Nghiên cứu môi trường thích hợp để nhân nhanh giống sâm nam núi dành bằng phương pháp in vitro

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

NGỌ MẠNH HÙNG
Tên đề tài:
“NGHIÊN CỨU MÔI TRƢỜNG THÍCH HỢP
ĐỂ NHÂN NHANH GIỐNG SÂM NAM NÚI DÀNH BẰNG
PHƢƠNG PHÁP IN VITRO”.

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo

: Chính quy

Chuyên ngành

: Công nghệ sinh học

Khoa

: CNSH – CNSH

Khoá

: 2013 – 2017

Thái Nguyên, 2017


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

NGỌ MẠNH HÙNG
Tên đề tài:
“NGHIÊN CỨU MÔI TRƢỜNG THÍCH HỢP
ĐỂ NHÂN NHANH GIỐNG SÂM NAM NÚI DÀNH BẰNG
PHƢƠNG PHÁP IN VITRO”.

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo

: Chính quy

Chuyên ngành

: Công nghệ sinh học

Khoa

: CNSH – CNSH

Khoá

: 2013 – 2017

Giảng viên hƣớng dẫn

: TS. Phạm Bằng Phƣơng
TS. Đồng Thị Kim Cúc

Thái Nguyên, 2017


i

LỜI CẢM ƠN
Đƣợc sự đồng ý của Ban Giám hiệu nhà trƣờng, Ban Chủ nhiệm khoa
CNSH - CNTP, trong thời gian thực tập em đã tiến hành thực hiện đề tài
“Nghiên cứu môi trường thích hợp để nhân nhanh giống Sâm Nam Núi Dành
bằng phương pháp in vitro”.
Kết thúc thời gian thực tập tại Trung tâm Thực nghiệm sinh học Nông
nghiệp Công nghệ cao – Viện Di Truyền, đến nay em đã hoàn thành đề tài tốt
nghiệp. Để đạt đƣợc kết quả nhƣ ngày hôm nay, em xin gửi lời cảm ơn chân thành
tới Ban Giám hiệu Trƣờng Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, Ban Chủ nhiệm Khoa
CNSH-CNTP cùng các thầy cô giáo trong Khoa đã tạo điều kiện tốt nhất cho em
trong suốt thời gian thực tập.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy giáo TS. Phạm Bằng Phƣơng, cô
giáo TS. Đồng Thị Kim Cúc và kĩ sƣ Đinh Thế Anh đã tận tình chỉ bảo, giúp đỡ và
hƣớng dẫn em trong thời gian thực hiện đề tài.
Cuối cùng, em xin cám ơn gia đình đã tạo điều kiện vật chất tốt nhất có thể
và luôn là chỗ dựa tinh thần cho em trong quá trình thực tập, cảm ơn bạn bè đã giúp
đỡ em trong thời gian vừa qua.
Mặc dù bản thân đã cố gắng hết sức nhƣng do thời gian thực hiện đề tài có hạn
nên bản khóa luận không thể tránh khỏi những thiếu sót, em rất mong nhận đƣợc ý kiến
đóng góp chân thành từ các thầy cô và các bạn để đề tài đƣợc hoàn thiện hơn.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, tháng 5 năm 2017
Sinh viên
Ngọ Mạnh Hùng

ii

DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1. Dụng cụ và hóa chất ..............................................................................22
Bảng 4.1. Kết quả nghiên cứu sự ảnh hƣởng của môi trƣờng nền đến sự sinh
trƣởng và phát triển của cây Sâm Nam Núi Dành .................................30
Bảng 4.2. Kết quả nghiên cứu sự ảnh hƣởng của BAP đến khả năng nhân
nhanh chồi Sâm Nam Núi Dành ............................................................32
Bảng 4.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của αNAA đến sự hình thành rễ của
chồi Sâm Nam Núi Dành .......................................................................34
Bảng 4.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của αNAA và IBA đến sự hình thành
rễ của chồi Sâm Nam Núi Dành ............................................................35
Bảng 4.5. Kết quả nghiên cứu sự ảnh hƣởng của 2,4-D đến sự phát sinh hình
thái của lớp mỏng tế bào mô lá Sâm Nam Núi Dành ............................37


iii

DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1:

Cây Sâm Nam Núi Dành .........................................................................5

Hình 2.2.

Sơ đồ quá trình phân hóa và phản phân hóa của tế bào thực vật ...........14

Hình 3.1: Sơ đồ nghiên cứu ảnh hƣởng đến khả năng, tái sinh chồi, nhân nhanh

chồi và ra rễ . .........................................................................................24
Hình 4.1:

Chồi Sâm Nam phát triển trên các nền môi trƣờng ...............................31

Hình 4.2:

Sự ảnh hƣởng của BAP đến khả năng nhân nhanh chồi Sâm Nam
Núi Dành ................................................................................................33

Hình 4.3:

Ảnh hƣởng của αNAA đến sự hình thành rễ của chồi Sâm Nam Núi
Dành .......................................................................................................35

Hình 4.4:

Ảnh hƣởng của αNAA và IBA đến sự hình thành rễ của chồi Sâm
Nam Núi Dành .......................................................................................36

Hình 4.4:

Sâm Nam Núi Dành khi đƣa ra vƣờn ƣơm ............................................37

Hình 4.5:

Ảnh hƣởng của 2,4-D đến sự phát sinh hình thái của lớp mỏng tế
bào mô lá Sâm Nam Núi Dành ..............................................................38

iv

DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT
BA

: 6-Benzylaminopurine

GA3

: Gibberellic Acid

IBA

: Indole butyric acid

MS

: Murashige & Skoog (1962)

CS

: Cộng sự

CT

: Công thức

CV

: Coeficient of Variation

Đ/C

: Đối chứng

LSD

: Least Singnificant Difference Test

MS

: Murashige & Skoog (1962)

