Nghiên cứu đặc điểm gen ZmbZIP72 phân lập từ giống ngô địa phương việt nam và thiết kế cấu trúc mang gen phục vụ nghiên cứu chuyển gen vào cây trồng

VIỆN HÀN LÂM VÀ KHOA HỌC VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI TÀI NGUYÊN VÀ SINH VẬT

PHẠM THỊ HẰNG

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM GEN ZmBZIP72 PHÂN LẬP TỪ GIỐNG NGÔ ĐỊA
PHƯƠNG VIỆT NAM VÀ THIẾT KẾ CẤU TRÚC MANG GEN PHỤC VỤ
NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN VÀO CÂY TRỒNG

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60 42 01 14

LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC
GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN: TS. HUỲNH THỊ THU HUỆ

Hà Nội - 2017


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết quả nêu
trong luận văn là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nào khác.
Hà Nội, Ngày tháng năm 2017
Tác giả luận văn

Phạm Thị Hằng

i


LỜI CẢM ƠN
Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS. Huỳnh Thị

Thu Huệ - Phó trưởng phòng Đa dạng sinh học hệ gen – Viện Nghiên cứu hệ gen đã tận
tình hướng dẫn và dìu dắt tôi trong quá trình hoàn thành luận văn.
Luận văn này được thực hiện tại phòng Đa dạng sinh học hệ gen – Viện Nghiên
cứu hệ gen với sự hỗ trợ kinh phí của Đề tài cấp nhà nước: “Phân lập thiết kế gen chịu
hạn phục vụ công tác tạo giống ngô biến đổi gen” giai đoạn 2014-2018 do Bộ Nông
nghiệp và Phát triển Nông thôn quản lý.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo thuộc cơ sở đào tạo Viện Sinh thái và
Tài nguyên sinh vật và ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu hệ gen đã giảng dạy và tạo điều
kiện cho tôi học tập và thực hiện luận văn.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới toàn thể các cán bộ Phòng Đa dạng sinh học hệ gen,
Viện Nghiên cứu hệ gen đã luôn nhiệt tình giúp đỡ và cho tôi những lời khuyên cũng như
những góp ý quý báu trong quá trình tôi thực hiện luận văn.
Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn động viên, giúp đỡ
tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.
Hà Nội, Ngày tháng năm 2017
Tác giả luận văn

Phạm Thị Hằng

ii


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
ABA

Abscisic acid

ABF

ABRE binding factor

ABRE

AB -responsive element

AP2/EREBP

APETALA2/ethylene responsive element binding protein

AREB

ABA responsive element binding protein

AS

Acetosyringone

bZIP

basic leucine zipper

CaMV

Cauliflower mosaic virus

CBF

CRT binding factor

CBU

Crop Biotech Update

cDNA

Complementary DNA

CDPK

Calcium-dependent protein kinase

CDS

Coding DNA sequence

CRT

C-Repeat

CSP

Cold shock protein

CUC2

Cupshaped cotyledon 2

CYP

Cyclophilin

DEPC

Diethyl pyrocarbonate

DNA

Deoxyribonucleic acid

DRE

Dehydration responsive element

DREB

Dehydration responsive element binding
iii


DST

Drought and Salt Tolerance

EAR

ERF-associated amphiphilic repression

EDTA

Ethylenediaminetetraacetic acid

ERD1

Early responsive to dehydration

ERF

Ethylene responsive e blement

EtBr

Ethidium bromide

FAO

Food and Agriculture Organization

FAS-USDA

Foreign Agricultural Service-United States Department of Agriculture

HSP

Heat Shock Protein

LB

Lysogeny broth

LEA

Late embryogenesis abundant

MALDI-TOF

Matrix-assisted laser desorption/ionization- time of flight

MCS

Multiple cloning site

mRNA

Messenger RNA

NAC

NAM, ATAF1,2, CUC2

NACRS

NAC recognition sequence

NAM

No apical meristem

NF-Y

Nuclear factor Y

PCR

Polymerase Chain Reaction

PIS

Phosphatidylinositol synthase

PKC

Protein kinase C

PTMs

Post translation modifications
iv


RNA

Ribonucleic acid

RT-PCR

Reverse transcription-polymerase chain reaction

sHSP

Small heat shock protein

TF

Transcription factor

WFP

World Food Programme

WMO

World Meteorological Organization

ZAT

Zinc transporter

ZFP

Zinc finger protein

v


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng

Tên bảng

Trang

Bảng 1.1

Sản lượng ngô trên toàn thế giới qua các niên vụ 2011/2012 –

14

2016/2017
Bảng 2.1

Trình tự mồi sử dụng trong nghiên cứu

Bảng 2.2

Thành phần các môi trường sử dụng trong nuôi cấy mô thực vật 22 - 23

Bảng 3.1

Kết quả biến nạp gen ZmbZIP72

57

Bảng 3.2

Danh sách mẫu cây chuyển gen ZmbIP72 thu được

58

vi

21 - 22


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình

Tên hình

Trang

Hình 2.1

Sơ đồ vector biểu hiện mang gen ZmbZIP72

29

Hình 3.1

Sản phẩm tách chiết RNA tổng số từ mẫu mô lá ngô xử lý hạn

38

nhân tạo
Hình 3.2

Sản phẩm PCR nhân gen Actin từ các mẫu cDNA

39

Hình 3.3

Kết quả RT-PCR nhân gen ZmbZIP72

40

Hình 3.4

Tách chiết và chọn lọc plasmid mang gen ZmbZIP72

41

Hình 3.5

Kiểm tra plasmid pJET 1.2 mang đoạn gen ZmbZIP72

42

Hình 3.6

So sánh trình tự nucleotide giữa đoạn gen ZmbZIP72 từ giống
Tẻ

43

Hình 3.7

vàng chắt dạo (Lai Châu) với trình tự tham chiếu
So sánh trình tự acid amin suy diễn của đoạn CDS trên đoạn gen

