồng độ khác nhau. ......................................................................... 30
Bảng 4.2 Tỉ lệ mẫu sống sót trên môi trường chọn lọc và tỉ lệ dương tính
với thử nghiệm GUS của 3 loại mẫu. ........................................................................... 33
Bảng 4.3 Tỉ lệ mẫu sống sót trên môi trường chọn lọc và tỉ lệ dương tính
với thử nghiệm GUS của mẫu phôi Jatropha............................................................... 36

ix


DANH SÁCH HÌNH
Trang
Hình 2.1 Cây Jatropha curcas L. (a) với lá (b) hoa, quả và hạt (c) ............................... 3
Hình 2. 2 Agrobacterium tumefaciens (a) và khối u thực vật
do A. tumefaciens gây ra (b). ......................................................................................... 11
Hình 2.3 Mô hình xâm nhiễm của A. tumefaciens vào tế bào
thực vật (Jacobsen, 2007) .............................................................................................. 13
Hình 2.4 Plasmid pGII0229 Trgus cp148 luc. .............................................................. 18
Hình 2.5 Sơ đồ vùng T-DNA của plasmid pGII0229 Trgus cp148 luc. ....................... 18
Hình 3.1 Mẫu phôi Jatropha tiền nuôi cấy 2 ngày (a) và 4 ngày (b) trên
môi trường cảm ứng tạo mô sẹo ................................................................................... 27
Hình 3.2 Mẫu phôi Jatropha nuôi cấy 15 ngày trên môi trường cảm ứng
tạo phôi vô tính ............................................................................................................ .27
Hình 4.1 Mẫu phôi Jatropha sau 15 ngày diệt khuẩn theo nghiệm thức 7................... 32
Hình 4.2 Biểu hiện GUS của mẫu phôi tiền nuôi cấy theo NT1 .................................. 34
Hình 4.3 Biểu hiện GUS của mẫu phôi tiền nuôi cấy theo NT2 .................................. 34

Hình 4.4 Biểu hiện GUS của mẫu phôi tiền nuôi cấy theo NT1 .................................. 34
Hình 4.5 Mẫu phôi tiền nuôi cấy theo NT1 (a) và đối chứng (d);
Mẫu phôi tiền nuôi cấy theo NT2(c) và đối chứng (e) ; mẫu phôi nuôi cấy
theo NT3 (b) ................................................................................................................. 35
Hình 4.6 Biểu hiện GUS của mẫu phôi xâm nhiễm theo NT1 ..................................... 37
Hình 4.7 Biểu hiện GUS của mẫu phôi xâm nhiễm theo NT2 ..................................... 37
Hình 4.8 Mẫu đối chứng không có biểu hiện GUS ...................................................... 37
Hình 4.9 Mẫu phôi xâm nhiễm theo NT2 sau khi chọn lọc .......................................... 38
Hình 4.10 Mẫu phôi xâm nhiễm theo 1 sau khi chọn lọc ............................................. 38

x


Chương 1 MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Nhu cầu năng lượng ngày càng tăng trong bối cảnh trữ lượng dầu mỏ thế giới
đang dần cạn kiệt, giá cả leo thang và những mối quan tâm đến vấn đề ô nhiễm tăng
cao. Điều này đã dẫn đến việc tìm kiếm các nguồn nhiên liệu tái tạo thay thế. Vấn đề
được quan tâm hiện nay đó là năng lượng sinh học (Biofuel), trong đó diesel sinh học
từ thực vật đang nhanh chóng nổi lên như là sự thay thế cho nhiên liệu xăng dầu.
Tuy nhiên, việc trồng cây lương thực, chẳng hạn như ngô và đậu nành để thu
nhiên liệu sinh học gây ra sức ép đối với nguồn thực phẩm, ảnh hưởng đến diện tích
đất canh tác và giá cả của dầu thực vật khá cao. Một hướng khác để giải quyết vấn đề
này là sử dụng cây trồng sản xuất dầu thực vật không ăn được và có thể phát triển trên
đất không thích hợp cho việc trồng cây lương thực.
Cây Cọc rào (Jatropha curcas L.) tỏ ra là một ứng cử viên thích hợp để trở thành
một loại cây trồng nhiên liệu sinh học. Cọc rào là một loại cây phi thực phẩm với hàm
lượng dầu cao và có thể phát triển trên đất bị suy thoái hay đất thải không phù hợp cho
việc trồng cây lương thực. Dầu sản xuất từ cây trồng này có thể dễ dàng chuyển đổi
thành dầu diesel sinh học, đáp ứng các tiêu chuẩn của Mỹ và châu Âu (Tiwari và cs,