MT

: Môi trƣờng

NAA

: α-Naphthalene acetic acid

WHO

: World Health Organization


v

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................. i

DANH MỤC BẢNG .................................................................................................. ii
DANH MỤC HÌNH .................................................................................................. iii
DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT ......................................................... iv
MỤC LỤC ...................................................................................................................v
PHẦN 1: MỞ ĐẦU .....................................................................................................1
1.1. Đặt vấn đề ............................................................................................................1
1.2. Tính cấp thiết của đề tài .......................................................................................2
1.3. Mục tiêu và yêu cầu của đề tài .............................................................................3
1.3.2. Yêu cầu đề tài ....................................................................................................3
1.4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn..............................................................................3
1.4.1. Ý nghĩa khoa học ..............................................................................................3
1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn ...............................................................................................3
PHẦN 2: TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU ..........................................4
2.1 Giới thiệu về cây Sâm Nam Núi Dành..................................................................4
2.1.1 Nguồn gốc ..........................................................................................................4
2.2. Giá trị của cây Sâm Nam .....................................................................................7
2.2.1. Giá trị dƣợc liệu ................................................................................................7
2.3. Phƣơng pháp nhân giống cây Sâm Nam Núi Dành .............................................7
2.3.1. Phƣơng pháp nhân giống truyền thống .............................................................7
2.3.2. Phƣơng pháp nhân giống bằng công nghệ sinh học ..........................................7
2.3.4. Các bƣớc chính trong nhân giống vô tính in vitro ............................................8
2.3.5. Các phƣơng thức nhân giống vô tính in vitro ...................................................9
2.3.6. Ý nghĩa nhân giống cây trồng bằng phƣơng pháp nuôi cấy mô, tế bào..........10
2.4. Ứng dụng công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật trong nhân nhanh giống cây
trồng ..........................................................................................................................12
2.4.1. Cơ sở khoa học của kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào thực vật .............................13
2.4.2. Điều kiện và môi trƣờng nuôi cấy tế bào thực vật ..........................................15


vi

PHẦN 3: ĐỐI TƢỢNG, PHẠM VI, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU ..........................................................................................................................22
3.1. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu ......................................................................22
3.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu......................................................................................22
3.1.2. Phạm vi nghiên cứu .........................................................................................22
3.2. Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu ......................................................22
3.3. Hóa chất và bị sử dụng .......................................................................................22
3.3.1. Hóa chất sử dụng .............................................................................................22
3.3.2. Thiết bị sử dụng ..............................................................................................23
3.4. Nội dung nghiên cứu ..........................................................................................23
3.4.1. Nội dung 1: .....................................................................................................23
3.4.2. Nội dung 2: .....................................................................................................23
3.4.3. Nội dung 3: .....................................................................................................23
3.4.4. Nội dung 4: .....................................................................................................23
3.4.5. Nội dung 5: .....................................................................................................23
3.5. Phƣơng pháp nghiên cứu và các chỉ tiêu theo dõi..............................................23
3.5.1. Chuẩn bị môi trƣờng nuôi cấy in vitro ............................................................23
3.5.2. Phƣơng pháp nghiên cứu.................................................................................24
3.5.3. Phƣơng pháp bố trí thí nghiệm........................................................................24
3.6. Phƣơng pháp xử lí số liệu...................................................................................29
PHẦN 4: KẾT QUẢ ĐẠT ĐƢỢC............................................................................30
4.1. Kết quả nghiên cứu sự ảnh hƣởng của một số môi trƣờng nền đến sự sinh
trƣởng và phát triển của cây Sâm Nam Núi Dành ....................................................30
4.2. Kết quả nghiên cứu sự ảnh hƣởng của BAP đến khả năng nhân nhanh chồi Sâm
Nam Núi Dành ..........................................................................................................32
4.3. Nghiên cứu ảnh hƣởng của αNAA đến sự hình thành rễ của chồi Sâm Nam Núi
Dành ..........................................................................................................................34
PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................................39
5.1. Kết luận ..............................................................................................................39

vii

TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................41
I. Tài liệu Tiếng Việt .................................................................................................41
II. Tài liệu Tiếng Anh................................................................................................42
III. Nguồn khác .........................................................................................................43


1

PHẦN 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Trong dân gian, Sâm là tên gọi khái quát chỉ một số loài cây mà củ và rễ
đƣợc sử dụng làm thuốc từ rất lâu đời tại nhiều nƣớc châu Á. Chính vì vậy, có rất
nhiều loài sâm thuộc nhiều chi, họ khác nhau nhƣng chủ yếu là các loài thuộc chi
Sâm (Panax). Rất nhiều loại củ sâm có hình dáng hao hao giống hình ngƣời, đặc
biệt là nhân sâm, do đó một số vị thuốc khác không thuộc chi, họ sâm nhƣng có
hình dáng củ tƣơng tự cũng thƣờng đƣợc gọi là sâm. Thêm vào đó, sâm là một vị
thuốc bổ nên nhiều vị thuốc khác có tác dụng bổ cũng đƣợc gọi là sâm hoặc gắn với
chữ sâm. Ở Việt Nam có nhiều loại thảo dƣợc có tên sâm đƣợc sử dụng từ rất lâu
đời nhƣng với công dụng khác nhau.
Sâm Nam Núi Dành - một loại sâm quý là sản vật tiến vua trong các triều đại
phong kiến xƣa, hiện đang đƣợc nhân dân trong vùng thƣờng dùng trong các bài
thuốc dân gian có thể chữa đƣợc rất nhiều bệnh. Trong sách “Đại Nam nhất thống
chí” có ghi: “Tên nỏ sản xuất tại Yên Thế. Cát sâm sẵn ở đỉnh núi Chung Sơn…”.
Núi Chung Sơn đƣợc nhắc tới đó là núi Dành thuộc 2 xã Việt Lập và Liên Chung,
huyện Tân Yên, tỉnh Bắc Giang. Ngoài tên Sâm Nam Núi Dành, cây sâm này còn

có tên gọi khác là Cát sâm hay Sâm Bảo Sơn (Kim Sa, 2012).
Sâm Nam Núi Dành là một đối tƣợng chƣa đƣợc nghiên cứu nhiều ở Việt
Nam. Phân bố khá nhiều ở vùng Đông Bắc và bao gồm nhiều loại: nhƣ 3 lá, 5 lá,
hay củ dài và củ tròn. Sâm Nam có 2 loại là vị sâm ngọt và vị sâm đắng. Trong các
loại Sâm Nam phân bố ở vùng Đông Bắc, Sâm Nam Núi Dành có lẽ là tốt nhất và
đƣợc nhắc đến nhiều nhất, không chỉ trong dân gian mà còn đi vào lịch sử.
Tuy nổi tiếng là vậy nhƣng đến bây giờ, rất ít ngƣời đƣợc trực tiếp nhìn thấy
Sâm Nam Núi Dành. Nguyên nhân dẫn đến sƣ cạn kiệt nguồn gen quý này là do cây
Sâm Nam Núi Dành rất khó nhân giống. Hạt không nảy mầm trong điều kiện tự
nhiên, nhân giống vô tính cũng khó khăn.