44

ZmbZIP72 giống Tẻ vàng chắt dạo (Lai Châu) với trình tự tham
chiếu
Hình 3.8

Kiểm tra sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi ZmbZIP72SacI F/R

45

Hình 3.9

Kết quả cắt enzyme giới hạn BglII trên các plasmid pJET 1.2

46

Hình 3.10 Tách chiết và chọn lọc plasmid pRTL2 mang gen ZmbZIP72

47

Hình 3.11 Sản cắt plasmid pRTL2_ZmbZIP72 bằng enzyme HindIII

47

Hình 3.12 Sản phẩm cắt plamsid pRTL2_ZmbZIP72 với enzyme BamHI
và HindIII
Hình 3.13 Chọn lọc plasmid pCAMBIA1300 mang gen ZmbZIP72

48

Hình 3.14 Sản phẩm cắt plasmid pCAM1300_ZmbZIP72 bằng enzyme

HindIII
Hình 3.15 Sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp 01 bằng enzyme SacI, HindIII

51

Hình 3.16 Sản phẩm PCR nhân đoạn gen ZmbZIP72 từ 4 dòng plasmid

53

Hình 3.17 Minh hoạ quá trình biến nạp và tái sinh cây ngô chuyển gen

56

Hình 3.18 DNA tổng số tách chiết từ mẫu lá cây chuyển gen ZmbZIP72
thế hệ T0

60

vii

50

51


Hình 3.19 Sản phẩm PCR nhân gen chỉ thị hygromycin ở các cây chuyển
gen T0
Hình 3.20 Sản phẩm PCR nhân gen đích ZmbZIP72 ở cây chuyển gen T0

viii

61
62


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN................................................................................................................ i
LỜI CẢM ƠN .................................................................................................................... ii
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT .................................................................................iii
DANH MỤC CÁC BẢNG................................................................................................ vi
DANH MỤC CÁC HÌNH ............................................................................................... vii
MỞ ĐẦU............................................................................................................................. 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................................... 3
1.1. Phản ứng của thực vật trong điều kiện hạn hán , .........................................3
1.1.1.

Tác động của hạn hán đến sinh trưởng và phát triển của thực vật ......3

1.1.3.1.

Các gen mã hoá protein chức năng ..........................................................5

1.1.3.2.

Các gen mã hoá protein truyền tín hiện ..................................................6

1.1.3.3.

Các gen mã hoá yếu tố điều khiển phiên mã ...........................................7

1.2. Họ bZIP là yếu tố điều khiển phiên mã trong cảm ứng chống chịu hạn ở
thực vật .....................................................................................................................10
1.3. Cấu trúc và chức năng của gen ZmbZIP72..................................................12
1.4. Cây ngô và vấn đề chịu hạn ..........................................................................14
1.5. Nghiên cứu tạo giống ngô biến đổi gen ........................................................17
1.6. Chuyển gen vào thực vật thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens19
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................... 21
2.1. Vật liệu và hoá chất nghiên cứu....................................................................21
2.1.1.

Mẫu thực vật ............................................................................................21

2.1.2.

Các vật liệu khác ......................................................................................21

2.1.3.

Hoá chất ....................................................................................................21

2.1.4.

Thiết bị nghiên cứu ..................................................................................23

2.2. Phương pháp nghiên cứu ..............................................................................24
2.2.1.

Tách chiết DNA tổng số từ thực vật .......................................................24

2.2.2.

Tách chiết RNA tổng số từ thực vật .......................................................25

2.2.3.

Sinh tổng hợp cDNA sợi thứ nhất ..........................................................26

2.2.4.

Phương pháp nhân gen bằng kỹ thuật PCR..........................................26
ix


2.2.5.

Tinh sạch các đoạn DNA trên gel agarose .............................................27

2.2.6.

Tạo dòng gen và thiết kế các vector tái tổ hợp mang gen ZmbZIP72 .28

2.2.7.
Biến nạp các vector tái hợp vào tế bào vi khuẩn E. coli DH10β và A.
tumefaciens .................................................................................................................3
0
2.2.8.

Tách chiết và tinh sạch plasmid..............................................................32

2.2.9.

Phân tích plasmid tái tổ hợp bằng enzyme giới hạn .............................33

2.2.10.

Điện di trên gel agarose ...........................................................................33

2.2.11.

Chuyển gen vào thực vật thông qua A. tumefaciens .............................35

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................. 37
3.1. PHÂN LẬP GEN ZmBZIP72 TỪ CÂY NGÔ .............................................37
3.1.1.

Tách chiết RNA tổng số từ mẫu mô lá ngô ............................................37

3.1.2.

Tổng hợp cDNA sợi thứ nhất ..................................................................38

3.1.3.

RT-PCR nhân gen ZmbZIP72.................................................................39

3.1.4.

Tạo dòng gen ZmbZIP72 trong vector pJET1.2....................................40

3.1.5.

Xác định và phân tích trình tự gen ZmbZIP72 .....................................42

3.2. Thiết kế các vector tái tổ hợp mang gen ZmbZIP72 ...................................44
3.2.1.

PCR nhân gen ZmbZIP72 với cặp mồi treo vị trí enzyme SacI ...........44

3.2.2.

Thiết kế vector trung gian mang gen ZmbZIP72 ..................................46

3.2.3.

Thiết kế vector biểu hiện thực vật mang gen ZmbZIP72 .....................49

3.3. Tạo chủng A. tumefaciens mang cấu trúc biểu hiện gen ZmbZIP72 .........52
3.4. Chuyển gen ZmbZIP72 vào cây ngô .............................................................54
3.5. Đánh giá cây ngô T0 chuyển gen ZmbZIP72 ...............................................58
3.5.1.

