140428 bao cao tong ket thang 4 nhuan TT

140428 -bao cao tong ket thang – nhuan TT
BÁO CÁO TRƯỞNG BỘ MÔN HÓA SINH- MIỄN DỊCH
V/v Kết quả học tập nuôi cấy tế bào từ 3/4/2014 đến 26/4/2014

MỤC LỤC
Trang
Phụ Lục 1: Hướng dẫn sử dụng máy móc, thiết bị.....................................................................................4
1.Máy hấp:...................................................................................................................................................4
2. Tủ sấy.......................................................................................................................................................5
3. Cân chân không.......................................................................................................................................5
4. Kính hiển vi soi ngược.............................................................................................................................6
5. Máy Ly tâm..............................................................................................................................................7
6. Cabinet.....................................................................................................................................................7
Phụ Lục 2: Cách pha các loại môi trường nuôi cấy tế bào.........................................................................8
3. Quy trình chuẩn bị môi trường MEM1x...............................................................................................10
4. Huyết thanh bào thai bò (FBS)..............................................................................................................11
Phụ lục 3: Quy trình mở giống tế bào.......................................................................................................12
1.Nguyên vật liệu.......................................................................................................................................12
2.Các bước thực hiện:...............................................................................................................................13
Phụ lục 4: Quy trình cất giống tế bào.......................................................................................................15
1. Nguyên vật liệu......................................................................................................................................15
2.Các bước thực hiện:...............................................................................................................................16
Phụ Lục 5: Quy trình tế bào Trypsin..........................................................................................................19
1. Nguyên vật liệu......................................................................................................................................19
2.Các bước thực hiện:...............................................................................................................................21
Phụ lục 6: Quy trình nuôi cấy sơ phôi một lớp (Đối với 1 phôi)...............................................................23
1.NGUYÊN VẬT LIỆU...................................................................................................................................23
2.Các bước thực hiện:...............................................................................................................................25

1. Mục đích
Nắm được quy tắc phòng thí nghiệm

Biết cách chuẩn bị dụng cụ
Biết sử dụng máy móc, thiết bị phòng thí nghiệm
Kiến tập ELISA cúm lợn, cất giống tế bào, trypsin tế bào, mở giống tế bào.
Biết cách nuôi cấy tế bào xơ phôi gà 1 lớp

1


140428 -bao cao tong ket thang – nhuan TT
Biết cách xử lý mẫu Swab, mẫu huyết thanh
2. Thời gian, địa điểm:
Thời gian: 03/04/2014- 26/4/2014
Địa điểm : Phòng thí nghiệm- bộ môn Hóa Sinh- Miễn dịch
3. Người thực hiện
Người thực hiện: BSTY. Trần Thị Nhuận
Người hướng dẫn: BSTY. Phạm Thi Nga
4. Nội dung học tập
Kiến tập Quy trình cất giống tế bào 1 lần (tế bào MDCK), quy trình mở giống
tế bào 2 lần ( Tế bào Vero,tế bào BHK-21), trypsin tế bào (tế bào MDCK, Tế bào
Vero)
Kiến tập quy trình nuôi cấy tế bào xơ phôi gà 1 lớp 1 lần
Thực hành nuôi cấy tế bào xơ phôi gà 1 lớp 2 lần
Thực hành xử lý mẫu Swab, mẫu huyết thanh lấy từ các địa phương: Thạch
Thất, Chương Mỹ, Thường Tín, Đông Anh.
Kiến tập làm phản ứng ELISA cúm lợn theo KIT.

5. Kết quả học tập
Nắm được các quy trình:
Cách sử dụng máy móc, thiết bị phòng thí nghiệm (Theo phụ lục 1)
Cách pha môi trường nuôi cấy (Theo phụ lục 2)

Quy trình mở giống tế bào (Theo phụ lục 3)
Quy trình cất giống tế bào (Theo phụ lục 4)
Quy trình trypsin tế bào (Theo phụ lục 5)
Quy trình nuôi cấy xơ phôi gà môt lớp (Theo phụ lục 6)
Những việc đã làm được:
Nắm được các nguyên tắc an toàn sinh học trong phòng thí nghiệm
Sử dụng thành thạo các loại máy móc, thiết bị: Cabinet, nồi hấp,tủ sấy, máy ly
tâm, máy khuấy từ, kính hiển vi soi ngược, máy ly tâm lạnh, máy Vortex, cân chân
không, máy hút chân không.

2


140428 -bao cao tong ket thang – nhuan TT
Biết cách sử dụng pipet 1 kênh
Tự pha được môi trường PBS-, lọc nước cất 2x
Nắm được các bước của quy trình mở giống tế bào, cất giống tế bào, trypsin tế
bào và nuôi cấy xơ phôi gà môt lớp.
Biết cách chọn trứng có phôi khỏe, mạch máu rõ ràng
Chuẩn bị dụng cụ cho 1 quy trình nuôi cấy.
Những việc chưa làm được:
Thao tác sử dụng pipet chưa được thành thạo, đầu pipet vẫn chạm vào thành
ống fancol, chai môi trường.
Sử dụng pipet đa kênh còn chưa thành thạo
Thao tác mở nắp chai nuôi tế bào, ống fancol vẫn phải dùng hai tay.
Thao tác trong Cabinet: thao tác còn ở gần ngoài cửa Cabinet.
Thao tác trong quá trình thực hiện chưa dứt khoát, chưa bố trí được thời gian
cho các bước thực hành: quá trình trypsin tế bào quá lâu, kiểm tra hình thái tế bào trên
kính hiển vi lâu làm ảnh hưởng tới môi trường nuôi cấy tế bào

6.Kết luận
Sau một tháng theo học, tôi nhận thấy bản thân học được rất nhiều điều: từ văn
hóa giao tiếp nơi công sở, đến các kỹ thuật cơ bản phòng thí nghiệm, tiếp thêm niềm
đam mê tâm huyết với nghề, học cách bố trí, sắp xếp công việc, sử dụng thời gian vào
công việc một cách hiệu quả nhất.
Mong muốn của tôi là được tiếp tục theo học các kỹ thuật, được thực hành
nhiều hơn nữa để tôi nâng cao được chuyên môn, đóng góp cho công ty sau này.

