VIỆN HÀN LÂM VÀ KHOA HỌC VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI TÀI NGUYÊN VÀ SINH VẬT
PHẠM THỊ HẰNG
NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM GEN ZmBZIP72 PHÂN LẬP TỪ GIỐNG NGÔ ĐỊA
PHƯƠNG VIỆT NAM VÀ THIẾT KẾ CẤU TRÚC MANG GEN PHỤC VỤ
NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN VÀO CÂY TRỒNG
Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60 42 01 14
LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC
GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN: TS. HUỲNH THỊ THU HUỆ
Hà Nội - 2017
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết quả nêu
trong luận văn là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nào khác.
Hà Nội, Ngày tháng
năm 2017
Tác giả luận văn
Phạm Thị Hằng
i
LỜI CẢM ƠN
Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS. Huỳnh Thị Thu
Huệ - Phó trưởng phòng Đa dạng sinh học hệ gen – Viện Nghiên cứu hệ gen đã tận tình
hướng dẫn và dìu dắt tôi trong quá trình hoàn thành luận văn.
Luận văn này được thực hiện tại phòng Đa dạng sinh học hệ gen – Viện Nghiên cứu
hệ gen với sự hỗ trợ kinh phí của Đề tài cấp nhà nước: “Phân lập thiết kế gen chịu hạn phục
vụ công tác tạo giống ngô biến đổi gen” giai đoạn 2014-2018 do Bộ Nông nghiệp và Phát
triển Nông thôn quản lý.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo thuộc cơ sở đào tạo Viện Sinh thái và
Tài nguyên sinh vật và ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu hệ gen đã giảng dạy và tạo điều kiện
cho tôi học tập và thực hiện luận văn.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới toàn thể các cán bộ Phòng Đa dạng sinh học hệ gen,
Viện Nghiên cứu hệ gen đã luôn nhiệt tình giúp đỡ và cho tôi những lời khuyên cũng như
những góp ý quý báu trong quá trình tôi thực hiện luận văn.
Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn động viên, giúp đỡ
tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.
Hà Nội, Ngày
tháng
năm 2017
Tác giả luận văn
Phạm Thị Hằng
ii
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
ABA
Abscisic acid
ABF
ABRE binding factor
ABRE
AB -responsive element
AP2/EREBP
APETALA2/ethylene responsive element binding protein
AREB
ABA responsive element binding protein
AS
Acetosyringone
bZIP
basic leucine zipper
CaMV
Cauliflower mosaic virus
CBF
CRT binding factor
CBU
Crop Biotech Update
cDNA
Complementary DNA
CDPK
Calcium-dependent protein kinase
CDS
Coding DNA sequence
CRT
C-Repeat
CSP
Cold shock protein
CUC2
Cupshaped cotyledon 2
CYP
Cyclophilin
DEPC
Diethyl pyrocarbonate
DNA
Deoxyribonucleic acid
DRE
Dehydration responsive element
DREB
Dehydration responsive element binding
iii
DST
Drought and Salt Tolerance
EAR
ERF-associated amphiphilic repression
EDTA
Ethylenediaminetetraacetic acid
ERD1
Early responsive to dehydration
ERF
Ethylene responsive e blement
EtBr
Ethidium bromide
FAO
Food and Agriculture Organization
FAS-USDA
Foreign Agricultural Service-United States Department of Agriculture
HSP
Heat Shock Protein
LB
Lysogeny broth
LEA
Late embryogenesis abundant
MALDI-TOF
Matrix-assisted laser desorption/ionization- time of flight
MCS
Multiple cloning site
mRNA
Messenger RNA
NAC
NAM, ATAF1,2, CUC2
NACRS
NAC recognition sequence
NAM
No apical meristem
NF-Y
Nuclear factor Y
PCR
Polymerase Chain Reaction
PIS
Phosphatidylinositol synthase
PKC
Protein kinase C
PTMs
Post translation modifications
iv
RNA
Ribonucleic acid
RT-PCR
Reverse transcription-polymerase chain reaction
sHSP
Small heat shock protein
TF
Transcription factor
WFP
World Food Programme
WMO
World Meteorological Organization
ZAT
Zinc transporter
ZFP
Zinc finger protein
v
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng
Tên bảng
Trang
Bảng 1.1
Sản lượng ngô trên toàn thế giới qua các niên vụ 2011/2012 –
14
2016/2017
Bảng 2.1
Trình tự mồi sử dụng trong nghiên cứu
Bảng 2.2
Thành phần các môi trường sử dụng trong nuôi cấy mô thực vật 22 - 23
Bảng 3.1
Kết quả biến nạp gen ZmbZIP72
57
Bảng 3.2
Danh sách mẫu cây chuyển gen ZmbIP72 thu được
58
vi
21 - 22
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình
Tên hình
Trang
Hình 2.1
Sơ đồ vector biểu hiện mang gen ZmbZIP72
29
Hình 3.1
Sản phẩm tách chiết RNA tổng số từ mẫu mô lá ngô xử lý hạn
38
nhân tạo
Hình 3.2
Sản phẩm PCR nhân gen Actin từ các mẫu cDNA
39
Hình 3.3
Kết quả RT-PCR nhân gen ZmbZIP72
40
Hình 3.4
Tách chiết và chọn lọc plasmid mang gen ZmbZIP72
41
Hình 3.5
Kiểm tra plasmid pJET 1.2 mang đoạn gen ZmbZIP72
42
Hình 3.6
So sánh trình tự nucleotide giữa đoạn gen ZmbZIP72 từ giống Tẻ
43
vàng chắt dạo (Lai Châu) với trình tự tham chiếu
Hình 3.7
So sánh trình tự acid amin suy diễn của đoạn CDS trên đoạn gen
44
ZmbZIP72 giống Tẻ vàng chắt dạo (Lai Châu) với trình tự tham
chiếu
Hình 3.8
Kiểm tra sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi ZmbZIP72SacI F/R
45
Hình 3.9
Kết quả cắt enzyme giới hạn BglII trên các plasmid pJET 1.2
46
Hình 3.10 Tách chiết và chọn lọc plasmid pRTL2 mang gen ZmbZIP72
47
Hình 3.11 Sản cắt plasmid pRTL2_ZmbZIP72 bằng enzyme HindIII
47
Hình 3.12 Sản phẩm cắt plamsid pRTL2_ZmbZIP72 với enzyme BamHI
và HindIII
Hình 3.13 Chọn lọc plasmid pCAMBIA1300 mang gen ZmbZIP72
48
Hình 3.14 Sản phẩm cắt plasmid pCAM1300_ZmbZIP72 bằng enzyme
HindIII
Hình 3.15 Sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp 01 bằng enzyme SacI, HindIII
51
Hình 3.16 Sản phẩm PCR nhân đoạn gen ZmbZIP72 từ 4 dòng plasmid
53
Hình 3.17 Minh hoạ quá trình biến nạp và tái sinh cây ngô chuyển gen
56
Hình 3.18 DNA tổng số tách chiết từ mẫu lá cây chuyển gen ZmbZIP72
thế hệ T0
60
vii
50
51
Hình 3.19 Sản phẩm PCR nhân gen chỉ thị hygromycin ở các cây chuyển
gen T0
Hình 3.20 Sản phẩm PCR nhân gen đích ZmbZIP72 ở cây chuyển gen T0
viii
61
62
MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN................................................................................................................ i
LỜI CẢM ƠN .................................................................................................................... ii
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ................................................................................. iii
DANH MỤC CÁC BẢNG................................................................................................ vi
DANH MỤC CÁC HÌNH ............................................................................................... vii
MỞ ĐẦU ............................................................................................................................. 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................................... 3
1.1. Phản ứng của thực vật trong điều kiện hạn hán , .........................................3
1.1.1.
