Nghiên cứu tạo gelatinase tái tổ hợp và ứng dụng trong thủy phân gelatin da cá Tra (Luận án tiến sĩ)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT
VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
--------------------------------------------------

PHẠM MỸ DUNG

NGHIÊN CỨU TẠO GELATINASE TÁI TỔ HỢP VÀ ỨNG
DỤNG TRONG THỦY PHÂN GELATIN DA CÁ TRA

LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP

HÀ NỘI, 2018


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT
VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
--------------------------------------------------

PHẠM MỸ DUNG

NGHIÊN CỨU TẠO GELATINASE TÁI TỔ HỢP VÀ ỨNG
DỤNG TRONG THỦY PHÂN GELATIN DA CÁ TRA

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
Mã số: 9 42 02 01

LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP

Người hướng dẫn khoa học: (1) PGS. TS. PHẠM CÔNG HOẠT

(2) GS. TS. LÊ HUY HÀM

HÀ NỘI, 2018


i

LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, tôi xin được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới
PGS.TS. Phạm Công Hoạt, Bộ Khoa học và Công nghệ và GS.TS. Lê Huy
Hàm, Viện Di Truyền Nông Nghiệp, những người thầy đã định hướng, truyền
dạy những kiến thức khoa học, động viên và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi
vượt qua những khó khăn và trở ngại trong suốt quá trình thực hiện luận án.
Tôi trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Di Truyền Nông Nghiệp,
Viện Khoa học Nông Nghiệp Việt Nam, Ban Đào tạo của Viện Khoa học
Nông Nghiệp Việt Nam đã tạo mọi điều kiện thuận lợi về cơ sở vật chất và
giúp tôi hoàn thành mọi thủ tục cần thiết trong quá trình làm luận án.
Đặc biệt, Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Ban lãnh đạo Trường Đại
học Vinh, Viện Nông Nghiệp và Tài Nguyên đã tạo điều kiện giúp tôi hoàn
thành tốt nhiệm vụ công tác, học tập và nghiên cứu trong bốn năm qua.
Tôi xin chân thành cảm ơn đến Khoa Công nghệ sinh học -Viện Đại
học Mở Hà Nội, Trại thủy sản mặn lợ - Nghi Xuân của Trường Đại học Vinh
đã hỗ trợ, giúp đỡ, hướng dẫn tôi trong suốt quá trình thực hiện luận án.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè và người
thân đã luôn bên cạnh chia sẻ, và tạo điều kiện cho tôi học tập, nghiên cứu và
hoàn thành luận án của mình.
Hà Nội, ngày……. tháng năm 2018


ii

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan:
- Luận án là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả này cộng
tác với các cộng sự khác.
- Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực, một phần đã
được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho
phép của các đồng tác giả
Hà Nội, ngày….. tháng năm 2018
Tác giả luận án

Phạm Mỹ Dung


iii
MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ......................................................................................................................... i
LỜI CAM ĐOAN ..................................................................................................................ii
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT .................................................................................... v
DANH MỤC CÁC BẢNG ..................................................................................................vii
DANH MỤC CÁC HÌNH..................................................................................................... ix
MỞ ĐẦU ............................................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................................ 5
1.1. GELATIN ....................................................................................................................... 5
1.1.1. Cấu trúc và tính chất gelatin ........................................................................................ 5
1.1.2. Gelatin có nguồn gốc từ da cá ..................................................................................... 6
1.2. GELATINASE.............................................................................................................. 11
1.2.1. Đặc điểm, chức năng của gelatinase .......................................................................... 11
1.2.2. Phân loại gelatinase ................................................................................................... 13
1.2.3. Cấu trúc và cơ chế hoạt động của gelatinase ............................................................. 16

1.2.4. Tính chất chung của gelatinase .................................................................................. 19
1.2.5. Nguồn sản xuất gelatinase ......................................................................................... 25
1.3. NGHIÊN CỨU VỀ GELATINASE TÁI TỔ HỢP ...................................................... 27
1.3.1. Gen mã hóa gelatinase ............................................................................................... 27
1.3.2. Sản xuất gelatinase tái tổ hợp .................................................................................... 32
1.4. NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT VÀ ỨNG DỤNG GETATINASE TẠI VIỆT NAM ..... 41
1.4.1. Nghiên cứu sản xuất gelatinase.................................................................................. 41
1.4.2. Nghiên cứu ứng dụng gelatinase vào thủy phân da cá............................................... 42
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................................... 50
2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU .......................................................................................... 50
2.2. HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ.......................................................................................... 50
2.2.1. Hóa chất ..................................................................................................................... 50
2.2.2. Thiết bị ....................................................................................................................... 51
2.3. MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY ....................................................................................... 52
2.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................................ 52
2.4.1. Phương pháp sàng lọc nguồn gen mã hóa gelatinase................................................ 52
2.4.2. Phương pháp tạo chủng tái tổ hợp ............................................................................. 55
2.4.3. Phương pháp nghiên cứu điều kiện biểu hiện rGEL .................................................. 61
2.4.4. Phương pháp thu hồi, tinh sạch và đặc tính của rGEL ............................................. 63


iv
2.4.5. Ứng dụng rGEL thủy phân gelatin da các tra ........................................................... 65
2.4.6. Phương pháp thu thập và xử lý số liệu....................................................................... 71
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ............................................. 72
3.1. SÀNG LỌC NGUỒN GEN MÃ HÓA GELATINASE .............................................. 72
3.1.1. Tuyển chọn các chủng vi khuẩn sinh tổng hợp gelatinase cao .................................. 72
3.1.2. Đặc điểm sinh học, sinh lý, sinh hóa và định tên của chủng vi khuẩn lựa chọn........ 74
3.2. TẠO CHỦNG TÁI TỔ HỢP ........................................................................................ 79
3.2.1. Thiết kế mồi khuếch đại gen gelE mã hóa gelatinase từ chủng E. faecalis MD4 ..... 79

