Báo cáo tập huấn hóa sinh - miễn dịch

141007- Báo cáo tổng kết khóa học tập huấn kỹ thuật – Nhuận TT

BÁO CÁO TRƯỞNG BỘ MÔN HÓA SINH- MIỄN DỊCH
V/v Kết quả học tập lớp tập huấn từ 3/4/2014 đến 3/10/2014

Mục Lục
1. Thời gian, địa điểm 2
2. Người thực hiện, người hướng dẫn 2
3. Nội dung học tập

2

4. Kết quả học tập

2

5. Kết luận và kiến nghị

4

Phụ lục 1: Hướng dẫn sử dụng máy móc, thiết bị Phòng thí nghiệm 5
Phụ lục 2: Quy trình xử lý dụng cụ

12

Phụ lục 3: Cách pha các loại môi trường nuôi cấy tế bào

14

Phụ lục 4: Quy trình mở giống tế bào 21
Phụ lục 5: Quy trình cất giống tế bào 26

Phụ lục 6: Quy trình trypsin tế bào

33

Phụ lục 7: Quy trình nuôi cấy sơ phôi một lớp (Đối với 1 phôi)
Phụ lục 8: Quy trình xử lý mẫu bệnh phẩm

40

47

Phụ lục 9: Quy trình phân lập virus Lở mồm long móng trên tế bào 49
Phụ lục 10: Quy trình phân lập virus Cúm lợn trên tế bào
Phụ lục 11: Quy trình phân lập Virus trên trứng

54

62

Phụ Lục 12: Quy trình nhân Virus Cúm trên tế bào MDCK chai Rouxs
Phụ lục 13: Quy trình nhân virus Lở mồm long móng trên tế bào

79

Phụ lục 14: Quy trình chuẩn độ virus Cúm trên đĩa tế bào 96 giếng 88

1

69

141007- Báo cáo tổng kết khóa học tập huấn kỹ thuật – Nhuận TT

1. Thời gian, địa điểm
Thời gian: 03/04/2014 đến 03/10/2014
Địa điểm: Phòng thí nghiệm bộ môn Hóa Sinh- Miễn dịch, Viện Thú y.
2. Người thực hiện, người hướng dẫn
Người thực hiện: BSTY. Trần Thị Nhuận
Người hướng dẫn: PGS.TS. Nguyễn Viết Không
BSTY. Phạm Thị Nga
3. Nội dung học tập
- Kỹ thuật nuôi cấy tế bào.
- Phân lập virus trên môi trường nuôi cấy tế bào.
- Nhân giống virus trên môi trường nuôi cấy tế bào.
- Xử lý mẫu bệnh phẩm.
- Phân lập virus trên trứng.
4. Kết quả học tập
4.1. Những việc đã làm được
a. Kỹ thuật nuôi cấy tế bào:
Cách sử dụng máy móc phòng thí nghiệm (Theo phụ lục 1)
Nắm vững và thành thạo được quy trình nuôi cấy tế bào:
+Quy trình xử lý dụng cụ dùng trong nuôi cấy tế bào (Theo phụ lục 2)
+ Tự chuẩn bị được môi trường nuôi cấy tế bào: MEM1x, PBS- (Theo
phụ lục3)
+ Quy trình mở giống tế bào (Theo phụ lục 4)
+Quy trình trypsin tế bào (Theo phụ lục 5)
+ Quy trình cất giống tế bào (Theo phụ lục 6)
Thực hành nuôi cấy tế bào dòng: BHK21 ra chai T25, T75, chai Rouxs.
Thực hành nuôi cấy tế bào sơ phôi trên chai T25. (Theo phụ lục 7)
Kiến tập quy trình nuôi cấy tế bào dòng: MDCK, MARC-145

