Chế tạo chế phẩm nano bạcPVA bằng phương pháp chiếu xạ và thử nghiệm hoạt tính kháng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tụy cấp trên tôm

1

LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành đề tài thực tập tốt nghiệp này, em đã nhận được sự hướng dẫn, góp ý,
và giúp đỡ của quý thầy cô phòng Công nghệ sinh học Vật liệu và Nano, trung tâm
Công Nghệ Sinh Học thành phố Hồ Chí Minh và các thầy cô chuyên ngành Công
nghiệp, khoa Sinh học – Công nghệ sinh học, Trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên đã
tạo điều kiện cho em thực tập tốt nhất.
Trước hết, em xin chân thành cảm ơn đến quý thầy cô phòng Công Nghệ Sinh Học
Vật Liệu và Nano, trung tâm Công Nghệ Sinh Học thành phố Hồ Chí Minh đã tận tình
dạy bảo em trong thời gian qua.
Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến thầy PGS.TS Lê Quang Luân đã dành thời gian
và tâm huyết hướng dẫn nghiên cứu và giúp đỡ em hoàn thành đề tài.
Em xin cảm ơn ThS. Đặng Hoàng Việt cùng các anh chị nhân viên phòng phòng
Công Nghệ Sinh Học Vật Liệu và Nano, trung tâm Công Nghệ Sinh Học thành phố Hồ
Chí Minh đã tận tình giúp đỡ em trong thời gian thực hiện đề tài.
Em cũng xin gửi lời cảm ơn đến toàn thể bạn bè, người thân, gia đình, những người
đã luôn bên cạnh và cổ vũ tinh thần lớn lao và ủng hộ em trong suốt thời gian vừa qua.
Mặc dù đã rất cố gắng thực hiện đề tài bằng sự tâm huyết và năng lực của mình, em
cũng không thể tránh khỏi những sai sót, rất mong nhận được sự đóng góp của thầy cô
và các bạn.
Kính chúc tất cả quý thầy cô và các bạn thành công trong công việc và cuộc sống.
Hồ Chí Minh, ngày 05 tháng 7 năm 2017
Sinh viên
Lại Thị Kiều Trang


2

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN.................................................................................................................i

MỤC LỤC...................................................................................................................... ii
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT................................................................................v
DANH MỤC CÁC BẢNG............................................................................................vi
DANH MỤC CÁC HÌNH............................................................................................vii
TÓM TẮT...................................................................................................................... 1
ĐẶT VẤN ĐỀ................................................................................................................2
Chương I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU..............................................................................4
1. Vật liệu – công nghệ nano....................................................................................4
1.1

Công nghệ nano.............................................................................................4

1.2

Vật liệu nano..................................................................................................4

1.2.1

Khái niệm................................................................................................4

1.2.2

Phân loại.................................................................................................4

2. Công nghệ chiếu xạ tạo hạt bạc nano...................................................................5
3. Sử dụng PVA làm chất ổn định trong chế tạo nano bạc........................................6
4. Hạt nano bạc.........................................................................................................6
4.1

Giới thiệu về bạc kim loại..............................................................................6

4.2 Đặc tính kháng khuẩn của bạc...........................................................................7
4.2

Cơ chế kháng khuẩn của hạt nano bạc...........................................................7

4.3

Giới thiệu về hạt nano bạc.............................................................................9

4.3.1

Định nghĩa...............................................................................................9

4.3.2

Các phương pháp phân tích hạt nano bạc................................................9

4.3.2.1 Sử dụng kính hiển vi điện tử truyền qua:.............................................9
4.3.2.2 Phân tích phổ UV – VIS....................................................................10
4.4.3 Ứng dụng của hạt nano bạc........................................................................11
5. Chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus...........................................................11


3

5.1

Đặc điểm......................................................................................................11

5.2 Đặc điểm gây bệnh...........................................................................................11
6. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước.........................................................13
6.1

Tình hình nghiên cứu ngoài nước................................................................13

6.2

Tình hình nghiên cứu trong nước.................................................................13

Chương II. VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP..................................................................15
1. Thời gian và địa điểm thực hiện nghiên cứu......................................................15
2. Vật liệu...............................................................................................................15
2.1

Vật liệu thí nghiệm......................................................................................15

2.2

Dụng cụ.......................................................................................................15

2.3

Hóa chất.......................................................................................................15

2.4

Môi trường sử dụng.....................................................................................16

2.4.1

Môi trường peptone kiềm:.....................................................................16

2.4.2

Môi trường TCBS:................................................................................16

3. Phương pháp thực hiện.......................................................................................16
3.1

Nội dung 1: Chế tạo dung dịch keo bạc nano/PVA bằng phương pháp bức xạ
16

3.1.1
Ag+

Xác định liều chiếu xạ bão hòa của dung dịch Ag+/PVA theo nồng độ
16

3.1.2

Xác định các đặc trưng..........................................................................17