Hà Nội, ngày 28 tháng 4 năm 2014.
Người thực hiện

Trần Thị Nhuận

3


140428 -bao cao tong ket thang – nhuan TT
Phụ Lục 1: Hướng dẫn sử dụng máy móc, thiết bị
Nguyên tắc: Trước khi sử dụng quan sát tình trạng hoạt động của máy, sau khi sử
dụng máy móc ghi vào sổ theo dõi.
1.Máy hấp:
Có 2 loại máy hấp:
Máy hấp sạch chuyên hấp dụng cụ đã xử lý.
Máy hấp bẩn chuyên hấp dụng cụ, trang phục bảo hộ chưa qua xử lý.
Cấu tạo máy hấp:
Đồng hồ chỉ thị áp suất
Van áp suất
Các nút điều chỉnh nhiệt độ, thời gian
Bình xả nước, van xả nước
Cách vệ sinh máy hấp: Sau khi hấp dụng cụ bẩn phải tiên hành rửa máy hấp.

Kiểm tra van xả áp suất. Đảm bảo áp suất về 0
Tắt công tắc điện
Lấy dụng cụ bẩn vừa được hấp
Xả hết nước trong máy
Hòa nước xà phòng: dung chổi rửa rửa sạch bên trong máy. Xả nước sạch cho
đến khi hết xà phòng.
Vệ sinh bên ngoài máy hấp
Thay nước trong bình xả nằm trong giới hạn cho phép.
Thao tác sử dụng máy hấp:
Kiểm tra mực nước trong bình xả nước, giữ ở mực nước cho phép.
Lắp khay, giá sắt vào trong nồi hấp, đảm bảo lượng nước ngập khay 1-2 cm
Cho giỏ đựng đồ hấp: các dụng cụ hấp nên xếp tạo độ thông thoáng, dụng cụ
bao gói xếp trước, dụng cụ thủy tinh xếp lên trên.
Đóng cửa nồi hấp, khóa chặt van áp suất.
Bật công tắc. cài đặt máy bằng các nút điều chỉnh nhiệt độ và thời gian
( 1210C/30-45 phút)
Ấn nút SET/ START. Máy hấp hiển thị ở chế độ Sterile.
Muốn xem nhiệt độ hiện tại của máy hấp ấn nút CHECK HEAT.

4


140428 -bao cao tong ket thang – nhuan TT
Khi lấy đồ hấp ra khỏi máy hấp phải xả van xả áp đảm bảo áp suất về 0 mới
được mở máy hấp.
2. Tủ sấy
Cách sử dụng tủ sấy:
Bước 1: Trước khi mở tủ sấy phải tắt tủ sấy: ấn nút tắt công tắc máy.
Bước 2: Cho dụng cụ cần sấy vào trong tủ sấy, tùy từng dụng cụ mà sấy ở nhiệt độ
khác nhau, hầu hết các dụng cụ được hấp ở 90-1000C/2-3 giờ.

Bước 3: Đóng tủ sấy, bật công tắc máy và cài đặt thời gian và nhiệt độ
Cách cài đẳt thời gian:
Giữ 2 nút RAM + TIME, đèn SET hiện màu đỏ, trên đồng hồ hiển thị thời
gian.
Giữ RAM sau đó TIME để chỉnh giảm thời gian.
Giữ RAM sau đó TEMP để tăng thời gian.
Sau đó ấn RAM, thời gian đã được cài đặt
Cách cài đặt nhiệt độ:
Giữ 2 nút RAM + TEMP, đèn SET hiện màu đỏ, trên đồng hồ hiển thị nhiệt độ.
Giữ RAM sau đó TIME để chỉnh giảm nhiệt độ.
Giữ RAM sau đó TEMP để tăng nhiệt độ.
Sau đó ấn RAM, nhiệt độ đã được cài đặt
Bước 4: tủ sấy đã hoạt động, đèn ở chế độ heater.
Chú ý:
Khi mở tủ sấy phải tắt công tắc để đảm bảo an toàn cho người sử dụng cung
như tránh hỏng tủ sấy.
Trước khi cho đồ vào sấy phải kiểm tra nhiệt độ và thời gian, để quá trình hấp
được đảm bảo và an toàn cho dụng cụ khi sấy khô.
3. Cân chân không
Cách sử dụng:
Bước 1: Cắm nguồn điện.
Bước 2: Cân hóa chất:

5


140428 -bao cao tong ket thang – nhuan TT
Mở cửa cân, đưa máng vào để đựng vật cần cân. Sau đó đóng cửa, ấn TARE, để
đồng hồ chỉ thị 0.000 g. Cân đủ lượng cần lấy, thao tác cẩn thận, cân chính xác số
lượng cần dùng.

Bước 3: Tắt cân
Ấn nút OFF để tắt máy.
Bước 4: Vệ sinh cân:
Sau khi cân nguyên liệu xong cần vệ sinh cân sạch sẽ. Lau bề mặt cân.
Bước 5: Rút nguồn điện. Để cân về trạng thái nghỉ.
4. Kính hiển vi soi ngược
Cấu tạo:
Thị kính có độ phóng đại khác nhau
Vật kính
Ốc vĩ cấp
Ốc vi cấp
Ốc điều chỉnh ánh sáng
Cách sử dụng:
Bước 1: Cắm nguồn điện
Sử dụng nguồn điện 110V, cắm vào nguồn điện 110V, không cắm trực tiếp vào
nguồn điện 220V sẽ gây hỏng máy, qua bộ đổi điện.
Bước 2: Khởi động máy
Bật công tắc đưa máy về chế độ hoạt động.
Xoay ốc điều chỉnh độ sáng của đèn lên tối đa. Điều chỉnh độ sang của đèn
thông qua núm điều chỉnh nguồn sáng.
Bước 3: Soi kính
Đặt chai nuôi tế bào hoặc buồng đếm tế bào lên khu vực soi.
Điều chỉnh ốc vĩ cấp lấy hình ảnh. Sau đó điều chỉnh ốc vi cấp để chỉnh ảnh rõ
nét
Bước 4:Cho kính nghỉ
Vặn núm điều chỉnh ánh sáng về 0
Tắt đèn
Tắt công tắc nguồn