Tác động của hạn hán đến sinh trưởng và phát triển của thực vật ......3
1.1.3.1.
Các gen mã hoá protein chức năng ..........................................................5
1.1.3.2.
Các gen mã hoá protein truyền tín hiện ..................................................6
1.1.3.3.
Các gen mã hoá yếu tố điều khiển phiên mã ...........................................7
1.2. Họ bZIP là yếu tố điều khiển phiên mã trong cảm ứng chống chịu hạn ở
thực vật .....................................................................................................................10
1.3. Cấu trúc và chức năng của gen ZmbZIP72 ..................................................12
1.4. Cây ngô và vấn đề chịu hạn ..........................................................................14
1.5. Nghiên cứu tạo giống ngô biến đổi gen ........................................................17
1.6. Chuyển gen vào thực vật thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens19
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................... 21
2.1. Vật liệu và hoá chất nghiên cứu....................................................................21
2.1.1.
Mẫu thực vật ............................................................................................21
2.1.2.
Các vật liệu khác ......................................................................................21
2.1.3.
Hoá chất ....................................................................................................21
2.1.4.
Thiết bị nghiên cứu ..................................................................................23
2.2. Phương pháp nghiên cứu ..............................................................................24
2.2.1.
Tách chiết DNA tổng số từ thực vật .......................................................24
2.2.2.
Tách chiết RNA tổng số từ thực vật .......................................................25
2.2.3.
Sinh tổng hợp cDNA sợi thứ nhất ..........................................................26
2.2.4.
Phương pháp nhân gen bằng kỹ thuật PCR..........................................26
ix
2.2.5.
Tinh sạch các đoạn DNA trên gel agarose .............................................27
2.2.6.
Tạo dòng gen và thiết kế các vector tái tổ hợp mang gen ZmbZIP72 .28
2.2.7.
Biến nạp các vector tái hợp vào tế bào vi khuẩn E. coli DH10β và A.
tumefaciens .................................................................................................................30
2.2.8.
Tách chiết và tinh sạch plasmid..............................................................32
2.2.9.
Phân tích plasmid tái tổ hợp bằng enzyme giới hạn .............................33
2.2.10.
Điện di trên gel agarose ...........................................................................33
2.2.11.
Chuyển gen vào thực vật thông qua A. tumefaciens .............................35
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................. 37
3.1. PHÂN LẬP GEN ZmBZIP72 TỪ CÂY NGÔ .............................................37
3.1.1.
Tách chiết RNA tổng số từ mẫu mô lá ngô ............................................37
3.1.2.
Tổng hợp cDNA sợi thứ nhất ..................................................................38
3.1.3.
RT-PCR nhân gen ZmbZIP72 .................................................................39
3.1.4.
Tạo dòng gen ZmbZIP72 trong vector pJET1.2 ....................................40
3.1.5.
Xác định và phân tích trình tự gen ZmbZIP72 .....................................42
3.2. Thiết kế các vector tái tổ hợp mang gen ZmbZIP72 ...................................44
3.2.1.
PCR nhân gen ZmbZIP72 với cặp mồi treo vị trí enzyme SacI ...........44
3.2.2.
Thiết kế vector trung gian mang gen ZmbZIP72 ..................................46
3.2.3.
Thiết kế vector biểu hiện thực vật mang gen ZmbZIP72 .....................49
3.3. Tạo chủng A. tumefaciens mang cấu trúc biểu hiện gen ZmbZIP72 .........52
3.4. Chuyển gen ZmbZIP72 vào cây ngô .............................................................54
3.5. Đánh giá cây ngô T0 chuyển gen ZmbZIP72 ...............................................58
3.5.1.
Kết quả tách chiết DNA tổng số cây ngô chuyển gen ...........................59
3.5.2.
Kết quả PCR kiểm tra sự có mặt của gen chỉ thị hygromycin ............60
3.5.3.
Kết quả PCR kiểm tra sự có mặt của cấu trúc biểu hiện gen ZmbZIP72
61
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ......................................................................................... 64
1.
Kết luận ...........................................................................................................64
2.
Kiến nghị .........................................................................................................64
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN
........................................................................................................................................... 65
x
TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................................... 66
xi
MỞ ĐẦU
Trong nhiều năm gần đây, biến đổi khí hậu đã và đang là vấn đề chính đối với nền
nông nghiệp thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng. Sản lượng lương thực toàn cầu đang
bị thiệt hại nghiêm trọng bởi các yếu tố phi sinh học như hạn, ngập úng, mặn, dịch bệnh,
xói mòn đất và ô nhiễm môi trường (Nikos and Bruinsma, 2012). Trong đó, hạn hán đang
là một trong những nhân tố chính gây ảnh hưởng lớn tới nền sản xuất nông nghiệp của toàn
cầu và ngày càng trở nên nghiêm trọng ở nhiều khu vực. Các quốc gia thuộc khu vực Nam
và Đông Phi là những quốc gia chịu ảnh hưởng nặng nề nhất bởi hạn hán. Khu vực này đã
trải qua hai mùa mưa liên tiếp 2014-15 và 2015-16 với lượng mưa dưới mức trung bình
(WMO, 2016). Theo Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp của Liên Hợp Quốc (FAO), sản
lượng ngũ cốc của khu vực này trong vụ mùa 2015-16 đã giảm 12% so với năm 2014-15.