3.1.2.1 Đo phổ UV-vis dung dịch keo bạc.........................................................17
3.2 Nội dung 2: Khảo sát khả năng kháng khuẩn của dung dịch keo bạc nano/PVA
trong điều kiện in vitro...........................................................................................17
3.1.3 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ bạc/PVA lên sự phát
triển của vi khuẩn V. parahaemolyticus điều kiện in vitro..................................17
3.1.4 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của kích thước hạt nano bạc lên sự
phát triển của vi khuẩn V. Parahaemolyticus......................................................18

2.2 Thiết lập quy trình chế tạo chế phẩm nano bạc/PVA bằng phương pháp chiếu
xạ quy mô 100 lít/mẻ.............................................................................................20


4

Chương III. KẾT QUẢ - THẢO LUẬN.......................................................................21
1. Chế tạo dung dịch keo bạc nano/PVA bằng phương pháp bức xạ....................21
2. Khảo sát khả năng kháng khuẩn của dung dịch keo bạc nano/PVA trong điều
kiện in vitro............................................................................................................23
2.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ bạc/PVA lên sự phát triển
của vi khuẩn V. parahaemolyticus trong điều kiện in vitro.................................23
2.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của kích thước hạt nano bạc lên sự
phát triển của vi khuẩn V. Parahaemolyticus,.....................................................26
3. Thiết lập quy trình chế tạo chế phẩm nano bạc/PVA bằng phương pháp chiếu xạ
quy mô 100 lít/mẻ.........................................................................................................28
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ........................................................................31
KẾT LUẬN...............................................................................................................31
ĐỀ NGHỊ..................................................................................................................31
TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................................32
Tài liệu Tiếng Việt.....................................................................................................32
Tài liệu tiếng Anh......................................................................................................32
Tài liệu Online..........................................................................................................34


5

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
AHPNS

Bệnh gan tụy cấp tính

Ag+

Bạc ion

Ag0

Bạc nguyên tử

AgNPs

Bạc nano

AgNPS/PVA

Bạc nano sử dụng PVA làm chất ổn định

BHI

Brain – Heart Infusion

Co – 60

Đồng vị Cobalt 60

e-aq

Electron bị solvate hóa

ESC

Bệnh gan thận mủ

kGy

Kilo Gray

PVA

Polyvinyl alcohol

TCBS

Thiosulfate Citrate Bile Salt Sucrose

TEM

Kính hiển vi điện tử truyền qua


6

DANH MỤC CÁC BẢ
Bảng 1. 1: Số nguyên tử bạc trong một đơn vị thể tích...................................................6
YBảng 3.2: Sự thay đổi mật độ quang (OD) của dung dịch Ag+ ở nồng độ 10 mM theo

liều chiếu xa…….........................................................................................................21
Bảng 3. 3: Hiệu suất kháng vi khuẩn V. parahaemolyticus trên môi trường rắn và lỏng
có bổ sung nano bạc ở các kích thước khác nhau.........................................................27

7

DANH MỤC CÁC HÌ
Hình 1.1: Tác động của ion bạc lên vi khuẩn..................................................................7
Hình 1. 2: Ion bạc vô hiệu hóa enzym chuyển hóa oxy của vi khuẩn.............................8
Hình 1. 3: Ion bạc liên kết với các base của DNA..........................................................8
Hình 1 .4: Mô hình nguyên lý của TEM so với kính hiển vi quang học.........................9
Hình 1 .5: Ảnh TEM của các hạt nano bạc kích thước 10 nm......................................10
Hình 1 .6: Ảnh UV-VIS của các hạt nano bạc..............................................................10
Hình 1 .7: vi khuẩn V. parahaemolyticus......................................................................11
Hình 1 .8: dấu hiệu bệnh lý của tôm bị bệnh nhiễm khuẩn...........................................12
Y

Hình 2.2: Quy trình chế tạo chế phẩm nano bạc/PVA bằng phương pháp chiếu xạ quy
mô lớn.......................................................................................................................... 20
Hình 3. 1: Ảnh TEM và phân bố kích thước hạt của dung dịch keo bạc nano ở nồng độ
10mM Ag+...................................................................................................................22
Hình 3. 2: Ảnh TEM và phân bố kích thước hạt của dung dịch keo bạc nano ở nồng độ
5mM, 20 mM Ag+.........................................................................................................23
Hình 3. 3: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ bạc nano/PVA lên sự phát triển của
vi khuẩn V. parahaemolyticus trong môi trường lỏng...................................................24
Hình 3. 4: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ bạc nano/PVA lên sự phát triển của
vi khuẩn V. parahaemolyticus trong môi trường rắn.....................................................24
Hình 3. 5: Hiệu suất kháng vi khuẩn V. parahaemolyticus trên môi trường rắn và lỏng
có bổ sung nano bạc ở các nồng độ khác nhau.............................................................25
Hình 3.6: kết quả khảo sát ảnh hưởng của kích thước bạc lên sự phát triển của vi khuẩn
V. parahaemolyticus trong môi trường lỏng..................................................................26
Hình 3. 7: kết quả khảo sát ảnh hưởng của kích thước bạc lên sự phát triển của vi

khuẩn V. parahaemolyticus trong môi trường rắn.........................................................26