b. Xử lý mẫu bệnh phẩm(Theo phụ lục 8)
2


141007- Báo cáo tổng kết khóa học tập huấn kỹ thuật – Nhuận TT

Quy trình xử lý mẫu bệnh phẩm nghi bệnh Lở mồm long móng Quy trình
xử lý mẫu bệnh phẩm Giám sát Cúm gia cầm
Quy trình xử lý mẫu bệnh phẩm Cúm lợn
c. Phân lập Virus trên môi trường nuôi cấy tế bào
Thực hành phân lập Virus Lở mồm long móng trên tế bào BHK21 chai
T25 từ mẫu bệnh phẩm thực địa. (Theo phụ lục 9)
Kiến tập phân lập virus Cúm lợn trên tế bào MDCK điã 24 giếng từ mẫu
swab ở lò mổ Vạn Phúc. (Theo phụ lục 10)
d. Phân lập Virus trên trứng (Theo phụ lục 11 )
Chuẩn bị trứng, ấp trứng, soi trứng, đánh dấu buồng hơi, vị trí tiêm.
Xử lý mẫu Swab. Tiêm trứng. Theo dõi trứng
Thu hoạch nước trứng. Check HA
e. Nhân giống Virus trên môi trường nuôi cấy tế bào
Kiến tập nhân virus Cúm trên Tế bào MDCK chai Rouxs.(Theo phụ lục 12)
Kiến tập nhân virus Lở mồm long móng trên Tế bào BHK21 chai Rouxs. (Theo
phụ lục 13).
Kiến tập chuẩn độ Virus Cúm trên đĩa 96 giếng tế bào MDCK. (Theo phụ lục
14).
f. Một số việc khác
Tham gia lấy mẫu thực địa tại Lò mổ Vạn Phúc xã Vạn Phúc huyện
Thanh Trì, thành phố Hà Nội.
4.2. Những việc chưa làm được
Phản ứng trung hòa trên tế bào chưa được thực hành.

3


141007- Báo cáo tổng kết khóa học tập huấn kỹ thuật – Nhuận TT

5. Kết luận và kiến nghị
Sau sáu tháng theo học, tôi nhận thấy bản thân học được rất nhiều điều: từ
văn hóa giao tiếp nơi công sở, đến các kỹ thuật cơ bản phòng thí nghiệm, cách
bố trí, sắp xếp công việc, sử dụng thời gian vào công việc một cách hiệu quả
nhất.
Nhân đây, cho phép tôi gửi lời cảm ơn tới Thầy PGS.TS Nguyễn Viết
Không – người Thầy đã tận tình quan tâm, giúp đỡ, định hướng và tạo mọi điều
kiện cho nhóm chúng tôi được trau dồi kiến thức và được thực hành các kỹ thuật
cơ bản phòng thí nghiệm. Cũng cho phép tôi gửi lời cảm ơn tới chị Phạm Thị
Nga – người đã trực tiếp truyền dạy cho tôi các kỹ thuật cơ bản trong đợt tập
huấn kỹ thuật và cũng xin gửi lời cảm ơn tới các anh, các chị trong bộ môn Hóa
sinh – Miễn dịch đã tạo mọi điều kiện và tận tình chỉ bảo, giúp đỡ tôi trong thời
gian theo học tại bộ môn.

Hà Nội, ngày 7 tháng 10 năm 2014
Người thực hiện

Trần Thị Nhuận

4


141007- Báo cáo tổng kết khóa học tập huấn kỹ thuật – Nhuận TT

Phụ lục 1: Hướng dẫn sử dụng máy móc, thiết bị Phòng thí nghiệm

Nguyên tắc: Trước khi sử dụng quan sát tình trạng hoạt động của máy, sau khi
sử dụng máy móc ghi vào sổ theo dõi.
1.Máy hấp:
Có 2 loại máy hấp:
Máy hấp sạch chuyên hấp dụng cụ đã xử lý.
Máy hấp bẩn chuyên hấp dụng cụ, trang phục bảo hộ chưa qua xử lý.
Cấu tạo máy hấp:
Đồng hồ chỉ thị áp suất
Van áp suất
Các nút điều chỉnh nhiệt độ, thời gian
Bình xả nước, van xả nước
Cách vệ sinh máy hấp: Sau khi hấp dụng cụ bẩn phải tiên hành rửa máy hấp.
Kiểm tra van xả áp suất. Đảm bảo áp suất về 0
Tắt công tắc điện
Lấy dụng cụ bẩn vừa được hấp
Xả hết nước trong máy
Hòa nước xà phòng: dung chổi rửa rửa sạch bên trong máy. Xả nước sạch
cho đến khi hết xà phòng.
Vệ sinh bên ngoài máy hấp
Thay nước trong bình xả nằm trong giới hạn cho phép.
Thao tác sử dụng máy hấp:
Kiểm tra mực nước trong bình xả nước, giữ ở mực nước cho phép.
5