6

140428 -bao cao tong ket thang – nhuan TT
Cho vật kính về chế độ nghỉrút điện vệ sinh Kính hiển vi.
5. Máy Ly tâm
Cấu tạo:
Có 2 Roto
Roto 15ml với tốc độ ly tâm 3500 vòng/ phút.
Roto 50ml với tốc độ ly tâm vòng/phút
Các nút điều chỉnh:
Nút công tắc máy: ON, OFF
Nút chế độ: HIGHT, LOW
Đồng hồ chỉ thị tốc độ và thời gian.
Nút điều chỉnh tốc độ
Nút điều chỉnh thời gian.
Cách sử dụng: Máy ly tâm hoạt động dựa trên nguyên lý cân bằng.
Bước 1: Cắm điện nguồn điện 220V.
Bước 2: Xếp mẫu vào các ROTO
Khi xếp mẫu phải đảm bảo các mẫu cần ly tâm ở dạng đối xứng và cân bằng.
Dùng cân tiểu ly khi cần thiết.
Bước 3: Khởi động máy
Đóng nắp máy ly tâm.
Ấn MAIN cho máy hoạt động.
Cài đặt vòng quay và thời gian: Nếu ly tâm <2.500 vòng ấn nút LOW. nếu ly
tâm > 2.500 vòng ấn HIGHT.
Điều chỉnh số vòng quay vặn nút speed, quan sát trên đồng hồ chỉ thị số vòng
trong khoảng cần ly tâm.
Điều chỉnh thời gian: vặn nút TIME chỉ thị trên máy, chỉnh thời gian cần ly tâm.
Bước 4: Đưa máy về trạng thái nghỉ,
Ấn tắt MAIN, rút ổ điện.

6. Cabinet
Trước khi sử dụng cabinet: ở trạng thái không hoạt động, chìa khóa cabinet ở vị
trí số 0, cánh cửa tủ ở vị trí đóng.
Vô trùng cabinet 15 phút trước khi sử dụng:

7


140428 -bao cao tong ket thang – nhuan TT
Vặn chìa khóa tủ ở số 2, ấn nút UV lamp
Đèn tử ngoại sáng, đồng thời xuất hiện tiếng kêu.
Để tắt tiếng kêu, ta ấn nút Stop. Vô trùng tủ trong 15 phút.
Sau 15 phút tắt đèn tử ngoại bằng cách ấn nút UV lamp và chìa khóa cabinet ở
vị trí số 0.
Cách sử dụng cabinet:
Mở cánh cửa tủ cabinet
Vặn chìa khóa tủ về vị trí số 1, núm quạt gió sẽ tự động hoạt động (không cần
ấn nút FAN). Khi quạt gió hoạt động ấn nút biểu tượng đèn (bên cạnh núm FAN). Tủ
cấy có 2 màng lọc khí: khí qua màng lọc thì đèn sẽ bật xanh. Chỉ được làm việc khi cả
2 đèn đều xanh.
Quá trình thao tác trong cabinet phải nhẹ nhàng, tránh đưa luồng không khí từ
ngoài vào sẽ gây tạp nhiễm.
Vệ sinh cabinet sau khi sử dụng:
Thu dọn sạch sẽ, không được để lại bất cứ dụng cụ thí nghiệm trong cabinet.
Tắt quạt gió và AS, vặn chìa khóa cabinet về vị trí 0.
Đậy cánh cửa cabinet lại, vô trùng cabinet 15 phút (giống như các bước ở trên).
Tắt cabinet hoàn toàn ( chìa khóa ở vị trí 0)
Chú ý khi sử dụng cabinet:
Trong quá trình sử dụng cabinet, có thể xuất hiện tiếng kêu, để tắt tiếng kêu ấn
nút Stop.

Không để quá nhiều dụng cụ trong Cabinet lúc làm việc và sau làm việc.

Phụ Lục 2: Cách pha các loại môi trường nuôi cấy tế bào
1. Quy trình chuẩn bị nước cất 2x
1.1. Mục đích: là dung môi để pha các môi trường PBS-, MEM 1x
1.2. Nguyên vật liệu
a. Nước cất 2x
b. Vật liệu hấp vô trùng:
STT Vật liệu
1
Hệ thống lọc Satorius
( 1 bình lọc, 1 hệ thống dây gắn lọc)
2
Màng lọc Cenlulose 0,22 µm
3
Cốc định mức 1 lít
4
Chai Schott 1 lít

8

Số lượng
01
01
01
01


140428 -bao cao tong ket thang – nhuan TT
c. Máy móc: Máy hút chân không

1.3. Thao tác
Bước 1: Thấm ướt màng lọc
Màng lọc cenlulose 0,22 µm bằng cách ngâm ngập màng lọc trong máng nước
cất 2x. Lắp màng lọc vào hệ thống lọc Satorius sao cho cân đối.
Bước 2: Nối hệ thống lọc với máy hút chân không
Dùng dây gắn hệ thống lọc với đầu vào INLET của máy hút chân không. Dùng
máy hút chân không hút hết không khí trong bình, khi đó tạo ra sự chênh lệch áp suất
 nước sẽ đi từ nơi có áp suất cao đến nơi có áp suất thấp.
Bước 3: Lọc nước
Cắm điện máy hút chân không, đổ nước cất 2x vào hệ thống lọc chân không.
Nước cất sau khi được lọc vào các chai Scott 1 lít, không hấp nước cất quá
nhiều, khi hấp không vặn nút chai quá chặt sẽ gây nổ.