8

Hình 3. 8: Hiệu suất kháng vi khuẩn V. parahaemolyticus trên môi trường rắn và lỏng
có bổ sung nano bạc ở các kích thước khác nhau.........................................................27
Hình 3. 9: Sơ đồ quy trình chế tạo keo bạc nano bằng phương pháp chiếu xạ..............29


1

TÓM TẮT
Chế phẩm keo bạc nano được chế tạo bằng phương pháp chiếu xạ tia Gamma (Co60) có sử dụng dung dịch bạc nitrat 10 mM với PVA 2% làm chất ổn định. Kết quả
nhận được kích thước hạt trung bình là 10.09 nm. Kết quả nghiên cứu hiệu suất diệt
khuẩn V. parahaemolyticus trong điều kiện in vitro của chế phẩm keo bạc nano/PVA có
kích thước bạc khác nhau (7,5; 10; 15 nm) cho thấy nồng độ bạc 15 ppm và với các
kích thước 7.5 và 10 nm cho hiệu suất kháng khuẩn là khá cao và tiêu diệt hoàn toàn vi
khuẩn V. parahaemolyticus. Từ kết quả in vitro, chúng tôi đã xây dựng được quy trình
chế tạo chế phẩm nano bạc quy mô 100 L/mẻ với dung dịch bạc 10 nm và nồng độ
1000 ppm.


2

ĐẶT VẤN ĐỀ
Ngành thủy sản là một trong những ngành xuất khẩu mũi nhọn và chiếm tỉ
trọng cao trong cơ cấu GDP. Kim ngạch xuất khẩu thủy sản của cả năm 2016 đạt
trên 7 tỷ USD tăng 6,5% so với cùng kỳ năm 2015, trong đó tôm là mặt hàng chủ
lực của thủy sản. Đặc biệt, mặt hàng tôm đang có dư địa để phát triển lớn và tôm

Việt Nam có lợi thế cạnh tranh trên thế giới; kim ngạch tôm đạt trên 3,1 tỷ USD
[25]. Tuy nhiên, ngành thủy sản vẫn còn nhiều khó khăn và thách thức do dễ dàng
bị các dịch bệnh tấn công và phát triển gây thiệt hại nặng nề như là bệnh gan tụy
cấp tính (AHPNS) ở tôm do vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus Bệnh ước tính có thể
gây thiệt hại cho ngành nuôi tôm lên đến 1 tỷ USD. Hiện nay, phương pháp đang
được sử dụng phổ biến để điều trị chống các loại vi khuẩn này là kháng sinh nhưng
trong những năm gần đây, việc sử dụng kháng sinh không mang lại hiệu quả hay
thậm chí còn làm tăng thêm mầm bệnh [26]. Báo cáo của Ven. L cho thấy V.
parahaemolyticus đã kháng lại hầu hết kháng sinh như imipenem, ampicillin,
chloramphenicol, gentamicin, tetracycline và một số kháng sinh khác [23]. Hơn nữa
việc tồn đọng dư lượng kháng sinh trong thủy sản gây ảnh hưởng xấu đến sức
khỏe con người [27].
Trước tình hình đó, ngày nay, cùng với sự ra đời và phát triển của công nghệ
nano, con người đã chế tạo được bạc ở kích thước nano mà vẫn giữ nguyên được
tính chất và khả năng kháng khuẩn của bạc ion. Điều này làm tăng đáng kể số ứng
dụng của bạc. Ở kích thước nano, bạc thể hiện khả năng kháng khuẩn mạnh mà
không gây ảnh hưởng tới con người và môi trường. Chính vì vậy, giới khoa học
đang đầu tư nghiên cứu bạc để phục vụ cho các ứng dụng trong y học, nhất là khi
hiện tượng vi khuẩn kháng kháng sinh ngày càng phổ biến như ngày nay.
Từ những lý do trên, chúng tôi thực hiện đề tài thực tập: “Chế tạo chế phẩm
nano bạc/PVA bằng phương pháp chiếu xạ và thử nghiệm hoạt tính kháng vi
khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tụy cấp trên tôm”.


3

Mục tiêu đề tài:
- Chế tạo thành công chế phẩm bạc nano/PVA bằng phương pháp chiếu xạ
- Khảo sát khả năng tiêu diệt vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus trong điều
kiện in vitro của chế phẩm.