2007).
Song, việc phổ biến và ứng dụng dầu Jatropha bị giới hạn do năng suất của hạt
giống và hàm lượng dầu trong hạt chưa cao.
Vì vậy cần sử dụng các biện pháp chọn tạo giống để cải thiện các đặc tính nông
học và chất lượng dầu trong hạt. Các kỹ thuật chọn tạo giống truyền thống như lai tạo
và chọn lọc nhân tạo đòi hỏi nhiều thời gian và có thể phải trải qua nhiều thế hệ mới có
được những tính trạng mong muốn và loại bỏ những tính trạng không mong muốn. Kỹ
thuật di truyền là một giải pháp đầy hứa hẹn và khả thi nhằm cải thiện đáng kể những
tính trạng của thực vật. Đặc biệt, kỹ thuật chuyển nạp gen nhờ vi khuẩn
Agrobacterium là kỹ thật được sử dụng phổ biến nhất và rất có hiệu quả trong chuyển
gen thực vật. Tuy nhiên, ứng dụng của kỹ thuật di truyền trong tạo giống cây Jatropha
vẫn còn mới mẻ, hiệu quả chuyển gen vào mô thực vật thông qua vi khuẩn

1


Agrobacterium phụ thuộc vào nhiều yếu tố như quá trình tái sinh còn là một thách thức,
cây dễ sinh những biến dị bất thường và mất khả năng sinh sản (Efendi và cs, 2000).
Từ những lý do trên, việc chuyển những gen mong muốn vào cây Jatropha bằng
kỹ thuật chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium, nhằm cải thiện các đặc tính
nông học và chất lượng dầu trong hạt, là hướng đi cần thiết. Đề tài “Xây dựng quy
trình chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ vào cây Jatropha curcas L.” được thực hiện với
mục đích xác định các điều kiện trong quy trình chuyển gen vào cây Jatropha cho hiệu
quả biến nạp cao, làm nền tảng cho các nghiên cứu chuyển nạp những gen khác nhau
vào cây Jatropha.
1.2. Yêu cầu
-

Lây nhiễm chủng vi khuẩn A. tumefaciens EHA101 mang plasmid vector
pIBGUS vào mẫu phôi hạt cây Jatropha.

-

Kiểm tra kết quả chuyển gen vào cây Jatropha bằng phương pháp nhuộm GUS.

-

Tuyển chọn và tái sinh mẫu giả định chuyển gen thành công.

1.3 Nội dung thực hiện
-

Khảo sát khả năng diệt khuẩn của hai loại kháng sinh cefotaxime và meropenem

đối với vi khuẩn A. tumefaciens chủng EHA101
-

Tiến hành lây nhiễm vi khuẩn A. tumefaciens mang plasmid vector pIBGUS vào

mẫu phôi và khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả chuyển nạp
-

Nuôi cấy mẫu đã tiến hành chuyển gen trên môi trường chọn lọc, tuyển chọn và tái

sinh mẫu chuyển gen.
-

Phân tích mẫu đã tiến hành chuyển gen bằng phương pháp nhuộm GUS.

2

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Giới thiệu về cây Jatropha curcas L.

a

b

c

Hình 2.1 Cây Jatropha curcas L. (a) và các bộ phận lá (b) hoa, quả và hạt (c)
(khcn-moit.gov.vn; chemicallygreen.com)

2.1.1. Đặc điểm thực vật học và sinh lý cây Jatropha curcas L.
Jatropha curcas L., thường được gọi là cây dầu mè hoặc cọc rào, là một loại cây
mọng nước hay cây bụi nhỏ, thuộc giới Plantae, ngành Magnoliophyta, lớp
Magnoliopsida, họ Euphorbiaceae, chi Jatropha, loài Jatropha curcas Linn (Wahl và
cs, 2009). Jatropha có khoảng 70 loài khác nhau đã được xác định. Tên chi Jatropha
có nguồn gốc từ jatrós (bác sĩ), trophé (thức ăn) trong tiếng Hy Lạp, với hàm ý được
sử dụng như thuốc. Curcas là tên gọi thông thường cho cây cọc rào ở Malabar, Ấn Độ
(Kamal và cs, 2011).

3


Jatropha curcas L. có nhiều nhánh dày. Cây Jatropha có thân thẳng và vỏ cây
màu xám hoặc đỏ nhạt. Lá cây này được sắp xếp xen kẽ, có màu xanh, có chiều dài và
chiều rộng từ 6 - 15 cm với 5 đến 7 thùy nông. Nhánh Jatropha chứa mủ màu trắng, là
nguyên nhân gây ra những vết bẩn màu nâu, rất khó loại bỏ. Thông thường, cây