3.2.2. Nhân dòng gen gelE mã hóa gelatinase .................................................................... 79
3.2.3. Giải trình tự và phân tích gen gelE ............................................................................ 81
3.2.4. Thiết kế vector tái tổ hợp cho biểu hiện gen gelE trong E. coli BL21(DE3) ............ 84
3.2.5. Tạo chủng E. coli tái tổ hợp mang gen gelE .............................................................. 86
3.3. ĐIỀU KIỆN BIỂU HIỆN rGEL ................................................................................... 87
3.3.1. Ảnh hưởng của pH đến biểu hiện rGEL .................................................................... 88
3.3.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến biểu hiện rGEL ............................................................ 89
3.3.3. Ảnh hưởng của IPTG đến biểu hiện rGEL ................................................................ 93
3.3.4. Động thái quá trình lên men sinh tổng hợp gelE tái tổ hợp ....................................... 95
3.4. THU HỒI, TINH SẠCH VÀ ĐẶC TÍNH CỦA rGEL................................................. 96
3.4.1. Thu hồi và tinh sạch rGEL ......................................................................................... 96
3.4.2. Đặc tính của gelatinase tái tổ hợp .............................................................................. 99
3.5. ỨNG DỤNG rGEL THỦY PHÂN GELATIN DA CÁ TRA ................................... 106
3.5.1. Kết quả xác định các điều kiện thủy phân gelatin da cá Tra bằng rGEL................. 106
3.5.2. Đánh giá hiệu quả bổ sung chế phẩm axit amin vào thức ăn ương cá Mú chấm đen ....... 111
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................................................... 118
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................................. 121
PHỤ LỤC .......................................................................................................................... 145


v

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt

Tên đầy đủ

ADG

: Average daily growth

ADN

: Acid deoxyribonucleic

AMP

: Ampicillin

ARN

: Acid ribonucleic

BLAST

: Basis Local Aligment Search Tool

bp

: base pair

BSA

: Bovine Serum Albumin

Dal

: Dalton

E

: Enzym

EC

: Classification enzyme

EDTA

: Ethyllene diamine tetraacetic acid

EtBr

: Ethidium Bromide

FCR

: Feed change rate

IPTG

: Isopropyl β-D- thiogalactoside

kDa

: Kilo Dalton

Kb

: Kilo base

LB

: Lubria – Bertani

MMP 2

: Matrix metalloprotease 2

MMP 9

: Matrix metalloprotease 9

MMPs

: Matrix metalloproteases

NST

: Nhiễm sắc thể

OD

: Optical density (mật độ quang)

PBS

: Phosphate buffer

PCR

: Polymerase Chain Reactions

rGelE

: recombinant gelatinase enzyme (enzyme gelatinase tái tổ hợp)


vi

RE

: Restriction enzyme (enzyme giới hạn)

S

: Cơ chất

SDS-PAGE : Sodium dodecyl sulfate polyarcrylamide gel electrophoresis
SGR

: Special growth rate

sprE

: serine proteinase

TAE

: Tris - acetate - EDTA

TSVKHK

: tổng số vi khuẩn hiếu khí

TTHĐ

: Trung tâm hoạt động

UV

: Ultra violet

VT TTH

: vector tái tổ hợp

VSV

: vi sinh vật


vii

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Thành phần axit amin của gelatin từ da cá da trơn (Clarias
gariepinus) ........................................................................................................ 8
Bảng 1.2. Các thành phần axít amin chủ yếu trong gelatin da một số loại cá và
bì lợn (thành phần trong 1000g)...................................................................... 10

Bảng 1.3. Một số loại enzym thuộc nhóm MMPs .......................................... 14
Bảng 2.1. Thành phần dinh dưỡng thức ăn ..................................................... 68
Bảng 2.2. Thành phần dinh dưỡng các công thức thức ăn thí nghiệm ........... 69
Bảng 2.3. Thành phần axit amin trong các loại thức ăn thí nghiệm .............. 69
Bảng 3.1. Hoạt tính phân giải gelatin của dịch lên men 11 chủng vi khuẩn
phân lập phân lập từ các mẫu cá nước ngọt bị bệnh sau 48 giờ nuôi cấy. ...... 72
Bảng 3.2. Khả năng đồng hoá nguồn carbon và nitơ và đặc điểm sinh trưởng
của chủng MD4 sau 2 ngày nuôi cấy ở 37°C.................................................. 75
Bảng 3.3. Độ tương đồng trình tự gen 16S rRNA của vi khuẩn MD4 với trình
tự gen tương ứng của các chủng được đăng ký trên Genbank (NCBI) .......... 77
Bảng 3.4. Mức độ tương đồng trình tự nucleotit của gen gelE của chủng E.
faecalis MD4 với các gen gelE tương ứng cả các vi khuẩn được đăng kí trên
GenBank .......................................................................................................... 81
Bảng 3.5. Mức độ tương đồng trình tự axít amin suy diễn của gen gelE của
chủng E. faecalis MD4 với các gen gelE tương ứng cả các vi khuẩn được
đăng kí trên GenBank...................................................................................... 84
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của nồng độ chất cảm ứng đến sinh trưởng và biểu hiện
GEL ................................................................................................................. 93
Bảng 3.7. Hiệu suất tinh sạch của GEL tái tổ hợp .......................................... 97
Bảng 3.8. Ảnh hưởng của các ion kim loại và hóa chất đến hoạt tính của GEL
tái tổ hợp ........................................................................................................ 103
Bảng 3.9. Ảnh hưởng của tỷ lệ nước khảo sát đến hiệu suất thủy phân ....... 106
Bảng 3.10. Thành phần axít amin của sản phẩm thủy phân từ gelatin da cá Tra
....................................................................................................................... 110


viii

Bảng 3.11. Diễn biến các yếu tố môi trường nước trong quá trình ương cá Mú
chấm đen ....................................................................................................... 111