Những khu vực khác bị ảnh hưởng nghiêm trọng bởi hạn hán trong những tháng đầu năm
2016 bao gồm phần lớn các khu vực ở phía Bắc Nam Mỹ, các vùng phía đông của Australia,
các hòn đảo thuộc phía Tây Thái Bình Dương và các nước Đông Nam Á thuộc lưu vực
sông Mekong đặc biệt là Việt Nam. Chương trình Lương thực thế giới (WFP) ước tính sẽ
có khoảng 17 triệu người cần được hỗ trợ vào đầu năm 2017 (WMO, 2016).
Cây ngô là một trong các loại cây ngũ cốc quan trọng đối với con người. Ở Việt
Nam, ngô là cây lương thực quan trọng thứ hai sau lúa và được trồng ở nhiều vùng khác
nhau. Theo số liệu của Tổng cục thống kê, diện tích trồng ngô ở nước ta năm 2015 ước đạt
1164,8 nghìn ha, sản lượng ước đạt 5287,2 nghìn tấn và năng suất bình quân đạt 4,54 tấn/ha
(). Tuy nhiên, sản xuất ngô ở Việt Nam hiện vẫn chưa đáp ứng
được nhu cầu tiêu dùng trong nước, năm 2015 nước ta vẫn phải nhập khẩu khoảng 7,55
triệu tấn ngô ( ). Một trong những nguyên nhân chính là do việc
canh tác ngô ở Việt Nam chủ yếu dựa vào nguồn nước mưa tự nhiên. Điều này ảnh hưởng
rất lớn đến khả năng tăng năng suất và sản lượng ngô hàng năm và đặc biệt là trong điều
kiện nắng hạn kéo dài. Do đó, việc nghiên cứu tạo giống ngô chịu hạn đang là chủ đề
nghiên cứu của nhiều tổ chức và các nhà khoa học. Trong nhiều năm gần đây, việc ứng
dụng công nghệ sinh học đặc biệt là công nghệ gen để cải thiện khả năng chịu hạn của cây
1
trồng đang được quan tâm. Tuy nhiên, ở nước ta, những thành tựu trong nghiên cứu tạo
giống ngô biến đổi gen có khả năng chịu hạn vẫn còn hạn chế. Nguyên nhân gồm cả khách
quan và chủ quan như nguồn gen chưa được tập trung khai thác/nghiên cứu nhiều, công
nghệ chuyển gen chưa được tiếp cận sớm, đồng thời cây ngô cũng là đối tượng khó để
chuyển gen vào hệ gen.
Ở thực vật, trong quá trình thích nghi với điều kiện hạn, sự biểu hiện và các cơ chế
điều hòa mức độ biểu hiện của các gen có vai trò quan trọng. Sự biểu hiện của gen liên
quan chặt chẽ với các yếu tố điều khiển phiên mã. Gen ZmbZIP72 là một trong những gen
mã hóa cho yếu tố điều khiển phiên mã của cây ngô đã được phân lập và mô tả bởi Sheng
và cộng sự (2012). Theo nhóm nghiên cứu, sự biểu hiện toàn thể của gen ZmbZIP72 dưới
sự điều khiển của promoter CaMV35S ở các dòng cây Arabidopsis chuyển gen đã làm tăng
đáng kể khả năng thích ứng với khô hạn, cho thấy vai trò tiềm năng của gen ZmbZIP72
trong việc tăng cường khả năng chịu hạn đối với cây chuyển gen. Trên cơ sở đó, chúng tôi
tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu đặc điểm gen ZmbZIP72 phân lập từ giống ngô
địa phương Việt Nam và thiết kế cấu trúc mang gen phục vụ nghiên cứu chuyển gen
vào cây trồng” mục tiêu là phân lập gen và chuyển gen ZmbZIP72 vào cây dòng ngô K7
để làm nguyên liệu cho các nghiên cứu tạo giống ngô chịu hạn. Các nội dung nghiên cứu
cụ thể như sau:
-
Phân lập, tách dòng gen ZmbZIP72 từ giống ngô Tẻ vàng chắt dạo (Lai Châu) của
Việt Nam.
-
Xác định và phân tích trình tự của gen ZmbZIP72
-
Thiết kế các vector mang gen ZmbZIP72
-
Chuyển gen ZmbZIP72 vào cây ngô thông qua vi khuẩn A. tumefaciens
-
Kiểm tra sự có mặt của gen ZmbZIP72 trong cây chuyển gen T0 bằng kỹ thuật PCR.
2
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.
Phản ứng của thực vật trong điều kiện hạn hán
1.1.1.
Tác động của hạn hán đến sinh trưởng và phát triển của thực vật
Hạn hán là một nguyên nhân quan trọng làm giảm năng suất và chất lượng sản phẩm
của cây trồng. Khi môi trường hạn hán, cây bị mất nước dẫn đến nhiều hậu quả nghiêm
trọng: (i) Gây nên hiện tượng co nguyên sinh và làm cho cây bị héo. Sự co nguyên sinh
chất xảy ra khi tế bào bị stress nước làm cho nước trong tế bào bị thất thoát ra ngoài nên
khối nguyên sinh chất của tế bào co lại, thể tích không bào bị thu hẹp. Khi cây sống trong
môi trường thiếu nước kéo dài, tế bào mất nước dẫn đến các mô trở nên mềm yếu và sự
héo xảy ra. Mô thực vật bị héo tạm thời nhưng cũng có thể vĩnh viễn nếu sự thiếu nước xảy
ra nghiêm trọng và trong thời gian dài. (ii) Môi trường sống bị khô hạn cản trở sự vận
chuyển nước trong mạch gỗ. Trong điều kiện thiếu nước, sự cung cấp nước cho rễ không
đủ trong đêm để thủy hóa các mô đã bị thiếu nước ban ngày, dẫn đến các lông hút bị tổn
thương lớp ngoài, vùng vỏ bị phủ chất sáp (suberin) làm giảm áp suất rễ nên ảnh hưởng
đến đẩy cột nước lên cao trong mạch gỗ. Đặc biệt khi thiếu nước sẽ hình thành nhiều bọt
khí trong mạch gỗ dẫn đến phá vỡ tính liên tục của cột nước làm cho cột nước trong mạch
gỗ không được đẩy lên liên tục. (iii) Hạn hán làm dày lớp cutin trên bề mặt lá làm giảm sự
thoát hơi nước qua biểu bì. (iv) Sự thiếu nước làm giảm cường độ quang hợp. Khi hàm
lượng nước trong lá còn khoảng 40 -50%, quang hợp của lá bị đình trệ. (v) Đặc biệt, hạn
hán cản trở sự sinh trưởng của cây trồng. Thiếu nước ảnh hưởng đến các hoạt động sinh lý,
nhất là quang hợp nên làm giảm sinh trưởng và năng suất cây trồng nghiêm trọng (Abdullah
et al., 2011; Belkheiri & Mulas, 2013).