- Thiết lập quy trình chế tạo chế phẩm quy mô 100 lít/mẻ


4

Chương I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1. Vật liệu – công nghệ nano
1.1 Công nghệ nano
Công nghệ nano (nanotechology) là ngành công nghệ liên quan đến việc thiết
kế, phân tích, chế tạo và ứng dụng các cấu trúc, thiết bị, hệ thống bằng việc điều
khiển hình dáng, kích thước trên quy mô nanomet (1nm = 10 -9m). Ở kích thước
nano, vật liệu sẽ có những tính năng đặc biệt mà vật liệu truyền thống không có
được do việc thu nhỏ kích thước và tăng diện tích bề mặt.
Có hai phương thức cơ bản để chế tạo vật liệu nano là “top–down”

và

“bottom-up”. “Top-down” nghĩa là chia nhỏ một hệ thống lớn để tạo ra được đơn
vị kích thước nano như phương pháp nghiền, biến dạng … “Bottom –up” là phương
thức lắp ghép các nguyên tử, phân tử để thu được các hạt có kích thước nano gồm
các phương pháp hóa học như sol-gel, lắng đọng hơi hóa học, phương pháp tự
lắp ghép (self-assembly) v.v. [3]
Công nghệ nano được coi như một bước ngoặt của khoa học kỹ thuật thế giới,
là một trong những ngành công nghệ tiên tiến bậc nhất hiện nay và có rất nhiều ứng
dụng trong y học, điện tử, may mặc thực phẩm.
1.2 Vật liệu nano
1.2.1 Khái niệm
Vật liệu nano là loại vật liệu ít nhất một chiều có kích thước nanomet. Về trạng
thái, người ta phân thành ba trạng thái: rắn, lỏng, khí. Trong đó, vật liệu được
nghiên cứu chủ yếu hiện nay là vật liệu rắn [24].

1.2.2 Phân loại
Có nhiều cách để phân loại vật liệu nano, một số cách phân loại thường dùng:
-

Phân loại theo hình dáng vật liệu:

Người ta đặt tên số chiều không bị giới hạn ở kích thước nano


5

+ Vật liệu nano không chiều (cả ba chiều đều có kích thước nano), ví dụ đám nano,
hạt nano
+ Vật liệu nano một chiều là vật liệu trong đó một chiều có kích thước nano, ví dụ
dây nano, ống nano
+ Vật liệu nano hai chiều là vật liệu trong đó hai chiều có kích thước nano, ví dụ
màng mỏng
+ Ngoài ra còn có vật liệu có cấu trúc nano hay nanocomposite trong đó chỉ có một
phần của vật liệu có kích thước nm, hoặc cấu trúc của nó có nano không chiều, một
chiều, hai chiều đan xen lẫn nhau.
-

Phân loại theo tính chất vật liệu:

+ Vật liệu nano kim loại
+ Vật liệu nano bán dẫn
+ Vật liệu nano từ tính
+ Vật liệu nano sinh học [25]
2. Công nghệ chiếu xạ tạo hạt bạc nano
Nghiên cứu ứng dụng bức xạ để tổng hợp hạt nano kim loại phân tán trong

dung dịch (in qaqueous dispersion) đặc bắt đầu từ khoảng cuối những năm 1970 và
sau đó nhiều nghiên cứu đã được tiến hành trong lĩnh vực này. Cơ chế đơn giản để
tạo nên hạt kim loại từ ion kim loại tương ứng là cần tạo ra điều kiện khử trong quá
trình chiếu xạ. Gốc tự do *OH có tính oxi hóa sẽ được chuyển thành gốc tự do có
tỉnh khử bằng việc thêm vào hệ chất hữu cơ bắt gốc tự do (free radical scavenger).
Chất hữu cơ thường được sử dụng là các loại alcol. Cơ chế được mô tả như sau [1]:
Bức xạ
H2O >>>-> eaq, *H, *OH, H2O2, H3O+
*OH + RCH2OH -> RC*HOH +H2O
RC*HOH + M (I) -> (M)n + RCH2OH (M là kim loại)
Neaq + M (I) -> (M)n