2

Qua quan sát điều tra của Trung tâm thực nghiệm Sinh học Nông nghiệp
Công nghệ cao – Viện Di truyền Nông nghiệp năm 2015, có rất nhiều cây mà ngƣời
dân địa phƣơng gọi chung là Sâm Nam, nhƣng theo điều tra thực tế thì các cây Sâm
này đều có những đặc điểm khác nhau về: thân, lá, hƣơng vị củ. Dựa vào đặc điểm
của cây Sâm Nam Núi Dành ngƣời dân địa phƣơng cung cấp thì củ sâm có lớp vỏ
bên ngoài cứng, bên trong lõi màu vàng nhạt, mùi thơm dịu và có vị hơi ngọt. Do
chƣa đƣợc nghiên cứu nhiều ở Việt Nam nên việc tiếp cận các kết quả nghiên cứu
trong nƣớc là vô cùng hạn chế. Thêm vào đó, bản thân cây Sâm Nam Núi Dành
cũng chƣa đƣợc phân loại thực vật. Tuy nhiên, việc nhân giống Sâm Nam Núi Dành
trong tự nhiên gặp rất nhiều khó khăn, hầu hết các hạt đem gieo đều không nảy
mầm, khi giâm cành cho tỷ lệ sống thấp, lại là giống sâm quý bị nhiều ngƣời săn
tìm. Do đó, Sâm Nam Núi Dành còn lại rất ít và đang đứng trƣớc nguy cơ bị tuyệt
chủng. Xuất phát từ những yêu cầu thực tiễn đó, tôi đã tiến hành đề tài: “Nghiên
cứu môi trường thích hợp để nhân nhanh giống Sâm Nam Núi Dành bằng
phương pháp in vitro”. nhằm góp phần xây dựng quy trình nhân nhanh cây giống,
bảo tồn và phát triển giống cây quý này.

1.2 . Tính cấp thiết của đề tài
Ở Việt Nam, chi Sâm có khoảng 10 loại có giá trị cao, trong đó có 1 trong 2
loại đƣợc trồng phổ biến ở Việt Nam để sản xuất dƣợc liệu. Hiện nay, nghiên cứu
trong lĩnh vực nhân giống và trồng trọt các loài Sâm ở Việt Nam vẫn chƣa đƣợc
quan tâm nhiều. Trong khi đó, hàng năm Việt Nam vẫn phải mua sâm và các thực
phẩm liên quan đến sâm của các nƣớc khác để phục vụ cho công nghệ thực phẩm,
nhiều sản phẩm thực phẩm chức năng...
Hiện nay có nhiều giống sâm đã đƣợc du nhập vào nƣớc ta, mang nhiều giá
trị về mặt dinh dƣỡng và y học cao. Tuy nhiên có giá thành rất cao, khó đến với các
thành phần có mức thu nhập trung bình – thấp.
Trƣớc tình hình đó, việc tìm ra biện pháp nhân giống cây Sâm Nam sạch bệnh, có
chất lƣợng tốt là cần thiết. Và thế là một phƣơng pháp nhân giống mới đƣợc áp dụng, đó
là phƣơng pháp nuôi cấy mô. Phƣơng pháp này làm cho cây tăng thêm cả về số lƣợng
lẫn chất lƣợng, tạo ra một số lƣợng trong thời gian ngắn và cây sạch bệnh.


3

1.3. Mục tiêu và yêu cầu của đề tài
1.3.1. Mục tiêu đề tài
- Nghiên cứu thăm dò đƣợc khả năng nhân giống của Sâm Nam trong từng
loại môi trƣờng từ đó tìm ra đƣợc môi trƣờng thích hợp nhân nhanh giống và có
hiệu quả cao.
- Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân nhanh cây giống Sâm Nam Núi Dành
bằng phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật.
1.3.2. Yêu cầu đề tài
- Tạo đƣợc nguồn vật liệu ban đầu (tạo cây in vitro sạch bệnh).
- Xác định đƣợc phƣơng thức và môi trƣờng nuôi cấy phù hợp trong giai đoạn
nhân nhanh chồi.
- Xác định đƣợc ảnh hƣởng của chất kích thích sinh trƣởng đến khả năng nhân

nhanh chồi.
- Xác định môi trƣờng phù hợp trong giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh.
1.4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
1.4.1. Ý nghĩa khoa học
Quá trình nghiên cứu sẽ đánh giá đƣợc ảnh hƣởng của một số auxin và
cytokinin đến khả năng tạo chồi nách và ra rễ cây Sâm Nam.
Kết quả đề tài góp phần bổ sung quy trình nuôi cấy in vitro đối với nhân giống
và bảo tồn loài Sâm Nam.
Hoàn thiện quy trình nuôi cấy in vitro đối với nhân giống và bảo tồn loài
Sâm Nam.
Cung cấp tài liệu tham khảo, nghiên cứu cho sinh viên, giúp sinh viên hoàn
thiện cả về kiến thức lý thuyết lẫn thực tiễn.
1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn
Kết quả đề tài góp phần nhân nhanh tạo số lƣợng lớn cây giống phục vụ mục
tiêu bảo tồn loài dƣợc liệu quý.
Phục vụ trực tiếp cho các ngành lâm nghiệp, công nghệ thực phẩm, công nghệ
sinh học, đảm bảo chất lƣợng cung cấp nguyên liệu cho ngành y dƣợc.


4

PHẦN 2
TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

2.1 Giới thiệu về cây Sâm Nam Núi Dành
2.1.1 Nguồn gốc
Thông thƣờng, để có thể có đƣợc phƣơng pháp nghiên cứu cũng nhƣ cách
tiếp cận hợp lý nhằm xây dựng đƣợc quy trình nhân giống in vitro thì việc tham
khảo các công trình công bố có liên quan là vô cùng quan trọng. Tuy nhiên, Sâm
Nam Núi Dành là một đối tƣợng chƣa đƣợc nghiên cứu ở Việt Nam. Chính vì vậy,

việc tiếp cận các kết quả nghiên cứu trong nƣớc là vô cùng hạn chế.
Thêm vào đó, bản thân cây Sâm Nam Núi Dành cũng chƣa đƣợc phân loại
thực vật. Do vậy, việc định hƣớng các tài liệu tham khảo trong và ngoài nƣớc càng
thêm khó khăn. Trƣớc tình hình đó, chúng tôi tiến hành điều tra và sơ bộ phân loại
thực vật cây Sâm Nam Núi Dành nhằm mục đích định hƣớng nghiên cứu cho có
hiệu quả hơn.
Sâm Nam Núi Dành là một đối tƣợng chƣa đƣợc nghiên cứu nhiều ở Việt
Nam. Theo sách đỏ Việt Nam (2007) đang trong tình trạng sẽ bị nguy cấp bởi nơi
cƣ trú của chúng bị thu hẹp do rừng thƣờng xuyên bị chặt phá, cùng với việc bị khai
thác quá nhiều không kiểm soát để sử dụng, và việc nhân giống khó khăn nên dẫn
đến cạn kiệt. Để phục vụ nghiên cứu bảo tồn loài này chúng tôi tiến hành đánh giá
sơ bộ để xác định danh pháp “ Sâm Nam Núi Dành ”.
Bằng phƣơng pháp so sánh đặc điểm hình thái thực vật, xác định khu vực
phân bố. Kết quả cho thấy tên khoa học loài Sâm Nam Núi Dành có tên khoa học là:
Callerya speciosa D.T. Kim Cuc.2015; phân bố tại gia đình ông Thân Hải Đăng,
thôn Đồng Sen, xã Việt Lập, huyện Tân Yên, tỉnh Bắc Giang.