Việc giảm năng suất do hạn hán đã được báo cáo ở nhiều loại cây trồng, mức độ
nghiêm trọng phụ thuộc vào thời gian xảy ra hạn. Ở lúa mạch (Hordeum vulgare), hạn hán
làm giảm năng suất do số lượng của chồi, cụm hoa, hạt trên mỗi cây và trọng lượng của
mỗi hạt bị giảm. Ở ngô, stress hạn làm giảm năng suất do trì hoãn việc phun râu, do đó làm
tăng thời gian chênh lệch trỗ cờ - phun râu. Đặc tính này liên quan chặt chẽ với năng suất
hạt, cụ thể là số bắp và số hạt trên mỗi cây bị ảnh hưởng (Cattivelli et al., 2008). Thâm hụt
3
nước trong suốt quá trình thụ phấn làm tăng tần số hạt không phát triển ở ngô. Ở cây đậu
triều (Cajanus cajan), hạn hán diễn ra trong giai đoạn nảy mầm làm sản lượng hạt bị giảm
đi 40 – 55% (Nam et al., 2001). Trong giai đoạn sinh sản, thiếu hụt nước làm giảm sản
lượng ở bông (Gossypium hirsutum) do việc giảm hình thành và sự phát triển không đầy
đủ của các quả nang. Hạn hán ở đậu tương cũng làm giảm tổng sản lượng hạt (Frederick et
al., 2001). Hạn hán ít có ảnh hưởng đến tỷ lệ hạt mẩy trên lúa mỳ nhưng thời gian hình
thành hạt ngắn hơn và trọng lượng khô bị giảm khi trưởng thành (Wardlaw and
Willenbrink, 2000).
1.1.2.
Cơ chế chống chịu hạn ở thực vật
Để chống lại khô hạn, thực vật có những biến đổi sinh lý, hóa sinh phù hợp. Có hai
cơ chế bảo vệ thực vật tồn tại trong môi trường thiếu nước: cơ chế tránh mất nước và cơ
chế chịu mất nước. Cơ chế tránh mất nước liên quan đến đặc điểm cấu trúc và hình thái
của bộ rễ (Lê Trần Bình và Lê Thị Muội, 1998). Những cây chịu hạn có bộ rễ khỏe, dài,
mập, có sức xuyên sâu sẽ hút được nước ở những nơi sâu, xa trong đất, hoặc lan rộng với
số lượng lớn để tăng diện tích tìm kiếm nước (Nguyễn Lan Điền, 2003). Cơ chế này phụ
thuộc vào khả năng thích nghi đặc biệt về cấu trúc và hình thái của rễ, chồi nhằm giảm mất
nước một cách tối đa (Lê Trần Bình và Lê Thị Muội, 1998) (Đinh Thị Phòng, 2001). Trong
khi đó, cơ chế chịu mất nước liên quan đến những thay đổi hóa sinh diễn ra trong tế bào
nhằm sinh tổng hợp các chất bảo vệ hoặc nhanh chóng bù lại sự thiếu hụt nước. Trong điều
kiện khô hạn, áp suất thẩm thấu của dịch bào được điều chỉnh tăng lên, giúp cho tế bào thu
nhận được những phân tử nước ít ỏi còn lại trong đất. Nhờ vậy, thực vật có thể vượt qua
được tình trạng hạn cục bộ (Steponkus P.L. et al, 2003). Tự điều chỉnh áp suất thẩm thấu
nội bào còn thông qua tích lũy các chất hòa tan, các protein, các axit amin ví dụ như: axit
amin prolin, mannitol, fructose, K+, các enzyme phân hủy gốc tự do… Sự điều chỉnh áp
suất thẩm thấu có hai chức năng: Giữ và lấy nước vào trong tế bào và ngăn chặn sự xâm
nhập của ion Na+; thay thế vị trí nước nơi xảy ra các phản ứng sinh hóa, tương tác với lipid
hoặc protein trong màng, ngăn chặn sự phá hủy màng và các phức protein (Lê Trần Bình,
Lê Thị Muội, 1998).
4
1.1.3.
Cơ chế phân tử của tính chống chịu hạn ở thực vật
Việc nắm được các cơ chế phân tử của phản ứng chịu hạn ở thực vật là vô cùng
quan trọng đối với việc cải thiện khả năng chịu hạn của cây trồng. Các nghiên cứu gần đây
đã phân lập được hàng trăm gen được cảm ứng hoặc ức chế khi cây gặp điều kiện khô hạn.
Tuy nhiên, chỉ một phần rất nhỏ các gen được kiểm chứng về vai trò của nó trong việc tăng
tính chịu hạn của cây. Những gen này có thể phân vào các nhóm dựa vào chức năng nội
bào như: các gen mã hoá protein chức năng, các gen mã hoá yếu tố truyền tín hiệu và các
gen mã hoá yếu tố điều khiển phiên mã…
1.1.3.1. Các gen mã hoá protein chức năng
Các gen liên quan đến chức năng bảo vệ trực tiếp lên màng tế bào và protein như
LEA protein, heat shock protein (HSP), cold shock protein (CSP). LEA là một nhóm các
protein tự nhiên tích tụ trong hạt phấn hoa, hạt và các mô thực vật trong quá trình đáp ứng
lại các stress phi sinh học. Việc tích luỹ các protein LEA liên quan trực tiếp với khả năng
chịu khô hạn ở thực vật (Amara et al. 2012). Bên cạnh dữ liệu phong phú về cấu trúc và sự
biểu hiện của protein này, ngày càng có nhiều các công trình đề cập đến việc sử dụng các
gen LEA nhằm cải thiện tính chống chịu khô hạn ở thực vật (Grelet et al., 2005). Ví dụ,
gen HVA1 mã hoá nhóm protein LEA3 của cây lúa mạch (Hordeum vulgare L.). Người ta
đã chuyển nạp gen này thành công vào cây ngô để tăng cường khả năng chịu hạn và mặn
trong điều kiện nhà lưới (Nguyen et al., 2013). Gen OsLEA3-1 nhạy cảm với mặn đã thể
hiện tính chống chịu khô hạn trong điều kiện đồng ruộng nhờ sự điều khiển của promoter
CaMV35S và promoter HVA1-like (Xiao et al. 2007).