6

Phương pháp bức xạ có một số ưu điểm như quá trình xảy ra ở nhiệt độ thường,
có thể dễ dàng điều chỉnh quá trình phản ứng, sản phẩm nhận được có độ tinh khiết
cao, thuận lợi cho ứng dụng ở quy mô lớn, hiệu quả kinh tế cao. Công nghệ bức xạ
hiện tại chủ yếu sử dụng các nguồn bức xạ gamma phát ra từ đồng vị Co – 60 và Cr
– 157, chùm điện tử gia tốc điện tử và chùm tia ion phát ra từ các máy gia tốc tion.
3. Sử dụng PVA làm chất ổn định trong chế tạo nano bạc
Polyvinyl alcohol (PVA) là một polymer tổng hợp tan trong nước, có công thức
hóa học [CH2CH(OH)]n, được sử dụng trong sản xuất giấy, dệt may, và các lớp phủ.
PVA hoạt động như một tác nhân phân tán ổn định nhờ vào khả năng tan trong
nước, dễ tạo màng, chịu dầu mỡ và dung môi, độ bền kéo cao, chất lượng kết dính
tuyệt vời. Khả năng tan trong nước của PVA có thể thay đổi trong khoảng rộng và
theo những ứng dụng đa dạng.
PVA hiện nay được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau, đặc biệt
được sử dụng làm chất ổn định trong chế tạo nano bạc do giá thành rẻ, khả năng tan
tốt trong nước cũng như không gây độc đối với vi sinh vật.

4. Hạt nano bạc
4.1 Giới thiệu về bạc kim loại
Cấu hình electron của bạc: 1s22s22p63s23p63d104s24p64d105s1
Bán kính nguyên tử Ag: 0,288 nm
Bán kính ion bạc: 0,23 nm
Bảng 1. 1: Số nguyên tử bạc trong một đơn vị thể tích [2]
Kích thước của hạt

Số nguyên tử chứa

nano Ag (nm)
1
5
20

trong đó
31
3900
250000

4.2 Đặc tính kháng khuẩn của bạc


7

Bạc và các hợp chất của bạc thể hiện tính độc đối với vi khuẩn, virus, tảo và
nấm. Tuy nhiên, khác với các kim loại nặng khác (chì, thủy ngân…) bạc không thể
hiện tính độc với con người.
Từ xa xưa, người ta đã sử dụng đặc tính này của bạc để phòng bệnh. Người cổ
đại sử dụng các bình bằng bạc để lưu trữ nước, rượu dấm. Trong thế kỷ 20, người ta

thường đặt một đồng bạc trong chai sữa để kéo dài độ tươi của sữa. Bạc và các hợp
chất của bạc được sử dụng rộng rãi từ đầu thế kỷ XIX đến giữa thế kỷ XX để điều
trị các vết bỏng và khử trùng.
Sau khi thuốc kháng sinh được phát minh và đưa vào ứng dụng với hiệu quả
cao người ta không còn quan tâm đến tác dụng kháng khuẩn của bạc nữa. Tuy
nhiên, từ những năm gần đây, do hiện tượng các chủng vi sinh ngày càng trở nên
kháng thuốc, người ta lại quan tâm trở lại đối với việc ứng dụng khả năng diệt
khuẩn và các ứng dụng khác của bạc, đặc biệt là dưới dạng hạt có kích thước nano.
4.2 Cơ chế kháng khuẩn của hạt nano bạc

Hình 1.1: Tác động của ion bạc lên vi khuẩn [8]
Các đặc tính kháng khuẩn của bạc bắt nguồn từ tính chất hóa học của các ion
Ag+. Ion này có khả năng liên kết mạnh với peptidoglican, thành phần cấu tạo nên
thành tế bào của vi khuẩn và ức chế khả năng vận chuyển oxy vào bên trong tế bào
dẫn đến làm tê liệt vi khuẩn. Nếu các ion bạc được lấy ra khỏi tế bào ngay sau đó,


8

khả năng hoạt động của vi khuẩn lại có thể được phục hồi. Do động vật không có
thành tế bào, vì vậy chúng ta không bị tổn thương khi tiếp xúc với các ion này.
Có một cơ chế tác động của các ion bạc lên vi khuẩn đáng chú ý được mô tả
như sau: Sau khi Ag+ tác động lên lớp màng bảo vệ của tế bào vi khuẩn gây bệnh nó
sẽ đi vào bên trong tế bào và phản ứng với nhóm sunfuahydrin – SH của phân tử
enzym chuyển hóa oxy và vô hiệu hóa men này dẫn đến ức chế quá trình hô hấp
của tế bào vi khuẩn.

Hình 1. 2: Ion bạc vô hiệu hóa enzym chuyển hóa oxy của vi khuẩn [11]
Ngoài ra các ion bạc còn có khả năng liên kết với các base của DNA và trung
hòa điện tích của gốc phosphate do đó ngăn chặn quá trình sao chép DNA.