141007- Báo cáo tổng kết khóa học tập huấn kỹ thuật – Nhuận TT

Lắp khay, giá sắt vào trong nồi hấp, đảm bảo lượng nước ngập khay 1-2
cm
Cho giỏ đựng đồ hấp: các dụng cụ hấp nên xếp tạo độ thông thoáng, dụng

cụ bao gói xếp trước, dụng cụ thủy tinh xếp lên trên.
Đóng cửa nồi hấp, khóa chặt van áp suất.
Bật công tắc. cài đặt máy bằng các nút điều chỉnh nhiệt độ và thời gian
( 1210C/30-45 phút)
Ấn nút SET/ START. Máy hấp hiển thị ở chế độ Sterile.
Muốn xem nhiệt độ hiện tại của máy hấp ấn nút CHECK HEAT.
Khi lấy đồ hấp ra khỏi máy hấp phải xả van xả áp đảm bảo áp suất về 0
mới được mở máy hấp.
2. Tủ sấy
Cách sử dụng tủ sấy:
Bước 1: Trước khi mở tủ sấy phải tắt tủ sấy: ấn nút tắt công tắc máy.
Bước 2: Cho dụng cụ cần sấy vào trong tủ sấy, tùy từng dụng cụ mà sấy ở nhiệt
độ khác nhau, hầu hết các dụng cụ được hấp ở 90-1000C/2-3 giờ.
Bước 3: Đóng tủ sấy, bật công tắc máy và cài đặt thời gian và nhiệt độ
Cách cài đẳt thời gian:
Giữ 2 nút RAM + TIME, đèn SET hiện màu đỏ, trên đồng hồ hiển thị
thời gian.
Giữ RAM sau đó TIME để chỉnh giảm thời gian.
Giữ RAM sau đó TEMP để tăng thời gian.
Sau đó ấn RAM, thời gian đã được cài đặt
Cách cài đặt nhiệt độ:
6


141007- Báo cáo tổng kết khóa học tập huấn kỹ thuật – Nhuận TT

Giữ 2 nút RAM + TEMP, đèn SET hiện màu đỏ, trên đồng hồ hiển thị
nhiệt độ.
Giữ RAM sau đó TIME để chỉnh giảm nhiệt độ.
Giữ RAM sau đó TEMP để tăng nhiệt độ.

Sau đó ấn RAM, nhiệt độ đã được cài đặt
Bước 4: tủ sấy đã hoạt động, đèn ở chế độ heater.
Chú ý:
Khi mở tủ sấy phải tắt công tắc để đảm bảo an toàn cho người sử dụng
cung như tránh hỏng tủ sấy.
Trước khi cho đồ vào sấy phải kiểm tra nhiệt độ và thời gian, để quá trình
hấp được đảm bảo và an toàn cho dụng cụ khi sấy khô.
3. Cân chân không
Cách sử dụng:
Bước 1: Cắm nguồn điện.
Bước 2: Cân hóa chất:
Mở cửa cân, đưa máng vào để đựng vật cần cân. Sau đó đóng cửa, ấn
TARE, để đồng hồ chỉ thị 0.000 g. Cân đủ lượng cần lấy, thao tác cẩn thận, cân
chính xác số lượng cần dùng.
Bước 3: Tắt cân
Ấn nút OFF để tắt máy.
Bước 4: Vệ sinh cân:
Sau khi cân nguyên liệu xong cần vệ sinh cân sạch sẽ. Lau bề mặt cân.
Bước 5: Rút nguồn điện. Để cân về trạng thái nghỉ.
7


141007- Báo cáo tổng kết khóa học tập huấn kỹ thuật – Nhuận TT

4. Kính hiển vi soi ngược
Cấu tạo:
Thị kính có độ phóng đại khác nhau
Vật kính
Ốc vĩ cấp
Ốc vi cấp

Ốc điều chỉnh ánh sáng
Cách sử dụng:
Bước 1: Cắm nguồn điện
Sử dụng nguồn điện 110V, cắm vào nguồn điện 110V, không cắm trực tiếp
vào nguồn điện 220V sẽ gây hỏng máy, qua bộ đổi điện.
Bước 2: Khởi động máy
Bật công tắc đưa máy về chế độ hoạt động.
Xoay ốc điều chỉnh độ sáng của đèn lên tối đa. Điều chỉnh độ sang của
đèn thông qua núm điều chỉnh nguồn sáng.
Bước 3: Soi kính
Đặt chai nuôi tế bào hoặc buồng đếm tế bào lên khu vực soi.
Điều chỉnh ốc vĩ cấp lấy hình ảnh. Sau đó điều chỉnh ốc vi cấp để chỉnh
ảnh rõ nét
Bước 4:Cho kính nghỉ
Vặn núm điều chỉnh ánh sáng về 0. Tắt đèn
Tắt công tắc nguồn
Cho vật kính về chế độ nghỉrút điện vệ sinh Kính hiển vi.
8