Jatropha có 5 rễ được hình thành từ hạt: một rễ chính (rễ cọc) và các rễ khác là rễ phụ
(rễ bên), cây trồng từ hom (đoạn thân cành được cắt đem đi trồng) thì chỉ phát triển rễ
bên. Cụm hoa của cây này được hình thành ở đỉnh của nhánh, hoa đực và hoa cái đơn
tính trên cùng một thân. Quá trình thụ phấn nhờ côn trùng. Sau khi thụ phấn, trái hình
elip được hình thành. Vỏ quả ngoài vẫn có nhiều thịt cho đến khi trưởng thành. Hạt
của trái Jatropha chín có màu đen và dài trung bình 18 mm, rộng trung bình 10 mm.
Trọng lượng hạt (tính trên 1000 hạt) là khoảng 727 g. Tuổi thọ của cây Jatropha là
hơn 50 năm (Kamal và cs, 2011).
2.1.2. Sự phân bố của Jatropha curcas L.
Jatropha curcas L. có nguồn gốc từ Trung Mỹ. Từ vùng biển Caribbean,
Jatropha curcas có lẽ được phân phối bởi người đi biển Bồ Đào Nha sang các nước
khác ở châu Phi và châu Á. Ngày nay Jatropha là cây trồng ở hầu hết các quốc gia
vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Jatropha curcas L. được sử dụng làm hàng rào xung
quanh khu vườn hoặc để bảo vệ cây trồng chống lại các động vật như gia súc, dê; giảm
xói mòn gây ra bởi nước, gió; làm cây thuốc chẳng hạn như hạt giống chống táo bón,
sap chữa lành vết thương; lá làm trà chống bệnh sốt rét (Kamal và cs, 2011).
Jatropha sinh trưởng và phát triển tốt trên các vùng có độ cao so với mặt nước
biển từ 30 - 1.400 m, nhiệt độ bình quân năm từ 18 -28oC, lượng mưa trung bình năm
từ 480 mm - 2.380 mm. Loài cây này có đặc tính chịu hạn rất khỏe, có thể mọc ở nơi
khô hạn lượng mưa bình quân năm chỉ có 250 mm và cho hiệu quả kinh tế ở những
vùng mà lượng mưa trên 800 mm/năm, trong điều kiện hạn hán 8-9 tháng cây vẫn
không bị chết. Jatropha cũng thích hợp trên đất cát pha và có thể sinh trưởng phát
triển trên nhiều loại đất khác nhau kể cả đất sỏi đá và nhiễm mặn, trừ đất bị ngập úng.
2.1.3 Các ưu điểm sinh học đáp ứng tiêu chí một cây nhiên liệu sinh học tại Việt
nam của Jatropha curcas L.
Các ưu điểm sinh học vượt trội và giá trị của cây Jatropha bao gồm:
Jatropha là cây bụi lớn, có chu kỳ sống lâu tới 50 năm, cho quả, hạt sớm, hàng
năm, năng suất cao tới 10-12 tấn/ha, hàm lượng dầu trong hạt cao, trung bình 32- 35%.
4

Đây là nguồn nguyên liệu dầu diesel sinh học rất tiềm năng để dần thay thế các tài
nguyên nhiên liệu hoá thạch đang càng ngày càng bị cạn kiệt.
Cây Jatropha được coi là loài cây thân thiện với môi trường bởi Jatropha có khả
năng cộng sinh với nấm rễ mycorrhiza cao, nên thích nghi sinh trưởng tốt trên những
lập địa suy thoái, khô cằn cỗi, thậm chí ô nhiễm và hoang hóa, do vậy cây có tác dụng
cải tạo đất, cải tạo môi trường rất tốt. Đây là loài cây thường xanh, chỉ cần thu hái quả
hạt hàng năm, không phải đốn hạ cây, tạo ra thảm thực vật có độ che phủ ổn định, có
khả năng hấp thụ CO2 lớn, vì vậy cây Jatropha cũng rất có ý nghĩa về dịch vụ môi
trường (Lê Quốc Huy và cộng sự, 2007).
Năng suất sinh học và hàm lượng chất dinh dưỡng trong hạt cao, bã ép dầu từ cây
Jatropha là nguyên liệu để sản xuất phân hữu cơ cao cấp vì có chứa hàm lượng
protein cao, thành phần hoạt chất của phế liệu có khả năng sử dụng làm chế phẩm
phòng trừ sâu bệnh (Lê Quốc Huy và cộng sự, 2007). Cây Jatropha curcas L. được sử
dụng như là một cây thuốc chẳng hạn như hạt giống chống táo bón, sáp chữa lành vết
thương, lá dùng như trà giúp chống bệnh sốt rét (Garg và cộng sự, 2011).
Các tài liệu nghiên cứu và thử nghiệm cây Jatropha tại một số tỉnh của Việt Nam
cho thấy Jatropha là cây nhiên liệu sinh học có triển vọng ở Việt Nam vì đáp ứng
được một số tiêu chí sau: Cây Jatropha thích hợp với điều kiện đất đai, khí hậu nhiệt
đới ở nước ta và không cạnh tranh với đất trồng cây lương thực. Cây sinh trưởng
nhanh, có thể bắt đầu cho quả khoảng sáu tháng sau khi trồng. Jatropha là cây chịu
hạn, có thể trồng cả trên các vùng đất đai cằn cỗi, đất cát ven biển (như Ninh Thuận,
Bình Thuận), ven đường, đất bờ kênh, ven suối và không cần chăm sóc nhiều như đối
với một số cây trồng khác. Trồng cây Jatropha giúp cải tạo, bảo vệ đất rất tốt và chống
xói mòn trên đất dốc.
Cây Jatropha cho năng suất dầu tương đối cao: 2.500-3.000 l dầu
biodiesel/ha/năm và trồng một lần có thể thu hoạch từ 10 năm trở lên. Trồng cây
Jatropha cần vốn đầu tư thấp trên cùng đơn vị diện tích, tạo việc làm cho người nghèo
và lao động nhàn rỗi. Công nghệ chế biến dầu diesel từ hạt cây Jatropha tương đối
đơn giản, có thể thực hiện với các thiết bị được chế tạo trong nước (Thái Xuân Du và