Hình 1. 3: Ion bạc liên kết với các base của DNA [11]

4.3 Giới thiệu về hạt nano bạc


9

4.3.1 Định nghĩa
Hạt nano bạc là các hạt bạc có kích thước từ 1 nm đến 100 nm. Do có diện tích
bề mặt lớn nên hạt nano bạc có khả năng kháng khuẩn tốt hơn so với các vật liệu
khối do khả năng giải phóng nhiều ion Ag+ hơn.
Các hạt nano bạc có hiện tượng cộng hưởng Plasmon bề mặt. Hiện tượng này
tạo nên màu sắc từ vàng nhạt đến đen cho các dung dịch có chứa hạt nano bạc với
các màu sắc phụ thuộc vào nồng độ và kích thước hạt nano.
4.3.2

Các phương pháp phân tích hạt nano bạc

4.3.2.1Sử dụng kính hiển vi điện tử truyền qua:
Kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) hoạt động trên nguyên tắc giống thấu
kính quang học, chỉ khác là sử dụng sóng điện tử thay cho bước sóng ánh sáng nên
có bước sóng rất ngắn) và sử dụng các thấu kính điện từ - magnetic lens thay cho
thấu kính quang học.
Ảnh của kính hiển vi điện tử truyền qua cho phép ta quan sát được hình dạng
và xác định được kích thước của các hạt nano.

Hình 1 .4: Mô hình nguyên lý của TEM so với kính hiển vi quang học [16]

10

Hình 1 .5: Ảnh TEM của các hạt nano bạc kích thước 10 nm [16]
4.3.2.2 Phân tích phổ UV – VIS
UV-VIS (Ultraviolet–visible spectroscopy) là phương pháp phân tích sử dụng
phổ hấp thụ hoặc phản xạ trong phạm vi vùng cực tím cho tới vùng ánh sáng nhìn
thấy được.
Do các thuộc tính quang học của dung dịch chứa hạt nano phụ thuộc vào hình
dạng, kích thước và nồng độ của hạt, nên ta có thể sử dụng UV-VIS để xác định
các thuộc tính trên. Bạc nano hấp thụ bước sóng cực đại trong vùng bước sóng 380
– 430nm tùy thuộc vào hệ ổn định.

Hình 1 .6: Ảnh UV-VIS của các hạt nano bạc


11

Do hạt nao bạc có kích thước nhỏ hơn 20 nm chỉ có một bề mặt plasmon duy
nhất nên trong phổ UV-VIS của chúng chỉ xuất hiện 1 đỉnh duy nhất. Người ta xử
dụng tính chất này để xác định hình dạng của hạt nano bạc.
4.4.3 Ứng dụng của hạt nano bạc
Do thể hiện tính kháng khuẩn tốt nên nano bạc thường được sử dụng để làm
chất khử trùng, kháng khuẩn, khử mùi…
5. Chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus
5.1 Đặc điểm
Giống Vibrio
Họ Vibrionaceae
Bộ Vibrionales
Lớp Gammaproteobacteria

Hình 1 .7: vi khuẩn V. parahaemolyticus [28]

Ngành Proteobacteria.
Vibrio parahaemolyticus là vi khuẩn gram âm, hình que hơi cong, ngắn, di
động. Là vi khuẩn kỵ khí tùy ý có phản ứng catalase và oxidase dương tính, lên
men D-mannitol, maltose, L. arabinose, không lên men saccharose.

V.

parahaemolyticus là vi khuẩn ưa mặn (halophile) tồn tại trong nước biển và các
động vật biển như cá, tôm, sò, ốc, v.v.
Vibrio parahaemolyticus phát triển tối ưu ở nồng độ muối 3% NaCl nhưng có
thể phát triển ở nồng độ muối từ 0.5% - 8%. Nhiệt độ giới hạn là 5 – 43 oC trong đó
tối ưu ở 37oC. pH tối ưu là 7.5 – 8.5. Trong điều kiện thuận lợi, chúng sinh trưởng
rất nhanh, thời gian thế hệ ngắn, khoảng 11 phút.
5.2 Đặc điểm gây bệnh
V. parahaemolyticus có thể gây ra nhiễm trùng vết thương và nhiễm trùng huyết
ở người thông qua tiêu thụ hải sản nấu chưa chín hoặc qua vết thương tiếp xúc với
động vật biển hoặc vùng nước ấm ven biển, đặc biệt là ở Đông Nam Á.Tuy
nhiên, không phải chủng V. parahaemolyticus nào cũng gây bệnh do chúng


12

mang các gen độc tố khác nhau. Trong số đó, hemolysin là loại độc tố phổ
biến nhất ở các loài Vibrio gây bệnh. Đây là ngoại độc tố bền nhiệt làm phân
giải tế bào hồng cầu và giải phóng hemoglobin. Ở loài V. parahaemolyticus, có ba
gen độc tố hemolysin chính bao gồm tdh và trh mã hóa các hemolysin bền nhiệt và
tlh mã hóa hemolysin không bền nhiệt [5].
Ngoài ra, vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus còn có khả năng gây bệnh hoại tử