Kết quả tách chiết DNA tổng số cây ngô chuyển gen ...........................59

3.5.2.

Kết quả PCR kiểm tra sự có mặt của gen chỉ thị hygromycin ............60

3.5.3.

Kết quả PCR kiểm tra sự có mặt của cấu trúc biểu hiện gen ZmbZIP72

61

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ......................................................................................... 64
1.

Kết luận ...........................................................................................................64

2.

Kiến nghị .........................................................................................................64

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN
........................................................................................................................................... 65
x


TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................................... 66

xi


MỞ ĐẦU
Trong nhiều năm gần đây, biến đổi khí hậu đã và đang là vấn đề chính đối với nền
nông nghiệp thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng. Sản lượng lương thực toàn cầu
đang bị thiệt hại nghiêm trọng bởi các yếu tố phi sinh học như hạn, ngập úng, mặn, dịch
bệnh, xói mòn đất và ô nhiễm môi trường (Nikos and Bruinsma, 2012). Trong đó, hạn
hán đang là một trong những nhân tố chính gây ảnh hưởng lớn tới nền sản xuất nông
nghiệp của toàn cầu và ngày càng trở nên nghiêm trọng ở nhiều khu vực. Các quốc gia
thuộc khu vực Nam và Đông Phi là những quốc gia chịu ảnh hưởng nặng nề nhất bởi hạn
hán. Khu vực này đã trải qua hai mùa mưa liên tiếp 2014-15 và 2015-16 với lượng mưa

dưới mức trung bình (WMO, 2016). Theo Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp của Liên
Hợp Quốc (FAO), sản lượng ngũ cốc của khu vực này trong vụ mùa 2015-16 đã giảm
12% so với năm 2014-15. Những khu vực khác bị ảnh hưởng nghiêm trọng bởi hạn hán
trong những tháng đầu năm
2016 bao gồm phần lớn các khu vực ở phía Bắc Nam Mỹ, các vùng phía đông của
Australia, các hòn đảo thuộc phía Tây Thái Bình Dương và các nước Đông Nam Á thuộc
lưu vực sông Mekong đặc biệt là Việt Nam. Chương trình Lương thực thế giới (WFP)
ước tính sẽ có khoảng 17 triệu người cần được hỗ trợ vào đầu năm 2017 (WMO, 2016).
Cây ngô là một trong các loại cây ngũ cốc quan trọng đối với con người. Ở Việt
Nam, ngô là cây lương thực quan trọng thứ hai sau lúa và được trồng ở nhiều vùng khác
nhau. Theo số liệu của Tổng cục thống kê, diện tích trồng ngô ở nước ta năm 2015 ước
đạt
1164,8 nghìn ha, sản lượng ước đạt 5287,2 nghìn tấn và năng suất bình quân đạt 4,54
tấn/ha (). Tuy nhiên, sản xuất ngô ở Việt Nam hiện vẫn chưa
đáp ứng được nhu cầu tiêu dùng trong nước, năm 2015 nước ta vẫn phải nhập khẩu
khoảng 7,55 triệu tấn ngô ( ). Một trong những nguyên nhân
chính là do việc canh tác ngô ở Việt Nam chủ yếu dựa vào nguồn nước mưa tự nhiên.
Điều này ảnh hưởng rất lớn đến khả năng tăng năng suất và sản lượng ngô hàng năm và
đặc biệt là trong điều kiện nắng hạn kéo dài. Do đó, việc nghiên cứu tạo giống ngô chịu
hạn đang là chủ đề nghiên cứu của nhiều tổ chức và các nhà khoa học. Trong nhiều năm
1


gần đây, việc ứng dụng công nghệ sinh học đặc biệt là công nghệ gen để cải thiện khả
năng chịu hạn của cây

2


trồng đang được quan tâm. Tuy nhiên, ở nước ta, những thành tựu trong nghiên cứu tạo

giống ngô biến đổi gen có khả năng chịu hạn vẫn còn hạn chế. Nguyên nhân gồm cả
khách quan và chủ quan như nguồn gen chưa được tập trung khai thác/nghiên cứu nhiều,
công nghệ chuyển gen chưa được tiếp cận sớm, đồng thời cây ngô cũng là đối tượng khó
để chuyển gen vào hệ gen.
Ở thực vật, trong quá trình thích nghi với điều kiện hạn, sự biểu hiện và các cơ chế
điều hòa mức độ biểu hiện của các gen có vai trò quan trọng. Sự biểu hiện của gen liên
quan chặt chẽ với các yếu tố điều khiển phiên mã. Gen ZmbZIP72 là một trong những gen
mã hóa cho yếu tố điều khiển phiên mã của cây ngô đã được phân lập và mô tả bởi Sheng
và cộng sự (2012). Theo nhóm nghiên cứu, sự biểu hiện toàn thể của gen ZmbZIP72 dưới
sự điều khiển của promoter CaMV35S ở các dòng cây Arabidopsis chuyển gen đã làm
tăng đáng kể khả năng thích ứng với khô hạn, cho thấy vai trò tiềm năng của gen
ZmbZIP72 trong việc tăng cường khả năng chịu hạn đối với cây chuyển gen. Trên cơ sở
đó, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu đặc điểm gen ZmbZIP72 phân lập
từ giống ngô địa phương Việt Nam và thiết kế cấu trúc mang gen phục vụ nghiên
cứu chuyển gen vào cây trồng” mục tiêu là phân lập gen và chuyển gen ZmbZIP72 vào
cây dòng ngô K7 để làm nguyên liệu cho các nghiên cứu tạo giống ngô chịu hạn. Các nội
dung nghiên cứu cụ thể như sau:
-

Phân lập, tách dòng gen ZmbZIP72 từ giống ngô Tẻ vàng chắt dạo (Lai Châu) của
Việt Nam.