Nguyễn Văn Uyển, 2006).

5


2.2. Sơ lược về phương pháp chuyển gen ở thực vật
2.2.1. Khái niệm chuyển gen thực vật
Trong cộng đồng công nghệ sinh học thực vật, chuyển nạp (transformation) có
thể được định nghĩa chính xác là quá trình đưa DNA vào tế bào thực vật, dẫn đến sự
thay đổi trong cấu tạo di truyền của tế bào mục tiêu và các dẫn xuất của nó. Khả năng
tái sinh toàn bộ cây từ tế bào thực vật được chuyển nạp, báo cáo đầu tiên bởi Horsch
và cs (1985), đã cách mạng hóa các ngành khoa học cây trồng, thay đổi bộ mặt của
hành tinh, thông qua những thành công và ứng dụng nhanh chóng của cây trồng biến
đổi gen (Finer, 2009).
Cây chuyển gen (transgenic plant) là cây mang một hoặc nhiều gen được đưa vào
bằng phương thức nhân tạo thay vì thông qua lai tạo như trước đây. Những gen được
đưa vào (gen chuyển) có thể được phân lập từ những loài thực vật có quan hệ họ hàng
hoặc từ những loài khác biệt hoàn toàn. Thực vật tạo ra được gọi là thực vật “chuyển
gen” mặc dù trên thực tế tất cả thực vật đều được “chuyển gen” từ tổ tiên hoang dại
của chúng bởi quá trình thuần hóa, chọn lọc và lai giống có kiểm soát trong một thời
gian dài (Nguyễn Hoàng Lộc, 2007).
2.2.2. Thành phần của gen chuyển nạp
2.2.2.1. Trình tự khởi động và kết thúc phiên mã (Promoter và terminator)
Một gen lạ chuyển nạp vào cây trồng chỉ có thể biểu hiện khi có một chuỗi trình
tự khởi động phiên mã thích hợp đi kèm theo nó, đó là các promoter. Mỗi promoter
khác nhau cần có các vector tương ứng. Hiện nay, promoter CAMV35S của virus gây
bệnh khảm trên cải bông là một trong những promoter mạnh và được sử dụng phổ
biến nhất. Theo Heldt (1997) promoter này bao gồm các enhancer có khả năng phiên
mã ở mức độ cao.
Terminator giúp đảm bảo gen chuyển kết thúc phiên mã đúng vị trí và không tạo

những protein thể khảm với các protein thực vật. Có rất nhiều terminator có tiềm năng
đã được tìm ra nhưng terminator nos (được thu nhận từ gen tổng hợp nopaline của Ti
plasmid trong vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens) vẫn là terminator thông dụng
nhất (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004).
2.2.2.2. Gen thông báo (reporter gene)
Dù là chuyển nạp gen bằng phương pháp nào cũng đều cần một phương pháp tin
cậy để xác định tế bào nào đã nhận gen ngoại lai (Jacobsen, 2007). Với mục đích đó,
6