Các protein sốc nhiệt (HSP) và sốc lạnh (CSP) là các chaperone ngăn ngừa sự biến
đổi và gấp nếp của các thành phần tế bào trong điều kiện stress. Các gen CspA và CspB từ
vi khuẩn đã được chuyển vào ngô để tăng cường khả năng chịu hạn, nóng, và lạnh bằng
cách bảo vệ quá trình quang hợp, sinh dưỡng và các giai đoạn sinh trưởng, sinh sản. Năng
suất tăng lên khoảng 11 – 12% đối với cây ngô chuyển gen CspA và CspB thông qua việc
đánh giá các thử nghiệm về năng suất trong nhiều năm, ở nhiều địa điểm (Yang et al.,
2010). sHSP17.2, sHSP17.4 và sHSP26 là 3 protein sốc nhiệt nhỏ đã được xác định bằng
5
cách sử dụng quang khối phổ MALDI-TOF ở lá ngô khi đáp ứng với stress hạn. Các phân
tích hệ phiên mã cho thấy mức biểu hiện của các sHSP này được điều chỉnh tăng lên khi
đáp ứng với stress nhiệt và hạn ở lá ngô. ABA chịu trách nhiệm điều hoà biểu hiện sau
phiên mã các sHSP này (Hu et al. 2010).
Protein Cyclophilin (CYP) liên quan đến nhiều chức năng như phân chia tế bào,
truyền tín hiệu tế bào, vận chuyển protein, điều hoà phiên mã, cắt nối tiền mRNA và khả
năng chịu stress (Trivedi et al. 2012). Các phân tích silico cho thấy rằng việc đáp ứng stress
của thực vật có liên quan với các protein cyclophilin. Các protein CYP ở lúa, ngô,
Arabidopsis, lúa mạch và brachypodium giống nhau đến trên 80% cho thấy tần số cao các
trình tự bảo thủ. CYP thường gặp ở lục lạp, cytosol, và ty thể (Trivedi et al. 2013). Đánh
giá so sánh chỉ ra rằng mRNA chịu trách nhiệm tổng hợp CYP được phát hiện với tần số
cao ở ngô sau 6 – 7 giờ xử lý stress hạn, ở đậu mất khoảng 48 giờ.
1.1.3.2. Các gen mã hoá protein truyền tín hiện
Nhiều hệ thống truyền tín hiệu có chức năng trong đáp ứng với điều kiện bất lợi phi
sinh học, bao gồm kinase, enzyme chuyển hoá phospholipid, calcium sensing… Mặc dù
các quá trình truyền tín hiệu này khá phức tạp và chưa được hiểu rõ, một vài gen mã hoá
cho các yếu tố truyền tín hiệu có chức năng trong đáp ứng chịu hạn đã được phân lập. Một
vào yếu tố gần đây đã được sử dụng trong tạo tính chịu hạn ở cây chuyển gen như: NPK
(Kovtun et al, 2000), SnRK2 (Umezawa et al., 2004), CBL (Cheong et al., 2003). Cũng
giống như các yếu tố điều khiển phiên mã, việc biến đổi một yếu tố truyền tín hiệu có thẻ
làm thay đổi một loạt các sự kiện sau đó, kết quả là tạo khả năng chống chịu ở nhiều mặt.
Ví dụ, NPK1 là một kinase của Nicotinana. NPK1 nằm ở giai đoạn đầu của con đường
truyền tín hiệu oxi hoá và dẫn đến khả năng chịu hạn, lạnh, nóng và muối ở cây ngô chuyển
gen (Shou et al., 2014). PIS (Phosphatidylinositol synthase) là một enzyme quan trọng
trong con đường tổng hợp phosphatidylinositol không những là một thành phần cấu trúc
màng tế bào mà còn là tiền chất của phần tử tín hiệu điều hoà đáp ứng của cây trước điều
kiện bất lợi. Khi biểu hiện quá mức gen ZmPIS trong cây ngô, cây tăng cường khả năng
chịu hạn đặc biệt là giai đoạn trước khi nở hoa (Liu et al., 2013).
6
1.1.3.3. Các gen mã hoá yếu tố điều khiển phiên mã
Yếu tố điều kiển phiên mã (TF) là các protein có vai trò kiểm soát quá trình phiên
mã bằng cách bám vào các vùng trình tự đặc hiệu trên promoter của gen. Các yếu tố điều
khiển phiên mã hiện nay được các nhà khoa học tập trung vào nghiên cứu và khai thác do
tiềm năng sử dụng lớn trong công nghệ sinh học (Saibo et al., 2009; Century et al., 2008).
Hiện nay, những nghiên cứu sinh học phân tử đã chỉ ra rằng abscisic acid (ABA) đóng vai
trò quan trọng trong việc đáp ứng và thích nghi với các stress phi sinh học. Người ta nhận
thấy rằng, bên cạnh phần lớn các gen đáp ứng với stress được điều hòa bằng ABA, vẫn còn
một lượng các gen không chịu ảnh hưởng bởi ABA. Do đó, các yếu tố phiên mã cũng được
chia thành nhóm phụ thuộc hay độc lập với ABA. Các TF của hơn 50 họ khác nhau mã hoá
cho 1700 gen khác nhau đã được tìm thấy trong Arabidopsis (Yang et al., 2010). Các TF
được trình bày dưới đây đều là các TF đáp ứng với hạn và chịu hạn.
TF bZIP là một trong những họ yếu tố điều khiển phiên mã phụ thuộc ABA. ABA
responsive element binding factors (AREB/ABF) là một thành viên của nhóm TF bZIP liên
quan đến tín hiệu ABA trong điều kiện hạn hán và trưởng thành của hạt. AREB/ABF nhận
biết và bám vào ABA responsive element (ABRE) yếu tố hoạt động cis để điều khiển sự
hoạt động của các gen phía sau (Mundy et al., 1990). ABRE nằm trong vùng promoter của
các gen đáp ứng ABA (Yamaguchi-Shinozaki and Shinozaki 2006). Việc đóng khí khổng
và giảm sự thoát hơi nước là kết quả của việc tăng hàm lượng ABA do sự biểu hiện quá
mức của AREB1/ABF2, ABF3 hoặc AREB2/ABF4 (Kang et al., 2002). Sự biểu hiện quá
mức của gen ABF3 ở cây lúa chuyển gen cho thấy khả năng chịu hạn thông qua việc tăng
cường độ phát huỳnh quang của diệp lục (Fv/Fm) và giảm sự héo và cuộn xoắn ở lá (Oh et
al., 2005). Các cây chuyển gen AREB1 được điều khiển bởi 35S promoter cho thấy khả
năng sống sót vượt trội (100%) so với cây đối chứng (40%) trong điều kiện hạn, không
những vậy cây chuyển gen còn có hiệu năng sử dụng nước cao hơn và có nhiều lá hơn so
với dòng đối chứng (Leite et al., 2014).