Bảng 3.12. Tốc độ tăng trưởng trung bình ngày của cá Mú chấm đen theo
khối lượng ở các mức bổ sung chế phẩm axit amin khác nhau .................... 113
Bảng 3.13. Tốc độ tăng trưởng trung bình ngày của cá Mú chấm đen theo
chiều dài ở các mức bổ sung chế phẩm axit amin khác nhau ....................... 114
Bảng 3.14. Hệ số chuyển đổi thức ăn của cá Mú ở các mức bổ sung chế phẩm
axit amin khác nhau ...................................................................................... 116
Bảng 3.15. Hệ số biến động của cá Mú chấm đen giai đoạn giống .............. 117


ix

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1 . Cấu trúc điển hình của gelatinase A, B có nguồn gốc từ người ... 17
Hình 1.2. Cấu trúc của các enzym gelatinase ................................................. 18
Hình 1.3. Sơ đồ trình tự axit amin dự đoán của gelatinase ............................ 28
Hình 1.4. A) Hệ thống điều hòa sự biểu hiện của gen gelE bởi operon ......... 31
Hình 2.1 Đồ thị đường chuẩn xác định nồng độ protein................................. 61
Hình 2.2a. Cá Mú chấm đen (Epinephelus malabaricus) ............................... 67
Hình 2.2b. Hệ thống giai ương thí nghiệm ..................................................... 67
Hình 2.3. Thức ăn công nghiệp dùng cho cá Mú chấm đen ........................... 68
Hình 3.1. Khả năng thủy phân gelatin (nồng độ 7,5 g/l) sang dạng lỏng của
chủng MD4 ...................................................................................................... 73
Hình 3.2. Vòng phân giải cơ chất gelatin của chủng vi khuẩn ....................... 73
Hình 3.3. Hình ảnh khuẩn lạc trên môi trường MPA (a), tế bào MD4 dưới
kính hiển vi điện tử quét (b) và nhuộm Gram (c) ........................................... 75
Hình 3.4. Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại gen 16S rDNA trên gel
agarose 1,0% ................................................................................................... 76
Hình 3.5. Cây phát sinh chủng loại dựa trên việc so sánh trình tự gen 16S
rRNA của chủng MD4 với các trình tự gen tương ứng của các chủng khác
trên GenBank................................................................................................... 78

Hình 3.6. Điện di đồ sản phẩm khuếch đại gen gelE từ DNA của E. faecalis
MD4. ............................................................................................................... 80
Hình 3.7. Điện di đồ kiểm tra plasmid đã mang gen. ..................................... 80
Hình 3.8. Điện di đồ sản phẩm cắt plasmid tách dòng bằng enzym giới hạn. 80
Hình 3.9. So sánh trình tự nucleotide của gen gelE từ chủng E. faecalis MD4
với trình tự của các gen gelE được đăng ký trên GenBank ........................... 83
Hình 3.10: Trình tự axit amin suy diễn của gelE của chủng E. faecalis MD484
Hình 3.11. Điện di đồ sản phẩm gen tinh sạch từ vector tách dòng và cắt mở
vòng vector biểu hiện pET-22b(+). ................................................................ 85
Hình 3.12. Điện di đồ DNA plasmid từ thể biến nạp (a) và plasmid tái tổ hợp
được xử lý bằng HindIII và SalI (b)................................................................ 85
Hình 3.13. Điện di đồ protein tái tổ hợp trên SDS-PAGE . ............................ 86


x

Hình 3.14. Hình ảnh sàng lọc các dòng E. coli BL21(DE3)[pET22b(+)-gelE]
trên môi trường thạch và hình ảnh kiểm tra hoạt tính GEL của các dòng trên
đĩa thạch đục lỗ....................................................................................... ........ 87
Hình 3.15. Ảnh hưởng của pH đến biểu hiện gelE tái tổ hợp ......................... 88
Hình 3.16 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến biểu hiện gelE tái tổ hợp.................. 90
Hình 3.17 Điện di đồ GEL biểu hiện ở 37oC (a) và 34oC(b) trên gel SDSPAGE. ............................................................................................................. 91
Hình 3.18. Điện di đồ protein GEL tái tổ hợp biểu hiện ở các nồng độ IPTG
khác nhau trên gel SDS-PAGE. ...................................................................... 94
Hình 3.19. Động thái quá trình lên men sinh tổng hợp rGEL ........................ 95
Hình 3.20. Điện di đồ protein tái tổ hợp trước và sau tinh sạch GEL bằng cột
sắc ký ái lực ..................................................................................................... 97
Hình 3.21. Quy trình thu nhận gelatinase tái tổ hợp từ chủng E. coli BL21
(DE3) ) [pET 22(b+) –GelE]……………………………………………...…97
Hình 3.22. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của rGEL ………… ...... 100

Hình 3.23. Độ bền nhiệt của rGEL ............................................................... 100
Hình 3.24. Ảnh hưởng của pH tới hoạt động xúc tác của GEL .................... 101
Hình 3.25. Ảnh hưởng của pH đến độ bền của GEL tái tổ hợp .................... 102
Hình 3.26. Ảnh hưởng của các chất tẩy rửa đến hoạt tính của rGEL ................ 105
Hình 3.27. Biến đổi vận tốc phản ứng theo nồng độ gelatinase (a) và đồ thị
Lineaweaver -Burk của gelatinase tái tổ hợp với cơ chất gelatin (b). .......... 106
Hình 3.28. Hiệu quả thủy phân gelatin ở các nồng độ gelatinase khác nhau 107
Hình 3.29. Hiệu suất thủy phân gelatin bằng gelatinase ở các mức nhiệt độ
khác nhau....................................................................................................... 108
Hình 3.30. Hiệu suất thủy phân gelatin bằng gelatinase ở các mức thời gian
thủy phân ....................................................................................................... 109
Hình 3.31. Tỷ lệ sống của cá Mú chấm đen khi kết thúc thí nghiệm ........... 113


1

MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của luận án
Gelatinase (GEL) là một trong những enzym được nghiên cứu nhiều
hiện nay với tác dụng thủy phân gelatin, pheromone, collagen, casein và
fibrinogen thành các đoạn peptit ngắn và các axít amin. Gelatinase là enzym
chứa kim loại, thuộc nhóm protease ngoại bào sử dụng trong ngành công
nghiệp hóa chất, y học, công nghệ thực phẩm...
Gelatinase tự nhiên được thu nhận từ nhiều loài vi khuẩn thuộc các chi
khác nhau như Staphylococcus, Pseudomonas, Aerromonas, Enterobacter,
Bacillus… Tuy nhiên, phần lớn vi khuẩn sinh gelatinase nói trên là các đối
tượng vi sinh vật (VSV) gây bệnh có thể gây hại đối với con người, động vật
nên không được sử dụng trực tiếp để sản xuất gelatinase. Ngoài ra, các vi
khuẩn tự nhiên sinh gelatinase có hoạt tính không cao.
Để khắc phục những tồn tại trên đối với nguồn gelatinase tự nhiên,