khi thiết kế plasmid, người ta đã sử dụng một hay nhiều gen thông báo. Những gen
thông báo đều mang chuỗi mã tổng hợp một loại protein đặc biệt nào đó rất dễ phát
hiện trong cây giúp nhận biết tế bào hoặc thể chuyển gen và cho phép đo lường mức
độ biểu hiện của gen ngoại lai.
Gen gusA của vi khuẩn E.coli là một trong các gen thông báo thường được sử
dụng phổ biến. Gen gusA mã hóa enzyme β–glucuronidase. Enzyme này xúc tác phản
ứng phân giải cơ chất glucuronidae không màu để tạo thành sản phẩm có màu xanh
chàm đặc trưng. Glucuronidae thường dùng là 5–bromo–4–chloro–3–indolyl
glucuronide (X-gluc). Trong tự nhiên, enzyme β–glucuronidase không tồn tại trong
thực vật nên gen gusA là gen chỉ thị rất tốt trong công nghệ gen thực vật. Mặt khác,
sản phẩm màu xanh chàm nói trên rất bền và phản ứng ít bị ảnh hưởng của pH môi
trường nên thuận tiện cho việc theo dõi.
Ngoài ra còn có gen phát sáng gfp hoặc gen mã hóa cho chloramphenicol
acetyltransferase (CAT), gen luc mã hóa cho luciferase được lấy từ đom đóm (Bùi Chí
Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004).
2.2.2.3. Chỉ thị chọn lọc (selectable marker)
Sau khi chuyển gen, cần phải tiến hành chọn lọc để tách riêng và tái sinh các tế
bào đã nhận gen mục tiêu. Vì vậy tất cả các plasmid đều phải có ít nhất một gen chọn
lọc để giúp quan sát và chọn lọc những thể chuyển gen thành công. Các gen này
thường mã hóa cho một enzyme có khả năng khử độc tính của chất chọn lọc như

kháng sinh (nptII, hpt…) hoặc thuốc diệt cỏ (bar hay pat) trong quá trình chuyển hóa.
Khi các gen chọn lọc biểu hiện, chúng sẽ giúp tế bào tiếp tục sinh trưởng trong môi
trường chọn lọc (selective media) thường chứa chất kháng sinh hay thuốc diệt cỏ.
Ngoài ra, chúng còn được dùng để phân tích bộ gen của cây được chyển gen nhằm
xác định đoạn DNA đưa vào có hoạt động hiệu quả hay không.
Một số chỉ thị chọn lọc phổ biến hiện nay như gen nptII mã hóa enzyme
neomycin phospho transferase II xúc tác quá trình phosphoryl hóa kháng sinh
kanamycin và làm bất hoạt kháng sinh này, gen hph mã hóa enzyme hygromycin
phospho transferase có tác dụng làm bất hoạt kháng sinh hygromycin, gen hph tỏ ra
rất thành công trên cây bắp (Walters và ctv, 1992), cây lúa (Christou và ctv, 1991; Li
và ctv, 1993). Gen bar kháng thuốc diệt cỏ có thể được sử dụng như gen mục tiêu
nhưng đồng thời cũng là một chỉ thị chọn lọc. Gen bar mã hóa cho enzyme
7


phosphinothricin acetyl transferase (PAT) làm bất hoạt phosphinothricin (PPT), là
thành phần chính trong thuốc diệt cỏ Basta. Gần đây, gen pmi mã hóa enzyme
phospho mannose isomerase đã được sử dụng làm chỉ thị chọn lọc. Gen này hoạt động
trên cơ sở phản ứng huỳnh quang trong môi trường có đường mannose. Điều này đã
mở ra một triển vọng lớn về an toàn sinh học do không cần sử dụng các gen kháng
kháng sinh hay kháng hoạt chất diệt cỏ (Lê Trần Bình, 2008).
2.2.3 Một số phương pháp chuyển nạp gen vào thực vật
2.2.3.1. Chuyển nạp gen bằng phương pháp PEG (polyethylene glycol)
Phương pháp PEG được sử dụng để chuyển nạp gen trên cả động vật lẫn thực vật.
Đối tượng của phương pháp này là các tế bào trần, gen chuyển nạp ở dạng plasmid
DNA. Phương pháp được phát triển dựa trên nguyên tắc PEG làm kích hoạt sự dung
hợp tế bào trần từ đó tạo khả năng du nhập gen lạ vào tế bào. Cao và ctv (1991) đã sử
dụng nguồn tế bào trần từ ba giống lúa Pi 4, Taipei 309 và Nipponbare trong thí
nghiệm chuyển gen bằng phương pháp PEG, kết quả là đã thu được những tế bào trần
mang các gen chuyển nạp.

2.2.3.2. Chuyển nạp gen bằng phương pháp sử dụng xung điện (electroporation)
Nguyên tắc của phương pháp này là sử dụng xung điện với thời gian cực ngắn
trong một điện trường cực mạnh tạo ra các lỗ tạm thời trên màng sinh chất để làm
tăng khả năng xâm nhập của DNA cần chuyển vào tế bào trần (Nagara, 1989).
Phương pháp sử dụng xung điện đã được sử dụng trong chuyển nạp gen trên cả động
vật, thực vật và vi sinh vật. Tuy còn nhiều khó khăn chưa giải quyết được về mặt kỹ
thuật nhưng người ta cũng đã ghi nhận những trường hợp chuyển gen thành công trên
cây lúa (Toriyama và ctv, 1988; Zhang và ctv, 1988; Shimamoto và ctv, 1989), trên
cây bắp (Rhodes và ctv, 1988) và trên cây cải dầu (Guerche và ctv, 1987, trích dẫn
bởi Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004).
2.2.3.3. Chuyển nạp gen bằng phương pháp bắn gen (biolistic)
Phương pháp bắn gen được phát minh bởi John Stanford ở Đại học Cornell
(Klein và ctv, 1987). Ưu điểm của phương pháp này là có thể áp dụng trên tất cả các
loài thực vật một lá mầm và hai lá mầm, không cần hệ vector kép (binary vector) và
quy trình vận hành tương đối đơn giản.
Bột vàng hoặc tungsten sẽ được phủ lớp DNA mục tiêu trên bề mặt và được gắn
lên viên đạn plastic. Khi bắn, viên đạn phóng xuống tấm chắn tạo ra một lực phóng
8