-

Xác định và phân tích trình tự của gen ZmbZIP72

-

Thiết kế các vector mang gen ZmbZIP72

-

Chuyển gen ZmbZIP72 vào cây ngô thông qua vi khuẩn A. tumefaciens

-

Kiểm tra sự có mặt của gen ZmbZIP72 trong cây chuyển gen T0 bằng kỹ thuật PCR.

3


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.

Phản ứng của thực vật trong điều kiện hạn hán

1.1.1.

Tác động của hạn hán đến sinh trưởng và phát triển của thực vật

Hạn hán là một nguyên nhân quan trọng làm giảm năng suất và chất lượng sản
phẩm của cây trồng. Khi môi trường hạn hán, cây bị mất nước dẫn đến nhiều hậu quả
nghiêm trọng: (i) Gây nên hiện tượng co nguyên sinh và làm cho cây bị héo. Sự co
nguyên sinh chất xảy ra khi tế bào bị stress nước làm cho nước trong tế bào bị thất thoát
ra ngoài nên khối nguyên sinh chất của tế bào co lại, thể tích không bào bị thu hẹp. Khi
cây sống trong môi trường thiếu nước kéo dài, tế bào mất nước dẫn đến các mô trở nên
mềm yếu và sự héo xảy ra. Mô thực vật bị héo tạm thời nhưng cũng có thể vĩnh viễn nếu
sự thiếu nước xảy ra nghiêm trọng và trong thời gian dài. (ii) Môi trường sống bị khô hạn
cản trở sự vận chuyển nước trong mạch gỗ. Trong điều kiện thiếu nước, sự cung cấp
nước cho rễ không đủ trong đêm để thủy hóa các mô đã bị thiếu nước ban ngày, dẫn đến

các lông hút bị tổn thương lớp ngoài, vùng vỏ bị phủ chất sáp (suberin) làm giảm áp suất
rễ nên ảnh hưởng đến đẩy cột nước lên cao trong mạch gỗ. Đặc biệt khi thiếu nước sẽ
hình thành nhiều bọt khí trong mạch gỗ dẫn đến phá vỡ tính liên tục của cột nước làm cho
cột nước trong mạch gỗ không được đẩy lên liên tục. (iii) Hạn hán làm dày lớp cutin trên
bề mặt lá làm giảm sự thoát hơi nước qua biểu bì. (iv) Sự thiếu nước làm giảm cường độ
quang hợp. Khi hàm lượng nước trong lá còn khoảng 40 -50%, quang hợp của lá bị đình
trệ. (v) Đặc biệt, hạn hán cản trở sự sinh trưởng của cây trồng. Thiếu nước ảnh hưởng đến
các hoạt động sinh lý, nhất là quang hợp nên làm giảm sinh trưởng và năng suất cây trồng
nghiêm trọng (Abdullah et al., 2011; Belkheiri & Mulas, 2013).
Việc giảm năng suất do hạn hán đã được báo cáo ở nhiều loại cây trồng, mức độ
nghiêm trọng phụ thuộc vào thời gian xảy ra hạn. Ở lúa mạch (Hordeum vulgare), hạn
hán làm giảm năng suất do số lượng của chồi, cụm hoa, hạt trên mỗi cây và trọng lượng
của mỗi hạt bị giảm. Ở ngô, stress hạn làm giảm năng suất do trì hoãn việc phun râu, do
đó làm tăng thời gian chênh lệch trỗ cờ - phun râu. Đặc tính này liên quan chặt chẽ với
năng suất hạt, cụ thể là số bắp và số hạt trên mỗi cây bị ảnh hưởng (Cattivelli et al.,
4


2008). Thâm hụt

5


nước trong suốt quá trình thụ phấn làm tăng tần số hạt không phát triển ở ngô. Ở cây đậu
triều (Cajanus cajan), hạn hán diễn ra trong giai đoạn nảy mầm làm sản lượng hạt bị
giảm đi 40 – 55% (Nam et al., 2001). Trong giai đoạn sinh sản, thiếu hụt nước làm giảm
sản lượng ở bông (Gossypium hirsutum) do việc giảm hình thành và sự phát triển không
đầy đủ của các quả nang. Hạn hán ở đậu tương cũng làm giảm tổng sản lượng hạt
(Frederick et al., 2001). Hạn hán ít có ảnh hưởng đến tỷ lệ hạt mẩy trên lúa mỳ nhưng
thời gian hình thành hạt ngắn hơn và trọng lượng khô bị giảm khi trưởng thành

(Wardlaw and Willenbrink, 2000).
1.1.2.

Cơ chế chống chịu hạn ở thực vật

Để chống lại khô hạn, thực vật có những biến đổi sinh lý, hóa sinh phù hợp. Có hai
cơ chế bảo vệ thực vật tồn tại trong môi trường thiếu nước: cơ chế tránh mất nước và cơ
chế chịu mất nước. Cơ chế tránh mất nước liên quan đến đặc điểm cấu trúc và hình thái
của bộ rễ (Lê Trần Bình và Lê Thị Muội, 1998). Những cây chịu hạn có bộ rễ khỏe, dài,
mập, có sức xuyên sâu sẽ hút được nước ở những nơi sâu, xa trong đất, hoặc lan rộng với
số lượng lớn để tăng diện tích tìm kiếm nước (Nguyễn Lan Điền, 2003). Cơ chế này phụ
thuộc vào khả năng thích nghi đặc biệt về cấu trúc và hình thái của rễ, chồi nhằm giảm
mất nước một cách tối đa (Lê Trần Bình và Lê Thị Muội, 1998) (Đinh Thị Phòng, 2001).
Trong khi đó, cơ chế chịu mất nước liên quan đến những thay đổi hóa sinh diễn ra trong
tế bào nhằm sinh tổng hợp các chất bảo vệ hoặc nhanh chóng bù lại sự thiếu hụt nước.
Trong điều kiện khô hạn, áp suất thẩm thấu của dịch bào được điều chỉnh tăng lên, giúp
cho tế bào thu nhận được những phân tử nước ít ỏi còn lại trong đất. Nhờ vậy, thực vật
có thể vượt qua được tình trạng hạn cục bộ (Steponkus P.L. et al, 2003). Tự điều chỉnh áp
suất thẩm thấu nội bào còn thông qua tích lũy các chất hòa tan, các protein, các axit amin
ví dụ như: axit amin prolin, mannitol, fructose, K+, các enzyme phân hủy gốc tự do… Sự
điều chỉnh áp suất thẩm thấu có hai chức năng: Giữ và lấy nước vào trong tế bào và ngăn
chặn sự xâm nhập của ion Na+; thay thế vị trí nước nơi xảy ra các phản ứng sinh hóa,
tương tác với lipid hoặc protein trong màng, ngăn chặn sự phá hủy màng và các phức
protein (Lê Trần Bình, Lê Thị Muội, 1998).
6