Bước 4: Bảo quản
Sau khi hấp, nước cất 2x được bảo quản ở nhiệt độ phòng.
2. Quy trình chuẩn bị PBS2.1. Mục đích: Là môi trường để rửa tế bào chết trong nuôi cấy tế bào.
2.2. Nguyên vật liệu pha PBS- 1 lít
a. Nước cất 2x đã lọc và hấp vô trùng 1 lít
b. Hóa chất: Hộp PBS bột 9,55 gam/1lit
c. Vật liệu hấp vô trùng:
STT
1
2
3
4
5
6
7
d. Máy móc:

Vật liệu
Giấy lau
Máng cân
Đầu type 200µl
Thìa cân
Chai Schott 1 lít
Chai Schott 250ml
Cốc định mức 1 lít

Số lượng
01
01
01
01
01
04
01

STT Vật liệu
1
Cân chân không
2
Giấy đo pH

Số lượng
01
01

9

140428 -bao cao tong ket thang – nhuan TT
3

Pipet 10-100 µl

01

2.3. Thao tác
Bước 1: Chuẩn bị nước cất
Lấy 1 lượng nước cất 2x vô trùng 200- 300ml
Bước 2: Cân PBS
Dùng máng cân 9,55 gam bột PBS
Bước 3: Pha PBS
Cho PBS vừa cân vào chai nước cất 2x, tráng máng vừa cân PBS, lắc đều cho
bột tan hết ( lắc trên máy khuấy từ nếu pha với 1 lượng lớn)
Chuyển lượng môi trường vừa pha sang cốc định mức 1 lít, cho thêm lượng
nước cất đủ thể tích cần pha
Chuyển toàn bộ 1 lít môi trường từ cốc định mức sang chai Schott 1 lít, lắc đều
cho tan hết.
Bước 4: Kiểm tra pH
Có thể sử dụng máy đo pH hoặc giấy đo pH.
Dùng pipet hút 1 ít dung dịch nhỏ lên giấy rồi đo pH. Dùng NaOH 1N hoặc
HCl 1N để điều chỉnh pH của môi trường (pH = 7,2 – 7,4).
Bước 5: Bảo quản
Chia môi trường ra các chai Schott nhỏ vô trùng. Đem hấp 1210C/15 phút.
Để nguội. Bảo quản 40C đến khi sử dụng.
3. Quy trình chuẩn bị môi trường MEM1x
3.1. Mục đích: Là môi trường để tế bào sinh trưởng và phát triển.
3.2. Nguyên vật liệu pha MEM 1x 1 lít

a. Nước cất 2x đã lọc và hấp vô trùng 1 lít
b. Hóa chất:
NaHCO3………..2,2g
MEM bột…….....9,53g
Gentamycin…….50µg
c. Vật liệu hấp vô trùng:
STT Vật liệu
1
Giấy lau

Số lượng
01

10


140428 -bao cao tong ket thang – nhuan TT
2
3
4
5
6

Máng cân
Cục khuấy từ
Thìa cân
Chai Schott 1 lít
Cốc định mức 1 lít

01

01
01
01
01

Vật liệu
Cân chân không
Giấy đo pH
Pipet 10-100 µl

Số lượng
01
01
01

d. Máy móc:
STT
1
2
3
3.3. Thao tác

Bước 1: Lấy 1 lượng nước cất 2x vô trùng 200- 300ml
Bước 2: Cân hoá chất
Dùng máng để cân hóa chất, trước khi cân nên lau sạch máng.
Cân MEM bột 9,53g cho vào bình đã có sẵn ít nước. Không được lắc ngay sẽ
đông vón.
Tráng máng  lắc đều với cục khuấy từ
Dùng máng khác cân NaHCO3: 2,2 gam cho tiếp vào bình, tráng máng lắc
đều.

Bước 3: Bổ sung lượng nước sao cho đủ thể tích 1 lít.
Tiếp tục cho lên máy khuấy từ, lắc đều, cho đến khi tan hoàn toàn
Bước 4: Lọc
Lọc qua màng lọc 0,22µm bằng hệ thống lọc chân không đã được hấp vô trùng
Bước 5: Điều chỉnh pH
Dùng 6ml HCl 1N để điều chỉnh pH về 7,2- 7,4
Bước 6: Bổ sung Gentamycin
Dùng pipet hút 50µg/ 1ml cho vào dung dịch
Bước 7: Bảo quản
Dung dịch sau khi pha được bảo quản ở 40C.
4. Huyết thanh bào thai bò (FBS)
Huyết thanh được bảo quản ở -200C

11


140428 -bao cao tong ket thang – nhuan TT
Đông tan huyết thanh
Xử lý nhiệt huyết thanh 560C trong 30 phút.
Chia 20ml/ ống ly tâm 50ml
Bảo quản ở -200C cho đến khi sử dụng.
5. Trypsin- EDTA
Trypsin bảo quản ở -200C
Đông tan trypsin
Chia 10ml/ ống ly tâm 15ml
Bảo quản ở -200C cho đến khi sử dụng.

Phụ lục 3: Quy trình mở giống tế bào
1.Nguyên vật liệu
a. Tế bào đã được cất giống trước đó.

b. Môi trường, hóa chất, sinh phẩm:
MEM1x:
Thành phần:
NaHCO3………………...2,2g
MEM bột……..................9,53g
Gentamycin……………..50µg
Nước cất vô trùng vừa đủ 1 lít.
MEM 10%
Thành phần:
MEM1x……………….100ml
FBS…………………….10ml
FBS:
Thành phần:
PBS bột …………………..9,55 gam
Nước cất vô trùng vừa đủ …….1 lít
c. Dụng cụ an toàn sinh học
Mũ, quần áo, khẩu trang, găng tay
Chai xịt cồn 700 .