141007- Báo cáo tổng kết khóa học tập huấn kỹ thuật – Nhuận TT

5. Máy Ly tâm
Cấu tạo:
Có 2 Roto
Roto 15ml với tốc độ ly tâm 3500 vòng/ phút.
Roto 50ml với tốc độ ly tâm vòng/phút
Các nút điều chỉnh:
Nút công tắc máy: ON, OFF
Nút chế độ: HIGHT, LOW

Đồng hồ chỉ thị tốc độ và thời gian.
Nút điều chỉnh tốc độ
Nút điều chỉnh thời gian.
Cách sử dụng: Máy ly tâm hoạt động dựa trên nguyên lý cân bằng.
Bước 1: Cắm điện nguồn điện 220V.
Bước 2: Xếp mẫu vào các ROTO
Khi xếp mẫu phải đảm bảo các mẫu cần ly tâm ở dạng đối xứng và cân
bằng. Dùng cân tiểu ly khi cần thiết.
Bước 3: Khởi động máy
Đóng nắp máy ly tâm.
Ấn MAIN cho máy hoạt động.
Cài đặt vòng quay và thời gian: Nếu ly tâm <2.500 vòng ấn nút LOW. nếu
ly tâm > 2.500 vòng ấn HIGHT.
Điều chỉnh số vòng quay vặn nút speed, quan sát trên đồng hồ chỉ thị số
vòng trong khoảng cần ly tâm.
9


141007- Báo cáo tổng kết khóa học tập huấn kỹ thuật – Nhuận TT

Điều chỉnh thời gian: vặn nút TIME chỉ thị trên máy, chỉnh thời gian cần
ly tâm.
Bước 4: Đưa máy về trạng thái nghỉ,
Ấn tắt MAIN, rút ổ điện.
6. Cabinet
Trước khi sử dụng cabinet: ở trạng thái không hoạt động, chìa khóa
cabinet ở vị trí số 0, cánh cửa tủ ở vị trí đóng.
Vô trùng cabinet 15 phút trước khi sử dụng:
Vặn chìa khóa tủ ở số 2, ấn nút UV lamp
Đèn tử ngoại sáng, đồng thời xuất hiện tiếng kêu.

Để tắt tiếng kêu, ta ấn nút Stop. Vô trùng tủ trong 15 phút.
Sau 15 phút tắt đèn tử ngoại bằng cách ấn nút UV lamp và chìa khóa
cabinet ở vị trí số 0.
Cách sử dụng cabinet:
Mở cánh cửa tủ cabinet
Vặn chìa khóa tủ về vị trí số 1, núm quạt gió sẽ tự động hoạt động (không
cần ấn nút FAN). Khi quạt gió hoạt động ấn nút biểu tượng đèn (bên cạnh núm
FAN). Tủ cấy có 2 màng lọc khí: khí qua màng lọc thì đèn sẽ bật xanh. Chỉ được
làm việc khi cả 2 đèn đều xanh.
Quá trình thao tác trong cabinet phải nhẹ nhàng, tránh đưa luồng không
khí từ ngoài vào sẽ gây tạp nhiễm.
Vệ sinh cabinet sau khi sử dụng:
Thu dọn sạch sẽ, không được để lại bất cứ dụng cụ thí nghiệm trong
cabinet. Tắt quạt gió và AS, vặn chìa khóa cabinet về vị trí 0.
10


141007- Báo cáo tổng kết khóa học tập huấn kỹ thuật – Nhuận TT

Đậy cánh cửa cabinet lại, vô trùng cabinet 15 phút (giống như các bước ở
trên).
Tắt cabinet hoàn toàn ( chìa khóa ở vị trí 0)
Chú ý khi sử dụng cabinet:
Trong quá trình sử dụng cabinet, có thể xuất hiện tiếng kêu, để tắt tiếng
kêu ấn nút Stop.
Không để quá nhiều dụng cụ trong tủ lúc làm việc và sau làm việc.