hướng nghiên cứu sản xuất gelatinase tái tổ hợp đã và đang được các nhà
khoa học, doanh nghiệp quan tâm nghiên cứu nhằm nâng cao hoạt tính
enzym, sản xuất ở quy mô lớn và ứng dụng rộng rãi. Ngoài ra, gelatinase tái
tổ hợp sản xuất được sẽ loại trừ tính độc của các chủng vi khuẩn tự nhiên, hạn
chế tác dụng gây hại tới con người hay động vật.
Một trong những phương pháp hiệu quả được chú trọng phát triển trên
thế giới là ứng dụng kỹ thuật di truyền và công nghệ lên men tạo ra các chủng
VSV tái tổ hợp có khả năng sinh tổng hợp gelatinase tái tổ hợp (rGEL) hoạt
tính cao, sản lượng lớn và có khả năng ứng dụng trong công nghiệp. Trong
nhiều công bố, hoạt tính rGEL thu được cao hơn nhiều lần so với GEL từ
VSV tự nhiên. Trong số các hệ biểu hiện rGEL, Escherichia coli được xem là
một trong những hệ biểu hiện nhanh, hiệu quả rGEL và tạo cơ sở khoa học cho
nghiên cứu đặc tính enzym để phát triển nghiên cứu sâu hơn. Các nghiên cứu
trước đây đã công bố rGEL được biểu hiện từ E. coli BL21 (DE3) cho hoạt


2

tính gelatinase đạt 38,14 U/mg và thể hiện khả năng ứng dụng hiệu quả trong
thủy phân.
Gelatinase là

một trong

những

enzym quan trọng thuộc

metalloproteases và chúng được sử dụng rộng rãi không chỉ trong hóa học, y
tế và các ngành công nghiệp mà còn trong thực phẩm và khoa học sinh học cơ

bản. Cụ thể, trong lĩnh vực nghiên cứu về sinh hóa và chẩn đoán ung thư: các
enzym của họ metalloproteinase này có khả năng làm giảm hầu hết các thành
phần ngoại bào và đó là chất trung gian quan trọng trong việc tái tạo mô sinh
lý và trong quá trình bị bệnh lý chẩn đoán ung thư. Còn trong công nghiệp
thực phẩm, gelatinase được ứng dụng để thủy phân da bò, da cá thành các axít
amin.
Theo Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn, cả nước có diện tích
trên 6.078 ha nuôi cá Tra đạt sản lượng xuất khẩu hơn 1,11 triệu tấn/năm và
có tổng giá trị xuất khẩu cá tra của Việt Nam đạt 1,78 tỷ USD năm 2017. Sản
phẩm xuất khẩu chủ yếu là cá phi-lê dạng miếng, nhưng theo ước tính cứ 2 ÷
2,5 kg cá nguyên liệu sẽ chế biến được 1 kg cá phi-lê, phụ thuộc vào kỹ thuật
chế biến và tùy sản phẩm cụ thể, còn lại 1 ÷ 1,5 kg sẽ nằm trong phần phụ
phẩm chế biến, trong đó da cá chiếm từ 4 ÷ 6% trên tổng lượng phụ phẩm. Từ
da cá có thể tạo ra những sản phẩm khác có giá trị kinh tế cao hơn và có nhiều
ứng dụng hơn trong thực tế, giảm thiểu ô nhiễm môi trường. Vì thế, trong
những năm gần đây, nhiều công ty cổ phần Việt Nam như Công ty Vĩnh
Hoàn, công ty Nam Việt…đã tăng cường đầu tư các công nghệ để tối đa hóa
giá trị của các phụ phẩm từ nhà máy chế biến cá Tra như sản xuất dầu,
collagen, gelatin, thức ăn cho động vật.
Hơn thế, gelatin có thể được thủy phân trong môi trường kiềm hoặc
axit. Tuy nhiên, các công nghệ sản xuất này yêu cầu thiết bị có tính chịu
nhiệt, chịu axit hoặc base, đồng thời có thể gây ô nhiễm môi trường. Hơn nữa,
việc sử dụng các dung dịch base hoặc axit để thủy phân gelatin sẽ rất dễ gây
hiện tượng làm chuyển dạng đồng phân của các axít amin, đây là nguyên nhân


3

làm mất hoạt tính của axít amin. Vì vậy, công nghệ enzym được lựa chọn như
giải pháp an toàn.

Mặt khác, hiện nay nghề nuôi cá biển đang phát triển mạnh ở nước ta,
nguồn thức ăn của cá biển rất cần bổ sung các axít amin thiết yếu vào bằng
thức ăn bởi bản thân cá biển không tự tổng hợp được.
Xuất phát từ cơ sở thực tiễn như trên, chúng tôi đã tiến hành đề tài
“Nghiên cứu tạo gelatinase tái tổ hợp và ứng dụng trong thủy phân gelatin da
cá Tra”.
2. Mục tiêu của luận án
Tạo được chủng Escherichia coli tái tổ hợp sinh tổng hợp gelatinase có
nguồn gốc từ Enterococcus faecalis và ứng dụng gelatinase tái tổ hợp thủy
phân gelatin da cá Tra thành chế phẩm axít amin bổ sung vào thức ăn cho cá
Mú chấm đen giai đoạn ương giống có hiệu quả.
3. Nội dung của luận án
- Sàng lọc nguồn gen gelE mã hóa GEL từ vi khuẩn phân lập tại Việt Nam.
- Tạo chủng E. coli tái tổ hợp sinh gelatinase và nghiên cứu điều kiện
lên men biểu hiện rGEL .
- Lựa chọn điều kiện thu hồi sản phẩm rGEL kỹ thuật và nghiên cứu
đặc tính của rGEL.
- Ứng dụng rGEL trong thủy phân gelatin da cá Tra
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
Ý nghĩa khoa học
Kết quả của luận án góp phần cung cấp thêm dữ liệu về nguồn gen các
chủng vi sinh vật tổng hợp gelatinase tự nhiên. Từ đó tạo chủng E. coli tái tổ
hợp sinh tổng hợp gelatinase hiệu quả và ứng dụng gelatinase trong thủy phân
da cá Tra tạo nguồn axít amin bổ sung vào thức ăn nuôi cá Mú giống.
Ý nghĩa thực tiễn