1.1.3.

Cơ chế phân tử của tính chống chịu hạn ở thực vật

Việc nắm được các cơ chế phân tử của phản ứng chịu hạn ở thực vật là vô cùng
quan trọng đối với việc cải thiện khả năng chịu hạn của cây trồng. Các nghiên cứu gần
đây đã phân lập được hàng trăm gen được cảm ứng hoặc ức chế khi cây gặp điều kiện khô
hạn. Tuy nhiên, chỉ một phần rất nhỏ các gen được kiểm chứng về vai trò của nó trong
việc tăng tính chịu hạn của cây. Những gen này có thể phân vào các nhóm dựa vào chức
năng nội bào như: các gen mã hoá protein chức năng, các gen mã hoá yếu tố truyền tín
hiệu và các gen mã hoá yếu tố điều khiển phiên mã…
1.1.3.1. Các gen mã hoá protein chức năng
Các gen liên quan đến chức năng bảo vệ trực tiếp lên màng tế bào và protein như
LEA protein, heat shock protein (HSP), cold shock protein (CSP). LEA là một nhóm các
protein tự nhiên tích tụ trong hạt phấn hoa, hạt và các mô thực vật trong quá trình đáp ứng
lại các stress phi sinh học. Việc tích luỹ các protein LEA liên quan trực tiếp với khả năng
chịu khô hạn ở thực vật (Amara et al. 2012). Bên cạnh dữ liệu phong phú về cấu trúc và
sự biểu hiện của protein này, ngày càng có nhiều các công trình đề cập đến việc sử dụng
các gen LEA nhằm cải thiện tính chống chịu khô hạn ở thực vật (Grelet et al., 2005). Ví
dụ, gen HVA1 mã hoá nhóm protein LEA3 của cây lúa mạch (Hordeum vulgare L.).
Người ta đã chuyển nạp gen này thành công vào cây ngô để tăng cường khả năng chịu
hạn và mặn trong điều kiện nhà lưới (Nguyen et al., 2013). Gen OsLEA3-1 nhạy cảm với
mặn đã thể hiện tính chống chịu khô hạn trong điều kiện đồng ruộng nhờ sự điều khiển
của promoter CaMV35S và promoter HVA1-like (Xiao et al. 2007).
Các protein sốc nhiệt (HSP) và sốc lạnh (CSP) là các chaperone ngăn ngừa sự biến
đổi và gấp nếp của các thành phần tế bào trong điều kiện stress. Các gen CspA và CspB từ
vi khuẩn đã được chuyển vào ngô để tăng cường khả năng chịu hạn, nóng, và lạnh bằng
cách bảo vệ quá trình quang hợp, sinh dưỡng và các giai đoạn sinh trưởng, sinh sản. Năng
suất tăng lên khoảng 11 – 12% đối với cây ngô chuyển gen CspA và CspB thông qua việc
đánh giá các thử nghiệm về năng suất trong nhiều năm, ở nhiều địa điểm (Yang et al.,
2010). sHSP17.2, sHSP17.4 và sHSP26 là 3 protein sốc nhiệt nhỏ đã được xác định bằng
7

cách sử dụng quang khối phổ MALDI-TOF ở lá ngô khi đáp ứng với stress hạn. Các phân
tích hệ phiên mã cho thấy mức biểu hiện của các sHSP này được điều chỉnh tăng lên khi
đáp ứng với stress nhiệt và hạn ở lá ngô. ABA chịu trách nhiệm điều hoà biểu hiện sau
phiên mã các sHSP này (Hu et al. 2010).
Protein Cyclophilin (CYP) liên quan đến nhiều chức năng như phân chia tế bào,
truyền tín hiệu tế bào, vận chuyển protein, điều hoà phiên mã, cắt nối tiền mRNA và khả
năng chịu stress (Trivedi et al. 2012). Các phân tích silico cho thấy rằng việc đáp ứng
stress của thực vật có liên quan với các protein cyclophilin. Các protein CYP ở lúa, ngô,
Arabidopsis, lúa mạch và brachypodium giống nhau đến trên 80% cho thấy tần số cao các
trình tự bảo thủ. CYP thường gặp ở lục lạp, cytosol, và ty thể (Trivedi et al. 2013). Đánh
giá so sánh chỉ ra rằng mRNA chịu trách nhiệm tổng hợp CYP được phát hiện với tần số
cao ở ngô sau 6 – 7 giờ xử lý stress hạn, ở đậu mất khoảng 48 giờ.
1.1.3.2. Các gen mã hoá protein truyền tín hiện
Nhiều hệ thống truyền tín hiệu có chức năng trong đáp ứng với điều kiện bất lợi
phi sinh học, bao gồm kinase, enzyme chuyển hoá phospholipid, calcium sensing… Mặc
dù các quá trình truyền tín hiệu này khá phức tạp và chưa được hiểu rõ, một vài gen mã
hoá cho các yếu tố truyền tín hiệu có chức năng trong đáp ứng chịu hạn đã được phân lập.
Một vào yếu tố gần đây đã được sử dụng trong tạo tính chịu hạn ở cây chuyển gen như:
NPK (Kovtun et al, 2000), SnRK2 (Umezawa et al., 2004), CBL (Cheong et al., 2003).
Cũng giống như các yếu tố điều khiển phiên mã, việc biến đổi một yếu tố truyền tín hiệu
có thẻ làm thay đổi một loạt các sự kiện sau đó, kết quả là tạo khả năng chống chịu ở
nhiều mặt. Ví dụ, NPK1 là một kinase của Nicotinana. NPK1 nằm ở giai đoạn đầu của
con đường truyền tín hiệu oxi hoá và dẫn đến khả năng chịu hạn, lạnh, nóng và muối ở
cây ngô chuyển gen (Shou et al., 2014). PIS (Phosphatidylinositol synthase) là một
enzyme quan trọng trong con đường tổng hợp phosphatidylinositol không những là một
thành phần cấu trúc màng tế bào mà còn là tiền chất của phần tử tín hiệu điều hoà đáp
ứng của cây trước điều kiện bất lợi. Khi biểu hiện quá mức gen ZmPIS trong cây ngô,
cây tăng cường khả năng chịu hạn đặc biệt là giai đoạn trước khi nở hoa (Liu et al.,
2013).