11

141007- Báo cáo tổng kết khóa học tập huấn kỹ thuật – Nhuận TT

Phụ lục 2: Quy trình xử lý dụng cụ
1. Phân loại
Dụng cụ chia làm 2 loại
Dụng cụ thuỷ tinh: Chai Schoot, Cốc đong thuỷ tinh, Bình nuôi cấy tế
bào, Pipet thuỷ tinh, Đĩa lồng petri.
Dụng cụ tái sử dụng nhựa: Ống fancol 15ml, 50ml, Eppendorf, Đầu type
200µl, 5ml, ống Swab.
2 . Xử lý dụng cụ:
Dung dịch NaOH 4% : 240 g pha vào một xô có khoảng 6 lít nước
thường, ghi nhãn NaOH 4% ngày pha, đậy nắp xô.
Dung dịch HCL 2% : Đổ 14 ml HCL vào xô có chứa 7 lít nước thường
khuấy đều (không được đổ ngược lại axít bắn gây nguy hiểm).
2.1. Xử lý dụng cụ thủy tinh và dụng cụ nhựa
Bước 1:
Ngâm các dụng cụ trên vào dung dịch NaOH 4% trong 24 giờ .
Vớt ra rửa nước thường 3- 5 lần .
Bước 2:
Chuyển sang ngâm trong dung dịch HCl 2% trong 24 giờ .
Vớt ra rửa nước thường 3- 5 lần.
Dùng chổi rửa chuyên dụng và vải gạc rửa sạch các dụng cụ.
Tráng nước thường nhiều lần (3- 5 lần, riêng chai schoot phải tráng 15 –
20 lần bằng nước thường).
Bước 3:
Tráng nước cất 1X tất cả các dụng cụ trên rồi xếp vào giá phải úp ngược
các dụng cụ xuống cho khô và tránh buị rơi vào.
12

141007- Báo cáo tổng kết khóa học tập huấn kỹ thuật – Nhuận TT

Chuyển tất cả các dụng cụ trên vào tủ sấy: Sấy ở 900C -1000C.
2.2. Xử lý quần áo, mũ
- Quần áo: đem giặt bằng xà phòng thật sạch, phơi khô
- Bao gói quần áo riêng bằng giấy, dán băng dính
- Bao gói mũ bằng túi giấy dập gim,dán băng dính
- Dán chỉ thị sterlize tất cả các dụng cụ đã bao gói trên, dùng bút dạ ghi
tên dụng cụ, ngày hấp, người dùng, phòng dùng.
- Hấp 1210C/30 phút.
- Sấy 700C/3-4 giờ.

13


141007- Báo cáo tổng kết khóa học tập huấn kỹ thuật – Nhuận TT

Phụ lục 3: Cách pha các loại môi trường nuôi cấy tế bào
1. Quy trình chuẩn bị nước cất 2x
1.1. Mục đích: là dung môi để pha các môi trường PBS-, MEM 1x
1.2. Nguyên vật liệu
a. Nước cất 2x
b. Vật liệu hấp vô trùng:

STT Vật liệu

Số lượng

1

Hệ thống lọc Satorius
01
( 1 bình lọc, 1 hệ thống dây gắn lọc)

2

Màng lọc Cenlulose 0,22 µm

01

3

Cốc định mức 1 lít

01

4

Chai Schott 1 lít

01

c. Máy móc: Máy hút chân không
1.3. Thao tác
Bước 1: Thấm ướt màng lọc
Màng lọc cenlulose 0,22 µm bằng cách ngâm ngập màng lọc trong máng
nước cất 2x. Lắp màng lọc vào hệ thống lọc Satorius sao cho cân đối.
Bước 2: Nối hệ thống lọc với máy hút chân không
Dùng dây gắn hệ thống lọc với đầu vào INLET của máy hút chân không.
Dùng máy hút chân không hút hết không khí trong bình, khi đó tạo ra sự chênh

lệch áp suất  nước sẽ đi từ nơi có áp suất cao đến nơi có áp suất thấp.
Bước 3: Lọc nước
Cắm điện máy hút chân không, đổ nước cất 2x vào hệ thống lọc chân
không.
Nước cất sau khi được lọc vào các chai Scott 1 lít, không hấp nước cất
quá nhiều, khi hấp không vặn nút chai quá chặt sẽ gây nổ.
Bước 4: Bảo quản
14