Một trong những họ yếu tố điều khiển phiên mã lớn khác là WRKY, TF này được
tìm thấy ở nhiều loài, đặc biệt là ở các loài thực vật bậc cao (Ulker and Somssich, 2004).
7
Gần đây, các nhà khoa học tập trung vào nghiên cứu vai trò của nhóm TF này trong đáp
ứng của cây với các điều kiện bất lợi phi sinh học, đặc biệt là hạn hán ở Arabidopsis, lúa
mạch (Luo et al., 2013; Xiong et al., 2010). Mới đây, các nhà khoa học đã phân lập được
gen ZmWRKY58 từ ngô và sự biểu hiện của gen này ở các dòng lúa chuyển gen làm tăng
khả năng chống chịu hạn và muối (Cai et al., 2014).
NAC (NAM, ATAF1-2, CUC2) là một họ TF đặc trưng cho thực vật, bao gồm các
vùng NAC bám DNA có tính bảo thủ cao (Guo et al., 2008). Có hơn 100 gen mã hóa cho
các protein NAC đã được xác định trên đối tượng Arabidopsis. Các protein NAC có nhiều
chức năng, không chỉ tham gia vào sự phát triển của cây mà còn tham gia vào phản ứng
chống chịu stress của thực vật (Nakashima et al., 2012). Có khoảng 40 TF NAC trong số
140 được tìm thấy chịu trách nhiệm đối khả năng chịu hạn và mặn ở lúa. NAC019, NAC055
và NAC072 là các thành viên của họ các yếu tố phiên mã NAC, chúng nhận biết và bám
vào yếu tố NACRS (CATGTG) nằm trong vùng promoter của các gen đáp ứng nhanh với
mất nước (ERD1) và tăng cường khả năng chống mất nước (Tran et al., 2004). Sự biểu
hiện của gen SNAC1 trong cây lúa biến đổi gen làm tăng độ thụ phấn của hoa lên 17 -22%
và khả năng hình thành hạt lên 22 -34% so với các cây đối chứng trong điều kiện hạn hán
vừa và nặng (Hu et al., 2006). Các cây lúa chuyển gen OsNAC6 tăng cường tính chịu hạn
và mặn, ngoài ra còn tăng cường tính kháng bệnh bạc lá so với cây đối chứng (Nakashima
et al., 2007). Cũng nằm trong nhóm NAC, các cây lúa chuyển gen OsNAC9 có tính chịu
hạn rất cao đồng thời, năng suất tốt hơn 13 – 32% so với các cây đối chứng trong điều kiện
bình thường và khô hạn (Redillas et al., 2012).
Một số TF đáp ứng mất nước nhưng không liên quan đến ABA, chúng được gọi là
các TF đáp ứng mất nước không phụ thuộc ABA. Phân tích vùng promoter của các gen
biểu hiện không phụ thuộc ABA trong phản ứng stress của thực vật cho thấy một yếu tố
hoạt động cis với trình tự A/GCCGAC là vị trí liên kết của các TF này, được biết đến như
yếu tố đáp ứng mất nước (DRE- dehydration responsive element). Họ TF đáp ứng mất
nước độc lập ABA điển hình là họ DREB. Các TF này đóng vai trò điều tiết trong điều
kiện stress hạn, lạnh và sự phát triển của lá, hoa, và hạt (Yang et al., 2010). Có 2 loại DREB
8
(DREB1 và DREB2) được tìm thấy đáp ứng cho những stress khác nhau. DREB1 đáp ứng
với stress lạnh trong khi DREB2 đáp ứng với stress hạn, nhiệt và mặn. Sự biểu hiện quá
mức của ZmDREB1A (DREB1A của Zea mays L.) và OsDREB1A (DREB1A của Oryza
sativa L.) ở Arabidopsis làm tăng cường sự hoạt động của các gen phía sau và tăng cường
khả năng chống chịu stress hạn hán, nhiệt và mặn (Qin et al. 2004; Yang et al., 2010).
Promoter ZmUbi (Zea mays L. Ubiquitin) có hiệu quả trong điều khiển các gen DREB1A,
DREB1B và DREB1C ở Arabidopsis để cải thiện khả năng chống chịu hạn hán (Yang et
al., 2010). Sự biểu hiện của DREB2A-CA đã cảm ứng biểu hiện một loạt các gen sốc nhiệt
và tăng cường khả năng chịu hạn của các cây chuyển gen (Sakamura et al., 2006). Rất
nhiều cây trồng đã được chuyển gen thử nghiệm nhằm biểu hiện yếu tố phiên mã
DREB/CBF như đậu phộng (Arachis hypogaea) (Bhatnagar-Mathur et al., 2014), khoai tây
(Iwaki et al., 2013), đậu nành (de Paiva Rolla et al., 2014), lúa (Datta et al., 2012; Ito et
al., 2006), lúa mỳ (Saint Piere et al., 2012) đều cho kết quả cải thiện khả năng chịu hạn
một cách đáng kế ở các cây chuyển gen. HARDY là một thành viên khác của họ TF DREB
được biểu hiện trong mô sẹo. Sự biểu hiện quá mức của thành viên này có ảnh hưởng đa
tính trạng lên sự tăng trưởng của thực vật và hình thành rễ dày đặc và lá xanh dày. HARDY
cải thiện hiệu quả sử dụng nước thông qua cải thiện quang hợp và giảm sự thoát hơi nước
(Karaba et al., 2007).
Protein zinc finger (ZFP) là protein phổ biến nhất ở tế bào nhân thực, chức năng của
các protein này khá đa dạng, bao gồm bám DNA và RNA, hoạt hoá phiên mã, điều hoà quá
tình tự chết, điều hoà sự cuộn gấp và kết hợp protein. Nhiều protein ZFP được chứng minh
là có khả năng làm tăng khả năng chống chịu với điều kiện bất lợi. Các TF này tham gia tự
động vào phản ứng stress thông qua hoạt động như chất hoạt hoá hoặc ức chế phiên mã
(Sakamoto et al. 2000, 2004). Các thành viên của họ ZFP như: OsZFP252 (Xu et al. 2008)
và ZAT10 (Xiao et al., 2009) tích cực tham gia vào việc điều hoà phản ứng mất nước. DST
là một chất điều hoà âm tính, cải thiện khả năng chịu hạn và mặn thông qua việc giảm biểu
hiện của gen (Huang et al., 2009). C2H2 ZFP, EAR và ZAT10 là thành viên của TF ZFP
cải thiện khả năng chịu hạn ở lúa (Yang et al., 2010).