12


140428 -bao cao tong ket thang – nhuan TT

d.Dụng cụ hấp, sấy:
STT
1
2
3
4

Vật liệu
Cốc đựng thủy tinh
Ống ly tâm 15
Chai nuôi tế bào T25
Khay đựng dụng cụ

Số lượng
01
01
01
01

e.Máy móc, thiết bị
STT
1
2
3
4
5
6

Vật liệu
Pipet 5ml
Cabinet
Máy ly tâm
Tủ ấm CO2
Tủ lạnh 40C
Tủ lạnh -200C

Số lượng
01
01
01
01
01
01

2.Các bước thực hiện:
Bước 1: Chuẩn bị Cabinet và đưa môi trường về nhiệt độ phòng
Chuẩn bị Cabinet: Vô trùng Cabinet trong 15 phút
Chuyển môi trường về nhiệt độ phòng:
Mục đích: không làm ảnh hưởng tế bào vì nếu để nhiệt độ quá thấp sẽ gây chết
tế bào.
MEM1x, MEM10%, PBS- bảo quản trong tủ lạnh 40C
Chuyển môi trường đang bảo quản trong tủ lạnh đưa ra ngoài để tan đông.
Bước 2: Giải đông tế bào cất giống
Mục đích: đưa tế bào về trạng thái hoạt động
Cách tiến hành:
Chuẩn bị ống môi trường 5ml MEM10% để cân bằng môi trường tế bào.
Cho ống giống vào bọt xốp, thả vào cốc nước ấm 370C
Thấy môi trường chuyển màu đậm hơn

13


140428 -bao cao tong ket thang – nhuan TT
Khi môi trường đồng nhất, chuyển ống môi trường vào Cabinet
Bước 3: Cân bằng môi trường
Mục đích: Cân bằng môi trường nuôi cấy tế bào.

Cách tiến hành:
Dùng pipet chuyển nhẹ nhàng giống vào ống môi trường 5ml MEM10%FBS đã
chuẩn bị
Tráng lại ống giống để lấy hết tế bào.
Chú ý:
Khi sử dụng pipet để lấy môi trường hoặc lấy huyễn dịch tế bào, tránh làm pipet
chạm vào thành chai, thành ống sẽ gây tạp nhiễm tế bào.
Bước 4: Ly tâm và đánh tan cặn tế bào
Mục đích: lấy cặn tế bào
Cách tiến hành:
Cho ống fancol chứa huyễn dịch đem ly tâm 700v/phút trong 10 phút.
Ly tâm xong, dùng pipet hút hết dung dịch ở phía trên, giữ lại cặn tế bào.
Đánh tan cặn tế bào bằng cách: Rà mạnh đáy ống vào Cabinet hoặc dùng pipet
đảo đều.
Chú ý:
Trước khi ly tâm, các ống ly tâm phải được đóng chặt nút và bao dán bằng
paraffin.
Khi hút bỏ môi trường, tránh để đầu type chạm vào cặn tế bào.
Bước 5: Hòa tan trong môi trường nuôi cấy tế bào
Mục đích: Hòa tan huyễn dịch tế bào trong môi trường nuôi cấy
Cách tiến hành:
Cho 6ml môi trường MEM10% vào ống ly tâm có chứa cặn tế bào.
Dùng pipet đảo đều.
Bước 6: Cấy tế bào vào chai nuôi
Mục đích: cung cấp chất dinh dưỡng cho tế bào phát triển
Cách tiến hành:
Ghi thông tin lên chai nuôi về ngày mở giống, dòng tế bào, đời tế bào, người
thực hiện.

14

140428 -bao cao tong ket thang – nhuan TT
Dùng pipet chuyển hết lượng huyễn dịch tế bào vừa được đánh tan cặn có bổ
sung 6ml MEM 10% vào chai nuôi T25.
Lắc nhẹ nhàng chai nuôi
Bước 7: Vệ sinh cabinet sau khi sử dụng
Chuyển các dụng cụ vừa thao tác ra khỏi cabinet
Dùng giấy lau xịt cồn lau sạch Cabinet
Đóng cửa Cabinet, bật UV trong 30 phút
Bước 8: Theo dõi sự phát triển của tế bào
Nuôi tế bào 370C, 5%CO2. Hàng ngày theo dõi tế bào trên kính hiển vi soi
ngược.

Phụ lục 4: Quy trình cất giống tế bào
1. Nguyên vật liệu
a. Tế bào đã phát triển, tỷ lệ bám đáy 100%. (Thường sau 2-3 ngày trypsin)
b. Môi trường, hóa chất, sinh phẩm:
MEM1x:
Thành phần:
NaHCO3………………...2,2g
MEM bột……..................9,53g
Gentamycin……………..50µg
Nước cất vô trùng vừa đủ 1 lít.
MEM 10%
Thành phần:
MEM1x……………….100ml
FBS…………………….10ml
FBS:
Thành phần:

PBS bột …………………..9,55 gam
Nước cất vô trùng vừa đủ …….1 lít
Pha dung dịch cất giống
Lượng dung dịch cất giống chiếm 50% cần pha 5ml dung dịch cất giống sau khi đã
qua màng lọc

15


140428 -bao cao tong ket thang – nhuan TT
Cách pha 6ml dung dịch cất giống 20% PBS, 20% DMSO:
Lấy 1 ống fancol 50ml vô trùng
Dùng pipet hút 3,6 ml MEM10%
Thay đầu type, hút tiếp 1,2ml PBS cho vào ống
Cho tiếp vào ống 1,2ml DMSO
Dùng xilanh, kim tiêm vô trùng hút hết dung dịch cất giống ở ống fancol, lắp
xilanh vào đầu lọc 0.45, bơm qua lọc cho vào ống fancol mới.
Chú ý : không được cho PBS sau khi cho DMSO, sẽ gây kết tủa
c. Dụng cụ an toàn sinh học
Mũ, quần áo, khẩu trang, găng tay
Chai xịt cồn 700 .
d.Dụng cụ hấp, sấy:
STT
1
2
3
4
5
6
7

8

Vật liệu
Cốc đựng thủy tinh
Ống ly tâm 15
Chai nuôi tế bào T25
Khay đựng dụng cụ
Type 5ml
Type 200µl
ống Tube cất giống
Cốc thủy tinh đựng rác