4

Đưa ra khảo sát ứng dụng gelatinase tái tổ hợp để thủy phân da cá Tra

thành bột axít amin và ứng dụng bổ sung vào thức ăn ương nuôi cá Mú chấm
đen nhằm nâng cao hiệu quả.
5. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
5.1. Đối tượng nghiên cứu
- Chủng vi khuẩn MD4 sinh gelatinase tại Bộ sưu tập vi sinh vật của
Khoa Công nghệ sinh học – Viện Đại học Mở Hà Nội; Các chủng E. coli
BL21(DE3), XL1-blue, nhận từ phòng thí nghiệm Genomics, Khoa Vi sinh vật học,
Trường đại học quốc gia Kyungpook, Hàn Quốc.- Da cá Tra được thu tại công ty

cổ phần Vĩnh Nguyên, Khu công nghiệp Trà Nóc, Thành phố Cần Thơ. Mẫu
sau khi thu gom được bảo quản trong tủ đông ở nhiệt độ -20 ± 2°C cho đến
khi xử lý và phân tích.
Cá Mú chấm đen (Epinephelus malabaricus): khỏe mạnh, đồng đều kích
cỡ 7 cm/con, khối lượng cá trung bình 7,067 g/con được thu mua từ Trại ương
cá Nghi Hợp – Nghi Lộc – Nghệ An.
5.2. Phạm vi nghiên cứu
- Nghiên cứu tạo gelatinase tái tổ hợp, ứng dụng thủy phân gelatin da
cá tra với quy mô phòng thí nghiệm, triển khai tại phòng thí nghiệm công
nghệ sinh học – Viện Đại học Mở HN.
- Nghiên cứu ứng dụng bổ sung chế phẩm axit amin triển khai ở phạm
vi mô hình thử nghiệm, được triển khai tại Trại Thực Nghiệm nuôi Hải sản –
Trường Đại học Vinh.
5.3. Thời gian nghiên cứu
Nghiên cứu được tiến hành từ năm 2013 đến năm 2017.
6. Những đóng góp mới của luận án
- Là luận án đầu tiên phân lập nguồn gen gel mã hóa GEL từ nguồn vi
khuẩn Enterococcus faecalis phân lập tại Việt Nam.
- Đã tạo được chủng E. coli BL21[pET22(b)-gelE] tái tổ hợp sinh
gelatinase.
- Ứng dụng hiệu quả rGEL trong thủy phân gelatin da cá Tra tạo chế

phẩm axít amin bổ sung vào thức ăn cho cá Mú chấm đen giai đoạn giống


5

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. GELATIN
1.1.1. Cấu trúc và tính chất gelatin
Gelatin là hỗn hợp không đồng nhất các protein hòa tan trong nước có
trọng lượng phân tử cao (Budavari, 1996). Theo Karim và cộng sự (2009)
gelatin là một polymer sinh học có nguồn gốc từ collagen, là thành phần chủ
yếu của da, xương và mô liên kết động vật. Với trọng lượng khô cơ bản,
gelatin bao gồm từ 98 đến 99% protein. Trọng lượng phân tử của gelatin lớn,
dao động từ 20.000 đến 300.000 Dalton (Keenan và cộng sự, 1994; Boran và
cộng sự, 2010).
Trong các dung dịch nước, gelatin là hỗn hợp các chuỗi polypeptit khác
biệt bao gồm các thành phần α, x (dimers của α-chain) và γ (trimers α-chain)
có khối lượng khoảng 90, 180 và 300 x 103 g/mol tương ứng (Rbii và cộng sự,
2011). Giống như collagen, gelatin có cấu trúc dạng chuỗi gồm những phân tử
có kích thước nhỏ liên kết với nhau bằng liên kết hydro tạo thành mạng lưới.
Trong đó, mỗi phân tử gelatin là các chuỗi axít amin được liên kết bằng liên
kết peptit. Trình tự axít amin của gelatin chủ yếu là Gly-Pro-Hyp (Poppe,
1997). Hàm lượng axít amin của gelatin tương đối cao: glycine (Gly) 26-34%;
Proline (Pro) 10-18%; và hydroxy proline (Hyp) 7-15% (Veis, 1964, Poppe,
1997). Các axít amin quan trọng khác bao gồm: Alanin (Ala) 8-11%;
Arginine (Arg) 8-9%; axít aspartic (Asp) 6-7%; và glutamic(Glu)10-12%
(Hudson, 1994, Poppe, 1997). Gelatin không chứa Tryptophan và chứa ít
Isoleucin, Threonin và Methionin (Potter và Hotchkiss, 1998).
Các tính chất quan trọng nhất của gelatin có thể được chia thành ba
nhóm: i) đặc tính liên quan đến hoạt động của chất gel, ví dụ: sự hình thành

gel, tăng cường kết cấu và tăng cường khả năng phụ thuộc nước, ii) Các tính
chất hydrat hóa cơ bản như sưng và tan iii) các tính chất liên quan đến hoạt
động bề mặt của chúng, bao gồm nhũ tương, tạo thành bọt, tính ổn định, sự
bám dính, sự gắn kết, chức năng keo và khả năng tạo màng.