5

2.1.2 Phân loại
Giới:

Plantar (Thực vật)

Ngành: Magnoliophyta (Thực vật hạt kín – Ngọc lan)
Lớp:

Magnoliopsida (Thực vật hai lá mầm thực sự - Ngọc lan)

Phân lớp: Rosidae (Hoa hồng)
Bộ:

Fabales (Bộ đậu)

Họ:

Fabaceae (Họ đậu)

Phân họ: Faboideae (Phân họ đậu)
Chi:

Millettia (Chi thàn mát) hoặc Callerya (Chi thàn mát lƣỡng thể)

Hình 2.1: Cây Sâm Nam Núi Dành
2.1.3 Đặc điểm sinh học và phân bố của cây Sâm Nam Núi Dành
* Đặc điểm hình thái
Cây Sâm Nam Núi Dành là cây nhỡ leo, dài 1,5 – 5(m) hay hơn, cành non
phủ lông dày màu nâu nâu.
Lá kép lông chim, lá chét 3 - 7, hình bầu dục dài hay trái xoan, dài 3 - 8(cm),
rộng 1 - 3(cm), mặt trên xanh thẫm, mặt dƣới xanh xám nâu; gân bên 5 - 6, dính
nhau ở gần mép lá (Hình 2.1).
Hoa sâm có màu trắng ngà, mùi thơm nhẹ, mọc thành chùm kép ở đầu cành
tạo thành chùy dài 10 - 20(cm), cuống có lông. Đài 5 mảnh dính với nhau, tràng 5


6

cánh không đều nhau, tiền khai hoa cờ: cánh cờ (ở trên) lớn nhất, có màu sắc đẹp
hơn và ở ngoài cùng, 2 cánh bên nhỏ hơn, trong cùng là 2 cánh thìa dính lại với

nhau ở đáy tạo thành cấu trúc tƣơng tự nhƣ cái thuyền con mang nhị và nhụy. Nhị
10, 9 chiếc dính lại với nhau ở phần chỉ nhị thành 1 bó bao quanh nhụy, 1 chiếc rời.
Bầu nhụy lớn, 1 ô, mang 2 dãy noãn, khi phát triển đƣợc sẽ tạo ra quả.
Quả hình quả đậu dẹt, có lông mềm, hai vỏ của nó có thể tách đôi, bên trong
chứa nhiều hạt trong các khoang riêng rẽ. Hạt không có nội nhũ, phôi cong, 2 lá
mầm dầy và lớn chứa nhiều chất dinh dƣỡng.
Rễ củ nạc, có lớp vỏ bên ngoài hơi cứng, bên trong lõi màu vàng nhạt, mùi
thơm dịu và có vị hơi ngọt.
Công thức hoa: K(5)C5A(9)1G1
* Đặc điểm sinh thái:
Cây sinh trƣởng mạnh trong mùa xuân và mùa hè. Mùa hoa vào tháng 6 - 9,
mùa quả vào tháng 9 - 12. Cây mọc hoang ở vùng rừng núi chỗ dãi nắng, trong rừng
thƣa, trong lùm cây bụi, ở độ cao 100 – 350 (m), thƣờng leo trùm lên những cây bụi
và cây gỗ nhỏ. Theo ngƣời dân ở khu vực Núi Dành kể lại, Sâm Nam Núi Dành tái
sinh chủ yếu bằng chồi sau khi đổ đất vào đốt của thân cây hoặc sau khi cắt lấy rễ
củ, phần gốc lấp đất vào là cây có thể tái sinh. Cây ƣa đất ẩm mát, thành phần cơ
giới trung bình, nhiều mùn, tơi xốp và không chịu đƣợc đất bị úng.
Qua mô tả kết hợp với so sánh hình thái cũng nhƣ tham khảo ý kiến chuyên
gia là những nhà Thực vật học, chúng tôi kết luận cây Sâm Nam Núi Dành là một
loài cây thuộc Họ đậu.
* Phân bố:
Sâm Nam Núi Dành còn có tên gọi khác là Cát sâm hay Sâm Bảo Sơn. Trung
tâm khoa học công nghệ và môi trƣờng huyện Tân Yên (Bắc Giang) đã thực hiện
Đề án để nhân giống loại sâm quý này từ năm 2009 tại chính các gia đình đang sống
ở Núi Dành. Tuy nhiên, hệ số nhân giống rất thấp. Hiện tại (năm 2015), làng Hậu có
khoảng 100 gốc sâm 3 lá và làng Đầm Sen, xã Việt Lập có trên 600 gốc sâm 5 lá.


7

2.2. Giá trị của cây Sâm Nam
2.2.1. Giá trị dược liệu
Theo ngƣời dân ở khu vực Núi Dành thì Sâm Nam Núi Dành đƣợc sử dụng
chủ yếu trong y học cổ truyền làm thuốc bổ mát, chữa nhức đầu, bí đái, ho, sốt…
Củ dùng dƣới dạng tƣơi, ngâm rƣợu hoặc thuốc sắc uống.
2.3. Phƣơng pháp nhân giống cây Sâm Nam Núi Dành
2.3.1. Phương pháp nhân giống truyền thống
-

Gieo hạt

Là phƣơng pháp lấy hạt giống cho nảy mầm thành cây con, hạt giống đƣợc
thu từ quả đã chín, trong điều kiện thích hợp sẽ nảy mầm hình thành cây.
Ƣu điểm: Vận chuyển và bảo quản hạt giống dễ dàng do kích thƣớc hạt
giống nhỏ.
Nhƣợc điểm: Phƣơng pháp này cho hệ số nhân thấp.
-

Tách chồi từ cây mẹ

Là phƣơng pháp cắt cành (ngó) từ củ, đoạn thân cây mẹ để cho tạo thành
những cây mới.
Ƣu điểm: ít tốn thời gian.
Nhƣợc điểm: phƣơng pháp này cho hệ số nhân thấp, cây dễ bị thoái hóa, rễ
cây yếu. Phƣơng pháp này không đảm bảo cây sạch bệnh vì bệnh có thể đƣợc
truyền từ cây mẹ sang.
2.3.2. Phương pháp nhân giống bằng công nghệ sinh học
Nuôi cấy mô, tế bào thực vật là phạm trù khái niệm chung cho tất cả các loại
nuôi cấy nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch các vi sinh vật, trên các môi trƣờng
dinh dƣỡng nhân tạo, trong điều kiện vô trùng, bao gồm:

Nuôi cấy cây non và cây trƣởng thành
Nuôi cấy cơ quan (rễ, thân, lá, hoa, quả, noãn chƣa thụ tinh)
Nuôi cấy phôi (phôi non và phôi trƣởng thành)
Nuôi cấy mô sẹo (callus)
Nuôi cấy tế bào trần (protoplast)


8

Nuôi cấy tế bào đơn (huyền phù tế bào) (Nguyễn Quang Thạch và cs., 2005).
Nuôi cấy mô (nhân giống in vitro)
Nhân giống in vitro là hình thức sử dụng chồi đỉnh, hạt, lá, hoa, cuống lá,
đoạn thân non nuôi dƣỡng trong các điều kiện đặc biệt để hình thành một cơ thể
mới hoàn chỉnh.
Ƣu điểm: Hệ số nhân giống cao, đồng đều, sạch bệnh, chủ động trong việc
sản xuất cây con phục vụ cho công tác giống.
Nhƣợc điểm: Cây con có kích thƣớc nhỏ, xảy ra đột biến biến dị làm xuất
hiện những cây không mong muốn, cần trang thiết bị đặc biệt (Võ Quốc Việt và
CS, 2010).
Ngoài ra, theo Hoàng Ngọc Thuận (2000) việc nuôi cấy in vitro sử dụng
nguồn hydrocacbon nhân tạo do đó mà khả năng tự tổng hợp chất hữu cơ kém,
đồng thời cây nuôi cấy in vitro đƣợc nuôi trong bình thủy tinh có độ ẩm bão hòa, do
vậy mà khi trồng cây ra ngoài điều kiện tự nhiên cây thƣờng bị mất nƣớc, không
thích nghi đƣợc cây dễ bị héo và chết.
2.3.4. Các bước chính trong nhân giống vô tính in vitro
Theo George (1993) quá trình nhân giống vô tính in vitro bao gồm các bƣớc sau:
Bước 1: Chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ
Trƣớc khi tiến hành nhân giống in vitro cần chọn lọc cẩn thận cây mẹ (nguồn
mẫu nuôi cấy). Các cây này cần phải sạch bệnh, đặc biệt là sạch virus và ở giai đoạn
sinh trƣởng mạnh. Việc trồng các cây mẹ trong điều kiện môi trƣờng thích hợp với

chế độ chăm sóc và phòng trừ sâu bệnh hiệu quả trƣớc khi lấy mẫu nuôi cấy sẽ làm
giảm tỷ lệ mẫu nhiễm, tăng khả năng sống và sinh trƣởng của mẫu cấy.
Bước 2: Nuôi cấy khởi động
Là giai đoạn khử trùng và đƣa mẫu vào nuôi cấy in vitro. Các giai đoạn này
cần đảm bảo các yêu cầu sau: tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, mô tồn tại và sinh
trƣởng tốt. Khi lấy mẫu cần chọn đúng loại mô, đúng giai đoạn phát triển của cây.
Mẫu cấy phù hợp nhất là đỉnh chồi ngọn, đỉnh chồi nách sau đó là đỉnh chồi hoa,


9

cuối cùng là đoạn thân, mảnh lá. Ngoài ra, ngƣời ta cũng có thể sử dụng hạt làm
nguồn mẫu để nuôi cấy khởi động tạo cây in vitro.
Bước 3: Nhân nhanh
Là giai đoạn kích thích mô nuôi cấy phát sinh hình thái và tăng nhanh số
lƣợng thông qua các con đƣờng: hoạt hóa chồi nách, tạo chồi bất định hay tạo phôi
vô tính. Chúng ta cần phải xác định đƣợc môi trƣờng và điều kiện ngoại cảnh thích
hợp để có hiệu quả cao nhất. Theo nguyên tắc chung: môi trƣờng có nhiều
cytokinin sẽ kích thích tạo chồi. Nhiệt độ nuôi cấy thƣờng là 25 - 27oC thời gian
chiếu sáng 16 giờ/ngày với cƣờng độ ánh sáng 2000 - 4000(lux). Tuy nhiên, đối với
mỗi loại đối tƣợng nuôi cấy đòi hỏi có chế độ ánh sáng nuôi cấy khác nhau.
Bước 4: Tạo cây in vitro hoàn chỉnh
Để tạo rễ cho chồi ngƣời ta chuyển chồi từ môi trƣờng nhân nhanh sang môi
trƣờng tạo rễ. Một số chồi có thể phát sinh rễ ngay sau khi chuyển từ môi trƣờng
nhân nhanh giàu cytokinin sang môi trƣờng không chứa chất kích thích sinh trƣởng.
Bước 5: Thích ứng cây in vitro ngoài điều kiện tự nhiên
Để đƣa cây từ ống nghiệm ra vƣờn ƣơm với tỷ lệ sống cao, cây sinh trƣởng
tốt cần đảm bảo yêu cầu sau: Cây trong ống nghiệm đã đạt những tiêu chuẩn hình
thái nhất định (số lá, số rễ, chiều cao cây, khối lƣợng tƣơi); có giá thể tiếp nhận cây
in vitro thích hợp, giá thể sạch, tơi xốp, thoát nƣớc; có thể chủ động điều chỉnh

đƣợc độ ẩm, sự chiếu sáng vƣờn ƣơm cũng nhƣ có chế độ dinh dƣỡng phù hợp
(Nguyễn Quang Thạch và cs., 2005; Lê Văn Hoàng, 2007).
2.3.5. Các phương thức nhân giống vô tính in vitro
Quá trình thực hiện nhân giống in vitro sẽ tạo ra các dòng vô tính. Theo khái
niệm chung về dòng vô tính trong chọn giống thì dòng vô tính là một nhóm cá thể
có kiểu gen tƣơng tự nhau, chúng đƣợc nhân bằng sinh sản vô tính. Các dòng vô
tính này có thể đƣợc tạo ra theo các phƣơng thức sau:
* Tái sinh cây trực tiếp
Là quá trình phát động những điểm tồn tại sẵn có trong mô nuôi cấy phân
chia và tái sinh thành cây. Xét về nguồn gốc các cây này có thể phát sinh từ chồi