141007- Báo cáo tổng kết khóa học tập huấn kỹ thuật – Nhuận TT

Sau khi hấp, nước cất 2x được bảo quản ở nhiệt độ phòng.
2. Quy trình chuẩn bị PBS2.1. Mục đích: Là môi trường để rửa tế bào chết trong nuôi cấy tế bào.
2.2. Nguyên vật liệu pha PBS- 1 lít
a. Nước cất 2x đã lọc và hấp vô trùng 1 lít
b. Hóa chất: Hộp PBS bột 9,55 gam/1lit
c. Vật liệu hấp vô trùng:

STT Vật liệu

Số lượng

1

Giấy lau

01

2

Máng cân

01

3

Đầu type 200µl

01

4

Thìa cân

01

5

Chai Schott 1 lít

01

6

Chai Schott 250ml

04

7

Cốc định mức 1 lít

01

d. Máy móc:

STT Vật liệu

Số lượng

1

Cân chân không

01

2

Giấy đo pH

01

3

Pipet 10-100 µl

01

2.3. Thao tác

Bước 1: Chuẩn bị nước cất
Lấy 1 lượng nước cất 2x vô trùng 200- 300ml
Bước 2: Cân PBS
15


141007- Báo cáo tổng kết khóa học tập huấn kỹ thuật – Nhuận TT

Dùng máng cân 9,55 gam bột PBS
Bước 3: Pha PBS
Cho PBS vừa cân vào chai nước cất 2x, tráng máng vừa cân PBS, lắc đều
cho bột tan hết ( lắc trên máy khuấy từ nếu pha với 1 lượng lớn)
Chuyển lượng môi trường vừa pha sang cốc định mức 1 lít, cho thêm
lượng nước cất đủ thể tích cần pha
Chuyển toàn bộ 1 lít môi trường từ cốc định mức sang chai Schott 1 lít,
lắc đều cho tan hết.
Bước 4: Kiểm tra pH
Có thể sử dụng máy đo pH hoặc giấy đo pH.
Dùng pipet hút 1 ít dung dịch nhỏ lên giấy rồi đo pH. Dùng NaOH 1N
hoặc HCl 1N để điều chỉnh pH của môi trường (pH = 7,2 – 7,4).
Bước 5: Bảo quản
Chia môi trường ra các chai Schott nhỏ vô trùng. Đem hấp 1210C/15 phút.
Để nguội. Bảo quản 40C đến khi sử dụng.
3. Quy trình chuẩn bị môi trường MEM1x
3.1. Mục đích: Là môi trường để tế bào sinh trưởng và phát triển.
3.2. Nguyên vật liệu pha MEM 1x 1 lít
a. Nước cất 2x đã lọc và hấp vô trùng 1 lít
b. Hóa chất:
NaHCO3………..2,2g
MEM bột…….....9,53g

Gentamycin…….50µg
HCl 1N ……….6ml
16


141007- Báo cáo tổng kết khóa học tập huấn kỹ thuật – Nhuận TT
c. Vật liệu hấp vô trùng:

STT Vật liệu

Số lượng

1

Giấy lau

01

2

Máng cân

01

3

Cục khuấy từ

01

4

Thìa cân

01

5

Chai Schott 1 lít

01

6

Cốc định mức 1 lít

01

d. Máy móc:

STT Vật liệu

Số lượng

1

Cân chân không

01

2

Giấy đo pH

01

3

Pipet 10-100 µl

01

4

Hệ thống lọc Sartorious

01

3.3. Thao tác
Bước 1: Lấy 1 lượng nước cất 2x vô trùng 200- 300ml
Bước 2: Cân hoá chất
Dùng máng để cân hóa chất, trước khi cân nên lau sạch máng.
Cân MEM bột 9,53g cho vào bình đã có sẵn ít nước. Không được lắc
ngay sẽ đông vón.
Tráng máng  lắc đều với cục khuấy từ
Dùng máng khác cân NaHCO3: 2,2 gam cho tiếp vào bình, tráng máng
lắc đều.
Bước 3: Bổ sung lượng nước sao cho đủ thể tích 1 lít.
Tiếp tục cho lên máy khuấy từ, lắc đều, cho đến khi tan hoàn toàn
17

141007- Báo cáo tổng kết khóa học tập huấn kỹ thuật – Nhuận TT

Bước 4: Lọc
Lọc qua màng lọc 0,22µm bằng hệ thống lọc chân không đã được hấp vô
trùng
Bước 5: Bổ sung Gentamycin
Dùng pipet hút 50µg/ 1ml cho vào dung dịch
Bước 6: Điều chỉnh pH
Dùng 6ml HCl 1N để điều chỉnh pH về 7,2- 7,5.
Bước 7: Bảo quản
Dung dịch sau khi pha được bảo quản ở 40C.
4. Huyết thanh bào thai bò (FBS)
Huyết thanh được bảo quản ở -200C
Đông tan huyết thanh
Xử lý nhiệt huyết thanh 370C trong 30 phút.
Chia 20ml/ ống ly tâm 50ml
Bảo quản ở -200C cho đến khi sử dụng.