8


1.1.3.3. Các gen mã hoá yếu tố điều khiển phiên mã
Yếu tố điều kiển phiên mã (TF) là các protein có vai trò kiểm soát quá trình phiên
mã bằng cách bám vào các vùng trình tự đặc hiệu trên promoter của gen. Các yếu tố điều
khiển phiên mã hiện nay được các nhà khoa học tập trung vào nghiên cứu và khai thác do
tiềm năng sử dụng lớn trong công nghệ sinh học (Saibo et al., 2009; Century et al., 2008).
Hiện nay, những nghiên cứu sinh học phân tử đã chỉ ra rằng abscisic acid (ABA) đóng vai
trò quan trọng trong việc đáp ứng và thích nghi với các stress phi sinh học. Người ta nhận
thấy rằng, bên cạnh phần lớn các gen đáp ứng với stress được điều hòa bằng ABA, vẫn
còn một lượng các gen không chịu ảnh hưởng bởi ABA. Do đó, các yếu tố phiên mã cũng
được chia thành nhóm phụ thuộc hay độc lập với ABA. Các TF của hơn 50 họ khác nhau
mã hoá cho 1700 gen khác nhau đã được tìm thấy trong Arabidopsis (Yang et al., 2010).
Các TF được trình bày dưới đây đều là các TF đáp ứng với hạn và chịu hạn.
TF bZIP là một trong những họ yếu tố điều khiển phiên mã phụ thuộc ABA. ABA
responsive element binding factors (AREB/ABF) là một thành viên của nhóm TF bZIP
liên quan đến tín hiệu ABA trong điều kiện hạn hán và trưởng thành của hạt. AREB/ABF
nhận biết và bám vào ABA responsive element (ABRE) yếu tố hoạt động cis để điều
khiển sự hoạt động của các gen phía sau (Mundy et al., 1990). ABRE nằm trong vùng
promoter của các gen đáp ứng ABA (Yamaguchi-Shinozaki and Shinozaki 2006). Việc
đóng khí khổng và giảm sự thoát hơi nước là kết quả của việc tăng hàm lượng ABA do
sự biểu hiện quá mức của AREB1/ABF2, ABF3 hoặc AREB2/ABF4 (Kang et al., 2002).
Sự biểu hiện quá mức của gen ABF3 ở cây lúa chuyển gen cho thấy khả năng chịu hạn
thông qua việc tăng cường độ phát huỳnh quang của diệp lục (Fv/Fm) và giảm sự héo và
cuộn xoắn ở lá (Oh et al., 2005). Các cây chuyển gen AREB1 được điều khiển bởi 35S
promoter cho thấy khả năng sống sót vượt trội (100%) so với cây đối chứng (40%) trong
điều kiện hạn, không những vậy cây chuyển gen còn có hiệu năng sử dụng nước cao hơn
và có nhiều lá hơn so với dòng đối chứng (Leite et al., 2014).
Một trong những họ yếu tố điều khiển phiên mã lớn khác là WRKY, TF này được

tìm thấy ở nhiều loài, đặc biệt là ở các loài thực vật bậc cao (Ulker and Somssich, 2004).
7