9
Ở Việt Nam, hướng nghiên cứu tập trung vào các yếu tồ điều khiển phiên mã liên
quan đến tính chịu hạn của thực vật cũng đang được các nhóm nghiên cứu quan tâm. Nhóm
nghiên cứu của Phạm Xuân Hội đã phân lập một số gen TF (OsNAC1, OsNAC6,
OsDREB1A, OsDREB2A, OsAREB1A và ZmDREB2A) từ các giống lúa, ngô Việt Nam và
chuyển gen vào cây mô hình lúa và Arabidopsis (Phạm Thu Hằng et al., 2014; Nguyễn
Duy Phương et al., 2014; Nguyễn Thị Phương Dung và Phạm Xuân Hội, 2010; Cao Lệ
Quyên et al., 2012; Phạm Thu Hằng và Phạm Xuân Hội, 2012 ). Một nhóm tác giả khác
cũng đã chuyển thành công các gen TF OsRAP2.4A, OsNLI-IF1 và cây lúa nhằm nghiên
cứu đặc tính của các yếu tố phiên mã này để tăng cường mức độ chịu hạn và mặn của cây
trồng (Nguyen Duy Phuong and Pham Xuan Hoi 2015, Nguyen Duy Phuong et al., 2014).
Cao Lệ Quyên và đồng tác giả (2009) đã phân lập được gen MtOsDREB2A từ thư viện
cDNA xử lý hạn của giống lúa Mộc tuyền. Đây là nguồn gen điều khiển chịu hạn từ chính
nguồn thực vật của Việt Nam, là cơ sở cho các nghiên cứu tính chịu hạn trên cây lúa. Nhóm
nghiên cứu của Nguyễn Văn Đồng cũng đã áp dụng thành công các gen yếu tố điều khiển
phiên mã NF-YB2, MYB trong việc chọn tạo giống ngô và đậu tương có khả năng chống
chịu với điều kiện khô hạn (Nguyễn Văn Đồng và Nguyễn Hữu Kiên, 2013; Nguyễn Văn
Đồng et al., 2013; Nguyễn Văn Đồng et al., 2015). Gen DREB1A cũng được áp dụn g ở
đậu tương (Trần Thị Cúc Hoà, 2009; Trần Thị Cúc Hoà et al., 2015) để chọn tạo giống đậu
tương có khả năng chống chịu hạn.
1.2.
Họ bZIP là yếu tố điều khiển phiên mã trong cảm ứng chống chịu hạn ở thực
vật
Basic leucine zipper (bZIP) là một trong những họ yếu tố điều khiển phiên mã lớn
nhất ở thực vật, chúng tham gia điều hòa nhiều chức năng tế bào, đặc biệt là quá trình điều
hòa trong đáp ứng stress và cảm ứng tín hiệu hormone (Kim, 2006). Tên của họ bZIP được
bắt nguồn từ việc protein này chứa một vùng cơ sở (basic region) và một motif leucine
zipper. Vùng cơ sở chứa 16 chuỗi bên amino acid được nhận biết bởi sự có mặt của một
motif bất biến N-x7-R/K-x9, trong khi đó Leu zipper bao gồm sự lặp lại 7 lần của amino
acid Leu hay các amino acid kị nước khác như Ile, Val, Phe, hay Met nằm chính xác ở vị
10
trí amino acid thứ 9 từ đầu C. Vùng cơ sở và vùng Leu zipper có chức năng riêng biệt.
Vùng cơ sở có nhiệm vụ là tín hiệu di chuyển vào nhân và bám đặc hiệu lên trình tự DNA,
vùng này vô cùng bảo thủ. Vùng Leu zipper là trình tự lưỡng cực ở dạng cuộn xoắn, đặc
trưng cho chức năng dimer hóa và kém bảo thủ hơn. Vùng trình tự Leu zipper này thực
hiện quá trình dimer hóa tương đồng (homo-) hoặc không tương đồng (hetero-) của các
protein bZIP. Các đơn phân bZIP ở dạng một chuỗi xoắn alpha dài, và khi bám với DNA
chứa trình tự lõi ACGT, thường là G-box (CACGTG), C-box (GACGTC) và A-box
(TACGTA), đầu N bám vào rãnh chính của sợi kép DNA, còn đầu C thì làm chức năng
dimer hóa để hình thành nên cấu trúc cuộn xoắn chồng gọi là Leu zipper (Nijhawan et al.,
2008).
Họ gen bZIP đã được phân lập và mô tả ở Arabidopsis (có 75 gen), lúa (89), đậu
tương (131), ngô (125) (Wei et al. 2012). Ở Arabidopsis, 75 gen khác nhau đã được xác
định và phân vào 10 nhóm dựa vào vùng bảo thủ của nó (Jakoby et al., 2002). Trong khi ở
lúa, 89 gen bZIP cũng được chia thành 11 nhóm (Nijhawa et al., 2008). Phần lớn các gen
bZIP liên kết với ABRE thuộc nhóm A, các gen trong nhóm này được cảm ứng mạnh mẽ
bởi ABA và stress phi sinh học khác (Jakoby et al., 2002, Lu et al., 2009).
Ở Arabidopsis, 75 gen mã hóa cho yếu tố phiên mã bZIP đã được phân lập nhưng
còn khoảng 50 gen chưa được miêu tả trong các dữ liệu. Trong số 7 gen thuộc nhóm A,
nhóm tham gia quá trình chống chịu stress và đáp ứng ABA thì chỉ có 3 gen tham gia vào
sự chịu hạn của cây. Đó là ABRE-binding protein 1 và 2 (AREB1 và AREB2) và ABRE
binding factor 3 (ABF3) (Jakoby et al., 2002). Một số nghiên cứu cho thấy ABA và stress
phi sinh học cảm ứng sự biểu hiện của ABF/AREB và ABA gây sự phosphoryl hóa của
AREB1/2. Sự photphoryl hóa này là cần thiết cho AREB1/2 cảm ứng gen sau nó và có thể
xảy ra ở vị trí phosphoryl hóa bằng casein kinase II nằm ở các domain bảo thủ. ABA và
stress hạn do đó có thể cảm ứng cả sự phiên mã và điều hòa sau dịch mã của nhiều gen
bZIP thuộc nhóm A.