6

1.1.2. Gelatin có nguồn gốc từ da cá
Gelatin được sản xuất nhiều nhất từ da lợn (46%), da trâu, bò (29,4%),
thịt lợn và xương gia súc (23,1%). Gelatin cá chiếm dưới 1,5% tổng sản lượng
gelatin trong năm 2007, tỷ lệ này tăng gấp đôi vào năm 2002, cho thấy xu
hướng sản xuất gelatin từ các động vật không phải là động vật có vú ngày
càng gia tăng. Gelatin từ cá loại bỏ nguy cơ lây nhiễm bệnh bò điên và có thể
sử dụng cho các cộng đồng không sử dụng các sản phẩm tư gia súc như lợn,
bò (Gómez-Guillén và cộng sự, 2011; Ahmad & Benjakul, 2011 ).
Gelatin có nguồn gốc từ cá có thể được chiết xuất từ da và xương của cá.
Phụ phẩm và chất thải trong quá trình chế biến thủy sản chiếm đến 75% tổng
khối lượng nguyên liệu sản xuất gelatin từ cá (Shahidi, 1995). Khoảng 30%
chất thải của da và xương có hàm lượng collagen cao có thể được sử dụng để
sản xuất gelatin (Gómez-Guillén và cộng sự, 2002). Việc chiết xuất gelatin từ
da cá có thể cung cấp sản phẩm thay thế phục vụ cộng đồng Hồi giáo và nâng
cao giá trị ngành sản xuất cá tuyết (Gudmundsson và Hafsteinsson,
1997;Montero và cộng sự, 1999), cá megrim (Montero và Gómez-Guillén.,
2000) và cá rô phi (Grossman và Bergman., 1992; Jamilah và Harvinder.,
2002). Năng suất và chất lượng gelatin bị ảnh hưởng không chỉ bởi các loài
hoặc mô cá mà còn vào độ pH, nhiệt độ và thời gian trong quá trình tiền xử lý
và chiết xuất (Montero và Gómez-Guillén, 2000).
Da cá là sản phẩm phụ chủ yếu của ngành công nghiệp chế biến cá, gây
lãng phí, ô nhiễm môi trường và có thể cung cấp một nguồn gelatin có giá trị

(Badii và Howell, 2006). Da cá chứa một lượng lớn collagen. Nagai và
Suzuki (2000) công bố rằng hàm lượng collagen trong phụ phẩm da cá của cá
Vược Nhật Bản, cá chẻ và cá mập lần lượt là 51,4%, 49,8% và 50,1% (khối
lượng khô). Năm 2002, Gómez-Guillén và cộng sự đã công bố rằng 30% chất
thải của cá ở dạng xương và da có collagen cao.
Từ những năm 1960, gelatin đã được sản xuất quy mô công nghiệp sử
dụng axit làm tác nhân thủy phân (Norland, 1990). Năm 1992, quy trình sản


7

xuất gelatin từ cá và đặc tính gelatin thu được đã được mô tả bởi Grossman và
Bergman (1992). Kể từ đó, gelatin cá được chiết xuất từ da và xương của
nhiều cá nước lạnh khác nhau như cá tuyết,cá hồi và các loài cá nước ấm như
cá ngừ, cá da trơn, cá rô phi, cá Nile, cá mập và cá biển.
Gelatin được sản xuất qua ba giai đoạn: tiền xử lý nguyên liệu thô, chiết
xuất gelatin và làm sạch kết hợp làm khô. Tùy thuộc vào phương pháp mà
collagen được xử lý trước, hai loại gelatin có thể được sản xuất. Chất gelatin
loại A (điểm đẳng điện áp ở pH 6÷9) được sản xuất từ collagen được xử lý
bằng axít và gelatin loại B (điểm đẳng điện khoảng pH 5) được sản xuất từ
collagen bằng phương pháp xử lý kiềm (Stainsby, 1987). Xử lý axít là thích
hợp nhất cho collagen được tìm thấy trong da lợn hoặc cá, xử lý kiềm phù
hợp cho các collagen phức tạp hơn được tìm thấy trong da bò.
Gelatin từ da cá đã được chiết xuất bằng một số cách khác nhau. Thông
thường, da cá được xử lý trong điều kiện axit yếu trước khi chuyển qua công
đoạn tạo gelatin. Gómez-Guillén và Montero (2001) đã công bố quy trình sản
xuất gelatin từ da cá bao gồm các công đoạn: tiền xử lý colagen trong dung
dịch axit yếu, tiếp đó trích xuất trong nước ở nhiệt độ vừa phải (45 oC) và xử
lý nhiệt ở nhiệt độ trên 40oC, toàn bộ quá trình mất khoảng 24 giờ. Theo Yang
và cộng sự (2007) gelatin được tạo thành từ cá da trơn bằng cách tiền xử lý da

bằng dung dịch kiềm NaOH, tiếp theo là dung dịch axít acetic, sau đó 30g da
được rửa sạch, xử lý với NaOH theo tỷ lệ 1: 6 ( w/v) cho thời gian biến đổi
và rửa bằng nước máy lặp lại hai lần trước khi mẫu được xử lý bằng axit
acetic (1: 6 w/v). Loại bỏ nước và rửa mẫu bằng nước máy theo tỉ lệ (1: 6
w/v), bước này lặp lại ba lần. Sau các bước xử lý trên, bổ sung nước không
chứa ion vào mẫu và bảo quản ở 4°C.
Năm 2008, quy trình tách chiết da cá da trơn được hai nhóm nghiên cứu
cùng đưa ra. Theo quy trình đó, da cá da trơn được ngâm trong dung dịch 50mmol /L axít acetic theo tỉ lệ 1:8 v/w ở 15 oC trong 18 giờ. Da được tiếp tục
xử lý rửa bằng nước cất cho đến khi độ pH đạt 3,5÷4,0. Quá trình tách chiết


8

có sự tham gia của pepsin. Sự tách chiết gelatin được thực hiện trong nước cất
ở 45oC trong 7 giờ (Nalinanon và cộng sự, 2008; Liu và cộng sự, 2008).
Theo Sanaei Ardekani và cộng sự (2013) đã công bố điều kiện tối ưu cho
chiết xuất gelatin từ da cá da trơn thu được bằng cách sử dụng 0,13 mol/L
NaOH và 0,09 mol/L axit axetic xử lý trong thời gian 1 giờ và tiếp theo là
chiết xuất nước nóng ở 64,92°C trong 3 giờ. Và nhóm nghiên cứu này cũng
công bố rằng gelatin da cá da trơn khi được thủy phân với 6 mol/L HCl ở
110ºC trong 16 giờ. Sau đó, dịch thủy phân được hòa tan trong nước khử ion
và được lọc. Thành phần axit amin đã được xác định bằng sắc ký lỏng hiệu
suất cao (HPLC). Kết quả thành phần axit amin của gelatin da cá da trơn
(Clarias gariepinus) được trình bày ở bảng 1.1.
Bảng 1.1. Thành phần axit amin của gelatin từ da cá da trơn (Clarias
gariepinus) (Sanaei Ardekani và cộng sự, 2013)
Axit amin

Số dư
lượng/1000

Alanine

86

Arginine

78

Aspartic acid

50

Cystine

0

Glutamic acid

85

Glycine

250

Histidine

11

Hydroxyproline

58

Isoleucine

13

Leucine

22

Lysine

33

Methionine

92

Phenylalanine

16


9

Proline

115

Serine

38

Threonine

25

Tryrosine

6

Valine

22

Total

1000

Hydroxyproline + Proline

173

(Imino axit
Thành phần axit amin trong gelatin của da cá da trơn (Bảng 1.1) cho thấy
chủ yếu là glycine, chiếm 250 dư lượng /1000 dư lượng, sau đó là proline
(115 dư lượng/1000), methionine (92 dư lượng/100), alanine (86 dư
lượng/1000). Và axit imino (hydroxyprolinevà proline) của gelatin da cá da
trơn chiếm 173 dư lượng trên 1000 dư lượng.