các hạt vàng (hay tungsten) túa ra trên rây lưới kim loại với một vận tốc lớn xuyên
vào tế bào. Mô được bắn xong sẽ được chuyển vào môi trường tái sinh có bổ sung các
chất chọn lọc thích hợp (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004).
2.2.3.4. Chuyển nạp gen bằng phương pháp vi tiêm
Vi tiêm (microinjection) là phương pháp tiêm trực tiếp DNA vào nhân của tế bào
phôi bằng cách sử dụng micropipette để tiêm dung dịch DNA lạ vào tế bào trần dưới
áp lực cao, tạo ra những cây chuyển gen (Neuhaus và ctv, 1987; De la Pẽna và ctv,
1987, trích dẫn bởi Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004). Phương pháp này đòi
hỏi trang thiết bị kỹ thuật đắt tiền cho việc vi thao tác dưới kính hiển vi và sự khéo léo,
chính xác tiêm một lượng rất nhỏ dung dịch DNA.

2.2.3.5 Phương pháp chuyển gen gián tiếp sử dụng vi khuẩn Agrobacterium với
sự hỗ trợ sóng siêu âm – SAAT (Sonication-assisted Agrobacterium mediated
transformation)
Phương pháp SAAT là phương pháp biến đổi gen dựa trên phương pháp chuyển
gen gián tiếp nhờ vào vi khuẩn Agrobacterium. Mô đích sẽ được xử lý trong một thời
gian ngắn cùng với sự hiện diện của vi khuẩn. Sóng siêu âm sẽ tạo rất nhiều vết
thương nhỏ và đồng đều trên mô cây, cho phép Agrobacterium xâm nhiễm dễ dàng và
do đó sẽ làm gia tăng hiệu quả biến nạp. Đây là phương pháp khá hữu hiệu, đơn giản,
rẻ tiền làm gia tăng hiệu quả biến nạp vào mẫu mô cây có hiệu quả chuyển gen thấp
(Liu và ctv, 2005).
Theo Trick và Finer (1997), các mô xử lý SAAT cho thấy sự tăng mạnh của biểu
hiện GUS so với các mô chỉ ủ khuẩn thông thường. Tùy theo loại mô, thời gian đáp
ứng cũng khác nhau, có thể từ vài giây đến vài trăm giây. Các mô đáp ứng ở diện
rộng với thời gian xử lý SAAT. Vì thế, thời gian xử lý tối ưu là khi xử lý thời gian
ngắn nhất và cho hiệu quả cao nhất.
Từ năm 1974, Miller và ctv ứng dụng phương pháp chuyển gen SAAT trên mô
rễ cây Vicia faba; đến năm 1990 Joersbo và Brunstedt chuyển vào protoplast của
Nicotiana tabacum và Beta vulgaris, Trick và Finer thực hiện trên cây đậu nành, bắp,
lúa mì vào năm 1997, v.v.. Gần đây, một số nghiên cứu của Liu và ctv (2005) trên hạt
Phaseolus vulgaris L., Park và ctv (2005) trên Raphanus sativus L. đã kết hợp SAAT
với phương pháp thấm hút chân không, tạo điều kiện cho A. tumefaciens xâm nhiễm,

9


làm tăng khả năng biến nạp. Sự kết hợp giữa hai phương pháp tỏ trên ra rất hữu hiệu,
nhất là trên các loại cây khó chuyển nạp gen (Liu và ctv, 2005).
2.3. Phương pháp chuyển gen gián tiếp bằng vi khuẩn Agrobacterium
Biến nạp gen thực vật đã cho phép nhà chọn giống biến đổi cây trồng bằng một
phương pháp mới và có khả năng khắc phục các vấn đề quan trọng của nông nghiệp

hiện đại. Chuyển các gen vào thực vật đã được thực hiện thông qua kỹ thuật sử dụng vi
khuẩn Agrobacterium như một vector sinh học hoặc kỹ thuật chuyển gen trực tiếp
(Tsaftaris và cs, 2000).
Kỹ thuật chuyển gen dựa trên vi khuẩn Agrobacterium và kỹ thuật chuyển gen
trực tiếp phát triển song song, nhưng ngày nay phương pháp chuyển gen gián tiếp
được sử dụng rộng rãi nhất do tính đơn giản và hiệu quả của nó đối với nhiều loài thực
vật, mặc dù nó vẫn còn bị hạn chế về phạm vi của cây trồng chủ (Tsaftaris và cs, 2000).
2.3.1. Vi khuẩn Agrobacterium

a

b

Hình 2. 2 Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens (a) và khối u thực vật
do A. tumefaciens gây ra (b)
(www.apsnet.org, www.visualphotos.com)