Số lượng
01
01
01
01
01 (hộp)
01 (hộp)
01
01

e.Máy móc, thiết bị
STT
1
2
3
4
5
6

7
8

Vật liệu
Pipet 5ml
Cabinet
Máy ly tâm
Tủ ấm CO2
Tủ lạnh 40C
Tủ lạnh -200C
Tủ lạnh -800C
Hộp đá khô

Số lượng
01
01
01
01
01
01
01
01

2.Các bước thực hiện:
Bước 1: Chuẩn bị Cabinet và đưa môi trường về nhiệt độ phòng
Chuẩn bị Cabinet: Vô trùng Cabinet trong 15 phút

16

140428 -bao cao tong ket thang – nhuan TT
Chuyển môi trường về nhiệt độ phòng:
Mục đích: không làm ảnh hưởng tế bào vì nếu để nhiệt độ quá thấp sẽ gây chết
tế bào.
MEM1x, MEM10%, PBS- bảo quản trong tủ lạnh 40C
Chuyển môi trường đang bảo quản trong tủ lạnh đưa ra ngoài để tan đông.
Bước 2: Quan sát tế bào
Mục đích: quan sát mức độ phát triển của tê bào, tỷ lệ tế bào bám đáy.
Cách tiến hành:
Khi tế bào phát triển tốt, tỉ lệ bám đáy 100%
Bước 3:Loại bỏ môi trường đang nuôi:
Mục đích: loại bỏ tế bào chết
Cách tiến hành:
Lắc nhẹ chai nuôi, lắc ngang chai
Mở nắp chai, nghiêng chai về mặt không có tế bào
Dùng pipet lắp đầu type 5ml hút bỏ môi trường vào cốc thủy tinh đựng rác.
Bước 4:Rửa PBSMục đích: loại bỏ tế bào chết, huyết thanh và môi trường còn sót lại.
Cách tiến hành:
Thêm vào bình nuôi PBS- vào chai nuôi (15ml/chai T75). Rửa 2 lần PBS-.
Chú ý: Khi hút môi trường: thao tác không đưa không khí vào trong các chai
môi trường bằng cách ấn đầu pipet ở ngoài rồi mới đưa đầu type vào hút môi trường.
Bước 5: Trypsin tế bào
Mục đích: tách tế bào ra khỏi đáy bình
Cách tiến hành:
Dùng pipet hút 3ml trypsin 1x cho vào mặt chai không có tế bào, nghiêng chai
nhẹ nhàng để các tế bào đồng pha cùng tách nhau
Quan sát tế bào sau khi trypsin dưới kính hiển vi nếu tế bào bắt đầu co tròn lại,
tách rời nhau thì tiến hành dừng trypsin.
Nếu tế bào chưa tách rời nhau thì để tiếp tủ ấm 3-5 phút để cho các tế bào đồng
pha.

Chú ý:
Không được lắc chai nuôi TB.

17


140428 -bao cao tong ket thang – nhuan TT
Bước 6: Trung hòa trypsin
Mục đích: Dừng quá trình trypsin
Cách tiến hành:
Vỗ mạnh chai để các tế bào tách nhau hoàn toàn (tránh làm môi trường bắn lên
thành bình)
Dùng pipet hút 7ml môi trường MEM10%FBS cho vào chai nuôi để trung hòa
trypsin.
Dùng pipet đảo đều môi trường, tưới đều lên mặt tế bào bám đáy, lắc đều nhiều
lần để bong hết các tế bào bám dính đáy chai.
Chuyển hết huyễn dịch vào ống fancol 50ml (chú ý khi mở nắp ống không
chạm tay vào miệng ống fancol). Đậy nắp, Bao dán paraffin, lắc nhẹ, đem ly tâm.
Bước 7: Ly tâm và đánh tan cặn
Mục đích: thu cặn tế bào
Cách tiến hành:
Cho ống fancol chứa huyễn dịch đem ly tâm 700v/phút trong 10 phút.
Dùng pipet hút hết dung dịch ở phía trên, giữ lại cặn tế bào
Hút 3ml môi trường MEM10% cho vào ống, dùng pipet đảo đều hoặcrầ nhẹ đáy
ống vào mặt cabinet để đánh tan hoàn toàn cặn tế bào.
Chú ý :
Khi hút không để đầu type chạm vào đáy ống có tế bào
Bước 8: Đếm tế bào
Mục đích: xác định lượng tế bào có trong 1ml huyễn dịch
Cách tiến hành:

Pha loãng tế bào 10 lần với MEM10%FBS : Hút 900µl môi trường MEM10%
cho vào ống eppendorf. Cho vào 100µl huyễn dịch tế bào vào trộn đều.
Pha loãng huyễn dịch tế bào với thuốc nhuộm trypan blue theo hệ số pha loãng
2: cho vào ống eppendorf 100µl huyễn dịch tế bào vừa pha loãng 10 lần với 100µl
trypan blue.
Dùng pipet hút 1 lượng huyễn dịch tế bào sau khi nhuộm nhỏ từ từ vào buồng
đếm tế bào.
Đếm sô tế bào trên buồng đếm:

18


140428 -bao cao tong ket thang – nhuan TT
Đếm tế bào ở 4 góc, trong mỗi góc có 16 ô vuông nhỏ, đếm số tế bào nằm trong
khung 16 ô vuông nhỏ.
Đếm từng tế bào riêng lẻ trong đám tế bào.
Đếm theo hình zic zắc.
Đếm các tế bào có kích thước tương đồng nhau.
Không đếm các tế bào chết bắt màu xanh, chỉ đếm các tế bào còn sống.
Ước lượng số tế bào trong 1ml:
số tế bào/1ml = (số tế bào đếm được trong 4góc/4 )x 2 x độ pha loãng tế bào x 104
Bước 9: Ra chai và cất giống tế bào:
Mục đích: Lưu giữ giống tế bào (106 cell/ tube)
Cách tiến hành:
Dùng pipet hút 1,5 ml huyễn dịch tế bào + 3,5 ml môi trường MEM10% FBS
cho vào ống fancol chứa dung dịch cất giống vừa lọc.
Dùng pipet trộn đều môi trường, chia vào ống cất giống,mỗi ống cất 1ml
Xoáy chặt nắp ống, bao dán paraffin.
Bước 10: Bảo quản tế bào
Giữ ống giống trong hộp đá