10

đỉnh, chồi nách phá ngủ hoặc từ chồi mới phát sinh (Bhojwani, 1980). Các cây con
này đƣợc phát sinh từ các đỉnh sinh trƣởng có bộ nhiễm sắc thể 2n, hoàn toàn đồng
nhất về mặt di truyền và duy trì đƣợc các tính trạng của cây mẹ. Tái sinh trực tiếp
cũng có thể xuất phát từ những tế bào không nằm trên đỉnh sinh trƣởng đó là các
đoạn thân, mảnh lá, cuống lá, mảnh hoa… Trong trƣờng hợp này, các tế bào thƣờng
phân chia nhƣng không hình thành các tế bào mô sẹo mà tạo thành các điểm sinh
trƣởng phụ sau đó tái sinh thành cây con. Xác suất biến dị và đột biến thƣờng cao
hơn so với tái sinh từ đỉnh sinh trƣởng (Đỗ Năng Vịnh, 2002).
* Tái sinh gián tiếp
Mẫu cấy khi nuôi cấy trong môi trƣờng thích hợp có chứa auxin và cytokinin
có thể đem lại sự gia tăng thành khối tế bào không tổ chức. Đó chính là các tế bào
mô sẹo. Sự tăng sinh của các tế bào callus có thể đƣợc duy trì nhiều hay ít là không
hạn định, chỉ cần mô sẹo đƣợc cấy chuyển sang môi trƣờng mới theo chu kỳ. Tuy
nhiên, tế bào mô sẹo khi cấy chuyển nhiều lần sẽ không ổn định về mặt di truyền.
Để tránh tình trạng này nên sử dụng các loại mô sẹo vừa mới phát sinh. Nuôi cấy
mô sẹo có vai trò vô cùng quan trọng trong công nghệ sinh học thực vật. Tỷ lệ auxin

và cytokinin trong môi trƣờng có thể dẫn tới sự phát triển của ngọn, rễ hay phôi
soma. Từ đó có thể tạo thành cây hoàn chỉnh. Nuôi cấy mô sẹo cũng có thể đƣợc sử
dụng để mở đầu nuôi cấy tế bào dịch huyền phù hay tạo ra hạt nhân tạo.
Để có thể thực hiện nuôi cấy có kết quả tốt, dù bằng con đƣờng nào đi chăng
nữa cũng cần chú ý tới các yếu tố ảnh hƣởng tới nuôi cấy; vì chính các yếu tố này
quyết định đƣờng hƣớng vô tính cũng nhƣ chất lƣợng của cây giống thu đƣợc.
2.3.6. Ý nghĩa nhân giống cây trồng bằng phương pháp nuôi cấy mô, tế bào
Nuôi cấy mô, tế bào thực vật là phƣơng pháp nhân giống vô tính. Đối với
nhiều loài thực vật quý hiếm, có giá trị kinh tế và ý nghĩa sinh học cao mà gặp khó
khăn trong vấn đề nhân giống hữu tính thì nhân giống vô tính in vitro là công cụ vô
cùng hữu ích.
Trên thực tế, nhiều loài thực vật nhân giống hữu tính bằng hạt có hệ số nhân
cao nhƣng vẫn tiến hành nhân giống vô tính in vitro; vì khi nhân giống bằng hạt sẽ


11

cho ra các cây con không hoàn toàn giống bố mẹ cả về hình thái và khả năng tích
lũy các thành phần hoá học (Bammi and Randhava, 1975). Sự không đồng nhất này
gây ra khó khăn trong việc đƣa cây vào sản xuất theo dây truyền công nghiệp; vì
các cây có chất lƣợng sản phẩm không đồng đều, làm giảm giá trị thƣơng phẩm.
Đặc biệt, đối với cây thuốc thì việc không đồng nhất về chất lƣợng (hàm lƣợng các
chất hoạt tính) sẽ dẫn đến hậu quả là nguyên liệu không ổn định, không đáp ứng
đƣợc nhu cầu sản xuất. Ví dụ: Đối với các cây lấy tinh dầu, việc nhân giống bằng
hạt dẫn tới sự phân ly không đều về hàm lƣợng các thành phần hoạt chất. Cây cọ
dầu khi nhân giống bằng hạt, hàm lƣợng tinh dầu ở cây con phân ly từ 0,5% đến
11,3%, hàm lƣợng lynalyl acetat từ 11% đến 78%; cây bạc hà nhân giống hữu tính
có sự phân ly rất lớn về hàm lƣợng và thành phần tinh dầu (Staritsky, 1970).
Đối với nhiều cây dƣợc liệu, việc nhân giống hữu tính gặp khó khăn nhƣ ô dầu,
bạch thƣợc có hạt nảy mầm chậm; đan sâm thì hạt chín không đều và thời gian nảy

mầm kéo dài, gây khó khăn cho việc sản xuất đại trà. Các cây tam thất, nhân sâm,
hoàng liên phải sử dụng hạt tƣơi mới nảy mầm nên thu hoạch đến đâu cần gieo ngay
đến đó, gây nhiều khó khăn cho sản xuất… (Đỗ Huy Bích và Bùi Xuân Chƣơng,
1980). Mặt khác, phƣơng pháp nhân giống truyền thống (chiết, giâm, ghép) vẫn còn
nhiều nhƣợc điểm nhƣ sự lây nhiễm bệnh qua nguyên liệu rất phổ biến và phức tạp,
hệ số nhân thấp: xuyên khung 2 - 5 cây/cây mẹ (Đỗ Huy Bích và Bùi Xuân Chƣơng,
1980), chuối là 2 - 3 cây/cây mẹ (Đoàn Thị Ái Thuyền và cs., 1993).
Hơn nữa, việc sử dụng chính các bộ phận làm thuốc để nhân giống rất lãng
phí, tốn kém.
Để khắc phục những nhƣợc điểm trên, nhân giống cây trồng bằng phƣơng
pháp nuôi cấy mô, tế bào đã mang lại nhiều hiệu quả kinh tế và ý nghĩa sinh học to
lớn thực sự. Việc sử dụng các mô nuôi cấy có kích thƣớc nhỏ làm cho mô nuôi cấy
dễ phân hóa và dễ tái sinh hơn. Kỹ thuật nhân nhanh in vitro có những ƣu việt mà
các phƣơng pháp khác không có đƣợc: Có thể nhân giống cây trồng ở quy mô công
nghiệp (kể cả trên các đối tƣợng khó nhân bằng phƣơng pháp thông thƣờng), hệ số
nhân rất cao và cho các cá thể hoàn toàn đồng nhất về mặt di truyền.