2.3.1.1. Đặc điểm sinh học của vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens
Agrobacterium tumefaciens thuộc giới Bacteria, ngành Proteobacteria, lớp Alpha
Proteobacteria, bộ Rhizobiales, họ Rhizobiaceae, chi Agrobacterium, loài
A. tumefaciens (Deacon và ctv, 2005).
Agrobacterium tumefaciens là vi khuẩn Gram âm, hình que,di động, không sinh
bào tử và có quan hệ gần gũi với vi khuẩn cố định đạm Rhizobium (Deacon và ctv,
2005). Đây là vi khuẩn hiếu khí, có 5- 11 lông roi, phát triển tối ưu ở 29oC trong môi
10


trường có bổ sung mangan và succinate như là nguồn cacbon duy nhất (Domer, 1999).
Agrobacterium tumefaciens là nguyên nhân gây bệnh u sần trở thực vật (chủ yếu là cây
hai lá mầm) khi xâm nhiễm vào cây.

Bộ nhiễm sắc thể Agrobacterium tumefaciens dạng vòng, có kích thước 2,6Mb.
Ngoài ra vi khuẩn còn mang một hay nhiều plasmid lớn có kích thước 200 - 800 kb
(Gelvin, 2003), một trong số đó là Ti plasmid, hầu hết các gen gây khối u đều nằm trên
Ti plasmid, chính plamid này là nguyên nhân gây ra khối u trên cây khi vi khuẩn này
xâm nhập (Deacon và ctv, 2005). Khi rễ cây xuất hiện vết thương thì tế bào vi khuẩn
sẽ di chuyển về phía vết thương theo cơ chế hóa hướng động và xâm nhập vào cây qua
vết thương đó. Ti plasmid mang các gen để xác định kí chủ và triệu chứng khi nhiễm
vào cây. Những vi khuẩn không mang Ti lasmid thì được xem như là vi khuẩn không
độc và không có khả năng gây bệnh khối u cho cây. Các khối u có đường kính đến 30
cm nhưng phổ biến là 5 – 10 cm. Cây bị nhiễm vi khuẩn sẽ trở nên còi cọc, lá úa vàng
và rất nhạy cảm với các điều kiện môi trường. Khi xâm nhiễm vào cây một phần gen
trên Ti plasmid sẽ gắn vào bộ gen của cây làm cho các tế bào phát triển mạnh và sản
xuất ra một chất đặc biệt gọi là opine. Vi khuẩn sẽ sử dụng chất này như nguồn cacbon
và nitơ (Gustavo và cs, 1998).
2.3.1.2 Các thành phần của Ti-plamid
Ti plasmid là một DNA vòng tách rời với nhiễm sắc thể của vi khuẩn và có khả
năng nhân lên một cách độc lập trong tế bào vi khuẩn. Việc xác định Ti plasmid như
một nguyên lý tạo bướu TIP (tumor inducing principle) đã đánh dấu bước khởi động
của một giai đoạn mới trong nghiên cứu về Agrobacterium tumefaciens. Điều này đã
mở ra khả năng nghiên cứu cấu trúc và chức năng của plasmid bằng kỹ thuật di truyền
phân tử (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2000).
Trong quá trình xâm nhiễm, T-DNA, một đoạn của Ti plasmid, được chuyển vào
nhân tế bào thực vật và cài nhập vào nhiễm sắc thể của cây (Gustavo và cs, 1998).
Trong cấu trúc của Ti plasmid , hai yếu tố quan trọng cần cho sự chuyển gen vào cây
là đoạn T- DNA, bao gồm cả trình tự 25 bp ở hai cánh của T- DNA, và gen vir
(Nguyễn Đức Lượng và cs, 2002).
T-DNA có chứa hai loại gen: thứ nhất là các gen gây ung thư, mã hóa cho enzym
tham gia trong quá trình tổng hợp auxin và cytokinin và chịu trách nhiệm cho sự hình
thành khối u; thứ hai là các gen mã hóa cho tổng hợp opines. Các hợp chất này được
11