Theo Kim và cộng sự (2000), khi thủy phân protein cá với các enzym
thích hợp như alcalase, pronase, collagenase, pepsin, papain, protamex,
bromelain, chymotrypsin và trypsin thu được các peptit hoạt tính sinh học và
các axít amin. Ưu điểm chính của enzym thủy phân protein là nó cho phép
định lượng aspargine và glutamine và các thành phần có số lượng ít, thường
bị

phá

hủy khi

thủy phân

protein

bằng

axít

và kiềm.

Theo

Wachirattanapongmettee và cộng sự (2009) protein cá da trơn sẽ bị thủy phân
hoàn toàn tạo thành các axit amin khi được trộn với với nước cất theo tỉ lệ 1:
1,5 (w / v) và bổ sung enzym protex 0,5; 1,5 hoặc 3% v/w trong thời gian 60,
120 và 180 phút. Năm 2011, Alemán và cộng sự đã thử nghiệm thủy phân
gelatin từ cá ngừ, cá bơn và mực để sản xuất chất chống oxy hóa. Gelatin
2,5% được hòa tan trong dung dịch đệm phosphate (0,01 M; pH 8) và bổ
sung alcalase vào với tỷ lệ enzym/cơ chất gelatin là 1:20 và thủy phân ở 50 oC

trong 3 giờ. Gelatin từ mực và cá ngừ được thủy phân bằng enzym trypsin ở
37oC và trong dung dịch nước pH 7,5 và pepsin ở 37 oC và trong dung dịch


10

nước pH 4. Sau khi thủy phân các enzym bị bất hoạt bằng cách gia nhiệt ở
90oC trong 10 phút.
Quá trình thuỷ phân collagen bằng Neutrase cho hiệu suất thủy phân cao
nhất khi nồng độ cơ chất là 200 g/L, tỷ lệ E/S là 39,45 U/g protein, nhiệt độ
thuỷ phân là 50oC, tại pH 7,0 và thuỷ phân trong thời gian là 3 giờ. Mức độ
thuỷ phân tại điều kiện trên đạt 11,02%. Khi thuỷ phân collagen bằng
neutrase kết hợp với sóng siêu âm, với thời gian xử lý sóng siêu âm là 6 phút,
cường độ sóng siêu âm 150W/ 20ml mẫu, cho hiệu suất thủy phân là 14,92%.
Sản phẩm thuỷ phân bằng enzym kết hợp sóng siêu âm có phân tử lượng thấp
hơn so với khi thuỷ phân bằng enzym. Hiệu suất thủy phân neutrase thu được
có phân đoạn 19 ÷ 31 kDa, còn khi kết hợp neutrase và sóng siêu âm thì thu
được phân đoạn 8,5 ÷12 kDa và 12 – 18kDa. Theo nghiên cứu của Karim và
Bhat (2009), Go´mez-Guille´n và cộng sự (2002); Zhou và cộng sự (2006);
Sarabia và cộng sự (2000); Eastoe và Leach (1977) đã công bố thành phần
axít amin chủ yếu trong gelatin da một số loại cá và bì lợn cho kết quả ở bảng
1.2 cho thấy các loại axít amin chính và hàm lượng của chúng ở da cá tương
đương với các thành phần trong gelatin từ da lợn.
Bảng 1.2. Các thành phần axít amin chủ yếu trong gelatin da một số loại cá và
bì lợn (thành phần trong 1000g)
Loại axít amin

Da cá
tuyết

a

Da cá
Alaska

Hakea Megrima

pollockb

Cá rô
phi

c

Bì lợnd

Alanine

96

108

119

123

123

112

Glycine

344

358

331

350

347

330

Hydroxyproline

50

55

59

60

79

91

Proline

106

95

114

115

119

132

Arginine

56

51

54

54

47

49

Lysine

29

26

28

27

25

27


11

Methione

17

16

15

13

9

4

Leucine

22

20

23

21

23

24

Serine

64

63

49

41

35

35

Ghi chú: a: Gómez-Guillén và cộng sự (2002); b: Zhou và cộng sự (2006);
c: Sarabia và cộng sự (2000); d: Eastoe và Leach (1977)
Nghiên cứu của các tác giả trên cũng chỉ rõ: glycine là axít amin chiếm
hàm lượng cao nhất trong thành phần thủy phân gelatin trong da cá là yếu tố
tạo nên cầu nối của cấu trúc sợi collagen, vì vậy nó có thể được sử dụng như

tác nhân chống lại hiện tượng mất cấu trúc sợi collagen ở các cơ biểu mô. Bên
cạnh đó, trong cơ thể glycine chuyển hoá thành betanine là chất có tác dụng
biến homocystein thành methionine.
Tuy nhiên, các công nghệ sản xuất gelatin bằng axit hay kiềm thường
yêu cầu thiết bị có tính chịu nhiệt, chịu axit hoặc kiềm, đồng thời có thể gây ô
nhiễm môi trường. Hơn nữa, việc sử dụng các dung dịch kiềm hoặc axit để
thủy phân gelatin sẽ rất dễ gây hiện tượng làm chuyển dạng đồng phân của
các axít amin, đây là nguyên nhân làm mất hoạt tính của axít amin và mất khả
năng thẩm thấu qua màng tế bào. Vì vậy, công nghệ enzym được lựa chọn
như giải pháp tối ưu.
1.2. GELATINASE
1.2.1. Đặc điểm, chức năng của gelatinase
Gelatinase và collagenase là một trong những enzym có cofactor là ion
kim loại quan trọng và được sử dụng rộng rãi trong hóa học, y tế, các ngành
công nghiệp, thực phẩm và khoa học sinh học cơ bản (Hisano và cộng sự,
1989). Năm 1994, Makinen và cộng sự đã công bố gelatinase là một protease
ngoại bào phụ thuộc kim loại (kẽm) có khả năng thủy phân gelatin và một số
chất khác như pheromone, collagen, casein và fibrinogen thành các
polypeptit, peptit và các axít amin.
Gelatinase được tìm thấy nhiều ở người, động vật và vi khuẩn. Ở vi
khuẩn, rất nhiều nghiên cứu được tiến hành về gelatinase sinh tổng hợp bởi