12

Kỹ thuật nhân nhanh in vitro có thể đƣợc ứng dụng vào các mục đích nhƣ duy
trì và nhân nhanh các kiểu gen quý làm vật liệu cho công tác giống; nhân nhanh các
loài hoa, cây cảnh khó trồng bằng hạt; duy trì và nhân nhanh các dòng bố mẹ và các
dòng lai để tạo hạt giống cây rau, cây hoa và cây trồng khác; nhân nhanh kết hợp
làm sạch virus; bảo quản tập đoàn gene (Nguyễn Quang Thạch và cs., 2005).
2.4. Ứng dụng công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật trong nhân nhanh giống
cây trồng
Khi lĩnh vực sản xuất giống cây trồng đƣợc thực hiện trên quy mô công
nghiệp thì phƣơng pháp nhân giống in vitro ngày càng đƣợc khai thác và sử dụng
một cách triệt để. Có rất nhiều loại cây trồng nói chung và cây thuốc nói riêng đƣợc

nhân nhanh bằng phƣơng pháp này. Thí dụ: Sử dụng chồi nách để nhân có thể tạo ra
26 vạn cây cam thảo trong năm tháng chỉ từ một lát cắt ban đầu (Chaturvedi and
Sinha, 1979). Ở Việt Nam, đối với khoai tây đã đạt đƣợc hệ số nhân 532 trong vòng
1 năm (Mai Thị Tân và cs., 1993); hệ số nhân giống của cây hà thủ ô đỏ là 105/
năm; cây trinh nữ hoàng cung có hệ số nhân giống vô tính truyền thống là 6 - 7
cây/năm nhƣng khi nhân bằng phƣơng pháp in vitro thì hệ số này có thể lên tới 2 x
35 cây từ một lát cắt của củ giống (Tạ Nhƣ Thục Anh, 2002). Đặc biệt, cây cọ dầu
thƣờng phải mất 10 - 15 năm mới cho quả thu hoạch và nhân giống từ hạt, nhƣng
khi áp dụng nhân nhanh in vitro cho đối tƣợng này, ngƣời ta có thể cung cấp đƣợc
500.000 cây con giống hệt nhau trong vòng một năm (Staritsky, 1970).
Trong công tác giống cây trồng, vấn đề đƣợc quan tâm hàng đầu là chất
lƣợng và số lƣợng giống. Bằng phƣơng pháp nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng, ngƣời ta đã
tạo ra đƣợc những giống cây hoàn toàn sạch virus. Limasset và Cornel đã chứng
minh đƣợc rằng nồng độ virus trong thực vật giảm dần ở bộ phận gần đỉnh sinh
trƣởng (Limasset and Cornel, 1949), riêng đỉnh sinh trƣởng thì hoàn toàn sạch virus
(Morel and Martin, 1952). Nguyên nhân của hiện tƣợng này là đỉnh sinh trƣởng
không có hệ thống mô dẫn làm cho virus và vi sinh vật không có khả năng xâm
nhập; đỉnh sinh trƣởng là nơi sinh tổng hợp của auxin nên hàm lƣợng auxin khá cao,


13

auxin có tác dụng ức chế sinh sản của virus; quá trình phân chia tế bào phôi sinh
(đỉnh sinh trƣởng) không kéo theo sự phân chia của virus.
Nuôi cấy mô tế bào có thể đƣợc dùng để phục tráng, làm sạch bệnh và nhân
nhanh theo các hƣớng vi nhân giống, sản xuất hạt giống nhân tạo. Qua nuôi cấy in
vitro, tế bào đƣợc trẻ hoá do vậy có thể tạo đƣợc những cây con có tuổi sinh lý trẻ
hơn, làm sức sống của cây trồng tăng lên, dẫn đến tăng năng suất và chất lƣợng sản
phẩm (Murashige, 1980). Những kỹ thuật này ở nƣớc ngoài đã đƣợc áp dụng trên
nhiều loại cây trồng nhƣ cây thuốc địa hoàng ở Trung Quốc, Hàn Quốc; bạch truật ở

Nhật Bản…
Tóm lại, phƣơng pháp nhân giống in vitro với các ƣu thế về hệ số nhân
giống, tiềm năng công nghiệp hoá cao và tính khả thi rộng đã thực sự trở thành công
cụ cần thiết trong công tác giống cây trồng.
2.4.1. Cơ sở khoa học của kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào thực vật
- Tính toàn năng của tế bào
Năm 1902, Haberlandt đã đƣa ra giả thuyết về tính toàn năng của tế bào thực
vật. Ông cho rằng tất cả các tế bào đều có tính toàn năng (totipotency), nghĩa là mỗi
tế bào đều mang toàn bộ lƣợng thông tin di truyền của cơ thể và có khả năng phát
triển thành một cơ thể hoàn chỉnh khi gặp điều kiện thuận lợi.
Đến năm 1922, Kotte và Robbins đã nuôi đƣợc đỉnh sinh trƣởng từ đầu rễ
của một cây hòa thảo trong 12 ngày. Nhƣ vậy, lần đầu tiên tính toàn năng của tế bào
đƣợc chứng minh bằng thực nghiệm. Từ đó đến nay, rất nhiều công trình nghiên
cứu đã tạo đƣợc cây hoàn chỉnh từ một tế bào riêng lẻ, một khối mô hay một phần
của cơ quan. Điều đó khẳng định tính toàn năng của tế bào thực vật là cơ sở khoa
học của nuôi cấy mô, tế bào thực vật.
- Sự phân hóa và phản phân hóa của tế bào
Biệt hóa (phân hóa) là sự biến đổi của tế bào từ trạng thái tế bào phôi cho
đến khi thể hiện một chức năng nào đó.


14

Các tế bào dùng trong môi trƣờng nuôi cấy đều đã biệt hóa về cấu trúc và
chức năng. Trong những điều kiện thích hợp, có thể làm cho những tế bào này trở
lại trạng thái của tế bào đầu tiên đã sinh ra chúng – tế bào phôi và quá trình đó gọi
là phản phân hóa.

Hình 2.2. Sơ đồ quá trình phân hóa và phản phân hóa của tế bào thực vật
Trong cùng một cơ thể, mỗi tế bào đều có khả năng phân hoá, phản phân

hoá và vì thế triển vọng nuôi cấy thành công cũng khác nhau. Những tế bào càng
chuyên hoá về một chức năng nào đó (đã biệt hoá sâu) thì càng khó xảy ra quá
trình phản phân hoá và ngƣợc lại, nhƣ các tế bào mạch dẫn ở thực vật, tế bào thần
kinh ở động vật. Ngƣời ta đã chứng minh rằng: các tế bào càng gần trạng thái của
tế bào phôi bao nhiêu thì khả năng nuôi cấy thành công càng cao bấy nhiêu.
Sự phân hoá và phản phân hoá tế bào là một quá trình hoạt hoá, ức chế hoạt
động của gene. Trong một giai đoạn phát triển nhất định của cây, một gene nào đó
đang ở trạng thái ức chế không hoạt động đƣợc hoạt hoá để cho một tính trạng
mới. Ngƣợc lại một số gene lại bị ức chế đình chỉ hoạt động. Quá trình hoạt hoá,
ức chế diễn ra theo một chƣơng trình đã đƣợc lập sẵn trong cấu trúc hệ gene của tế
bào, giúp cho sự sinh trƣởng, phát triển của cơ thể thực vật đƣợc hài hoà. Khi tách
riêng từng tế bào hoặc làm giảm kích thƣớc khối mô sẽ tạo điều kiện cho việc hoạt
hoá các gene của tế bào.
Kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào thực vật là kỹ thuật điều khiển sự phát sinh
hình thái của tế bào thực vật một cách có định hƣớng dựa vào sự phân hoá và phản