Sau đó chuyển sang tủ lạnh -200 C/ 2-3 giờ
Chuyển sang tủ -800 C
Chuyển vào nitơ khi cần thiết.
Bước 11: Vệ sinh Cabinet sau khi sử dụng
Chuyển các dụng cụ vừa thao tác ra khỏi cabinet
Dùng giấy lau xịt cồn lau sạch Cabinet
Đóng cửa Cabinet, bật UV trong 30 phút

Phụ Lục 5: Quy trình tế bào Trypsin
1. Nguyên vật liệu
a. Tế bào đã phát triển, tỷ lệ bám đáy 90-100%.
b. Môi trường, hóa chất, sinh phẩm:
MEM1x:

19


140428 -bao cao tong ket thang – nhuan TT
Thành phần:
NaHCO3………………...2,2g
MEM bột……..................9,53g
Gentamycin……………..50µg
Nước cất vô trùng vừa đủ 1 lít.
MEM 10%
Thành phần:
MEM1x……………….100ml
FBS…………………….10ml
FBS:
Thành phần:
PBS bột …………………..9,55 gam

Nước cất vô trùng vừa đủ …….1 lít
c. Dụng cụ an toàn sinh học
Mũ, quần áo, khẩu trang, găng tay
Chai xịt cồn 700 .
d.Dụng cụ hấp, sấy:
STT
1
2
3
4
5

Vật liệu
Giá để ống nghiệm
Hộp type 200µl
Hộp type 5ml
Ống Fancol 50ml
Chai nuôi cấy tế bào T75

Số lượng
01
01
01
01
02

e.Máy móc, thiết bị
STT
1
2

3
4
5
6
7
8
9

Vật liệu
Pipet 5ml
Pipet 10 - 100µl
Cabinet
Máy ly tâm
Tủ ấm CO2
Tủ lạnh 40C
Tủ lạnh -200C
Kính hiển vi
Bộ buồng đếm tế bào

Số lượng
01
01
01
01
01
01
01
01
01

20


140428 -bao cao tong ket thang – nhuan TT
2.Các bước thực hiện:
Bước 1: Chuẩn bị Cabinet và đưa môi trường về nhiệt độ phòng
Chuẩn bị Cabinet: Vô trùng Cabinet trong 15 phút
Chuyển môi trường về nhiệt độ phòng:
Mục đích: không làm ảnh hưởng tế bào vì nếu để nhiệt độ quá thấp sẽ gây chết
tế bào.
MEM1x, MEM10%, PBS- bảo quản trong tủ lạnh 40C
Chuyển môi trường đang bảo quản trong tủ lạnh đưa ra ngoài để tan đông.
Bước 2: Quan sát tế bào
Mục đích:
Quan sát mức độ phát triển của tế bào, tỷ lệ bám đáy
Cách quan sát:
Quan sát màu sắc môi trường, độ đục trong, tỷ lệ tế bào bám đáy
Khi quan sát trên kính hiển vi thấy tế bào bám đáy 90 – 100% thì tiến hành
trypsin tế bào.
Bước 3: Loại bỏ môi trường đang nuôi tế bào
Mục đích: loại bỏ tế bào chết
Cách tiến hành:
Lắc nhẹ chai nuôi, lắc ngang chai
Mở nắp chai, nghiêng chai về mặt không có tế bào
Dùng pipet lắp đầu type 5ml hút bỏ môi trường vào cốc thủy tinh đựng rác.
Bước 4: Rửa tế bào
Mục đích: loại bỏ tế bào chết, huyết thanh và môi trường còn sót lại.
Cách tiến hành:
Cho vào chai nuôi tế bào 1 lượng PBS- để rửa tế bào (15ml PBS- vào chai nuôi
T75, 5ml PBS- vào chai nuôi T25).

Lắc ngang chai nuôi, cầm nghiêng chai, hút bỏ PBS- vừa rửa
Rửa tiếp chai nuôi tế bào bằng PBS- một lần nữa.
Chú ý :
khi cho PBS- nên để đầu type vào gần miệng chai, không cho sâu quá, cho vào
mặt không có tế bào bám dính, đầu pipet không được chạm vào thành chai
Bước 5: Trypsin tế bào

21


140428 -bao cao tong ket thang – nhuan TT
Mục đích: tách tế bào ra khỏi đáy bình
Cách tiến hành:
Dùng pipet hút 3ml trypsin 1x cho vào chai T75, 1ml trypsin cho vào chai T25
Cho trypsin vào mặt chai không có tế bào, nghiêng chai nhẹ nhàng để các tế
bào đồng pha cùng tách nhau. Thời gian trypsin từ 5 -45 phút
Chú ý : Không được lắc chai nuôi TB.
Bước 6: Trung hòa trypsin
Mục đích: dừng quá trình trypsin
Cách tiến hành:
Vỗ mạnh chai để tách hết các tế bào bám dính đáy bình (tránh làm môi trường
bắn lên thành bình)
Dùng pipet hút 7ml môi trường MEM10%FBS cho vào chai T75, 2,5 ml môi
trường MEM10%FBS cho vào chai T25 nuôi để trung hòa trypsin.
Dùng pipet đảo đều môi trường, tưới đều lên mặt tế bào bám đáy, lắc đều nhiều
lần để bong hết các tế bào bám dính đáy chai.
Chuyển hết huyễn dịch vào ống fancol 50ml (chú ý khi mở nắp ống không
chạm tay vào miệng ống fancol). Đậy nắp, Bao dán paraffin, lắc nhẹ, đem ly tâm.