12

chủng Enterococcus faecalis (Bourgogne và cộng sự, 2006; Nakayama và
cộng sự, 2006; Del Papa và cộng sự, 2007). Ngoài ra, rất nhiều chủng vi
khuẩn khác như Bacillus spp. (Evans và Wardlaw, 1953), B. subtilis PE-11
(Qadar và cộng sự, 2009 ), Bacillus halodurans (Ibrahim và Al-Salamah,
2009),

B.

subtilis

mirabilis, Serratia

BS1

(Shaheen

và

cộng

marcescens, Escherichia

coli,

sự,

2008),

Salmonella

Proteus
typhi,

Klebsiella oxytoca, Klebsiella pneumoniae, Shigella flexneri và Serratia
liquefaciens cũng có khả năng thủy phân gelatin. Theo nghiên cứu của

Shanmugasundaram và cộng sự (2012), Bacillus spp. tiết ra hai loại
proteinase đóng vai trò quan trọng trong công nghiệp gồm subtilisin hoặc
protease kiềm và metalloprotease protease trung tính.
Trong số các gelatinase từ vi khuẩn, gelatinase từ chủng E. faecalis được
nghiên

cứu

nhiều

nhất.

Gelatinase

từ

E.

faecalis

thuộc

họ

metalloendopeptidases M4, là enzym chịu nhiệt, có thể thủy phân casein,
hemoglobin, insulin, fibrinogen, collagen, gelatin và một số các loại
protein/peptide (Makinen và cộng sự, 1989). Gelatinase là tác nhân hỗ trợ cho
các vi sinh vật gây bệnh trên nhiều cơ thể, bao gồm viêm phúc mạc ở chuột,
chứng đau thắt ngực ở thỏ và diệt tuyến trùng. Ngoài gelatin, một số các cơ
chất khác như các kích thích trong ruột kết và một số cơ chất trong cơ thể in

vitro như insulin B, endothelin, hemoglobin, fibrinogen, fibronectin, collagen
và laminin là cơ chất của gelatinase. Ngoài ra, gelatinase tham gia cùng với hệ
miễn dịch bảo vệ cơ thể bằng cách bất hoạt hoạt tính của các peptit kháng
khuẩn LL-37 và α-defensin. Gần đây, gelatinase đã được chứng minh là có
liên quan đến quá trình xâm nhập của E. faecalis trên mô hình in vitro qua các
tế bào tương tự tế bào T84 ở người ( Del Papa và cộng sự, 2007).
Ở người, gelatinase là metalloproteinase (MMP2 và 9) có liên quan đến
quá trình phá vỡ mạng lưới ngoại bào trong các quá trình sinh lý bình thường
như sự phát triển phôi thai, sinh sản và tái tạo mô. Gelatinase có khối lượng
phân tử 92kDa (MMP9) được sử dụng để sàng lọc chất ức chế hoạt động của


13

enzym và trong chẩn đoán bệnh, gelatinase còn được dùng như là yếu tố chỉ
thị để chẩn đoán sớm sự di căn của khối u. Đối với lĩnh vực sản xuất thực
phẩm, gelatinase, collagentinase là những men tiêu hoá protid gân, bạc nhạc
và protid liên kết thành những mạch peptide và axít amin (Makinen và
Makenin, 1994).
1.2.2. Phân loại gelatinase
Các công bố đầu tiên về gelatinase từ vi khuẩn xuất hiện 4 thập kỷ trước.
Chủng Streptococcus (nay là Enterococcus) faecalis var. liquefaciens có khả
năng sản xuất metalloprotease (protease phụ thuộc kim loại) ngoại bào có khả
năng thủy phân (hóa lỏng) gelatin, do vậy người ta gọi là streptococcal
gelatinase.

Một

số

nghiên

cứu

trước

đây

gọi

enzym

này

là

metalloendopeptidase II và protease từ vi khuẩn. Các nghiên cứu trước đây
cho thấy enzym này có khả năng thủy phân casein, gelatin, hemoglobin và
sữa đông. Enzym này sau đó được phân lập từ chủng E. faecalis var.
liquefaciens OG1-10 phân lập từ người bệnh, được xếp vào nhóm
endopeptidase phụ thuộc kẽm và được đặt tên cococlysin (EC.3.4.24.30).
Trình tự nucleotide của gen mã hóa gelatinase (gelE) được công bố lần đầu
năm 1991 (Rawlings và Salvesen, 2013).
Gelatinase từ vi khuẩn, điển hình là gelatinase của E. faecalis thuộc họ
enzym phụ thuộc kim loại M4, đại diện là enzym thermolysin từ chủng
Bacillus thermoproteolyticus và aureolysin từ Staphylococcus. Enzym M4
chứa vùng xúc tác đặc trưng bởi chuỗi trình tự bậc 1 HExxH chịu trách nhiệm
liên kết với Zn tại tâm xúc tác và liên kết với 3 hoặc 4 nguyên tử Ca, có tác
dụng làm bền cấu trúc và ổn nhiệt (Del Papa và cộng sự, 2007). Gelatinase có
khả năng thủy phân casein, hemoglobin, insulin, fibrinogen, collagen, gelatin

(Makinen và cộng sự, 1989). Các enzym M4 của vi khuẩn được hình thành
dưới dạng tiền enzym không có hoạt tính (preproenzyms). Enzym hoàn thiện
được hình thành sau quá trình tự phân hủy (cắt đi một số trình tự ở đầu tận
cùng C) để tạo thành dạng hoạt hóa. Dạng propeptide vận hành như một