15

phân hoá của tế bào thực vật để điều khiển sự phát sinh hình thái của tế bào, ngƣời
ta bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy hai nhóm chất kích thích sinh trƣởng thực vật
chính là auxin và cytokinin. Tỷ lệ hàm lƣợng của hai nhóm chất kích thích sinh
trƣởng này của mô nuôi cấy khác nhau tuỳ từng mục đích nghiên cứu (phát sinh
chồi, rễ hoặc mô sẹo).
2.4.2. Điều kiện và môi trường nuôi cấy tế bào thực vật
Môi trƣờng nuôi cấy là điều kiện tối cần thiết, là yếu tố quyết định cho sự
phân hoá tế bào và cơ quan nuôi cấy.
Nghiên cứu về môi trƣờng nuôi cấy giữ một vị trí quan trọng trong lịch sử
phát triển nuôi cấy mô, tế bào thực vật. Vào thời kì Haberlandt tiến hành các thí
nghiệm nuôi cấy tế bào biệt lập, hiểu biết về nhu cầu dinh dƣỡng khoáng còn hạn

chế, đặc biệt là vai trò của các chất kích thích sinh trƣởng hầu nhƣ chƣa đƣợc
khám phá. Chính vì vậy mà Haberlandt đã không thành công.
2.4.2.1 Điều kiện nuôi cấy mô tế bào thực vật
a) Điều kiện vô trùng
Nuôi cấy in vitro là nuôi cấy trong điều kiện vô trùng. Nếu không đảm bảo điều
kiện vô trùng mẫu nuôi cấy, môi trƣờng hoặc thao tác nuôi cấy sẽ bị nhiễm. Điều kiện vô
trùng có ý nghĩa quyết định đến sự thành bại của nuôi cấy mô in vitro.
Phƣơng pháp vô trùng vật liệu thông dụng nhất hiện nay là dùng các chất
hoá học, tia UV có khả năng diệt nấm và vi khuẩn.
Vô trùng ban đầu là một thao tác khó và là khâu đầu tiên có ý nghĩa quyết định.
Việc lựa chọn chất khử trùng, thời gian khử trùng, nồng độ chất khử trùng thích hợp sẽ
mang lại hiệu quả vô trùng mẫu tốt, tỷ lệ sống cao. Thông thƣờng hay sử dụng một số
hoá chất nhƣ: cồn 700, NaOCl, Ca(OCl)2, HgCl2 (0,1%), … để khử trùng.
b) Điều kiện ánh sáng, nhiệt độ, pH
- Ánh sáng
Sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy chịu ảnh hƣởng từ các yếu tố nhƣ:
thời gian chiếu sáng, cƣờng độ ánh sáng và chất lƣợng ánh sáng. Thời gian chiếu
sáng tác động đến quá trình phát triển của mô nuôi cấy. Thời gian chiếu sáng
thích hợp với đa số các loài cây là 12-18h/ngày.


16

Cƣờng độ ánh sáng tác động đến sự phát sinh hình thái mô nuôi cấy.
Theo Ammirato (1986): Cƣờng độ ánh sáng cao kích thích sự sinh trƣởng
của mô sẹo. Ngƣợc lại, cƣờng độ ánh sáng thấp kích thích sự tạo chồi. Nhìn
chung cƣờng độ ánh sáng thích hợp cho mô nuôi cấy là 1000 - 7000(lux), ngoài
ra chất lƣợng ánh sáng cũng ảnh hƣởng tới sự phát sinh hình thái của mô thực
vật in vitro: Ánh sáng đỏ làm tăng chiều cao của thân chồi hơn so với ánh sáng
trắng. Nếu mô nuôi cấy trong ánh sáng xanh thì sẽ ức chế vƣơn cao nhƣng lại có

ảnh hƣởng tốt tới sự sinh trƣởng của mô sẹo. Hiện nay trong các phòng thí
nghiệm nuôi cấy mô để cung cấp nguồn ánh sáng có cƣờng độ 2000 - 2500(lux)
ngƣời ta sử dụng các đèn huỳnh quang đặt cách bình nuôi cấy từ 35 – 40(cm).
- Nhiệt độ
Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, nhiệt độ là nhân tố quan trọng ảnh
hƣởng tới sự phân chia tế bào và các quá trình sinh hoá trong cây. Tuỳ thuộc vào
xuất xứ của mẫu nuôi cấy mà điều chỉnh nhiệt độ cho phù hợp. Nhìn chung nhiệt
độ thích hợp nhất cho sự sinh trƣởng tốt ở nhiều loài cây là 25±2 0C.
- pH
pH của môi trƣờng là một yếu tố quan trọng. Sự ổn định của pH môi
trƣờng là yếu tố duy trì trao đổi chất trong tế bào. pH của đa số môi trƣờng đƣợc
điều chỉnh giữa 5,5-6 pH trƣớc khi hấp khử trùng. pH dƣới 5,5 làm agar khó
chuyển sang trạng thái gel còn pH lớn hơn 6(g)agar có thể rất cứng.
2.4.2.2. Thành phần môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật
Một trong những yếu tố quan trọng nhất trong sự tăng trƣởng, phát triển
hình thái của tế bào và mô thực vật trong nuôi cấy là thành phần môi trƣờng nuôi
cấy. Thành phần môi trƣờng nuôi cấy mô tế bào thay đổi tuỳ theo loài thực vật,
loại tế bào, mô và bộ phận nuôi cấy. Mặc dù có sự đa dạng về thành phần và
nồng độ các chất nhƣng tất cả các loại môi trƣờng nuôi cấy mô đều gồm các
thành phần sau: các khoáng đa lƣợng, các khoáng vi lƣợng, đƣờng làm nguồn
cacbon, các vitamin, các chất điều hoà sinh trƣởng. Ngoài ra, ngƣời ta còn bổ
sung một số chất hữu cơ có thành phần xác định (amino acid, EDTA,..) và một
số chất có thành phần không xác định nhƣ nƣớc dừa, dịch trích nấm men…