Bước 7: Ly tâm

Mục đích: thu cặn tế bào
Cách tiến hành:
Cho ống fancol chứa huyễn dịch đem ly tâm 700v/phút trong 10 phút.
Ly tâm xong, dùng pipet hút hết dung dịch ở phía trên, giữ lại cặn tế bào.
Đánh tan cặn tế bào bằng cách: Rà mạnh đáy ống vào Cabinet hoặc dùng pipet
đảo đều.
Chú ý:
Trước khi ly tâm, các ống ly tâm phải được đóng chặt nút và bao dán bằng
paraffin.
Khi hút bỏ môi trường, tránh để đầu type chạm vào cặn tế bào.
Bước 8: Cân bằng môi trường
Mục đích: Đánh tan cặn tế bào

22


140428 -bao cao tong ket thang – nhuan TT
Cách tiến hành:
Dùng pipet hút 7ml môi trường MEM10% cho vào ống fancol vừa ly tâm để
đánh tan cặn tế bào.
Dùng pipet đảo đều hoặc rà mạnh vào cabinet.
Bước 9: Tráng sạch chai nuôi tế bào
Mục đích: loại bỏ các tế bào, môi trường còn sót lại, tránh sự tạp nhiễm, chống nấm
phát triển.
Cách tiến hành:
Hút 15ml PBS- cho vào chai T75, 5ml PBS- vào T25 vừa nuôi tế bào
Lắc mạnh, rửa sạch chai
Nghiêng chai để hút bỏ môi trường PBS- vừa rửa
Bước 10: Ra chai nuôi
Mục đích: Tiếp tục nuôi tế bào, để tế bào nhân lên.

Cách tiến hành:
Dùng pipet hút 6ml MEM10% cho vào T25, 20ml MEM10% cho vào chai T75.
Dùng pipet lấy 1ml huyễn dịch cho vào chai nuôi
Lắc nhẹ nhàng để tế bào được trải đều khắp mặt đáy chai nuôi.

Bước 11: Vệ sinh cabinet sau khi sử dụng
Thu dọn rác, Chuyển các dụng cụ vừa thao tác ra khỏi cabinet
Dùng giấy lau xịt cồn lau sạch Cabinet
Đóng cửa Cabinet, bật UV trong 30 phút
Bước 12: Theo dõi sự phát triển của tế bào
Nuôi tế bào ở tủ ấm 370C, 5% CO2
Hằng ngày quan sát tế bào phát triển ở đáy chai nuôi trên kính hiển vi soi
ngược.

Phụ lục 6: Quy trình nuôi cấy sơ phôi một lớp (Đối với 1 phôi)
1.NGUYÊN VẬT LIỆU
a.Trứng gà có phôi: 10-11 ngày tuổi. Phôi khỏe mạnh, có nhiều mạch máu.
b. Môi trường, hóa chất, sinh phẩm:

23


140428 -bao cao tong ket thang – nhuan TT
MEM1x:
Thành phần:
NaHCO3………………...2,2g
MEM bột……..................9,53g
Gentamycin……………..50µg
Nước cất vô trùng vừa đủ 1 lít.
MEM 10%

Thành phần:
MEM1x……………….100ml
FBS…………………….10ml
FBS:
Thành phần:
PBS bột …………………..9,55 gam
Nước cất vô trùng vừa đủ …….1 lít
Trypan blue 0,4%
Trypsin –EDTA bảo quản ở -200C
c. Dụng cụ an toàn sinh học
Mũ, quần áo, khẩu trang, găng tay
Chai xịt cồn 700 .
d.Dụng cụ hấp, sấy:
STT
1
2
3
4
5

Vật liệu
Giá để ống nghiệm
Hộp type 200µl
Hộp type 5ml
Ống Fancol 50ml
Chai nuôi cấy tế bào T25

Số lượng
01
01

01
01
01

e.Máy móc, thiết bị
STT
1
2
3
4
5
6

Vật liệu
Pipet 5ml
Pipet 10 - 100µl
Cabinet
Máy ly tâm
Tủ ấm CO2
Tủ lạnh 40C

Số lượng
01
01
01
01
01
01

24

140428 -bao cao tong ket thang – nhuan TT
7
8
9

Tủ lạnh -200C
Kính hiển vi
Bộ buồng đếm tế bào

01
01
01

2.Các bước thực hiện:
Bước 1: Chuẩn bị Cabinet và đưa môi trường về nhiệt độ phòng
Chuẩn bị Cabinet: Vô trùng Cabinet trong 15 phút
Chuyển môi trường về nhiệt độ phòng:
Mục đích: không làm ảnh hưởng tế bào vì nếu để nhiệt độ quá thấp sẽ gây chết
tế bào.
MEM1x, MEM10%, PBS- bảo quản trong tủ lạnh 40C
Chuyển môi trường đang bảo quản trong tủ lạnh đưa ra ngoài để tan đông.

Bước 2: Soi trứng để chọn phôi
Mục đích: chọn những trứng có phôi khỏe
Cách tiến hành:
Chọn những trứng có phôi khỏe, mạch máu rõ ràng, phôi 9-11 ngày tuổi, tốt nhất là
trứng 10 ngày tuổi.
Bước 3: Chuyển môi trường, dụng cụ cần thiết vào Cabinet

Cho cacbinet ở trạng thái hoạt động
Xịt cồn trứng, các chai môi trường đã được đưa về nhiệt độ phòng trước đó, các
dụng cụ trước khi cho vào Cabinet.
Sắp xếp Cabinet sao cho gọn gang để thuận tiện trong khi thao tác.
Bước 4: Chia PBS- ra cốc đong
Mục đích: rửa phôi
Cách tiến hành:
Đổ môi trường PBS- vào cốc đong thủy tinh , 40 ml/ phôi
Bước 5: Xử lý phôi
Mục đích: lấy phôi, cắt nhỏ phôi
Cách tiến hành:
Sát trùng vỏ trứng vùng buồng hơi bằng cồn 70
Dùng pank làm vỡ vỏ trứng

25