Gần đây, các nhà khoa học tập trung vào nghiên cứu vai trò của nhóm TF này trong đáp
ứng của cây với các điều kiện bất lợi phi sinh học, đặc biệt là hạn hán ở Arabidopsis, lúa
mạch (Luo et al., 2013; Xiong et al., 2010). Mới đây, các nhà khoa học đã phân lập được
gen ZmWRKY58 từ ngô và sự biểu hiện của gen này ở các dòng lúa chuyển gen làm tăng
khả năng chống chịu hạn và muối (Cai et al., 2014).
NAC (NAM, ATAF1-2, CUC2) là một họ TF đặc trưng cho thực vật, bao gồm các
vùng NAC bám DNA có tính bảo thủ cao (Guo et al., 2008). Có hơn 100 gen mã hóa cho
các protein NAC đã được xác định trên đối tượng Arabidopsis. Các protein NAC có nhiều
chức năng, không chỉ tham gia vào sự phát triển của cây mà còn tham gia vào phản ứng
chống chịu stress của thực vật (Nakashima et al., 2012). Có khoảng 40 TF NAC trong số
140 được tìm thấy chịu trách nhiệm đối khả năng chịu hạn và mặn ở lúa. NAC019,
NAC055 và NAC072 là các thành viên của họ các yếu tố phiên mã NAC, chúng nhận
biết và bám vào yếu tố NACRS (CATGTG) nằm trong vùng promoter của các gen đáp
ứng nhanh với mất nước (ERD1) và tăng cường khả năng chống mất nước (Tran et al.,
2004). Sự biểu hiện của gen SNAC1 trong cây lúa biến đổi gen làm tăng độ thụ phấn của
hoa lên 17 -22% và khả năng hình thành hạt lên 22 -34% so với các cây đối chứng trong
điều kiện hạn hán vừa và nặng (Hu et al., 2006). Các cây lúa chuyển gen OsNAC6 tăng
cường tính chịu hạn và mặn, ngoài ra còn tăng cường tính kháng bệnh bạc lá so với cây
đối chứng (Nakashima et al., 2007). Cũng nằm trong nhóm NAC, các cây lúa chuyển gen
OsNAC9 có tính chịu hạn rất cao đồng thời, năng suất tốt hơn 13 – 32% so với các cây
đối chứng trong điều kiện bình thường và khô hạn (Redillas et al., 2012).
Một số TF đáp ứng mất nước nhưng không liên quan đến ABA, chúng được gọi là
các TF đáp ứng mất nước không phụ thuộc ABA. Phân tích vùng promoter của các gen
biểu hiện không phụ thuộc ABA trong phản ứng stress của thực vật cho thấy một yếu tố
hoạt động cis với trình tự A/GCCGAC là vị trí liên kết của các TF này, được biết đến như
yếu tố đáp ứng mất nước (DRE- dehydration responsive element). Họ TF đáp ứng mất

nước độc lập ABA điển hình là họ DREB. Các TF này đóng vai trò điều tiết trong điều
kiện stress hạn, lạnh và sự phát triển của lá, hoa, và hạt (Yang et al., 2010). Có 2 loại
DREB
8


(DREB1 và DREB2) được tìm thấy đáp ứng cho những stress khác nhau. DREB1 đáp
ứng với stress lạnh trong khi DREB2 đáp ứng với stress hạn, nhiệt và mặn. Sự biểu hiện
quá mức của ZmDREB1A (DREB1A của Zea mays L.) và OsDREB1A (DREB1A của
Oryza sativa L.) ở Arabidopsis làm tăng cường sự hoạt động của các gen phía sau và tăng
cường khả năng chống chịu stress hạn hán, nhiệt và mặn (Qin et al. 2004; Yang et al.,
2010). Promoter ZmUbi (Zea mays L. Ubiquitin) có hiệu quả trong điều khiển các gen
DREB1A, DREB1B và DREB1C ở Arabidopsis để cải thiện khả năng chống chịu hạn hán
(Yang et al., 2010). Sự biểu hiện của DREB2A-CA đã cảm ứng biểu hiện một loạt các gen
sốc nhiệt và tăng cường khả năng chịu hạn của các cây chuyển gen (Sakamura et al.,
2006). Rất nhiều cây trồng đã được chuyển gen thử nghiệm nhằm biểu hiện yếu tố phiên
mã DREB/CBF như đậu phộng (Arachis hypogaea) (Bhatnagar-Mathur et al., 2014),
khoai tây (Iwaki et al., 2013), đậu nành (de Paiva Rolla et al., 2014), lúa (Datta et al.,
2012; Ito et al., 2006), lúa mỳ (Saint Piere et al., 2012) đều cho kết quả cải thiện khả
năng chịu hạn một cách đáng kế ở các cây chuyển gen. HARDY là một thành viên khác
của họ TF DREB được biểu hiện trong mô sẹo. Sự biểu hiện quá mức của thành viên này
có ảnh hưởng đa tính trạng lên sự tăng trưởng của thực vật và hình thành rễ dày đặc và lá
xanh dày. HARDY cải thiện hiệu quả sử dụng nước thông qua cải thiện quang hợp và
giảm sự thoát hơi nước (Karaba et al., 2007).
Protein zinc finger (ZFP) là protein phổ biến nhất ở tế bào nhân thực, chức năng
của các protein này khá đa dạng, bao gồm bám DNA và RNA, hoạt hoá phiên mã, điều
hoà quá tình tự chết, điều hoà sự cuộn gấp và kết hợp protein. Nhiều protein ZFP được
chứng minh là có khả năng làm tăng khả năng chống chịu với điều kiện bất lợi. Các TF
này tham gia tự động vào phản ứng stress thông qua hoạt động như chất hoạt hoá hoặc ức
chế phiên mã (Sakamoto et al. 2000, 2004). Các thành viên của họ ZFP như: OsZFP252

(Xu et al. 2008) và ZAT10 (Xiao et al., 2009) tích cực tham gia vào việc điều hoà phản
ứng mất nước. DST là một chất điều hoà âm tính, cải thiện khả năng chịu hạn và mặn
thông qua việc giảm biểu hiện của gen (Huang et al., 2009). C2H2 ZFP, EAR và ZAT10
là thành viên của TF ZFP cải thiện khả năng chịu hạn ở lúa (Yang et al., 2010).
9