5. Trypsin- EDTA
Trypsin bảo quản ở -200C
Đông tan trypsin
Chia 10ml/ ống ly tâm 15ml
Bảo quản ở -200C cho đến khi sử dụng

6. Pha Hepes 1M
18

141007- Báo cáo tổng kết khóa học tập huấn kỹ thuật – Nhuận TT

6.1. Mục đích
Là Hệ đệm, giúp ổn định pH môi trường nuôi cấy tế bào.
6.2. Nguyên vật liệu
a. Nước cất 2x đã lọc và hấp vô trùng 100ml
b. Môi trường, hóa chất
NaOH

Hepes M=238,3g

c. . Vật liệu hấp vô trùng:
STT Vật liệu

Số lượng

1

Giấy lau

01

2

Máng cân

01

3

Chai Schott 200ml

02

d. Máy móc:

STT Vật liệu

Số lượng

1

Cân chân không

01

2

Giấy đo pH

01

3

Pipet 10-100 µl

01

3.3. Thao tác
Bước 1: Pha NaOH 5N

Cân NaOH 5g hòa tan trong 1 ít nước cất 2x vô trùng. Sau đó cho đủ nước
cất 2x sao cho đủ 25ml.
Bước 2:Pha Hepes 1M
Cân 23,8 g Hepes bột cho vào 40ml nước cất 2x đã lọc, hấp vô trùng. Lắc
cho tan hết. Dùng NaOH 5N để điều chỉnh đưa pH dung dịch Hepes về khoảng
7,3-7,5 (Khoảng 5ml NaOH 5N cho 100ml Hepes). Sau đó, bổ sung nước cất 2x
đã lọc, hấp vô trùng sao cho đủ l00ml dung dịch.. Sau đó tiến hành lọc qua màng
lọc 0,45µm hoặc có thể đem hấp 1100C trong 20 phút.
Bước 3: Bảo quản
19


141007- Báo cáo tổng kết khóa học tập huấn kỹ thuật – Nhuận TT

Hepes được bảo quản ở 40C.
7. Môi trường bảo quản mẫu swab để phân lập virus- Môi trường VTM
(Virus transport medium).
a. Nguyên liệu: 2 lít VTM

Hóa chất
Medium 199
Polymycin B
Nystatin
Penicillin G
Gentamycin

Khối lượng
2 lọ (1 lọ/1 lít)
5 lọ (Lọ 100g)
X lọ (lọ 870 mg)

25g
1 lọ 100ml

b. Cách pha
Pha 2 lọ Medium 199 trong 160ml nước cất 2x đã lọc, hấp vô trùng. Đem
lọc qua màng lọc 0,22 µm.
Pha riêng mỗi loại kháng sinh trong các chai khác nhau theo đúng số
lượng. Đem lọc từng loại kháng sinh. Sau đó bổ sung kháng sinh đã được lọc
cho vào chai môi trường Medium 199 vừa pha. Bổ sung lượng nước sao cho đủ
2 lít.
Chia nhỏ môi trường ra các ống Fancol 50ml. Bảo quản ở (-300C)

20


141007- Báo cáo tổng kết khóa học tập huấn kỹ thuật – Nhuận TT

Phụ lục 4: Quy trình mở giống tế bào
1.Nguyên vật liệu
a. Tế bào đã được cất giống trước đó.
b. Môi trường, hóa chất, sinh phẩm:
MEM1x:
Thành phần:
NaHCO3………………...2,2g
MEM bột……..................9,53g
Gentamycin……………..50µg
HCl 1N…………………6ml
Nước cất vô trùng vừa đủ 1 lít.
MEM 10%
Thành phần:

MEM1x……………….100ml
FBS…………………….10ml
PBS:
Thành phần:
PBS bột …………………..9,55 gam
Nước cất vô trùng vừa đủ …….1 lít
c. Dụng cụ an toàn sinh học
Mũ, quần áo, khẩu trang, găng tay
Chai xịt cồn 700 .