Ở lúa, có gần 100 gen thuộc họ bZIP, trong đó 33 gen tham gia phản ứng với hạn
(Nijihawan et al., 2008). Trong số đó, 5 gen ABF3, OsbZIP23, OsbZIP46, OsbZIP 52 và
11
OsbZIP72 được cho là tạo nên khả năng thích ứng với hạn khi biểu hiện quá mức ở lúa.
Gen OsbZIP23 biểu hiện mạnh bởi stress phi sinh học, bao gồm muối, hạn, xử lí với ABA
và PEG. Gen OsbZIP23 khi biểu hiện quá mức ở thực vật cho thấy một sự điều hòa tăng
lên ở trên 800 gen tham gia trong các con đường chống chịu khác nhau. OsbZIP46 có thể
là yếu tố điều hòa dương tính của con đường tín hiệu ABA và chịu hạn ở lúa (Tang et al.,
2012). Một protein bZIP khác OsbZIP52 gần đây được cho là có khả năng tăng tính nhạy
cảm với hạn và lạnh (Liu et al., 2012). OsbZIP72 được công bố là có chức năng như một
chất điều hòa dương tính trong con đường truyền tín hiệu của ABA và hạt nảy mầm biểu
hiện quá mức OsbZIP72 cho thấy tăng khả năng chịu hạn.
1.3. Cấu trúc và chức năng của gen ZmbZIP72
Gen mã hóa ZmbZIP72 dài 2164bp, gồm 3 intron, giống với sự phân bố introns ở
hầu hết các gen bZIP nhóm A ở Arabidopsis và lúa. Vùng promoter của gen ZmbZIP72
(1670bp upstream) có nhiều các yếu tố hoạt động cis đáp ứng với stress và một vài đáp ứng
với ánh sáng cũng được tìm thấy. Điều đó gợi ý rằng ZmbZIP72 có thể tham gia nhiều đáp
ứng stress và điều khiển bởi một cơ chế điều hòa phức tạp. Tuy nhiên chưa có bằng chứng
cho thấy ZmbZIP72 tham gia đáp ứng lạnh.
Gen ZmbZIP72 chứa một khung đọc mở dài 894bp mã hóa cho một chuỗi
polypeptide dài 297 aa, 180bp ở vùng 5’ không dịch mã và 226bp ở vùng 3’ không dịch
mã. Trình tự amino acid suy diễn của ZmbZIP72 được tính toán tương ứng với protein có
khối lượng 32,4 kDa và chỉ số pI là 9,39. Protein suy diễn có trình tự amino acid tương
đồng cao với protein của lúa là OsbZIP72 (Sheng et al., 2012).
Protein ZmbZIP72 chứa một domain bám DNA bZIP điển hình ở đầu C và 4 trình
tự bảo thủ phân bố ở đầu N hoặc C. Một vài vị trí hoạt động đích của kinase, ví dụ
R/KXXS/T cho CDPK, S/TXK/R cho PKC, nằm trong các vùng bảo thủ. Amino acid vị trí
từ 23 đến 63 là cần thiết cho hoạt động hoạt hóa phiên mã của gen ZmbZIP72.
Sản phẩm phiên mã của gen ZmbZIP72 được tìm thấy ở tất cả các cơ quan, nhưng
nồng độ cao nhất là ở rễ của cây mới nảy mầm và trưởng thành và thấp nhất ở thân. Protein
12
ZmbZIP72 hoạt động ở nhân. Tín hiệu chuyển vào nhân được tìm thấy ở domain bảo thủ
bZIP của ZmbZIP72 giống với các nghiên cứu trước (Fujita et al., 2005, Xiang et al., 2008,
Zou et al., 2008, Lu et al., 2009). Để hoạt động thì bZIP cần được phosphoryl hóa phụ
thuộc ABA nhờ protein kinase. Một vài gốc serin ở vùng bảo thủ có thể là vị trí được
phosphoryl hóa. Đồng thời, chúng có thể cần được dimer hóa tương đồng (homo) hoặc
không tương đồng (hetero-) như ở Arabidopsis và lúa.
Khi chuyển cDNA ZmbZIP72 vào Arabidopsis dưới sự điều khiển của promoter
CaMV 35S, dòng chuyển gen thể hiện một số đặc điểm của sự thích ứng với hạn như: sự
nảy mầm của hạt bị ức chế mạnh hơn so với hạt đối chứng trong điều kiện xử lí với ABA
và stress thẩm thấu. Cây trồng trong đất không được tưới nước trong 2 tuần cho thấy lá
tươi và xanh hơn so với cây đối chứng, đồng thời nhanh phục hồi khi được tưới lại với tỉ
lệ sống sót cao hơn đối chứng. Những kết quả kiểu hình và thay đổi sinh lý này cho thấy
sự biểu hiện quá mức ZmbZIP72 ở Arabidopsis chuyển gen có thể làm tăng đáng kể khả
năng thích ứng với khô hạn. Không những thế, ZmbZIP72 có thể hoạt hóa sự biểu hiện của
một vài gen cảm ứng bởi ABA. ZmbZIP72 làm tăng sự biểu hiện của các gen như RD29B,
RAB18, HIS1-3, các gen được cảm ứng bởi các stress khác nhau qua con đường phụ thuộc
ABA, và các gen này biểu hiện càng cao thì tính chống chịu càng cao. Điều này chứng tỏ
ZmbZIP72 hoạt động như là yếu tố hoạt hóa phiên mã dương tính trung gian ABA (ABAmediating). Một vài nghiên cứu chỉ ra rằng sự biểu hiện quá mức liên tục của gen mã hóa
yếu tố phiên mã thường gây ra các kiểu hình không mong muốn, như là sự sinh trưởng
chậm của cây (Kasuga et al., 1999; Kim et al., 2004). Tuy nhiên, các dòng Arabidopsis
chuyển gen biểu hiện quá mức ZmbZIP72 không gây ra hậu quả bất lợi nào đến sự sinh
trưởng và phát triển của cây như chiều cao hay kiểu hình so với kiểu dại. Do đó protein
ZmbZIP72 có tiềm năng ứng dụng vào trồng trọt để tăng khả năng chống chịu stress, đặc
biệt là điều kiện khô hạn (Sheng et al., 2012).
13