gan tụy cấp trên tôm (Acute hepatopancreatic nerosis syndrome - AHPNS) hay còn
gọi là Hội chứng chết sớm (Early mortality syndrome) và đã ảnh hưởng nghiêm
trọng đến sản lượng tôm nuôi hằng năm. Đây cũng chính là nguyên nhân làm lan
truyền nhiều bệnh về đường tiêu hóa, trong đó có bệnh dịch tả, cho người ăn các
món ăn tái hoặc sống từ tôm [5].
Theo Lightner tôm bệnh thường có một số đặc điểm mô bệnh học đặc trưng
như: (i) thoái hoá cấp tính của các ống gan tụy với sự rối loạn về chức năng của tế
bào E, R và F; (ii) nhân tế bào trương to, tế bào bị hoại tử rơi vào trong lòng ống
gan tụy[16]. Ở giai đoạn cuối, phát hiện có hiện tượng tập trung của các tế bào
máu và sự phát triển của tác nhân vi khuẩn thứ cấp chủ yếu là nhóm vi khuẩn
Vibrio trong vùng gan tụy, đặc biệt là ở những ống gan tụy bị hoại tử và thoái
hoá [7].

Hình 1 .8: dấu hiệu bệnh lý của tôm bị bệnh nhiễm khuẩn [7]


13

6. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước
6.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước
Phương pháp chế tạo hạt kim loại nano nói chung và chế tạo nano bạc nói riêng
đã được rất nhiều nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu. Phương pháp thường được
sử dụng chủ yếu là: điện hóa, khử hóa học, khử nhiệt, sinh học, khử do bức xạ ion
hóa [23], [18], [9]. Trong các phương pháp chế tạo đã được báo cáo, phương pháp
sử dụng tia γ-Co-60 để chế tạo bạc được đánh giá là hiệu quả hơn hẳn và có khả
năng sản xuất ở quy mô lớn [20], [14]. Cho đến nay, đã có một số nghiên cứu tiến
hành chế tạo nano bạc sử dụng các chất ổn định khác nhau như Polyvinyl alcohol
[12], oligochitosan [17], v.v. Việc sử dụng các chất ổn định khác nhau phụ thuộc
vào nhu cầu sử dụng sản phẩm bạc nano, ngoài ra chất ổn định còn ảnh hưởng tới
kích thước hạt và độ ổn định của dung dịch keo bạc nano.

Theo nhận định của nhiều chuyên gia, công nghệ nano sẽ tạo nên một cuộc
cách mạng đột phá trong nhiều ngành khoa học và đời sống, tạo tiền đề cho một
“thế giới nhỏ hơn và thông minh hơn”.
6.2 Tình hình nghiên cứu trong nước
Tại Việt Nam trong những năm gần đây công nghệ nano bắt đầu được đầu tư và
thu hút sự chú ý của các nhà khoa học. Tuy nhiên cho đến nay số lượng công trình
nghiên cứu về kim loại nano được công bố trên tạp trí khoa học trong nước còn rất
hạn chế. Đề tài nghiên cứu về vàng và platin nano để xúc tác chuyển hóa CO thành
CO2 được tác giả Nguyễn Thiết Dũng Viện khoa học Vật liệu ứng dụng – Viện khoa
học và công nghệ Việt Nam thực hiện (2009 – 2010). Về bạc, nhóm tác giả Nguyễn
Đức Nghĩa, Hoàng Mai Hà công bố trên Tạp chí hóa học (2001) đã chế tạo được hạt
nano bạc bằng phương pháp khử các ion bạc sử dụng tác nhân oleate trong polyme
ổn định, thu được các hạt bạc có kích thước từ 4 – 7nm.


14

Các nhà khoa học Việt Nam cũng bắt đầu triển khai ứng dụng công nghệ nano
trong chế tạo thuốc hướng đích và kết hoạch nghiên cứu ứng dụng của các hạt nano
trong y - sinh học để chẩn đoán và chữa bệnh. Bài báo “chế tạo và ứng dụng hạt
nano từ tính trong y sinh học” của nhóm tác giả Nguyễn Hữu Đức, Nguyễn Hoài
Hà, Trần Mậu Danh Bộ môn Vật liệu và Linh kiện từ tính nano, khoa Vật lý kỹ
thuật và Công nghệ nano, trường Đại học Công nghệ, Đại học Quốc Gia Hà Nội và
Trung tâm Khoa học Vật liệu, trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia
Hà Nội báo cáo tại hội nghị Vật lý toàn quốc lần thứ VI (2005). Tuy nhiên, công
nghệ nano vẫn là một điều gì đó mới lạ ở Việt Nam. Nói chung, công nghệ nano tại
Việt Nam hiện chỉ mới đang đặt những viên gạch móng đầu tiên [10].