tạo ra bởi phản ứng giữa axit amin và đường được tổng hợp và tiết ra bởi các tế bào
khối u. Hai bên đoạn T-DNA là hai trình tự lặp đi lặp lại 25 bp, hoạt động như một yếu
tố cis cho sự chuyển gen vào thực vật.
Quá trình chuyển T-DNA là hết quả hoạt động hợp tác của các protein được mã
hóa bởi các gen trong khu vực độc của plasmid Ti (gọi là các gen vir) và trong các
nhiễm sắc thể vi khuẩn. Khu vực gen độc 30 kb (vùng gen vir) được tổ chức trong sáu
operon cần thiết cho việc chuyển T-DNA (virA, virB, virD, và virG) hoặc để tăng hiệu
suất chuyển gen (virC và virE) (Riva và cs, 1998).
Ngoài T-DNA, Ti plasmid còn mang các gen dị hóa giúp phân giải sản phẩm của
các tế bào khối u, các gen liên quan đến quá trình tiếp hợp plasmid và các gen có vai
trò trong sự ổn định và toàn vẹn plasmid (Hooykaas và Schilperoort, 1992; Zupan và
Zambrysky, 1995 trích dẫn bởi Riva và cs, 1998).
2.3.2 Cơ chế xâm nhiễm và gây bệnh thực vật của vi khuẩn Agrobacterium
tumefaciens

Hình 2.3 Mô hình xâm nhiễm của vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens vào tế bào thực vật
()

12


Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens sống phổ biến ở xung quanh và trên bề mặt
rễ cây, nơi mà vi khuẩn tồn tại nhờ việc sử dụng chất dinh dưỡng do mô rễ tiết ra. Vi
khuẩn chỉ xâm nhiễm vào cây khi cây bị tổn thương do nhiều nguyên nhân khác nhau.
Trong đều kiện tự nhiên, các tế bào vi khuẩn di chuyển đến vị trí vết thương nhờ các
dấu hiệu hoá học. Đều này có được là do đáp ứng giải phóng đường và các thành phần
phổ biến khác trong rễ. Tuy nhiên, các chủng vi khuẩn mang Ti plasmid sẽ đáp ứng
mạnh hơn bởi vì chúng xác định các hợp chất vết thương (hợp chất phenolic) như

acetosyringone. Chất này có tác dụng rất mạnh dù ở nồng độ thấp (10-7M). Bởi vậy,
một trong những chức năng của Ti plasmid là mã hoá các thụ thể (receptor) nhận biết
các chất hoá học. Những thụ thể này nằm trên màng tế bào vi khuẩn và có thể giúp cho
vi khuẩn nhận biết ra các vùng bị tổn thương.
Acetosyringone đóng vai trò quan trọng trong tiến trình xâm nhiễm. Ở nồng độ
cao (10-5 – 10-4M) hơn nó sẽ kích hoạt các gen vir trên Ti plasmid (Valentine, 2003).
Sau khi được kích hoạt, các gen vir sẽ đều khiển quá trình tạo sợi đơn T-DNA. Quá
trình tạo sợi đơn T-DNA được thực hiện trong tế bào vi khuẩn và do các protein virD1
và virD2 thực hiện. Sau đó protein virD2 gắn vào sợi đơn T-DNA để tạo thành phức
hợp T- DNA. Phức hợp T-DNA-virD2 cùng với protein virE2 được chuyển vào trong
tế bào cây thông qua hệ thống chuyển nạp được mã hoá bởi các gen virB. Cùng với
một số thành phần trong tế chất của tế bào cây, các protein của vi khuẩn sẽ tiếp tục đưa
phức hợp T-DNA vào trong nhân tế bào (Valentine, 2003 ).
Trong nhân tế bào cây, T-DNA được kết nạp vào bộ gen của cây không theo một
quy luật tái tổ hợp nào cả, đầu tiên đầu 3’ của T-DNA nhận diện các đoạn tương đồng
với DNA của cây và gắn vào. Sau đó nucleotide gắn với virD2 tìm các đoạn vi tương
đồng (microhomology) trên DNA cây và gắn vào. Sự gắn kết này mang cầu nối
phosphotyrosine có ái lực điện tử của đầu 5’ đến gần đầu 3’ nucleophilic của DNA cây
mà bị tách ra. Cuối cùng sự gắn kết trên sợi DNA của cây được hoàn thành và cây
chuẩn bị một cơ chế sinh tổng hợp đoạn T-DNA dẫn đến sự hòa hợp của T-DNA hoàn
thành. Cuối cùng, sau khi sự kết nạp hoàn thành các gen trên T-DNA hoạt động tổng
hợp nên các sản phẩm cần thiết cho vi khuẩn (Valentine, 2003 ).
Người ta đã lợi dụng đặc điểm của vi khuẩn Agrobacterium để chuyển gen mong
muốn vào thực vật, trong đó plasmid Ti được biến đổi, nó chỉ còn khả năng gắn TDNA vào bộ gen của tế bào đích và mất khả năng gây bệnh.
13