21


141007- Báo cáo tổng kết khóa học tập huấn kỹ thuật – Nhuận TT

d.Dụng cụ hấp, sấy:

STT

Vật liệu

Số lượng

1

Cốc đựng thủy tinh

01

2

Ống ly tâm 15

01

3

Chai nuôi tế bào T25

01

4

Khay đựng dụng cụ

01

e.Máy móc, thiết bị

STT Vật liệu

Số lượng

1

Pipet 5ml

01

2

Cabinet

01

3

Máy ly tâm

01

4

Tủ ấm CO2

01

5

Tủ lạnh 40C

01

6

Tủ lạnh -200C

01

2.Các bước thực hiện:

Bước 1: Chuẩn bị Cabinet và đưa môi trường về nhiệt độ phòng
Chuẩn bị Cabinet: Vô trùng Cabinet trong 15 phút
Chuyển môi trường về nhiệt độ phòng:
Mục đích: không làm ảnh hưởng tế bào vì nếu để nhiệt độ quá thấp sẽ gây
chết tế bào.
Chuyển môi trường MEM10% đang bảo quản trong tủ lạnh 4 0C đưa ra
ngoài để tan đông.
22


141007- Báo cáo tổng kết khóa học tập huấn kỹ thuật – Nhuận TT

Bước 2: Giải đông tế bào cất giống
Mục đích: đưa tế bào về trạng thái hoạt động
Cách tiến hành:
Chuẩn bị ống môi trường 5ml MEM10% để cân bằng môi trường tế bào.
Cho ống giống vào bọt xốp, thả vào cốc nước ấm 370C
Thấy môi trường chuyển màu đậm hơn
Khi môi trường đồng nhất, chuyển ống môi trường vào Cabinet
Bước 3: Cân bằng môi trường
Mục đích: Cân bằng môi trường nuôi cấy tế bào.
Cách tiến hành:
Dùng pipet chuyển nhẹ nhàng giống vào ống môi trường 5ml
MEM10%FBS đã chuẩn bị
Tráng lại ống giống để lấy hết tế bào.
Chú ý:
Khi sử dụng pipet để lấy môi trường hoặc lấy huyễn dịch tế bào, tránh
làm pipet chạm vào thành chai, thành ống sẽ gây tạp nhiễm tế bào.
Bước 4: Ly tâm và đánh tan cặn tế bào
Mục đích: lấy cặn tế bào

Cách tiến hành:
Cho ống fancol chứa huyễn dịch đem ly tâm 700v/phút trong 10 phút.
Ly tâm xong, dùng pipet hút hết dung dịch ở phía trên, giữ lại cặn tế bào.
Đánh tan cặn tế bào bằng cách: Rà mạnh đáy ống vào Cabinet hoặc dùng
pipet đảo đều.
23


141007- Báo cáo tổng kết khóa học tập huấn kỹ thuật – Nhuận TT

Chú ý:
Trước khi ly tâm, các ống ly tâm phải được đóng chặt nút và bao dán bằng
paraffin.
Khi hút bỏ môi trường, tránh để đầu type chạm vào cặn tế bào.
Bước 5: Hòa tan trong môi trường nuôi cấy tế bào
Mục đích: Hòa tan huyễn dịch tế bào trong môi trường nuôi cấy
Cách tiến hành:
Cho 6ml môi trường MEM10% vào ống ly tâm có chứa cặn tế bào.
Dùng pipet đảo đều.
Bước 6: Cấy tế bào vào chai nuôi
Mục đích: cung cấp chất dinh dưỡng cho tế bào phát triển
Cách tiến hành:
Ghi thông tin lên chai nuôi về ngày mở giống, dòng tế bào, đời tế bào,
người thực hiện.
Dùng pipet chuyển hết lượng huyễn dịch tế bào vừa được đánh tan cặn có
bổ sung 6ml MEM 10% vào chai nuôi T25.
Lắc nhẹ nhàng chai nuôi
Bước 7: Vệ sinh cabinet sau khi sử dụng
Chuyển các dụng cụ vừa thao tác ra khỏi cabinet
Dùng giấy lau xịt cồn lau sạch Cabinet

Đóng cửa Cabinet, bật UV trong 30 phút
Bước 8: Theo dõi sự phát triển của tế bào

24


141007- Báo cáo tổng kết khóa học tập huấn kỹ thuật – Nhuận TT

Nuôi tế bào 370C, 5%CO2. Hàng ngày theo dõi tế bào trên kính hiển vi
soi ngược.

25