15

Chương II. VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP
1. Thời gian và địa điểm thực hiện nghiên cứu
Thời gian: từ tháng 3 đến tháng 7 năm 2017
Địa điểm: Trung tâm Công Nghệ Sinh Học thành phố Hồ Chí Minh, 2374

Quốc lộ 1, phường Trung Mỹ Tây, quận 12, TP. Hồ Chí Minh.
2. Vật liệu
2.1 Vật liệu thí nghiệm
Vi khuẩn dùng trong nghiên cứu này chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus
được cung cấp bởi phòng CNSH Vật liệu và Nano, Trung tâm Công nghệ sinh học
TPHCM.
2.2 Dụng cụ
-

Ống nghiệm

-

Falcon
Đĩa petri
Que cấy trải
Bercher 100 ml, 250 ml, 1000 ml

-

Ống đong 100 ml
Đèn cồn
Pipet 10 ml, 25 ml
Pipetman 200 µl, 1000 µl

2.3 Hóa chất
- Dung dịch keo bạc AgNPs/PVA được chiếu xạ với các nồng độ và liều xạ bão
hòa khác nhau là 5 mM và 20 mM
AgNO3
NaOH 1M
PVA
Nước khử ion
Pepton
NaCl

2.4 Môi trường sử dụng
2.4.1 Môi trường peptone kiềm:

Thành phần môi trường:
Peptone
10 g
NaCl
20 g
Nước cất
đủ 1000 ml
Dùng NaOH chuẩn pH về 8.6 ± 0.2, hấp khử trùng ở 121oC trong 15 phút
2.4.2 Môi trường TCBS:
Cân vô trùng 88g môi trường TCBS vào 1L nước cất đã được hấp khử trùng ở
121oC, 15 phút. Đun nóng cho tan hết agar, để nguội đến 50 – 60 oC và tiến hành đổ
đĩa.
3. Phương pháp thực hiện
3.1 Nội dung 1: Chế tạo dung dịch keo bạc nano/PVA bằng phương pháp bức
xạ

3.1.1 Xác định liều chiếu xạ bão hòa của dung dịch Ag+/PVA theo nồng độ Ag+
Mục tiêu: xác định được liều chiếu xạ cần thiết để khử toàn bộ ion bạc Ag + trong
dung dịch bạc thành bạc kim loại Ago
Quy trình thí nghiệm:
Hòa tan 2g PVA trong 80 mL nước cất ở nhiệt độ 60-80 0C. Sau khi để dung dịch
nguội đến nhiệt độ phòng, bổ sung 5 mL etanol vào và khuấy đều. Cân 0,17 g
AgNO3 tương ứng với Ag+ nồng độ 10 mM và hòa tan trong 10 mL nước cất sau
đó cho vào dung dịch PVA/etanol, khuấy đều. Thêm nước cất vào cho đủ 100 mL
và cho dung dịch vào các ống nghiệm có nút vặn kín khí. Chiếu xạ tạo dung dịch


16

keo bạc nano theo các liều chiếu xạ khác nhau trên nguồn gamma SVST/60-C0/B
tại Trung tâm Nghiên cứu và Triển khai Công nghệ Bức xạ, liều xạ được đo bằng
liều kế ethanol-chlorobenzene.
3.1.2 Xác định các đặc trưng
3.1.2.1 Đo phổ UV-vis dung dịch keo bạc
Các dung dịch sau khi chiếu xạ được để ổn định qua đêm. Pha loãng dung dịch
keo bạc nano bằng nước đến nồng độ 0,1 mM. Đo phổ UV-vis trên máy quang phổ
dùng cuvet thạch anh chiều dày 1 cm. Đo phổ hấp thụ đặc trưng dung dịch bạc nano
trong dải bước sóng từ 200 đến 800 nm.
3.1.2.2 Chụp ảnh kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM)
Chụp ảnh TEM được tiến hành trên máy JEM1010, JEOL, Nhật Bản tại Viện Vệ
sinh Dịch tễ Trung ương, Hà Nội. Kích thước và phân bố kích thước hạt bạc nano
được tính từ ảnh TEM sử dụng phần mềm Photoshop CS2, version 9.0.
3.2 Nội dung 2: Khảo sát khả năng kháng khuẩn của dung dịch keo bạc
nano/PVA trong điều kiện in vitro
Mục đích: xác định nồng độ và kích thước của nano bạc/PVA tốt nhất để kháng
khuẩn Vibrio parahaemolyticus

3.1.3 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ bạc/PVA lên sự phát
triển của vi 1khuẩn V. parahaemolyticus điều kiện in vitro
Dung dịch sử dụng là dung dịch keo bạc nano nồng độ 10 mM được chiếu xạ ở
liều bão hòa theo nội dung 1. Thí nghiệm được bố trí làm 4 lô và được lặp lại ba lần
theo mô hình khối ngẫu nhiên theo sơ đồ như sau:
Bảng 2.1 Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của nồng độ bạc nano/PVA đến sự phát triển
của vi khuẩn V. parahaemolyticus
Nghiệm thức
Đối chứng
ND 5
ND 10
ND 15

Nồng độ bạc nano (ppm)
0
5
10
15