Ở Việt Nam, hướng nghiên cứu tập trung vào các yếu tồ điều khiển phiên mã liên
quan đến tính chịu hạn của thực vật cũng đang được các nhóm nghiên cứu quan tâm.
Nhóm nghiên cứu của Phạm Xuân Hội đã phân lập một số gen TF (OsNAC1,
OsNAC6, OsDREB1A, OsDREB2A, OsAREB1A và ZmDREB2A) từ các giống lúa, ngô
Việt Nam và chuyển gen vào cây mô hình lúa và Arabidopsis (Phạm Thu Hằng et al.,
2014; Nguyễn Duy Phương et al., 2014; Nguyễn Thị Phương Dung và Phạm Xuân Hội,
2010; Cao Lệ Quyên et al., 2012; Phạm Thu Hằng và Phạm Xuân Hội, 2012 ). Một nhóm
tác giả khác cũng đã chuyển thành công các gen TF OsRAP2.4A, OsNLI-IF1 và cây lúa
nhằm nghiên cứu đặc tính của các yếu tố phiên mã này để tăng cường mức độ chịu hạn và
mặn của cây trồng (Nguyen Duy Phuong and Pham Xuan Hoi 2015, Nguyen Duy Phuong
et al., 2014). Cao Lệ Quyên và đồng tác giả (2009) đã phân lập được gen MtOsDREB2A
từ thư viện cDNA xử lý hạn của giống lúa Mộc tuyền. Đây là nguồn gen điều khiển chịu
hạn từ chính nguồn thực vật của Việt Nam, là cơ sở cho các nghiên cứu tính chịu hạn trên
cây lúa. Nhóm nghiên cứu của Nguyễn Văn Đồng cũng đã áp dụng thành công các gen
yếu tố điều khiển phiên mã NF-YB2, MYB trong việc chọn tạo giống ngô và đậu tương có
khả năng chống chịu với điều kiện khô hạn (Nguyễn Văn Đồng và Nguyễn Hữu Kiên,
2013; Nguyễn Văn Đồng et al., 2013; Nguyễn Văn Đồng et al., 2015). Gen DREB1A
cũng được áp dụn g ở đậu tương (Trần Thị Cúc Hoà, 2009; Trần Thị Cúc Hoà et al.,
2015) để chọn tạo giống đậu tương có khả năng chống chịu hạn.
1.2.

Họ bZIP là yếu tố điều khiển phiên mã trong cảm ứng chống chịu hạn ở thực
vật

Basic leucine zipper (bZIP) là một trong những họ yếu tố điều khiển phiên mã lớn

nhất ở thực vật, chúng tham gia điều hòa nhiều chức năng tế bào, đặc biệt là quá trình
điều hòa trong đáp ứng stress và cảm ứng tín hiệu hormone (Kim, 2006). Tên của họ
bZIP được bắt nguồn từ việc protein này chứa một vùng cơ sở (basic region) và một
motif leucine zipper. Vùng cơ sở chứa 16 chuỗi bên amino acid được nhận biết bởi sự có
mặt của một motif bất biến N-x7-R/K-x9, trong khi đó Leu zipper bao gồm sự lặp lại 7
lần của amino acid Leu hay các amino acid kị nước khác như Ile, Val, Phe, hay Met nằm
chính xác ở vị
10


trí amino acid thứ 9 từ đầu C. Vùng cơ sở và vùng Leu zipper có chức năng riêng biệt.
Vùng cơ sở có nhiệm vụ là tín hiệu di chuyển vào nhân và bám đặc hiệu lên trình tự
DNA, vùng này vô cùng bảo thủ. Vùng Leu zipper là trình tự lưỡng cực ở dạng cuộn
xoắn, đặc trưng cho chức năng dimer hóa và kém bảo thủ hơn. Vùng trình tự Leu zipper
này thực hiện quá trình dimer hóa tương đồng (homo-) hoặc không tương đồng (hetero-)
của các protein bZIP. Các đơn phân bZIP ở dạng một chuỗi xoắn alpha dài, và khi bám
với DNA chứa trình tự lõi ACGT, thường là G-box (CACGTG), C-box (GACGTC) và
A-box (TACGTA), đầu N bám vào rãnh chính của sợi kép DNA, còn đầu C thì làm chức
năng dimer hóa để hình thành nên cấu trúc cuộn xoắn chồng gọi là Leu zipper (Nijhawan
et al.,
2008).
Họ gen bZIP đã được phân lập và mô tả ở Arabidopsis (có 75 gen), lúa (89), đậu
tương (131), ngô (125) (Wei et al. 2012). Ở Arabidopsis, 75 gen khác nhau đã được xác
định và phân vào 10 nhóm dựa vào vùng bảo thủ của nó (Jakoby et al., 2002). Trong khi
ở lúa, 89 gen bZIP cũng được chia thành 11 nhóm (Nijhawa et al., 2008). Phần lớn các
gen bZIP liên kết với ABRE thuộc nhóm A, các gen trong nhóm này được cảm ứng mạnh
mẽ bởi ABA và stress phi sinh học khác (Jakoby et al., 2002, Lu et al., 2009).
Ở Arabidopsis, 75 gen mã hóa cho yếu tố phiên mã bZIP đã được phân lập nhưng

còn khoảng 50 gen chưa được miêu tả trong các dữ liệu. Trong số 7 gen thuộc nhóm A,
nhóm tham gia quá trình chống chịu stress và đáp ứng ABA thì chỉ có 3 gen tham gia vào
sự chịu hạn của cây. Đó là ABRE-binding protein 1 và 2 (AREB1 và AREB2) và ABRE
binding factor 3 (ABF3) (Jakoby et al., 2002). Một số nghiên cứu cho thấy ABA và stress
phi sinh học cảm ứng sự biểu hiện của ABF/AREB và ABA gây sự phosphoryl hóa của
AREB1/2. Sự photphoryl hóa này là cần thiết cho AREB1/2 cảm ứng gen sau nó và có
thể xảy ra ở vị trí phosphoryl hóa bằng casein kinase II nằm ở các domain bảo thủ. ABA
và stress hạn do đó có thể cảm ứng cả sự phiên mã và điều hòa sau dịch mã của nhiều
gen bZIP thuộc nhóm A.
Ở lúa, có gần 100 gen thuộc họ bZIP, trong đó 33 gen tham gia phản ứng với hạn
11